DE69302829T2

DE69302829T2 - Bicyclische pyrimidinderivate, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische präparate

Info

Publication number: DE69302829T2
Application number: DE69302829T
Authority: DE
Inventors: Ghanem Atassi; Alain Dhainaut; Alain Pierre; Gilbert Regnier
Original assignee: ADIR SARL
Current assignee: ADIR SARL
Priority date: 1992-12-11
Filing date: 1993-12-09
Publication date: 1996-11-28
Anticipated expiration: 2013-12-10
Also published as: US5508277A; ATE138380T1; DE69302829D1; GR3020330T3; JPH08504426A; AU5653594A; ES2091126T3; CA2117462A1; WO1994013668A1; EP0673376A1; AU666422B2; FR2699176B1; DK0673376T3; FR2699176A1; EP0673376B1; NZ258595A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bicyclische Pyrimidinverbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Stand der Technik

Der vorbekannte Stand der Technik auf diesem pharmazeutischen Gebiet wird insbesondere durch die unter den Nr.0495 982 Al und 0 514 540 Al veröffentlichten europäischen Patentanmeldungen verdeutlicht, welche Verbindungen der Formel:
betreffen, welche Formeln sich im wesentlichen vom Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die Bedeutung der Substituenten-Y'-Z' und Y"-Z" am Pyrimidinkern und durch ihre oharmakologische Wirksamkeit unterscheiden, wobei diese Verbindungen des Standes der Technik gegeüber mit Atmungserkrankungen verküpter Hypoxämie wirksam sind, während die Verbindungen der voriegenden Erfindung den Widerstand von Tumorzellen gegen Antikrebsmittel teilweise oder vollständig umkehren.

