DE69228633T2

DE69228633T2 - Verfahren zur Analyten-Bestimmung unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements

Info

Publication number: DE69228633T2
Application number: DE69228633T
Authority: DE
Inventors: Masao C/O Fuji Photo Film Co. Ltd Asaka-Shi Saitama Kitajima
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-17
Publication date: 1999-07-22
Anticipated expiration: 2012-07-18
Also published as: JPH0526865A; EP0525550B1; JP2611890B2; EP0525550A1; DE69228633D1; US5336599A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements, das keine Reagentien enthält, die dazu imstande sind, sich direkt mit dem Analyten umzusetzen, um eine meßbare Veränderung zu erzeugen.
Seit langer Zeit werden bei der Diagnose von Erkrankungen des Menschen Blut, Urin oder dergleichen, analysiert.
Als Verfahren hierfür gibt es die Naßanalyse, bei der ein Lösungsreagens verwendet wird. Dieses Verfahren hat eine lange Geschichte und es sind verschiedene Erfassungsreagentien für viele Zwecke entwickelt worden. Es sind auch schon verschiedene Analysengeräte entwickelt worden, die kompakte Apparate bis großdimensionierte Apparate sind. Die für die Naßanalyse verwendeten Proben sind Plasma, Serum, Urin und dergleichen. Im allgemeinen werden aber Gesamtblutproben nicht so wie sie sind verwendet.
Bei der Naßanalyse können die Reagentien im Hinblick auf ihre Stabilität während der Lagerung im Auflösen und im Vermischen zum Zeitpunkt des Gebrauchs in mehrere Gruppen aufgeteilt werden. Es ist auch möglich, die Zugabe der jeweiligen Reagentien in mehrere Stufen aufzuteilen.
Da es weiterhin möglich ist, eine geeignete Menge jedes Reagenses durch Auflösung, entsprechend der Anzahl der zu messenden Proben, herzustellen, werden die Meßkosten pro Probe vermindert. Es ist aufwendig, die Messung zu automatisieren, indem die Behandlung von vielen Lösungen kombiniert wird. Es ist aber Geschichte, klinische analytische Apparate zu entwickeln, und es sind schon verschiedene automatische Apparate mit guter Leistungsfähigkeit entwickelt und in jedem Gebiet, wo große, mittlere oder kleine Behandlungskapazität, entsprechend großen sozialen Erfordernissen, erforderlich sind, in die Praxis übernommen worden.
Die Nachteile der Naßanalyse liegen in der Herstellung und der Zuführung der Proben. Da dieses Verfahren auf der Prämisse der Messung des durchgegangenen Lichts durch eine transparente Lösung aufgebaut ist, können Gesamtblutproben nicht als Meßproben ohne Vorbehandlung verwendet werden. Das heißt, nach dem Abziehen der Gesamtblutproben werden sie zentrifugiert und das überstehende Plasma oder Serum wird in einen Probebecher gegeben oder das Zentrifugenrohr als solches wird in den Meßapparat anstelle des Probebechers eingesetzt. Zusätzlich zu dem komplexen Charakter der obigen Vorgänge besteht das weitere Problem, daß es erforderlich ist, eine große Menge von Gesamtblutproben zu erhalten, um eine genügende Menge von Plasma oder Serum ohne Verunreinigung der roten Blutzellen zu erhalten.
Um 200 ul einer Plasmaprobe durch Zentrifugieren zu erhalten, sind gewöhnlich 1,5 bis 2 ml Gesamtblut erforderlich. Selbst bei sorgfältiger Durchführung der Zentrifugierung und der Nachbehandlung wird die minimale Menge von Gesamtblut auf etwa 500 ul geschätzt.
Andererseits ist eine erforderliche Menge einer Probe etwa 10 ul pro ein Analysengegenstand für die Messung, und demgemäß nur 100 ul für 10 Gegenstände, und 200 ul für 20 Gegenstände. Trotzdem werden in Krankenhäusern oder dergleichen 2 bis 20 ml Blut tatsächlich abgezogen, was 50 bis 100 Mal soviel ist, wie die erforderliche Plasmamenge. Jede Person, selbst eine gesunde Person, erleidet mentale und physische Schmerzen, wenn die Nadel der Spritze in das Blutgefäß eingesetzt wird und Blut abgezogen wird. Beson ders Personen mit konstitutionell dünnen Blutgefäßen und kranke Personen, die an unvorstellbaren Schmerzen beim Abziehen von Blut leiden, sowie Patienten, denen wiederholt Blut abgezogen wird, wünschen stark, daß die Menge an abgezogenem Blut auf ein Minimum vermindert wird.
In dem Blutentnahmeraum von Krankenhäusern, Arztpraxen und Kliniken werden abgezogene Blutproben, die in ein Rohr oder eine Vakuumspritze gegeben worden sind, so wie sie sind oder im gekühlten Zustand zu einem zentralen Untersuchungsraum oder einem Untersuchungscenter transportiert. Das heißt, jedes Blut wird nach dem Transport zentrifugiert und in die festen Komponenten, wie rote Blutzellen und Plasma oder Serum, das als Analysenprobe verwendet wird, aufgetrennt. Während des Transports besteht die Möglichkeit, daß biochemische Reaktionen, die die Analyse beeinträchtigen, durch die gleichzeitige Gegenwart von roten Blutzellen ablaufen. Es werden aber nur gegen die Variationsfaktoren, von denen bekannt ist, daß sie die Analysenergebnisse erheblich beeinträchtigen, wie die Hemmung gegenüber einer Glykolyse und die Antikoagulation, getroffen. Unter Berücksichtigung der obigen Umstände wird es bevorzugt, daß das Zentrifugieren sofort nach dem Abziehen durchgeführt wird. Dies wird aber gewöhnlich nicht gemacht. Da analytische Methoden, bei denen Blutserum als Probe verwendet wird, historisch etabliert sind, ist es für die Trennung des Serums notwendig, die Koagulierung zu vervollständigen, indem mindestens 30 Minuten bis 1 Stunde stehen gelassen wird. Weiterhin, wenn Blut nach der Zugabe eines Antikoagulationsmittels zentrifugiert wird, scheiden sich gelegentlich Fibrine zwischen dem Zentrifugieren und der Messung in dem Analysator, entsprechend den Proben, ab. Diese Umstände können Schwierigkeiten im Übertragungssystem, wie in der Pipettierspritze oder den Röhrchen, in dem Analysator bewirken.
Es ist daher anzustreben, Serumproben durch Zentrifugieren innerhalb etwa 1 Stunde nach dem Abziehen des Bluts zu erhalten. Obgleich dies bei der Analyse in Krankenhäusern möglich ist, variiert im Falle von Analysezentren, bei denen eine gewisse Zeit für den Transport der Proben erforderlich ist, die Zeit der Durchführung der Zentrifugierung ziemlich stark und die Zentrifugierung wird oftmals nach einem Tag oder mehreren durchgeführt.
Als analytisches Verfahren, das die Nachteile im Zusammenhang mit der Herstellung und Zuführung der Proben überwunden hat, sind solche mit vielen trockenen analytischen Elementen (auch als analytische Filme, mehrschichtige Teststreifen oder dergleichen bezeichnet) entwickelt worden, wobei alle für die qualitative oder quantitative Analyse notwendigen Reagentien in das Testpapier oder ein analytisches Element, wie einen mehrschichtigen analytischen Film, eingearbeitet worden sind. Solche Produkte sind im Handel.
Die trockenen analytischen Elemente haben die folgenden Eigenschaften.
1) Alle für die Analyse erforderlichen Reagentien sind in das analytische Element eingearbeitet.
2) Die für die Analyse erforderlichen Reaktionen treten lediglich durch Auftüpfeln einer Probe (gewöhnlich Plasma, Serum oder Urin, wie bei Teilgegenständen, Gesamtblut) auf.
Ein analytisches Element dieses Typs wird in der EP-A- 0 162 301 beschrieben. Dieses Dokument beschreibt ein integrales, mehrschichtiges analytisches Element vom Trockentyp. Es wird darin gelehrt, ein Reagens, das an der Erfassungs- bzw. Nachweisreaktion teilnimmt, in die sogenannte "Reagensschicht" des analytischen Elements einzuarbeiten.
Die trockenen analytischen Elemente werden grob, je nach ihrem Anwendungsgebiet, in drei Gruppen aufgeteilt.
Gruppe 1: Das Ziel ist die Screeninganalyse durch praktische Ärzte und Zuhause. Die Ergebnisse können qualitativ (+/-) oder semiquantitativ (etwa 5 Grade) durch visuelle Beobachtung abgeschätzt werden.
Gruppe 2: Der Meßort kann relativ frei ausgewählt werden, indem ein Analysator, der durch kompakte Größe und einfache Verfahrensführung charakterisiert ist, kombiniert wird. Verwendet in Notfall- Untersuchungsräumen, Kinderhospitälern, Arztpraxen, kleinen Krankenhäusern, etc.
Gruppe 3: Verwendet für die Durchführung von Routine- Messassays in Krankenhäusern oder Assayzentren unter Verwendung von vollautomatischen Analysenapparaten.
Die Konstruktion und der Gehalt der analytischen Elemente unterscheiden sich je nach der obigen Klassifizierung.
Repräsentative analytische Elemente der Gruppe 1 sind Urin-Testpapier und Blutzucker-Testpapier. Die Analysedurchführung mit diesen Papieren ist einfach und es ist kein Analyseapparat erforderlich. Die Ergebnisse sind aber grob (wie normal oder anormal), und es wird davon ausgegangen, daß im Notfall eine erneute Messung der Probe durch eine andere Analyseneinrichtung erfolgt, die dazu imstande ist, ein quantitatives Ergebnis zu liefern.
Bei analytischen Elementen entsprechend dieser Methode sind keine Spezialisten, wie klinische Assay-Ingenieure, Ärzte und Krankenschwestern, erforderlich. Üblicherweise können Urin oder Gesamtblut als Probe ohne irgendeine Vor behandlung verwendet werden.
Das Ziel der analytischen Elemente der Gruppe 2 ist die quantitative Analyse, und die quantitative Messung mittels eines Apparates ist in Betracht gezogen. Der Betrieb ist relativ einfach, obgleich nicht einfacher, als im Falle von Gruppe 1. Auch hier ist kein Spezialist, wie ein klinischer Test-Ingenieur, erforderlich. Was die Proben betrifft, sind analytische Elemente allmählich entwickelt worden, die für Gesamtblut, Plasma, Serum oder Urin geeignet sind. Analysengegenstände, die durch das Gesamtblut meßbar sind, sind immer noch 10, und mehrere Gegenstände davon sind relativ eingeschränkt.
Die Proben, die für vollautomatisierte Analysenapparate in Gruppe 3 geeignet sind, sind im allgemeinen auf Plasma, Serum und Urin beschränkt. Gesamtblut kann nicht als Probe verwendet werden. Die Meßgegenstände sind aber allmählich erhöht worden, und es sind schon analytische Elemente zur Messung von mindestens 40 Gegenständen entwickelt worden.
Bei den trockenen analytischen Elementen müssen aber alle für die Reaktionen erforderlichen Reagentien in das analytische Element eingearbeitet werden. Trotzdem unterscheiden sich die Eigenschaften der Reagentien entsprechend der Analysengegenstände, und als Ergebnis tritt das große Problem auf, daß erheblicher Arbeitsaufwand, erhebliche Zeit und erhebliche Einrichtungskosten verbraucht werden durch Entwickeln der Rezeptur und Optimierung der Herstellungsbedingungen.
Außerdem ist es notwendig - wenn alle Reagentien enthalten sind - ausreichende Trockenbedingungen für den Vorrat an analytischen Elementen über eine lange Zeitspanne beizubehalten. Zu diesem Zweck wird üblicherweise jedes analytische Element in eine feuchtigkeitsdichte Verpackung gegeben, und, wenn nötig, wird ein Trockenmittel in die Packung gegeben.
Selbst wenn die Trockenverpackung und Kühlkonservierung verwendet werden, beträgt die Lagerzeit nur 1 bis 2 Jahre, was den Preis der trockenen analytischen Elemente erhöht.

