JPS6082859A - 一体型多層化学分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は一体型多層化学分析要素に関し、詳しくは水性
液体試料、特に生物液体、例えば血液、りんは液、髄液
、尿等に含まれる成分の定量分析において過醇化水素を
生成するオキシグーゼ酵素反応系を利用する場合に特に
効果的な一体型多層化学分析要素に関するものである。

Ｕ従来技術］ オキシダーゼを用い被検物質またはその反１５生成物を
酸化すると同時に生成されるＨ２Ｏ２をペルオキシダー
ゼを用いて色素の生成反応に導き、比色的に色素を定量
する原理に基づく被検物質の定量分析のだめの乾式分析
器共としてフィルム状またはシート状の一体型多層化学
分析要素（以下、多層分析要素ということがある。）か
提案または実用化されている。オキシダーゼとベルオキ
シダーゼを用い色素の生成反応に導く試薬としてはＰ、
ＴｒｉｎｄｅｒがｒＡｎｎａｌｅｓ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉ
ｃａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、６．２４−２
７（１８６９）において提案した試薬系およびその改良
試薬系がよく知られており、改良試薬系か多層分析要素
に組こまれている。Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬の改良系はオキ
シダーゼ、ベルオキシダーゼ、水素供−１ｊ体（色原体
）として４−アミノアンチピリンまたは４−アミノ−２
−メチル−３−フェニル−１−（２，４，６，−トリク
ロロフェニル）−３−ピラゾリン−５−オン等の４−ア
ミノアンチピリンホモログまたは誘導体、およびカプラ
ーとして１，７−ジヒトロキシナフクＩ／ン、１−ヒＩ
・ロキシナフタレンー２−スルホン醇すＩ・リウムτの
ヒＩ・ロキシナフタレン類を含む呈色試薬系である。Ｔ
ｒｉｎｄｅｒにより提案された試薬系およびその改良試
薬系（以下、両者を杏めて弔にＴｒｉｎｄｅｒ試薬系と
いう試薬層利点はオキシダーゼの種類をかえても残余の
成分は同しままで呈色試薬系として用いることができる
点にある。オキシダーゼとしてはグルコースオキシダー
セ、コレステロールオキシグ−セ、ウリカーセ、グリセ
ロ−ルオキシグーセ等を用いうろことが知られている。

またオキシダーゼとベルオキシダーゼを含む１，４色試
薬系において、ジアニシジンまたは４，５−ビス［４−
（ジメチルアミノ）フェニル］　−２−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ンメトキシフェニル）イミタソール等の無
色の水素供与体であるロイコ色素を水素供与体（色原体
）とカプラーの組合せのかわりに用いることも知られて
いる（米国＃１１’　＋！１第３９９２１５８　吟、特
公昭５６−４５５９９号、４１ｒ公１聞１５５−２５８
４０号、特公昭５７−５５１９　’＋＋′Ｓの明細書参
照）。

Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬系を含む試薬層析要素においては、
水性鹸体中の被検物質か、水性液体中に溶解した状態で
試薬層に到達し、そこでオキシダーゼの触媒作用を受け
て空気中の酸ふ（０２）と反応してＨ２Ｏ２を生成し、
ついでベルオキシダーゼの触媒作用を受けて酸化カプリ
ング反送、（醇化的１．１色反応）が進み発色（または
変色）が発現すると考えられる。このようにＴｒｉｎｄ
ｅｒ試薬系を含む試薬層析要素においては空気中の酸素
が一連の共役反応の一反応に必須であるので、オキシダ
ーゼをＴｒｉｎｄｅｒ試薬系の残余試薬層を含む層より
も上側（支持体から遠い側）に含ませて呈色反応の進行
を８１Ｔ１め、同時に分析精度を向上、させる提案がな
されている（特開昭５７−２０８９９７号）。オキシダ
ーゼをＴｒｉｎｄｅｒ試薬系の残余試薬層を含む層より
も」−側に含有させることは、特開昭５５−１６４３５
６号等に記載のＴｒｉｎｄｅｒ試薬系を含む試薬層の１
．に非孔性光遮蔽層、多孔性展開層をこの＋ｕｎに設′
けてなる多層分析要素において呈色反応の進行を１７１
−め、分析精度を向上させるという効果か顕著であった
。

しかしながら、オキシダーゼをＴｒｉｎｄｅｒ試薬系の
残余試薬層を含む層よりも上側に含有させた多層分析要
素は多孔性展開層に点着された水性液体試料に含まれる
醇化還元性妨害物質による妨害または「渉を受け分析精
度が損われるという問題点を有することが明らかになっ
た。ここにいう醇化還元性妨害物質とは、水性液体試ｔ
’＋か生物体液の場合、カタラーゼ、ヘモグロビン等の
過酸化水素分解活性（本明細書において過酸化水素分解
活性とはカタラーセ゛活性、ベルオキシターセ活に１の
１戸ずれか一方または両方を意味する。）を有する物質
、アスコルビン酸等を意味し、また前述の問題点は水性
液体試料として全血、溶血全血、血漿、血清を用いる場
合に顕著に現われることがｒｌ明した。