Beschreibung der Erfindung

Sie betrifft insbesondere die bicyclischen Pyrimidinverbindungen der Formel I: in der:
-T und U, die gleichartig oder verschieden sein können, Jeweils eine Gruppe
-CH-oder ein Stickstoffatom bedeuten, so daß sie mit der Pyrimidinylgruppe einen Heterocyclus ausgewählt aus: Purin, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin und 1,2,3-Triazolol[4,5-d]pyrimidin bilden;
-R und R', die gleichartig oder verschieden sein können, jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen Jeweils in gerader oder verzweigter Kette bedeuten;
-A eine heteromonocyclische Gruppe der Formel:
bedeutet, in der:
-B eine Gruppe der Formel:
worin R" ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette ist, und
-t eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 darstellen;
-p Werte von Null oder Eins aufweist;
-X und Y, die gleichartig oder verschieden sein können, Jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkyl-oder Alkoxy-gruppe mitjeweils 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette bedeuten;
-m und n, die gleichartig oder verschieden sein können,Jeweils eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 bedeuten;
-R&sub1; und R&sub2;, die gleichartig oder verschieden sein können, Jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette oder gemeinsam eine Einfachbindung, ein Sauerstoff-oder Schwefelatom, eine Gruppe-(CH2)r-worin r eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 darstellt, eine Gruppe-CH=CH-,-O-CH&sub2;-,-S-CH&sub2;-,-SO&sub2;-CH&sub2;-, -CO-CH&sub2;-,-CO-N -oder-SO&sub2;-N -, worin R''' ein Wasserstoffatom oder eine
Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette darstellt, oder R&sub1; und R&sub2; gemeinsam die Gruppe-SO&sub2;-N -
deren endständige CH&sub2;-Gruppe mit dem nächsten Kohlenstoffatom des benachbarten Benzolrings verbunden ist, so daß die Gruppe:
den tetracyclischen Rest der Formel bildet:
30 bedeuten; und
-R&sub3; ein Wasserstoffatom oder eine Phenylgruppe bedeutet; sowie die chiralen Verbindungen und ihre Enantiomere.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin das Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man:
-eine Chlorverbindung der Formel II:
in der T, U und R' die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, mit dem Amin der Formel:
welches man in der 6-Stellung binden will (wobei in diesen Formeln R, X, Y, m, n, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, p und A die oben angegebenen Bedeutungen besitzen), kondensiert und dann das Je nachdem erhaltene Produkt der Formel:
mit dem anderen Amin der Formel III oder IV, welches man in der 2-Stellung binden will, kondensiert-wobei die Reihenfolge der Reaktivität der Amine mit den Dichlorderivaten II bekannt ist [siehe Heterocyclic Compounds, Teil II, Ed. D. J. Brown, Wiley-Interscience (1971), Teil V, S. 160].
Es ist besonders vorteilhaft, diese aufeinanderfolgenden Kondensationen wie folgt durchzuführen:
Die Reaktion der Verbindung II mit dem Amin, das man in der 6-Stellung binden will, erfolgt in einem polaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem Alkohol mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, Dimethylformamid oder Dimethylacetamid, bei einer Temperatur von etwa 60ºC in Gegenwart eines Akzept ors für die im Verlaufe der Reaktion gebildete Wasserstoffsäure; wobei dieser Akzeptor beispielsweise Triethylamin oder ein Überschuß des für die Reaktion verwendeten Amins sein kann.
Das in dieser Weise erhaltene Kondensationsprodukt wird anschließend mit dem anderen (in der 2-Stellung zu bindenden) Amin kondensiert in einem po laren Lösungsmittel des gleichen Typs, wie es für die vorausgehende Kondensation verwendet worden ist, wobei man in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 130 bis 150ºC und in Gegenwart eines Akzeptors für die im Verlaufe der Reaktion gebildete Wasserstoffsäure arbeitet; wobei diese Akzeptor beispielsweise Triethylamin oder ein Überschuß des für die Reaktion eingesetzten Amins sein kann.
Die Ausgangsmaterialien der Formel II wurden ausgehend von bekannten Dichlorverbindungen hergestellt, wie:
-2,4-Dichlorpyrrolol2,3-d]pyrimidin (siehe R.K. Robins et coll. JACS 106 (1984), 6379);
-5,7-Dichlortriazolo[4,5-d]pyrimidin (siehe P. Bitterli, H. Erlenmeyer, Helv. Chem. Acta 34 (1951), 835) und
-4,6-Dichlorpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (siehe R.K. Robins, JACS 79 (1957), 6407).
Diese Dichlorverbindungen, welche der Formel:
entsprechen, werden dann mit einem Alkohol der Formel
R'-OH
in der R' die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, nach der Methode von Mitsunobu-Synthesis (1981), 1, in Analogie zu M. Iwakawa et coll., Can. J. Chem. 56 (1978), 326 und A. Toyota et coll., Chem. Pharm. Bull. 40 (1992), 1039
-umgesetzt zur Bildung der Ausgangsmaterialien der Formel II.
In bestimmten Fällen kann man Substitutionsisomeren erhalten, welche man durch Chromatographie abtrennen kann.
Die Verbindungen der Formel I können mit Säuren in Additionssalze umgewandelt werden, welche Salze ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind. Als für die Bildung dieser Salze geeignete Säuren kann man beispielsweise als anorganische Säuren Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und als organische Säuren Essigsäure, Propionsäu re, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure Oxalsäure, Benzoesäure, Methansulfonsäure und Isethionsäure nennen.
Die Verbindungen der Formel I können mit Hilfe physikalischer Methoden, wie durch Umkristallisation der Basen oder der Salze, durch Chromatographie (insbesondere Blitzchromatographie über Siliciumdioxid (35-70 µm) unter Elution mit Ethylacetat oder den Systemen CH&sub2;Cl&sub2;-Methanol oder CH&sub2;Cl&sub2;-Aceton) oder mit Hilfe chemischer Verfahrensweisen, wie der Bildung von Additionssalzen mit Säuren und der Zersetzung dieser Salze mit alkalischen Mitteln, gereinigt werden.
Die Verbindungen der Formel I und ihre physiologisch verträglichen Addi tionssalze besitzen interessante pharmakologische und therapeutische Eigenschaften und kehren den Widerstand von Tumorzellen gegen Antikrebsmittel teilweise oder vollständig um, was die Verwendung dieser Verbindungen als Adjuvantien bei der Behandlung von Krebsen mit dem Ziel ermöglicht, den Widerstand der Tumorzellen gegen Antikrebsmittel zu verringern oder zu unterdrücken.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff eine Verbindung der Formell oder eines ihrer physiologisch verträglichen Salze in Mischung oder Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Trägermaterial enthalten.
Die in dieser Weise erhaltenen pharmazeutischen Zubereitungen liegen im allgemeinen in dosierter Form vor und können 0,1 bis 1000 mg des Wirkstoffs enthalten. Sie können beispielsweise in Form von Tabletten, Drage es, Gelkapseln, Suppositorien oder injizierbaren oder trinkbaren Lösungen vorliegen und können auf oralem. rektalem oder parenteralem Wege verabreicht werden.
Die Dosierung variiert insbesondere in Abhängigkeit von dem Alter und dem Gewicht des Patienten, dem Verabreichungsweg, der Art der Erkrankung und begleitenden Behandlungen und erstreckt sich von 0,1 bis 1000 mg des Wirkstoffs pro Gabe.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung. Die Schmelzpunkte wurden im Kapillarröhrchen (Kap) oder auf der Kofler-Heizbank (K) bestimmt.