Zusammenfassung der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Messen eines Analyten bereitzustellen, das ein akurates Ergebnis bei einfacher Arbeitsweise liefern kann, unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements, das in einem einfachen Verfahren hergestellt und während langer Zeit konserviert werden kann und das mit einer sehr kleinen Menge einer Körperflüssigkeit, wie Gesamtblut, Plasma, Serum oder Urin als Probe verwendet werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Konservieren und Transportieren eines analytischen Elements, zu dem eine Körperflüssigkeit wie Blut, eine biologische Probe oder eine wäßrige Lösungsprobe zugegeben worden ist, unter Beibehaltung einer ausreichenden analytischen Genauigkeit.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das in der Lage ist, ein analytisches Element zu messen, dem eine Probe zugesetzt und dann konserviert worden ist.
Dies ist selbst dann der Fall, wenn eine Geschwindigkeitsanalyse erforderlich ist, wie eine Enzymreaktion.
Erfindungsgemäß wird das obige Ziel durch ein Verfahren zur quantitativen Messung eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements, das mindestens eine hydrophile Polymerschicht und eine Ausbreitungsschicht, die in dieser Reihenfolge laminiert sind, umfaßt, wobei die Ausbreitungsschicht die Funktion hat, daß sie gleichmäßig die in der wäßrigen flüssigen Probe, enthaltend den Analyten, enthaltenen Komponenten ausbreitet, um die Komponenten der hydrophilen Polymerschicht mit einer konstanten Geschwindigkeit pro Flächeneinheit zuzuführen, umfassend:
Zuführung der flüssigen Probe zu dem analytischen Element,
Trocknung des analytischen Elements, dem die flüssige Probe zugeführt worden ist, bei einer Temperatur von 10 bis 60ºC bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt des hydrophilen Polymeren von weniger als 20%,
Zuführung einer Lösung, enthaltend ein Meßreagens, das sich direkt mit dem Analyten umsetzt, um eine optisch erfaßbare, chemische Veränderung hervorzurufen, zu dem getrockneten analytischen Element, und
Messung der chemischen Veränderung durch optisches Mittel,
gelöst.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Fig. 1 bis 4 sind Teilquerschnitte von erfindungsgemäßen analytischen Elementen.
Die Fig. 5 ist eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße Verfahrensweise zeigt.
Die Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Harnstoffstickstoff-Konzentration einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren und der optischen Reflexionsdichte, zeigt.
Die Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Harnstoffstickstoff-Konzentration einer Plasmaprobe, gemessen durch das erfindungsgemäße Verfahren, und derje nigen, gemessen durch das Lösungsverfahren, zeigt.
Die Fig. 8 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Harnstoffstickstoff-Konzentration einer Gesamtblutprobe, gemessen durch das erfindungsgemäße Verfahren, und derjenigen, gemessen durch das Lösungsverfahren, zeigt.
Die Fig. 9 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konservierungszeit und dem Meßwert der Harnstoffstickstoff-Konzentration eines Kontrollserums zeigt.
Die Fig. 10 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konservierungszeit und dem Meßwert der Harnstoffstickstoff-Konzentration einer Gesamtblutprobe zeigt.
Die Fig. 11 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Kreatininkonzentration eines Kontrollserums, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 12 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Kreatininkonzentration einer Plasmaprobe, gemessen durch das erfindungsgemäße Verfahren, und derjenigen, gemessen durch das Lösungsverfahren, zeigt.
Die Fig. 13 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der GGT-Aktivität eines Kontrollserums, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 14 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konservierungszeit und dem Meßwert der GGT-Aktivität einer Plasmaprobe zeigt.
Die Fig. 15 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der GOT-Aktivität einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 16 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der GPT-Aktivität einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 17 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Konservierungszeit und dem Meßwert der GPT-Aktivität eines Kontrollserums zeigt.
Die Fig. 18 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Calciumkonzentration einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 19 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Gesamtcholesterin-Konzentration einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.
Die Fig. 20 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der GPT-Aktivität einer Probe, gemessen durch das Lösungsverfahren, und der optischen Reflexionsdichte zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Ausbreitungsschicht hat die Funktion, die in der wäßrigen, flüssigen Probe enthaltenen Komponenten in einer Ebene ohne ungleichförmige Verteilung auszubreiten, und sie zu der hydrophilen Polymerschicht mit konstanter Geschwindigkeit pro Flächeneinheit zuzuführen. Sie kann aus jedem nichtfaserartigen oder faserartigen porösen Material bestehen, das für die Ausbreitungsschicht von herkömmlichen trockenen analytischen Elementen bekannt ist. Beispiele für die Ausbreitungsschicht sind nichtporöse, isotrope mikroporöse Mediumschichten, repräsentiert durch Membranfilter (Rotpolymeres), beschrieben in der US-PS 3 992 158, nichtfaserige, poröse Schichten, repräsentiert durch eine dreidimensionale, gitterförmige Kornstruktur schicht, enthaltend kontinuierliche Räume, bei der Polymerteilchen an Flächen durch einen in Wasser nicht quellenden Klebstoff verbunden sind, beschrieben in der US-PS 4 258 001, poröse Schichten, bestehend aus gewebten Tuch, beschrieben in der US-PS 4 292 272, GB 2 087 074A, etc., poröse Schichten, bestehend aus gewirkten Textilien, beschrieben in EP 0 162 302A, und dergleichen.
Die Ausbreitungsschicht kann aus zwei oder mehreren mikroporösen Schichten bestehen, wie in der EP 0 166 365A, EP 0 226 465A, etc., beschrieben. Was ein mehrschichtiges analytisches Element betrifft, bei dem zwei oder mehrere poröse Schichten aufeinander gelegt sind, ist es erforderlich, eine Konstruktion zu haben, daß alle Schichten integral zum Zeitpunkt des Auftüpfelns der Probe laminiert sind, doch ist es nicht erforderlich, daß diese bei den nachfolgenden Verfahrensstufen integriert sind. Gegebenenfalls kann das analytische Element in einem Zustand verwendet werden, daß die erste poröse Schicht von der zweiten porösen Schicht getrennt ist.
Die Ausbreitungsschicht kann ein nichtionisches, anionisches, kationisches oder ampholytisches Netzmittel enthalten, um das Ausbreiten der Probe zu beschleunigen. Daneben kann es ein Ausbreitungskontrollmittel, wie ein hydrophiles Polymeres, enthalten, um das Ausbreiten zu kontrollieren. Weiterhin kann es alle oder einen Teil der verschiedenen Reagentien zur Beschleunigung der Zielerfassungsreaktion oder zur Reduzierung oder Hemmung von störenden Reaktionen enthalten.
Eine geeignete Dicke der Ausbreitungsschicht ist 20 bis 200 um, bevorzugt 50 bis 170 um, mehr bevorzugt 80 bis 150 um.
Die hydrophile Polymerschicht kann aus verschiedenen bekannten Polymeren, die wasserlöslich, quellbar und hydro phil sind, und die für herkömmliche analytische Elemente verwendet werden, bestehen. Das hydrophile Polymere ist im allgemeinen ein natürliches oder synthetisches hydrophiles Polymeres mit einem Quellverhältnis im Bereich von etwa 1,5 bis etwa 20mal, vorzugsweise etwa 2,5 bis etwa 15mal, bei einer Wasserabsorption bei 30ºC. Beispiele für das hydrophile Polymer sind Gelatine, wie säurebehandelte Gelatine und entionisierte Gelatine, Gelatinderivate, wie phthalalierte Gelatine und Hydroxyacrylat-gepfropfte Gelatine, Agarose, Pullulan, Pullulanderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Anstelle der hydrophilen Polymerschicht kann Papier oder eine poröse Polymermembran mit einer hydrophilen Oberfläche verwendet werden.
Eine geeignete Dicke der hydrophilen Polymerschicht ist etwa 1 bis 100 um, vorzugsweise etwa 3 bis 50 um, mehr bevorzugt etwa 5 bis 30 um. Es wird bevorzugt, daß die hydrophile Schicht im wesentlichen transparent ist. Die hydrophile Polymerschicht kann alle oder einen Teil der verschiedenen Reagentien zur Beschleunigung der Zielerfassungsreaktion oder zur Reduzierung oder Hemmung von Störreaktionen enthalten.