BEISPIEL 1

9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-methylamino]-piperidino}-purin
Zu einer Lösung von 1,15 g 2,6-Dichlor-9-allylpurin in 15 ml Ethanol gibt man 0,75 ml Allylamin und rührt die Mischung während 1 Stunde bei Raumtem peratur, wonach man während 30 Minuten auf 50ºC erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels nimmt man die Mischung mit CH&sub2;Cl&sub2;-H&sub2;O auf, dekantiert und verdampft das Lösungsmittel. Man kristallisiert den Rückstand aus Ethanol um.
Man erhält 1 g 2-Chlor-6-allylamino-9-allylpurin, welches bei 110-112ºC schmilzt. Man löst 0,85 g dieser Verbindung in 20 ml Butanol und gibt zu der erhaltenen Lösung 1,04 g 4-[(10,11-Dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)- methylamino]-piperidin (Öl), 0,5 g K&sub2;CO&sub3; und 0,1 g Kaliumiodid und erhitzt die Mischung während 10 Stunden zum Sieden am Rückfluß.
Anschließend engt man die Reaktionsmischung ein und nimmt den Rück stand mit CH&sub2;Cl&sub2;-H&sub2;O auf.
Man dekantiert, verdampft die organische Phase und chromatographiert den Rückstand durch Elution mit Ethylacetat.
Man isoliert 0,6 g 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl]-methylamino]-piperidino}-purin in Form von Kristallen mit einem Schmelzpunkt (Kap) von 142-144ºC.
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte 9-Allyl-2,6-dichlorpurin wurde durch Umsetzen von Allylalkohol mit 2,6-Dichlorpurin in Tetrahydrofuran nach der Methode von Mitsunobu hergestellt.
Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Amin wurde durch Debenzylierung des entsprechenden, bei 78-81ºC schmelzenden Piperidins hergestellt, welches seinerseits durch alkylierende Reduktion einer Mischung aus 1-Benzylpiperidon und (10,11-Dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamin-Hydrochlorid, welches bei 275-280ºC schmilzt (Kap), mit NaBH&sub3;CN hergestellt wird.

BEISPIEL 2

9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-methylamino]-pip eridino}-purin
Man gibt zu einer Lösung von 1,15 g 9-Allyl-2,6-dichlorpurin in 20 ml Ethanol 3 g 4-[(10,11-Dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidin und rührt die Mischung während 3 Stunden bei Raumtemperatur und dann während 30 Minuten bei 50ºC.
Anschließend behandelt man die Mischung wie in Beispiel 1 beschrieben und kristallisiert den erhaltenen Rückstand aus Ether um.
Man erhält 1,8 g weißer Kristalle, die bei 146-148ºC (Kap) schmelzen.
Nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 erhält man ausgehend von 1,8 g des in dieser Weise erhaltenen 2-Chlorpurin-Derivats in Lösung in 20 ml Butanol durch Erhitzen in Gegenwart von 0,6 mlallylamin auf 150ºC 0,7 g 9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]- piperidino}-purin in Form eines harzartigen Produkts, dessen aus Ethanol umkristallisiertes Difumarat bei 191-194ºC (Kap) schmilzt.

BEISPIEL 3 bis 28

Unter Anwendung der in den obigen Beispielen beschriebenen Methode wurden die folgenden Derivate hergestellt:
3) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[2,2-bis(4-fluorphenyl)-ethylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (Kap): 143-145ºC.
4) 9-Allyl-6-allylamino-6-{4-[2,2-bis(4-fluorphenyl)-ethylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (Kap) des entsprechenden Dimaleats: 151-152ºC.
5) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[6,11-dihydrodibenzo[b,e]oxepin-11-yl)-methylamino]-piperidinol-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 240ºC.
6) 9-Mlyl-6-allylamino-2-{4-[(SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 250ºC.
7) 6-Allylamino-2-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-9-propylpurin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 237ºC.
5 8) 9-Allyl-2-{4-t(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-6-propylaminopurin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 213ºC.
9) 1-Allyl-4-allylamino-6-14-[(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-methylamino]-piperidino}-pyrazolo 13,4-d]pyrimidin, Schmelzpunkt (Kap) des entsprechenden Fumarats: > 230ºC unter Zersetzung.
10) 7-Allyl-4-allylamino-2-{4-[(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-methylamino]-piperidino}-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin, Schmelzpunkt (Kap) des entsprechenden Fumarats: 160-163ºC.
11) 3-Allyl-7-allylamino-5-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-methylamino]-piperidino}-1,2,3-triazolo[4,5-d]pyrimidin, Schmelzpunkt (Kap) des entsprechenden Fumarats: 159-162ºC.
12) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(2,2-diphenylethyl)-amino]-piperidinol-purin, Schmelzpunkt (K): 150ºC.
13) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(3-chlor-6-methyl-5,5-dioxo-6, 11-dihydrod benzo) [c,f) [1,2lthiazepin-11-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 174ºC.
14) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(2-methoxy-10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino)-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 205ºC.
15) (+ )-(R)-oder-(S)-9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(3-chlor-6-methyl-5,5-dioxo-6,11-dihydrodibenzo)[c,f][1,2]thiazepin-11-yl)-amino]-piperidino)-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Dihydrochlorids: 174ºC.
16) (-)-(R)-oder-(S)-9-Allyl-6-allylamino-2-{4-t(3-chlor-6-methyl-5,5-dioxo-6,11-dihydrodibenzo)[c,f][1,2]thiazepin-11-yl)-amino]-piperidinoj-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Dihydrochlorids: 210ºC.
17) 9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(3-chlor-6-methyl-5,5-dioxo-6,11-dihydrodibenzo) [c,f][1,2]-thiazepin-11-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Dihydrochlorids: 210ºC.
18) 9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(6,11-dihydro-dibenzolb,ejoxepin-11-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Difumarats: 186ºC.
19) 9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(2-methoxy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Difumarats: 188ºC.
20) 9-Allyl-2-allylamino-6-{4-[(SH-dibenzo[a,d] cyclohepten-5-yl)-methylaminol-piperidinol-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Difumarats: 200ºC.
21) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(11-methyl-10,10-dioxo-5, 11-dihydro-10-thia-11-aza-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-amino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K): 182ºC.
22) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(10,10-dioxo-11-propyl-5, 11-dihydro-10-thia-11-aza-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino)-purin, Schmelzpunkt (K): 165ºC.
23) 9-Allyl-6-allylamino-2-(4-[(2,3,4-trimethoxy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 170ºC.
24) 9-Alyl-6-allylamino-2-{4-[(6,11-dihydrodibenzotb,ejoxepin-11-yl)-amino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 223ºC.
25) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(5,11-dihydro-6-oxo-dibenzo[b,ejazepin-11- yl)-methylamino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 240ºC.
26) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-amino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K): 114ºC.
27) 9-Allyl-2allylamino-6-{4-[(10,11-dihydro-SH-dibenzo[a,d]cyclohepten-5- yl)-amino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K) des entsprechenden Fumarats: 170ºC.
28) 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(2,2,2-triphenylethyl)-amino]-piperidino}-purin, Schmelzpunkt (K): 175ºC.