Der wasserundurchlässige Träger kann ein bekannter wasserundurchlässiger Träger sein, der bei herkömmlichen trockenen analytischen Elementen verwendet wird. Beispiele hierfür sind transparente Filme aus Polyethylenterephthalat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol, Celluloseester, wie Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat oder Celluloseacetatpropionat, und dergleichen. Die Dicke des Trägers liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 50 um bis etwa 1 mm, vorzugsweise von etwa 80 um bis etwa 300 um. Der Träger ist gewöhnlich lichtdurchlässig, doch kann er im Falle der Messung von der Seite der Ausbreitungsschicht gefärbt oder opaque sein. Der Träger kann mit einer Unterschicht auf seiner Oberfläche versehen sein, um die Haftung der hydro philen Polymerschicht zu verstärken.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der zu messende Analyt keinen Beschränkungen unterworfen, und jeder Analyt, der gewöhnlich auf dem Gebiet von klinischen Assays untersucht wird, und für den es ein eingeführtes analytisches Verfahren gibt, kann gemessen werden. Beispiele sind Enzyme, Lipide, anorganische Ionen, Metabolite, Proteine, verschiedene Komponenten, erhalten aus dem lebenden Körper, wie Globuline, Antigene und Antikörper, Arzneimittel, Hormone und Tumormarker.
Das erfindungsgemäß verwendete trockene analytische Element kann verschiedene Konstruktionen, wie nachstehend beschrieben, entsprechend dem Analysengegenstand oder der zu messenden Probe, haben. Einige fundamentale Schichtkonstruktionen werden in den Fig. 1-4 angegeben.
1. Analytisches Element mit einer Schichtkonstruktion wasserundurchlässiger Träger/hydrophile Polymerschicht/Ausbreitungsschicht:
Dieses analytische Element ist für die Analyse von Ca, GOT (Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase), GPT (Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase), γ-GTP (γ-Glutamyl-Transpeptidase), Glucose, LDH (Lactatdehydrogenase), CPK (Creatinphosphokinase), TP (Gesamtprotein), Alb (Albumin), Tcho (Gesamtcholesterin), UA (Harnsäure), neutrale Fette, etc., geeignet.
2. Analytisches Element mit einer Schichtkonstruktion wasserundurchlässiger Träger/hydrophile Polymerschicht /Ausbreitungsschicht, das ein Chromogen in der hydrophilen Polymerschicht und/oder Ausbreitungsschicht enthält:
Das für die Zwecke der Erfindung geeignete Chromogen schließt folgendes ein: 4-Aminoantipyrin (Synonym: 4- Aminophenazon, das heißt 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on), beschrieben in Ann. Clin. Biochem., 6, 24-27 (1969), und 4-Aminoantipyrinanaloge, wie trisubstituiertes 4-Amino-2-pyrazolin-5-on, wie 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on und 1-(3,5- Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on, beschrieben in EP 0 103 901A, und 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4- dimethylamino-3-pyrazolin-5-on, beschrieben in der US-PS 3 886 045. Bevorzugte Verbindungen sind 4-Aminoantipyrin, 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on, 1-(3,5-Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on, und dergleichen.
3. Analytisches Element mit einer Schichtkonstruktion wasserunlöslicher Träger/hydrophile Polymerschicht/Ausbreitungsschicht, das Chromogen und andere Reagentien (ausgenommen das später beschriebene Meßreagens) in der hydrophilen Polymerschicht und/oder Ausbreitungsschicht enthält:
Beispiele für die anderen Reagentien sind POP (Peroxidase), NAD (Nikotinamidadenindinukleotid), NADP (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat), DIP (Diaphorase), etc.
Bei den obigen Konstruktionen von 2 und 3 können das Chromogen und die anderen Reagentien, nach dem Zuführen der flüssigen Probe, zugeführt und dann stabilisiert werden. Dies wird deswegen bevorzugt, weil die meisten Chromogene wasserunlöslich sind und es daher erforderlich ist, sie getrennt zuzusetzen. Eine bessere Reproduzierbarkeit kann erhalten werden, indem ein analytisches Element hergestellt wird, bei dem das Chromogen und die anderen Reagentien zuvor in die vorgeschriebene Schicht eingearbeitet worden sind.
4. Analytisches Element, enthaltend ein Beizmittel:
Im Falle, daß das Färbungsreagens einen ionischen Farbstoff bildet, kann eine Beizmittelschicht zwischen dem wasserundurchlässigen Träger und der Reagensschicht vorgesehen werden. Die Wirksamkeit der optischen Erfassung kann verbessert werden, indem der Farbstoff, der im Verhältnis zu der Menge des Analyten in einer Probe erzeugt wird, in die Beizmittelschicht überführt wird, und daß dort das Einfangen erfolgt.
So kann beispielsweise im Falle der Bildung eines kationischen Farbstoffs durch die Färbungsreagentien eine hydrophile Polymerschicht, enthaltend ein Polymeres mit einem anionischen Atom oder einer Atomgruppe, gebunden an die Polymerkette, als Beizmittelschicht verwendet werden. Im Falle der Bildung eines anionischen Farbstoffs durch die Färbereagentien kann eine hydrophile Polymerschicht, enthaltend ein Polymeres mit einem kationischen Atom oder einer Atomgruppe, gebunden an die Polymerkette, verwendet werden.
Die Beizmittelpolymeren werden im Detail in der JP-PS KOKOKU Nr. 2-30466, US-PS 4 042 335, US-PS 4 166 093, US- PS 4 144 306, etc., beschrieben.
Beispielsweise sind anionische Beizmittelpolymere Alkalihydrolysate von Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid- Copolymeren, Alkalimetallsalze oder Erdalkalimetallsalze von Polystyrol-p-sulfonsäure, Alkalimetallsalze oder Erdalkalimetallsalze eines Copolymeren von Styrol-p- sulfonsäure und einem hydrophilen Vinylmonomeren, und dergleichen, wie in den Spalten 23-14 der JP-PS KOKOKU Nr. 2- 30466 beschrieben. Die japanische Patentschrift beschreibt weiterhin in den Spalten 15-16 Schichten, die dazu imstande sind, die obigen Polymeren eingearbeitet zu enthalten.
5. Analytisches Element mit einer Schichtkonstruktion wie oben unter 1-4 beschrieben, mit der Maßgabe, daß eine Lichtabschirmschicht zwischen der hydrophilen Polymerschicht und der Ausbreitungsschicht vorgesehen ist:
Gesamtblutproben können so wie sie sind verwendet werden. Die Lichtabschirmschicht ist eine wasserdurchlässige Schicht, bei der Teilchen mit einer Lichtabschirmfähigkeit oder einer Lichtabschirmfähigkeit und einer Lichtreflexionsfähigkeit in einer kleinen Menge eines hydrophilen Polymer-Bindemittels mit filmbildenden Eigenschaften dispergiert ist und davon getragen wird. Die Lichtabschirmschicht schirmt die Farbe einer wäßrigen Flüssigkeitsprobe, insbesondere die rote Farbe von in der Gesamtblutprobe enthaltenem Hämoglobin, ab, wenn die erfaßbare Veränderung (Farbveränderung, Färbung, etc.) durch Reflexionsphotometrie von der Seite des lichtdurchlässigen Trägers gemessen wird. Sie wirkt auch als Lichtreflexionsschicht oder als Hintergrundschicht.
Teilchen mit lichtabschirmender Fähigkeit und lichtreflektierender Fähigkeit schließen beispielsweise Titandioxidteilchen (mikrokristalline Teilchen mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 um bis ca. 1,2 um vom Rutiltyp, Anatastyp oder Brookittyp, etc.), Bariumsulfatteilchen, Aluminiumteilchen und Mikroflocken ein. Teilchen mit lichtabschirmender Fähigkeit schließen Ruß, Gasruß und Kohlenstoffteilchen ein. Unter diesen werden Titandioxidteilchen und Bariumsulfatteilchen bevorzugt.
Was das hydrophile Polymere-Bindemittel mit filmbildender Eigenschaft betrifft, so handelt es sich um die vorgenannten hydrophilen Polymeren und regenerierte Cellulose und Celluloseacetat, und dergleichen, die schwach hydrophil sind. Bevorzugte Materialien sind Gelatine, Gelatinderivate, Polyvinylalkohol, Polyacrylamid, Maleinsäure-Copolymere und dergleichen. Im Falle von Gelatine und Gelatinde rivaten kann ein bekanntes Härtungsmittel (Vernetzungsmittel) zugesetzt werden.
6. Analytisches Element mit einer Schichtkonstruktion, wie oben unter 1-4 beschrieben, mit der Maßgabe, daß eine wasserundurchlässige, gasdurchlässige Schicht (Schrankenschicht) zwischen der hydrophilen Polymerschicht und der Ausbreitungsschicht vorgesehen ist:
Dieses analytische Element ist für die Analyse von BUN (Harnstoffstickstoff) und CRE (Creatinin) unter Freisetzung von Ammoniakgas, CO&sub2;, etc., geeignet. Sowohl Gesamtblut als auch Plasma können als Probe verwendet werden. Die für die Zwecke der Erfindung geeignete Schrankenschicht schließt eine gleichförmige Beschichtungsschicht aus einem gleichförmigen Polymeren, wie in der US-PS 4 066 403 beschrieben, ein Membranfilter, wie in der US-PS 4 548 906 beschrieben, und dergleichen, ein.
Erfindungsgemäß wird unter dem Meßreagens ein Reagens verstanden, das sich direkt mit dem Analyten unter Erzeugung einer chemischen Veränderung umsetzt. Im Falle, daß ein Enzym der Analyt ist, ist das Meßreagens ein Substrat davon, und im Falle, daß der Analyt ein Antigen (Antikörper) ist, dann ist es ein Antikörper (Antigen). Im Falle, daß die Erfassungsreaktion durch ein Enzym initiiert wird, ist das Meßreagens das Enzym, und im Falle, daß die Erfassungsreaktion durch eine allgemeine chemische Reaktion induziert wird, ist es die entsprechende chemische Substanz.