BEISPIEL 29: Pharmakologische Untersuchung

Die Resistenz gegen Antikrebsmittel ist ein wesentliches Hindernis der Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen. Unter den verschiedenen Arten der Resistenz ist die "Multidrug Resistance" (MDR, Mehrfachwirkstoffresistenz) besonders interessant, da sie durch Verbindungen natürlichen Ursprungs, die gegen feste Tumoren wirksam sind (beispielsweise Anthracycline, Vincaalkaloide, Epipodophyllotoxine) und bei bestimmten Krebsen sehr häufig ist (beispielsweise Colonkarzinom). Wenn die Tumorzellen in vitro oder in vivo einem dieser Wirkstoffe ausgesetzt werden, werden sie in unterschiedlichem Ausmaß für die Gesamtheit dieser Verbindungen resistent. Das pHänomen der Resistenz ist eine Folge der Wirkung eines induzierbaren Membranproteins, des P-gP 170, dessen Rolle darin besteht, die Abführung des Cytotoxicums zu steigern und damit seine intrazellulare Konzentration zu verringern, wodurch der Verlust der Empfindlichkeit dieser Zellen gegen den Wirkstoff verursacht wird.
Es sind bereits für andere pathologische Zustände verwendete Arzneimittel dafür bekannt, daß sie diesen Widerstand teilweise oder vollständig umkehren können (T. Tsuruo, Mechanism ofmultidrug Resistance and Implications fortherapy. Int. J. Cancer Res. 79 (1988, 285-296; M. Rothenberg und V. Ling, Multidrug Resistance: Molecular Biology and Clinical Relevance, J.N.C.I. 81(1989), 907-910: M.M. Gottesman und 1. Pastan, Resistance to Multiple Chemotherapeutic Agents in Human Cancer Cells, Trends Pharmacol. Sci. 9 (1989), 54-58; J.A. Endicott und V. Ling, The Biochemistry of P-Glycoprotein-mediated Multidrug Resistance, Ann. Rev. Biochem. 58 (1989), 137-171).
Wenn das modulierende Mittel gleichzeitig mit dem Cytotoxin verabreicht wird, vermindert oder unterdrückt es vollständig die Resistanz des MDR-Typs. Bestimmte Arzneimittel, wie Verapamil, Amiodaron oder Cyclosporin, wurden in der Klinik dazu verwendet, diese Resistenz zu bekämpfen, wobeijedoch die ihnen eigenen pharmakologischen Eigenschaften und ihre Toxizität diese Anwendung beträchtlich einschränken. Hieraus ergibt sich das Interesse für das Auffinden von Verbindungen, welche den phänotyp MDR umkehren können und trotzdem frei sind von anderen pharmakologischen Wirkungen und von Toxizität.
Die pharmakologische Untersuchung der erfindungsgemäßen Verbindungen bestand zunächst darin, eine in vitro-Untersuchung ihrer Wirksamkeit auf resistente Zellen zu untersuchen.
Der gemessene Parameter ist die Cytotoxizität des antitumoralen Wirkstoffs, die in Abwesenheit und in Gegenwart der die Wirkung umkehrenden Verbindung gemessen wird.
Es wurde auch die Wirkung der Produkte auf die intrazellulare Konzentration des Cytotoxicums bestimmt.
In der Tat wirken die Verbindungen, die dafür bekannt sind, die MDR umzukehren, dadurch, daß sie die intrazellulare Konzentration des Cytotoxicums erhöhen. Dieser Effekt ist die Konsequenz der Inhibierung der Wirkung von P-gP 170, welches für den Abfluß des Wirkstoffs verantwortlich ist.
Diese Untersuchung wurde durch eine in vivo-Untersuchung ergänzt, bei der eine gegen Vincristin resistente Murin-Leukämle (P388/VCR) eingesetzt und mit Vincristin-Produkten kombiniert worden ist.

Material und Methoden:

1) In vitro-Wirkung
Cytotoxizität
Es wurden zwei resistente Zellinien verwendet:
-Eine Lungen-Zellinie vom chinesischen Hamster, DC-3F/AD, deren Resistenz durch Actinomycin D induziert worden ist. Sein Resistenzfaktor ist größer als 10.000, so daß es sich um eine extrem resistente Linie handelt;
-und eine menschliche Zellinie ausgehend von einem Mund-Epidermiskarzinom, KB-A1, dessen Resistenz durch Adriamycin induziert worden ist. Ihr Resistenzfaktor beträgt etwa 300.
Diese beiden Linien sind ebenfalls gegen Vincaalkaloide (Vincristin und Vinblastin) resistent.
Die Zellen werden in einem vollständigen Kulturmedlum (RPMI 1640) gezüchtet, welches 10 % Kalbsfötenserum, 2 mM Glutamin, 50 Einheiten/ml Peni cillin, 50 µg/ml Streptomycin und 10 mM Hepes enthält.
Die Zellen werden in Mikrotiterplättchen verteilt und der cytotoxischen Verbindung (Actinomycin D oder Adriamycin) in 9 Konzentrationen (Verdünnungsreihen von 2 zu 2) ausgesetzt. Die bezüglich ihrer Fähigkeit, die MDR umzukehren, untersuchten Produkte werden gleichzeitig mit dem Cytotoxicum zugesetzt.
Die Zellen werden anschließend während 4 Tagen inkubiert. Dann bestimmt man die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Hilfe eines kolorimetrischen Tests, dem Microculture Tetrazollum Assay (J. Carmichael, W.G. Degraff, A.F. Gazdar, J.D. Minna und J.R. Mitchell, Evaluation of a Tetrazolium-based Semi audomated Colorimetric Assay: Assessment of Chemosensitivity Testing, Cancer Res. 47 (1987), 936-942). Die Ergebnisse sind als IC&sub5;&sub0;-Wert angegeben, d.h. der Konzentration des Cytotoxicums, welche die Vermehrung der behandelten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen um 50 % inhibiert.
Die Ergebnisse sind als Umkehrfaktor (FR) ausgedrückt gemäß der folgenden Gleichung:
FR = IC&sub5;&sub0; des allein verabreichten Cytotoxicums/ IC&sub5;&sub0; des Cytotoxicums in Gegenwart der die Umkehrung bewirkenden Verbindung

Durchflußcytometrie

Bestimmte Antikrebsverbindungen, wie Adriamycin (ADR) besitzen die Fähigkeit, nach dem Anregen mit einer Lichtquelle von bekannter Wellenlänge zu fluoreszieren.
Durch die Messung dieser Fluoreszenz ist es in dieser Weise möglich, die intrazelluläre Konzentration vonadr in relativer Weise zu messen. Die Durchfluß cytometrie (CMF) ist das Werkzeug der Wahl zur Durchführung dieser Messung und zur schnellen Bestimmung, ob bestimmte wirksame Verbindungen dadurch wirken, daß sie die intrazellulare Konzentration an ADR erhöhen.
Die verwendete resistente Zellinie ist die Zellinie KB-A1.
Man setzt 500 10³ Zellen pro ml gleichzeitig ADR in einer festen Konzentration (50 µM) und den zu untersuchenden Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen aus. Nach einer Inkubationsdauer von 5 Stunden wird die intrazellulare Ansammlung von ADR durch CMF bewertet. Die Analyse werden mit Hilfe eines Durchflußcytometers ATC3OOO (BRUKER-FRANCE) durchgeführt, das mit einem Argonlaser 2025(SPECTRA-PHISICS-FRANCE) ausgerüstet ist, der bei einer Leistung von 600 mW auf 488 nm optimiert worden ist.
Die Analyse einer jeden der Proben erfolgt an einer Gesamtzahl von 10.000 Zellen bei einer Geschwindigkeit von 1.000 Zelle pro Sekunde.
Die Ergebnisse sind in Form von linearen Histogrammen der Fluoreszenz des intrazellularen ADR angegeben.
Darstellung der Ergebnisse: Fürjedes der Histogramme wurde der mittlere Kanal (MEAN) der Fluoreszenz mit Hilfe des Rechners des Systems bestimmt. Bei all diesen Untersuchungen bewirkt man:
-Eine negative Kontrolle (Zellen ohne ADR) mit einem fixierten Autofluoreszenz-Schwellenwert.
-Eine positive Kontrolle (Zellen mit ADR) durch Bestimmung des Wertes MEAN = MN1.
-Es wurden für die "Test"-Röhrchen (Zellen mit ADR und dem Produkt) fürj e des der Produkte und beijeder der Konzentrationen die Werte MEAN = MN2 bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Form von Variationen des Mittelwerts der Fluoreszenz, die man mitjedem der "Test"-Röhrchen (MN2) erhalten hat, im Vergleich zu dem Mittelwert der Fluoreszenz der positiven Kontrolle (MN 1): VAR-MEAN = MN2- MN1. Der angegebene Parameter ist damit die Erhöhung der Fluoreszenz des ADR in Gegenwart der untersuchten Verbindungen.
2) In vivo-Wirkung
Antitumorale Wirkung
Die parenteral empfindliche Linie P388 (Murinleukämle) und die fürvincri stin resistente Unterlinle, P388/VCR, wurden von dem NCI(Frederick, USA) geliefert. Die Tumorzellen (10&sub6; Zellen) wurden am Tag Null in den Peritonealraum von weiblichen Mäusen B6D2F1(Iffa Credo, Frankreich) mit einem Gewicht von 18 bis 20 g (Gruppen von 8 bis 10 Tieren) inokuliert.
Im Fall einer intraperitonealen Verabreichung der zu untersuchenden Pro dukte wurde den Tieren an den Tagen 1,5 und 9 folgendes gegeben:
-eine Verabreichung des zu untersuchenden Produkts der vorliegenden Erfindung in einer Dosis von 25,50 oder 75 mg/kg aufintraperitonealem Wege, dann
-30 bis 60 Minuten später eine Verabreichung von Vincristin (welches als antitumorales Vergleichsprodukt eingesetzt wird) in einer Dosis von 0,50 mg/ kg aufintraperitonealem Wege.
Im Fall einer peroralen Verabreichung der zu untersuchenden Produkte gibt man den Tieren an den Tagen 1, 2, 3, 4 folgendes:
-eine Verabreichung des zu untersuchenden Produkts der vorliegenden Erfindung in einer Dosis von 100 mg/kg auf oralem Wege, dann
-30 bis 60 Minuten danach eine Verabreichung von Vincristin in einer Dosis von 0,25 mg/kg auf intraperitonealem Wege.
Die antitumorale Wirkung wird wie folgt ausgedrückt:
T/C% = Mittlere Überlebenszeit der behandelten Tiere/ Überlebenszeit der Kontrolltiere x 1000
Die Wirkung der Umkehrverbindung wird in T/V ausgedrückt:
T/V% = Mittlere Überlebenszeit der Tiere, die mit der Kombination VCR + Umkehrprodukt behandelt worden sind/Mittlere Überlebenszeit der Tiere, die lediglich mit VCR behandelt worden sind