Beispiele werden nachfolgend angegeben:

Im Falle, daß der Analyt GOT ist, ist das Meßreagens Asparaginsäure und Glutaminsäure, und im Falle von Amylase ist es Stärke mit einem hohen Molekulargewicht oder ein Oligosaccharid mit niedrigem Molekulargewicht. Im Falle von GGT ist es Paranitrophenylanilid, und im Falle von ALP ist es Paranitrophosphophenylanilid, etc. Im Falle von Glucose ist es Glucoseoxidase, und im Falle von Harnsäure ist es Urikase. Im Falle von Cholesterin ist es Cholesterinesterase oder Cholesterinoxidase, und im Falle von Neutralfetten ist es Lipase oder Esterase, etc. Im Falle, daß sich der Indikator direkt mit einem Analyten umsetzt, wie Protein, Albumin, Ca, anorganischer Phosphor, etc., ist es der Indikator. Obgleich die obigen Reagentien in das analytische Reagens eingearbeitet werden können, wird hierdurch in vielen Fällen die Stabilität des Produkts nach der Reaktion verschlechtert. Es ist daher von Vorteil, daß die Lösung des Meßreagenses gesondert hergestellt wird.
Da es eine Aufgabe der Erfindung ist, die Zersetzung des Erfassungsreagenses während der Lagerung, was ein Nachteil der herkömmlichen analytischen Elemente darstellt, zu verhindern, wenn ein in das analytische Element eingearbeitetes Reagens instabil ist, wie es bei manchen Enzymen der Fall ist, wird das Reaktionsreagens vorzugsweise in die Meßreagenslösung eingearbeitet. Das heißt, hinsichtlich der Verteilung zwischen den Reagentien, die in die Meßreagenslösung eingearbeitet werden und denjenigen, die in das analytische Element eingearbeitet werden, kann eine Variierung erfolgen, wobei das analytische Verhalten und die Lagerungsstabilität als Indikator verwendet werden. Im Falle eines Analyten unterscheidet sich die obige Verteilung je nach der Konstruktion des Erfassungsreaktionssystems.
Verschiedene Reagentien können in die Meßreagenslösung eingearbeitet werden, um den pH-Wert oder die Ionenstärke so einzustellen, daß die Reaktion unter Erhalt einer guten Reproduzierbarkeit stabil voranschreitet, um die Diffusion und die Permeation in die Materialien zu verbessern, die das analytische Element bilden, damit die Instabilität des Enzyms etc., das darin enthalten ist, oder dergleichen, verbessert wird. Es können auch Reagentien zur Hemmung von Konkurrenzreaktionen für die Erfassungsreaktion eingear beitet werden. Ein solches Reagens ist beispielsweise Bilirubinoxidase, Ascorbatoxidase, etc. Weiterhin kann eine Verbindung, die ein Enzym hemmt, das sich von einem bestimmten Organismus ableitet, wie beispielsweise ein Inhibitor der p-Typ-Amylase, zugesetzt werden, damit ein Isoenzym erfaßt wird. Im Falle der Messung von Gesamtblutproben können NaN&sub3; oder dergleichen zugesetzt werden, die als Inhibitor der Katalaseaktivität von Hämoglobin wirksam sind.
Im Hinblick auf Herstellung, Abpackung, Transport, Lagerung, Meßvorgänge, etc., wird das erfindungsgemäße mehrschichtige Analyseelement vorzugsweise zu quadratischen oder kreisförmigen Stücken mit einer Seite oder einem Durchmesser von etwa 15 mm bis etwa 30 mm zerschnitten, und in einen Gleitrahmen, wie es in der JP-PS KOKAI Nr. 57-63452, US-PS 4 169 751, US-PS 4 387 990, der PCT- Anmeldung WO 83/00391 beschrieben wird, für den Gebrauch eingesetzt. Es kann aber auch zu einem Stäbchen verformt werden, das einem Urin-Testpapier etc., ähnlich ist.
Im Falle, daß die Zeitspanne von der Zuführung der flüssigen Probe bis zu der Zuführung der Meßreagentien lang ist, wird es bevorzugt, daß das analytische Element über eine fixierte Zeitspanne, bei im wesentlichen fixierten Bedingungen, nach der Zuführung einer flüssigen Probe getrocknet wird. Bevorzugte Trocknungsmethoden und -bedingungen werden im Detail in der JP-PS KOKAI Nr. 3-289543 von Seite 25, Zeile 9, bis Seite 28, Zeile 6, insbesondere von Seite 27, Zeile 13, bis Seite 28, Zeile 6, beschrieben. Eine besonders bevorzugte Methode besteht darin, das analytische Element nach dem Eingeben in eine Umhüllung dahingehend, daß der Umfang des analytischen Elements bedeckt ist, zu erhitzen. Durch Anwendung dieser Methode kann ein im wesentlichen konstanter Trocknungszustand ohne den Einfluß der Umgebungstemperatur und der Feuchtigkeit erhalten werden. Ein geeigneter Temperaturbereich ist 10 bis 60ºC, vorzugsweise 20 bis 45ºC, mehr bevorzugt 30 bis 40ºC. Eine geeignete Temperaturvariierung während der Inkubierung ist ± 5ºC, vorzugsweise ± 3ºC, mehr bevorzugt ± 1ºC. Ein Inkubator, der für die obige Inkubation, die unter im wesentlichen fixierten Bedingungen durchgeführt wird, geeignet ist, wird im japanischen Gebrauchsmuster KOKAI Nr. 3-126499 beschrieben. Der Inkubator ist so konstruiert, daß ein analytisches Element in seinen Aufnahmeteil eingebracht wird. Es wird durch eine Heizeinrichtung erhitzt und bei konstanter Temperatur gehalten. Der Inkubator ist mit einem abnehmbaren Deckel versehen, der den Elementaufnahmeteil am oberen Teil des Aufnahmeteils abdichten kann, und das Volumen des Raums, des in dem durch den Deckel abgeschlossenen Elementaufnahmeteil gebildeten Raums, ist so ausgebildet, daß es fast mit dem Volumen des analytischen Elements gleich ist. Ähnlich gute reproduzierbare Ergebnisse können erhalten werden, indem getrocknete Luft mit fixierter Temperatur, unter im wesentlichen fixierten Bedingungen, darüber geblasen wird. Dieses Verfahren ist aber wegen der im Vergleich zu dem obigen Inkubator hohen Kosten von Nachteil.
Hierin wird unter dem Begriff "getrocknet" der Zustand verstanden, daß im wesentlichen keine Reaktionen ablaufen oder daß keine Zersetzung des Analyten erfolgt. Demgemäß bestehen entsprechend dem Analyten Unterschiede. Beispielsweise ist im Falle von Enzymen der Feuchtigkeitsgehalt in dem hydrophilen Polymeren weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 20%, mehr bevorzugt weniger als 10%.