Ergebnisse:

1) In vitro-Wirkung

Die Tabelle 1 verdeutlicht die mit den verschiedenen Verbindungen und der Linie DC-3F/AD erhaltenen Umkehrfaktoren sowie die mit den verschiedenen Verbindungen an der Linie KB-A1 erzielte ADR-Fluoreszenz (VAR-MEAN). Die Produkte sind wesentlich wirksamer als die Vergleichsprodukte.
Die Tabelle 2 verdeutlicht die Werte der Umkehrfaktoren, die mit den verschiedenen Verbindungen und der Linie KB-A1 erhalten worden sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind sehr aktiv, wobei einige sogar wesentlich wirksamer sind als die Vergleichsprodukte und die Resistenz von KB-A1 (menschliche Krebszellinie) für Adriamycin vollständig umkehren.

2) In vivo-Wirkung

Die Tabelle 3 verdeutlicht die Steigerung der antitumoralen in vivo-Wirkung von Vincristin, die mit zwei repräsentativen Verbindungen der vorliegenden Erfindung erzielt worden sind.
Die Produkte der Beispiele 1 und 2 der Erfindung steigern bei intraperitonealer Verabreichung die antitumorale Wirkung des Vincristins für einen resistenten Tumor in beträchtlichem Umfang, so daß das Vincristin die gleiche Wirkung besitzt wie für einen empfindlichen Tumor.
Die Tabelle 4 verdeutlicht die antitumorale Wirkung der auf oralem Wege an die Linie P388/VCR verabreichten erfindungsgemäßen Produkte.
Die Produkte der Erfindung sind sehr wirksam selbst dann, wenn sie auf oralem Wege gegeben werden. Die wirksamsten Produkte stellen die antitumorale Wirkung des Vincristins vollständig wieder her. In vitro-wirkung Tabelle 1 Produkte Umkehrfaktor Intrazellulare Ansammlung von Adriamycin VAR-MEAN bei Vergleichsprodukte Verapamil Cyclosporin Produkte der Beispiele Tabelle 2 Produkte Umkehrfaktor Vergleichsprodukte Verapamil Cyclosporin Produkte der Beispiele In vivo-Wirkung Tabelle 3: Erhöhung der antitumoralen Wirkung von VCR durch die auf intraperitonealem Wege verabreichten erfindungsgemäßen Verbindungen an der Linie P388/VCR Untersuchte Produkte Dosis Kein Produkt(lediglich VCR) Beispiel Tabelle 4: Erhöhung der antitumoralen Wirkung von VCR durch die auf oralem Wege verabreichten erfindungsgemäßen Verbindungen an der Linie P388 /VCR Untersuchte Produkte Dosis Kein Produkt(lediglich VCR) Produkte der Beispiele

Claims

11. Bicyclische Pyrimidinverbindungen der Formel I: in der:

-T und U, die gleichartig oder verschieden sein können, Jeweils eine Gruppe -CH-oder ein Stickstoffatom bedeuten, so daß sie mit der Pyrimidinylgruppe einen Heterocyclus ausgewählt aus: Purin, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, Pyrrolo[2,3-d]pyrimidin und 1,2,3-Triazolo[4,5-d]pyrimidin bilden;

-R und R', die gleichartig oder verschieden sein können,Jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine Alkenylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen Jeweils in gerader oder verzweigter Kette bedeuten;

-A eine heteromonocyclische Gruppe der Formel:

bedeutet, in der:

-B eine Gruppe der Formel:

worin R" ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette ist, und

-t eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 darstellen;

-p Werte von Null oder Eins aufweist;

-X und Y, die gleich artig oder verschieden sein können, Jeweils ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkyl-oder Alkoxy-gruppe mit jewells 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette bedeuten;

-mund n, die gleichartig oder verschieden sein können,Jeweils eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 bedeuten;

-R&sub1; und R&sub2;, die gleichartig oder verschieden sein können, Jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette oder gemeinsam eine Einfachbindung, ein Sauerstoff-oder Schwefelatom, eine Gruppe (CH2)r-, worin r eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3 darstellt, eine Gruppe-CH=CH-,-O-CH&sub2;-,-S-CH&sub2;-,-SO&sub2;-CH&sub2;-, -CO-CH&sub2;-,-CO-N -oder-SO&sub2;-N -, worin R''' ein Wasserstoffatom oder eine

Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen in gerader oder verzweigter Kette darstellt, oder

R&sub1; und R&sub2; gemeinsam die Gruppe-SO&sub2;-N -

deren endständige CH&sub2;-Gruppe mit dem nächsten Kohlenstoffatom des benachbarten Benzolrings verbunden Ist, so daß die Gruppe:

den tetracyclischen Rest der Formel bildet:

bedeuten; und

R&sub3; ein Wasserstoffatom oder eine Phenylgruppe bedeutet; sowie die chiralen Verbindungen und ihre Enantiomere und ihre physiologisch verträglichen Salze mit geeigneten Säuren.

2. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(10,11- dihydro-5H-dibenzo[a,d]d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-purin. P3. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[2,2- bis(4-fluorphenyl)-ethylamino]-piperidino}-purin.

4. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(6,11- dihydrodibenzo [b,e]oxepin-11-yl)-methylamlno]-piperidino}-purin und sein entsprechendes Fumarat.

5. Verbindung nach Anspruch 1 nämlich 9-Allyl-6-allylamlno-2-{4-[(5H-dibenzo [a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamlno]-piperidino}-purin und sein entsprechendes Fumarat.

6. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 1-Allyl-4-allylamino-6-{4-[(10,11- dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-pyrazolo- [3,4-d]pyrimidin und sein entsprechendes Fumarat.

7. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 7-Allyl-4-allylamino-2-{4-[(10,11- dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylaminoi-piperidlno}-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin und sein entsprechendes Fumarat.

8. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(2,2-diphenylethyl)-amino]-piperldino}-purin.

9. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-Allyl-6-allylamino-2-{4-[(2-methoxy-10, 11-dlhydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5-yl)-methylamino]-piperidino}-purin und sein entsprechendes Fumarat.

10. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man:

- eine Chlorverbindung der Formel II:

in der T, U und R' die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, mit dem Amin der Formel:

RNH&sub2; (III) oder

welches man in der 6-Stellung binden will (wobei in diesen Formeln R, X, Y, m, n, R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, p unda die inanspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen), kondensiert und dann das Je nachdem erhaltene Produkt der Formel:

mit dem anderen Amin der Formel III oder IV, welches man in der 2-Stellung binden will (wobei In diesen Formelnt, U, R, R', A, p, X Y, m, n, R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen), kondensiert.

11. Pharmazeutische Zubereitungen zur Unterdrückung der Resistenz von Tumorzellen gegen Antlkrebsmittel, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zusammen mit einem oder mehreren geeigneten pharmazeutischen Trägermaterialien.

12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers, dessen Zustand die Unterdrückung der Resistenz von Tumorzellen gegen Antikrebsmlttel erforderlich macht.