Im Falle, daß der Zeitraum von der Herstellung des analytischen Elements, das in einem Zustand hergestellt wurde, daß praktisch keine Reaktionen ablaufen bis zu der Zuführung der Meßreagenslösung lang ist, beispielsweise im Falle, daß das analytische Element an ein Krankenhaus oder dergleichen geschickt wird, ist es erforderlich, daß das analytische Element bei Bedingungen gehalten wird, bei de nen Feuchtigkeit und Luft praktisch ausgeschlossen sind. Die Details der Konservierung werden gleichfalls in der JP-PS KOKAI Nr. 3-289543 von Seite 28, Zeile 12, bis Seite 30, Zeile 11, beschrieben. Beispielsweise kann das analytische Element in einem Metallkasten oder einem Beutel, hergestellt aus einem wasserundurchlässigen organischen Polymeren oder einem Metallfilm oder -folie, versehen mit einem Mittel zur Entfernung von Feuchtigkeit, eingeschweißt werden. Als Mittel zur Entfernung von Feuchtigkeit kann ein Feuchtigkeitsabsorptionsmittel, das den Analyt nicht denaturiert, aus bekannten Mitteln ausgewählt und eingegeben werden. Eine andere Möglichkeit ist es, die Luft aus dem Beutel durch genügendes Wischen nach dem Eingeben des analytischen Elements herauszubefördern.
Die Analyse unter Verwendung des vorgenannten trockenen analytischen Elements erfolgt nach folgender Methode. Zu dem analytischen Element, das mit einer Flüssigkeitsprobe versehen worden ist, und das nicht getrocknet oder getrocknet worden ist, und das aus dem obigen dicht verschlossenen Behälter herausgenommen wird, wird die Meßreagenslösung entsprechend dem Analysengegenstand gegeben. Die Reaktion erfolgt und der in der Probe enthaltene Analyt wird dadurch bestimmt, daß die Reaktion unter Verwendung einer bekannten Methode (Reflexionsphotometrie, Farbveränderung, Fluormetrie, Emissionsphotometrie, etc.) bei der Trockenanalysemethode gemessen wird.
Als Meßreagenslösung kann eine bekannte Reagenslösung der Naßanalyse verwendet werden. Die Reagentien setzen sich mit dem Analyten unter Erzeugung einer Veränderung, hauptsächlich einer Veränderung, die durch optische Meßmethoden, wie eine Farbveränderung, eine Färbung, eine Fluoreszenz, eine Lumineszenz, eine Absorptionswellenlängenveränderung im Ultraviolettbereich, Bildung einer Trübung, etc., erfaßbar ist.
Als Meßmethode bei der trockenen Analyse wird gewöhnlich ein optisches Reflexionssystem verwendet. Bei der erfindungsgemäßen Methode hat die Photometrie, durchgeführt durch den wasserunlöslichen Träger des analytischen Elements, den breitesten Anwendungsbereich. Jedoch kann im Falle, daß die Probe kein Gesamtblut ist oder daß die Messung nach Entfernung der Ausbreitungsschicht durchgeführt wird, die Messung durch Messung des durchgegangenen Lichts erfolgen. Wenn der wasserundurchlässige Träger opaque ist, dann kann die Messung von der dem Träger gegenüberliegenden Seite durchgeführt werden.
Die Konservierung des erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements kann auf jedem Gebiet verwendet werden, das den vorgenannten Gruppen 1 bis 3 entspricht. Sie ist auch für einen klinischen medizinischen Assay bei der Untersuchung zuhause wirksam.
Im Falle, daß Blut als Probe verwendet wird, kann, weil trockene analytische Elemente nur eine sehr kleine Blutmenge benötigen, das Blut unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung, wie einer Kapillarpipette, abgezogen werden. Wenn das trockene analytische Element für Gesamtblut verwendbar ist, dann kann das abgezogene Blut als flüssige Probe zur Messung, so wie sie ist, eingesetzt werden und das Element ist daher besonders gut zur Inspektion zuhause geeignet. Wenn das trockene analytische Element für Plasma oder Serum verwendet wird, dann wird das Plasma oder das Serum von dem abgezogenen Blut durch Zentrifugieren oder Stehenlassen abgetrennt und als flüssige Meßprobe verwendet. Bei anderen Körperflüssigkeiten als Blut, wie Urin und Speichel, wird eine geeignete Menge in einen Behälter gegeben und direkt als Probe verwendet.
Die obigen Proben werden zu dem erfindungsgemäß verwendeten trockenen analytischen Element gegeben, gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren konserviert, erforderlichenfalls transportiert und nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren analysiert. Es ist möglich, den Transport durch die Post oder einen Kurierdienst vorzunehmen. Es besteht eine genügende Eignung für die Untersuchung zuhause. Eine Verfahrensweise des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in Fig. 5 gezeigt. Das analytische Element besteht aus einer Blutzellen-Filtrationsschicht, einer Ausbreitungsschicht, einer hydrophilen Polymerschicht und einem Träger, laminiert in dieser Reihenfolge. Es sind keine Meßreagentien enthalten. Eine Gesamtblutprobe wird auf die Blutzell- Filtrationsschicht des analytischen Elements aufgetüpfelt und die Blutzellen-Filtrationsschicht wird abgezogen. Dann wird das analytische Element zur Entwässerung getrocknet und in eine Packung eingepackt, die dazu imstande ist, den getrockneten Zustand aufrecht zu erhalten. Die Packung wird transportiert und das analytische Element wird in einen automatischen Analysator, zusammen mit der Meßreagenslösung, eingebracht. Dann wird die Analyse durchgeführt und das Ergebnis wird erhalten.
Da das erfindungsgemäße trockene analytische Element keine instabilen Meßreagentien enthält, ist die Lagerungszeit im Vergleich zu herkömmlichen trockenen analytischen Elementen stark verbessert. Da weiterhin bei der herkömmlichen Naßanalyse verwendete Meßreagentien verwendet werden können, ist es nicht erforderlich, analytische Elemente für jeden Meßgegenstand zu entwickeln. Weiterhin kann eine Art des analytischen Elements für viele Gegenstände angewendet werden. Es ist daher billig.

BEISPIELE

Beispiel 1 Messung von Harnstoffstickstoff (BUN) in Plasma

1 Herstellung der Meßreagenslösung

Urease, hergestellt von Toyo Boseki, wurde in 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,5% Triton X-100TM (eingetragenes Warenzeichen von Rohm und Haas (USA)), aufgelöst, um eine UN-Reagenslösung mit einer Ureaseaktivität von 75.000 E/l herzustellen. Nach der Herstellung wurden jeweils 500 ul der Lösung in Kunststoffröhrchen einpipettiert und im gefrorenen Zustand bei -80ºC gelagert.

2 Herstellung der Standardlösung für Plasma

Private Kontrollseren CP-L, CP-M und CP-H (hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) für "Fuji Dry Chem" wurden als Proben verwendet. Ihre BUN-Werte wurden unter Verwendung von "Hitachi 7050" (hergestellt von Hitachi Ltd.) gemessen. Es wurde folgendes gefunden: CP-1 = 11,4 mg/dl, CP-M = 67 mg/dl und CP-H = 101 mg/dl.

3 Herstellung des analytischen Elements

Auf einen transparenten PET-Film, mit einer Dicke von 180 um, wurde die folgende Unterschicht aufgebracht und dann getrocknet:

Unterschicht

Polyvinylmethylether (Molekulargewicht: Etwa 40.000) 0,035 g/m²
p-Chlorphenol 0,7 g/m²
Die folgende Indikatorschicht wurde darauf als wäßrige Lösung aufgebracht und dann getrocknet.
Bromphenol blau 0,340 g/m²
Vinylacetat-Ethylacrylat-Copolymerlatex 8,5 g/m²
N-Polyoxyethylen-N-octansulfonamid 0,100 g/m²
Danach wurde ein Polyethylenmembranfilter mit einer mitt leren Porengröße von 0,2 um, einem Hohlraumgehalt von 75% und einer Dicke von 100 um auf die Indikatorschicht aufgelegt und damit gleichförmig verpreßt, um eine Schranken- bzw. Sperrschicht zu bilden.
Auf die Schrankenschicht wurde die folgende Reagensschicht als wäßrige Lösung aufgebracht und dann getrocknet.

Reagensschicht

Hydroxyethylcellulose 16 g/m²
(Gewichtsmittleres Molekulargewicht: Etwa 40.000, mittlerer Substitutionsgrad (DS) der Hydroxyethylgruppen 1,0-1,3, mittlere Molsubstitution (MS): 2,8-2,5)
Natriumtetraborat 4 g/m²
pH 10,0
Die obige Reagensschicht wurde fast gleichförmig mit einer 0,2%igen wäßrigen Lösung von p-Nonylphenoxypolyglycidol gequollen. Dann wurde sofort ein gewirktes Tuch (Meßzahl: 40, 25% Gewichtsverlust bei Behandeln mit wäßriger NaOH- Lösung) aufgelegt und damit durch Durchleiten zwischen Preßwalzen gleichförmig laminiert.
Weiterhin wurde die folgende Polyvinylpyrrolidon- Ethanollösung aufgebracht, um das Laminat zum Zwecke der Verbesserung der Ausbreitungsfähigkeit zu imprägnieren. Es wurde getrocknet, um ein integrales mehrschichtiges analytisches Element zur Bestimmung von Ammoniak herzustellen.
Polyvinylpyrrolidon (Mittleres Molekulargewicht: Etwa 1.200.000) 7,76 g/m²

4 Auftüpfeln der Probe und Trocknen

10 ul der auf die obige Weise hergestellten Standardlösung wurden in eine Mikropipette eingesaugt und auf das in hergestellte analytische Element aufgetüpfelt. Das analytische Element wurde in einen Inkubator für das Trocknen und die Fixierung (Fuji Photo Film Co., Ltd.) eingegeben und 10 Minuten lang dort belassen, um die Probe in dem analytischen Element zu trocknen.

5 Messung

Das in 4 getrocknete analytische Element wurde in einen "Fuji Dry Chem 5500"-Analysator eingesetzt. Die in 1 hergestellte Ureaselösung wurde in eine Pipettierungsvorrichtung eingesaugt und aufgetüpfelt. Das analytische Element wurde inkubiert. Dann wurde die optische Reflexionsdichte bei einer Wellenlänge von 650 nm auf die übliche Weise gemessen. Die Differenz zwischen der Dichte nach 1 Minute vom Beginn der Reaktion und der nach 6 Minuten wurde errechnet, um die Beziehung zwischen der Harnstoffstickstoff-Konzentration der Probe und der optischen Reflexionsdichte (Eichkurve), gemäß Fig. 6, zu ermitteln.

6 Herstellung von Gesamtblut-Plasmaproben

Variierende Harnstoffkonzentration

Heparin wurde als Antikoagulans verwendet und 10 ml venöses Blut wurden von 2 gesunden Personen abgezogen. Gesondert wurde eine 10%ige wäßrige Harnstofflösung hergestellt, indem in Kochsalzlösung aufgelöst wurde. Das venöse Blut wurde in 5 Behälter, jeweils in einer Menge von 2 ml, aufgeteilt. Wäßrige Harnstofflösungen wurden hinzugegeben, um Proben mit 5 Konzentrationsstufen herzustellen.
Weiterhin wurden 1 ml der Gesamtblutprobe bei jeder Konzentration abgenommen und zentrifugiert, um Plasmaproben herzustellen. Die Harnstoffkonzentration der Plasmaproben wurde mittels einer "Hitachi 7050"-Vorrichtung (Hitachi Ltd.) gemessen. Diejenige der Gesamtblutproben wurde unter Verwendung einer "Fuji Dry Chem 5000"-Vorrichtung (Fuji Photo Film Co., Ltd.) gemessen.

7 Erstellung der Beziehungskurve

10 ul Plasma- und Gesamtblutproben, erhalten in 6, wurden auf das analytische Element aufgetüpfelt, getrocknet und nach der gleichen Verfahrensweise wie in 4 fixiert. Danach wurde die Ureaselösung aufgetüpfelt, inkubiert und die optische Reflexionsdichte wurde nach 1 Minute und nach 6 Minuten, ähnlich wie in 5, gemessen.

8 Errechnung der Harnstoffstickstoff-Konzentration

Unter Verwendung der in 5 erhaltenen Eichkurve wurde die Harnstoffstickstoff-Konzentration in den Plasmaproben bestimmt. Wie bei den Gesamtblutproben wurde eine Eichkurve durch einen Vergleich des Meßwertes von "Fuji Dry Chem 5000", wie bei der Probe 1, mit der optischen Dichte, erhalten in 7, hergestellt. Die Harnstoffstickstoff- Konzentration wurde wie bei der Probe 2 bestimmt.

9 Herstellung der Beziehungskurve

Die Beziehung zwischen den Meßwerten von "Hitachi 7050" und den Meßwerten gemäß der Erfindung bei den Plasmaproben und den Gesamtblutproben ist in den Fig. 7 und 8 gezeigt. In beiden Fällen wurde eine gute Beziehung erhalten.

10 Bewertung der Stabilität im Verlauf der Zeit

Nach der gleichen Verfahrensweise wie in 4 wurden private Kontrollseren CP-L, CP-M und CP-H für "Fuji Dry Chem" jeweils auf 30 Stücke des analytischen Elements aufgetüpfelt und getrocknet. Die analytischen Elemente wurden in Gruppen mit jeweils 3 Stücken aufgeteilt. Jede Gruppe wurde in einen Polyethylenbeutel, zusammen mit 2 g Silicagel, gegeben. Die Beutel wurden in der Schublade eines Laboratoriumstisches bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Beutel wurden allmählich mit den ablaufenden Tagen herausgenommen und die Harnstoffstickstoff-Konzentration wurde nach der Verfahrensweise von 6 gemessen. Die Beziehung zwischen den abgelaufenen Tagen und den Meßwerten ist in Fig. 9 gezeigt. Es wird ersichtlich, daß ein Meßwert mit guter Reproduzierbarkeit mindestens für mehrere Tage erhalten werden kann, indem in einem getrockneten Zustand, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, nach dem Auftüpfeln konserviert wird, und zwar selbst dann, wenn das analytische Element bei Raumtemperatur aufbewahrt wird.
Was die Gesamtblutproben betrifft, wurden sie ähnlich wie die Kontrollseren behandelt. Die Stabilität in der Zeit wurde bestimmt. Wie in Fig. 10 gezeigt, wurden Ergebnisse mit guter Reproduzierbarkeit erhalten.

11 Bewertung der gleichzeitigen Reproduzierbarkeit

Standardlösungen, hergestellt in ähnlicher Weise wie oben unter 4, wurden auf die trockenen analytischen Elemente aufgetüpfelt und getrocknet. Sie wurden nach der Verfahrensweise von 5 gemessen. Die Schwankung der Meßwerte wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Es handelte sich um gute Ergebnisse. Tabelle 1

Beispiel 2 Messung von Kreatinin (CRE)

1 Herstellung der Meßreagenslösung

Kreatininiminohydrolase, hergestellt von Toyo Boseki, wurde in 10 mM Phosphatpuffer, enthaltend 0,5% Triton X-100TM, aufgelöst, um eine CRE-Reagenslösung mit einer Enzymaktivität von 65.000 E/l herzustellen.

2 Herstellung der Eichkurve

Die Beziehung zwischen den optischen Reflexionsdichten und den Meßwerten von "Hitachi 7050" wurde nach der Verfahrensweise von 2, 4 und 5 des Beispiels 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 zusammengestellt. Es wurde eine gute Beziehung erhalten.

3 Messung von Gesamtblut-Plasmaproben

Unter Verwendung von Heparin als Antikoagulans wurde venöses Blut von gesunden Personen abgezogen und zentrifugiert, um Plasma zu erhalten. Das Plasma wurde als Probe verwendet und die optische Reflexionsdichte wurde, ähnlich wie in 5 von Beispiel 1, bestimmt. Die CRE-Konzentration in den Proben wurde unter Verwendung der oben unter hergestellten Eichkurve errechnet. Gleichzeitig wurde die CRE-Konzentration unter Verwendung von "Hitachi 7050" gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 gezeigt.

Beispiel 3 Messung von GGT

1 Herstellung des analytischen Elements

Auf einen transparenten Film auf der Basis von Polyethylenterephthalat mit einer Dicke von 180 um, der mit einer Unterschicht versehen war, wurde Gelatine, enthaltend 0,2% nicht ionogenes Netzmittel p-Nonylphenoxypolyglycidol (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Durchschnitt) so aufgebracht, daß die Trockendicke etwa 15 um betrug. Es wurde getrocknet. Ein Polyesterwirktuch, das unter Verwendung eines Netzmittels hydrophil gemacht worden war, wurde dann nach der Methode, beschrieben in der JP-PS KOKAI Nr. 62- 224299, auflaminiert. Eine 7%ige ethanolische Lösung von Polyvinylpyrrolidon (mittleres Molekulargewicht: 1.200.000) wurde auf die Ausbreitungsschicht so aufgebracht, daß die Beschichtungsmenge 2 g/m² betrug.
Der Film wurde zu quadratischen Chips mit einer Seitenlänge von 15 mm zerschnitten und in eine Kunststoffbefestigung eingegeben, um ein analytisches Element zu vervollständigen.

2 Herstellung der Meßreagenslösung

Die folgende GGT-Meßreagenslösung wurde hergestellt.
Tris(hydroxymethyl)aminomethan 720 mg
Glycylglycin 156 mg
L-α-glutamyl-3-carboxy-p-nitroanilin 58,5 mg
Destilliertes Wasser 10 ml
pH 8,1-8,2

3 Herstellung der GGT-Eichkurve

Eine Eichkurve wurde ähnlich wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt.

4 Bewertung der gleichzeitigen Reproduzierbarkeit

Unter Verwendung der oben unter 1 hergestellten Plättchen wurde die gleichzeitige Reproduzierbarkeit, ähnlich wie in Beispiel 1, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2

5 Bewertung der Stabilität im Verlauf der Zeit

Unter Verwendung des in 1 hergestellten analytischen Elements wurde die Stabilität im Verlauf der Zeit in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt. Es wurde eine gute Stabilität im Verlauf der Zeit gezeigt.

Beispiel 4 Messung von GOT

1 Herstellung des analytischen Elements

Ein ähnlicher Film wie in 1 von Beispiel 3 wurde hergestellt. Es wurde 5% eines Leukoimidazolfarbstoffs, 1-(3,5- Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on weiter darauf als Indikator für die Erfassung aufgebracht. Danach wurde getrocknet. Die Indikatorkonzentration für die Erfassung betrug etwa 1 g/m².

2 Herstellung der Meßreagenslösung

Die folgende GOT-Meßreagenslösung wurde hergestellt.
Tris(hydroxymethyl)aminomethan 84 mg
Monokaliumdihydrogenphosphat 104 mg
L-Asparaginsäure 431 mg
α-Ketoglutarsäure · 2Na 93 mg
20% Magnesiumchlorid 273 ul
Peroxidase 343 IE
Thiaminpyrophosphat 21 mg
Flavinadenindinukleotid 5 mg
Oxalacetatoxidase 24 E
Pyruvatoxidase · 3088 E
1N-Natriumhydroxid 3,4 ml
Triton X-100TM 100 mg
Destilliertes Wasser 6,6 ml
pH 7,5

3 Herstellung der GOT-Eichkurve

Eine Eichkurve wurde ähnlich wie in 2 von Beispiel 2 hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 gezeigt.

Beispiel 5 Messung von GPT

1 Herstellung des analytischen Elements

Auf einen transparenten Film auf der Grundlage von Polyethylenterephthalat mit einer Dicke von 180 um, der mit einer Unterschicht versehen war, wurde Gelatine, enthaltend 0,2% nichtionisches Netzmittel p-Nonylphenoxypolyglycidol (enthaltend 10 Glycidoleinheiten im Mittel) und 0,1% Leukoimidazolfarbstoff so aufgebracht, daß die Trockendicke etwa 15 um betrug. Es wurde getrocknet.
Eine Lichtreflexionsschicht, bestehend aus TiO&sub2;-Teilchen, Netzmittel und Gelatine wurden darauf so aufgebracht, daß die Trockendicke etwa 5 um betrug. Danach wurde Gelatine aufgebracht und getrocknet. Ein Polyesterwirktuch, das hydrophil gemacht worden war, wurde, ähnlich wie vorstehend beschrieben, darauf naß laminiert, um einen Film eines analytischen Elements herzustellen. Der Film wurde in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben behandelt, um analytische Elemente herzustellen.

2 Herstellung der Meßreagenslösung

Die folgende GPT-Meßreagenslösung wurde hergestellt.
Tris(hydroxymethyl)aminomethan 87 mg
Monokaliumdihydrogenphosphat 103 mg
L-Alanin 620 mg
α-Ketoglutarsäure · 2Na 93 mg
20% Magnesiumchlorid 275 ul
Peroxidase 3416 E
Thiaminpyrophosphat 21 mg
Flavinadenindinukleotid 5 mg
Pyruvatoxidase 3088 E
Triton X-100TM 100 mg
Destilliertes Wasser 10 ml
pH 7,5

3 Herstellung der GPT-Eichkurve

Der Zeitverlauf von GPT wurde ähnlich wie in 2 von Beispiel 2 gemessen. Eine Eichkurve wurde aus der Differenz der optischen Dichte von 2,5 Minuten bis 4 Minuten, wie in Fig. 16 gezeigt, hergestellt.

4 Bewertung der Konservierungsstabilität

Die Konservierungsstabilität wurde durch Stehenlassen des analytischen Elements bei Raumtemperatur nach dem Auftüpfeln und Trocknen, ähnlich wie in 10 von Beispiel 1, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 17 gezeigt.

Beispiel 6 Messung von Ca

1 Herstellung der Eichkurve

Unter Verwendung des ähnlich wie in 1 von Beispiel 3 hergestellten analytischen Elements und der folgenden Ca- Meßreagenslösung, wurde eine Eichkurve nach einer ähnlichen Verfahrensweise wie in 4 von Beispiel 1 hergestellt. Es wurden private Kontrollseren CP-L, CP-M und CP-H für Fuji Dry Chem als Proben verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 gezeigt.
o-Cresolphthaleinkomplex 90 mg
0,4 M CAPS (pH 10,5) 10 ml

2 Bestimmung der gleichzeitigen Reproduzierbarkeit

Die gleichzeitige Reproduzierbarkeit wurde ähnlich wie in 9 von Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Beispiel 7 Messung von Gesamtcholesterin (TCHO)

1 Herstellung des analytischen Elements

Ein analytisches Element wurde ähnlich wie in 1 von Beispiel 5 hergestellt, doch wurde Peroxidase zusammen mit dem Imidazolleukofarbstoff so zugegeben, daß die Beschichtungsmenge 50.000 E/m² betrug.

2 Herstellung der Meßreagenslösung

Es wurde folgende TCHO-Meßreagenslösung hergestellt.
Cholesterinesterase 987 E
Cholesterinoxidase 600 E
Triton X-100TM 500 mg
Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) 10 ml

3 Herstellung der Eichkurve

Ähnlich wie in 5 von Beispiel 1 wurde eine Eichkurve hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 19 gezeigt

4 Bestimmung der gleichzeitigen Reproduzierbarkeit

Ähnlich wie in 11 von Beispiel 1 wurde die gleichzeitige Reproduzierbarkeit bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4

5 Bewertung der gleichzeitigen Reproduzierbarkeit unter Verwendung von Gesamtblut

Unter Verwendung von venösem Blut, das von gesunden Personen abgezogen worden war, mit Heparin als Proben, wurde die gleichzeitige Reproduzierbarkeit bestimmt. 0,1% NaN&sub3; wurde zu der Meßreagenslösung gegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

mg/dl
1 123,5
2 116,6
3 110,8
4 112,0
5 113,2
6 104,8
7 111,1
8 108,8
9 118,7
10 110,8
113,03
SD 5,05
CV 4,5

Beispiel 8 Messung GPT in Gesamtblut

1 Herstellung des analytischen Elements

Ein analytisches Element wurde ähnlich wie in 1 von Beispiel 5 hergestellt, doch wurde eine wäßrige 1%ige NaN&sub3;- Lösung auf die Ausbreitungsschicht eines Polyesterwirktuchs, das hydrophil gemacht worden war, so aufgebracht, daß die Beschichtungsmenge 100 g/m² betrug. Nach dem Trocknen wurde es zu einem Plättchen verarbeitet.

2 Herstellung der Meßreagenslösung

Ähnlich wie in 2 von Beispiel 5 wurde die GPT- Meßreagenslösung hergestellt.

3 Herstellung der Gesamtblutproben

Venöses Blut, abgezogen von gesunden Personen, mit Heparin wurde in 3 Reagensgläser, jeweils in einer Menge von 1,5 ml, aufgeteilt. Private Kontrollseren CP-L, CP-M und CP-H von Fuji Dry Chem wurden unter Verwendung von 1,5 ml destilliertem Wasser, welches die Hälfte der normalen Verdünnungsflüssigkeitsmenge von 3 ml ist, aufgelöst. Es wurde mit dem obigen Gesamtblut vermischt, um Gesamtblutproben mit unterschiedlicher GPT-Konzentration herzustellen. Ein Teil jeder. Konzentrationsstufe wurde zentrifugiert und die GPT-Aktivität des Plasma wurde unter Verwendung von "Hitachi 7050" gemessen.

4 Zuführung der Probe und Trocknen

10 ul der auf die obige Weise in 3 hergestellten Gesamtblutproben wurden aufgetüpfelt und ähnlich wie in 4 von Beispiel 1 getrocknet.

5 Messung

Das oben in 4 erhaltene analytische Element wurde in einen "Fuji Dry Chem 5500"-Analysator, ähnlich wie in 5 von Beispiel 1, eingesetzt. Die Meßreagenslösung, hergestellt oben in 2, wurde aufgetüpfelt. Die optische Reflexionsdichte wurde bei 650 nm im Verlauf der Zeit als Funktion der Inkubationszeit gemessen. Der Zeitverlauf wurde erhalten.

6 Herstellung der Eichkurve

Die Beziehung zwischen dem GPT-Aktivitätswert des Plasmas, gemessen durch "Hitachi 7050", und der Differenz der optischen Reflexionsdichte (ΔODR) nach 5 Minuten und nach 1 Minute vom Beginn der Messung ist in Fig. 20 gezeigt.

7 Messung der Gesamtblutprobe

Das unbehandelte Gesamtblut von gesunden Personen, wie oben in 3 verwendet, wurde durch eine ähnliche Verfahrensweise wie oben unter 4 und 5 gemessen. Der Aktivitätswert wurde unter Verwendung der in 6 erhaltenen Eichkurve errechnet. Er wurde als 26 E/l errechnet.
Andererseits wurde das Plasma aus dem Gesamtblut durch Zentrifugieren abgetrennt und die GPT-Aktivität wurde unter Verwendung von "Hitachi 7050" gemessen. Es wurde ein Wert von 25 E/l ermittelt. Hierdurch wird bestätigt, daß der erfindungsgemäß erhaltene Meßwert vollständig verläßlich ist.

Beispiel 9

In einem ähnlichen Versuch wie in Beispiel 4 wurde die Meßreagenslösung sofort zu dem analytischen Element nach dem Auftüpfeln der Probe unter Trocknen gegeben. Es wurde gemessen.
Die Neigung der Eichkurve war etwa 2/3 der Ergebnisse des Beispiels 4. Es wurden aber Ergebnisse mit guter Beziehung zwischen ΔODR und den Meßwerten durch "Hitachi 7050" erhalten.

Beispiel 10

Bei der Messung von Ca in Beispiel 6 wurde eine mikroporöse Membran, hergestellt aus Celluloseacetat ("Fuji Microfilter FM 300", Fuji Photo Film Co., Ltd.), als Ausbreitungsschicht anstelle des Polyesterwirktuchs, das hydrophil gemacht worden war, verwendet. Die anderen Verfahrensweisen waren die gleichen wie in Beispiel 6.
Die gleichzeitige Reproduzierbarkeit (n = 10, CV) war CP-L : 2,7%, CP-M : 2,2%, CP-H : 3,1%. Es wurde bestätigt, daß eine quantitative Messung im Falle der Verwendung eines Membranfilters als Ausbreitungsschicht möglich war.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Messung eines Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements, das mindestens eine hydrophile Polymerschicht und eine Ausbreitungsschicht, die in dieser Reihenfolge laminiert sind, umfaßt, wobei die Ausbreitungsschicht die Funktion hat, daß sie gleichmäßig die in der wäßrigen flüssigen Probe, enthaltend den Analyten, enthaltenen Komponenten ausbreitet, um die Komponenten der hydrophilen Polymerschicht mit einer konstanten Geschwindigkeit pro Flächeneinheit zuzuführen, umfassend:

Zuführung der flüssigen Probe zu dem analytischen Element,

Trocknung des analytischen Elements, dem die flüssige Probe zugeführt worden ist, bei einer Temperatur von 10 bis 60ºC bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt des hydrophilen Polymeren von weniger als 20%,

Zuführung einer Lösung, enthaltend ein Meßreagens, das sich direkt mit dem Analyten umsetzt, um eine optisch erfaßbare, chemische Veränderung hervorzurufen, zu dem getrockneten analytischen Element, und

Messung der chemischen Veränderung durch optische Mittel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das analytische Element mindestens eine wasserundurchlässige, gasdurchlässige Schicht umfaßt, die zwischen der hydrophilen Polymerschicht und der Ausbreitungsschicht vorgesehen ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das analytische Element weiterhin eine Lichtabschirmschicht umfaßt, die zwischen der hydrophilen Polymerschicht und der Ausbreitungsschicht vorgesehen ist.

4. Trockenes analytisches Element, verwendet bei dem Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, das das beim Verfahren gemäß Anspruch 1 verwendete Meßreagens nicht enthält.