［発明の目的］ 本発明の目的は、オキシダ−セ、ペルオ上ンターゼ、水
素供与体（色原体）、およびカプラー（または水性供与
体とカプラーの組合せのかわりに酸化により発色または
変色しうる単一化合物である水素供与体）を必須成分と
して含み、オキシダーゼか残余の成分を含む層よりも上
側（支持体から遠い側）に含有されてなる一体型多層化
学分析要素において、水性液体試料に含まれる酸化還元
性妨害物質による妨害または干渉により生ずる負誤差等
となって現れる分析精度の劣化を排除して分析精度を向
」−させつつ分析時間を短縮し、同時に被検物質の測定
可能濃度範囲を広げることである。特に水性液体試料と
して血液（全血、血ツ３．血清）を用いる場合には溶血
に起因する血液中の酸化還元性妨害物質である過酸化水
素指示薬＋１を右するカクラーセやヘモグロビン等の複
合蛋白質等に起因する妨害または干渉を著しく低下また
はり１除して分析精度を向上させつつ分析時間をｔａｒ
縮し同時に被検物質の測定可能濃度＠囲を広げることで
ある。

［９：明の構成］ 前記の目的は多層分析要素において、オキシダーセを含
む層を残余の成分を含む層と配素透過性４ｉ白質不透過
性光遮蔽層との間に設けることにより達成される。

本発明は、（１）水不浸透性光透過性支持体の−にに（
ａ）ペルオキシダーゼと過酸化水素との存在下で検出回
旋な変化を生ずる過酸化水素指示薬、およびペルオキシ
ダーゼ″を含む指示薬層、（ｂ）オキシターセを含むオ
キシターゼ層、（ｃ）酸素透過性蛋白質不透過性光遮蔽
層、および（ｄ）多孔性ｊＪ（間層がこの順に設けられ
てなる一体型多層化学分析要素、ならびに（２）Ｓｉｒ
記オキシダーゼ層に媒染剤が含有されてなる一体型多層
化学分析要素である。

本発明の一体型多層化学分析要素の特徴点は指示薬層と
酵素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層との間にオキシダー
ゼを含む層またはオキシターセと媒染剤とを含む層が設
けられている点である。

本発明に用いることができる水不浸透性光透過性支持体
としては、特開（す（５３−２１６７７号、特開１す（
５５−１６４３５６号等の明細書に記載の多層分析要素
の支持体に用いられているものから適宜に選択して用い
ることができる。支持体の几体例としては、酢酸セルロ
ース、酢酸酪酸セルロース、ポリ（エチレンテレフタレ
ート）５ヒスフエノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、ポリメチルメタクリレートなどの親木性にとぼ
しいかまたは疎水性のポリマーで、約５０ｐｍから約１
ｍｍ、好ましくは約８０ｐＬｍから約４００ルｍの範囲
の厚さの透明なフィルムまたはシート、および厚さ約１
１００ｐから約２　ｍ　ｍ、好ましくは約１５０ｇｍか
ら約１ｍｍの範囲の透明なガラス根なとをあげることが
できる。支持体の表面は８問により公知の物理化学的処
理（例、紫外線照射、コロナ放電処理、グロー放電処理
等）を実施して指示薬層等との接着力を高めるか、ある
いは物理化学的処理を施して（または、施さずに）親水
ｔ’ｌポリマーであるゼラチン等の下塗り層を設けて指
、１＜薬層等との接着力を高めることかできる。

指示薬層はペルオキシダーゼと過酸化水素との存イＩド
で検出可能な変化を生ずる過酸化水素指示薬、およびペ
ルオキシダーゼが親水性の被股形成能を有するポリマー
バインダーの中に分散または溶解して含有される層であ
る。過酸化水素指示薬としてはｒＡｎｎａｌｅｓ　ｏｆ
　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｊ　。

Ｓ　、２４’２７（１９６９）、米国特許第３９９２１
５８号、＃５公１１／（５５−２５８４０号、特公昭５
６−４５５９９号、特公昭５８−１８６２’８号、特願
昭５７−１６５２３３号等に記載の水素供′ｊ一体（色
原体）とフェノールまたはナフトール系カプラーとの組
合せ、特公昭５７−５５１９号、特願昭５８−６８００
９号等に記載のトリアリールイミグンール系ロイコ色素
、４￥公開閉５６〜４５５９９、特公昭５８−１８６２
８号等に記載の単一の化合物でペルオキシダーゼと過酸
化水素との単一の化合自己カプリング等により発色また
は変色する色素前駆体化合物等を用いるごとができる。

好ましい過酸化水素指示薬の例として次の化合物がある
。

水素供与体Ｃ色原体）とカプラーとの組合せ：［水素供
与体］４−アミノアンチピリン、４−アミノ−２−メチ
ル−３−フェニル−１，−（２゜４　、６−ドリクロロ
フエニル）−３−ピランリン−５−オン雰の４−アミン
アンチピリンホモログまたは誘導体 ［カプラー］１．７−シヒドロギシナフクレン、１〜と
トロキシナフタレン−２−スルボン醇ナトリウム（また
はカリウム）塚の１−ヒドロキシナフタレン誘導体 トリアリールイ５ダジール系ロイコ色素：４，５−ビス
［４−（ジメチルアミン）フェニル］　−２−（４−ヒ
ドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）イミダゾール
、４−（ジメチルアミノ）フェニル−２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−５−フェネチル
イミダツール等 色素前駆体化合物、ジアニシジン、４−メトキシ−１−
ナフトール等 ベルオキシダーゼとしては特公昭５６−４５５９９号、
Ｌ、Ｓ公開５７−５５２０号等に記載の植物起源および
動物起源のベルオキシダーゼ（ＥＣ１１１，１，７）、
特公昭５ｇ−５ｏ３５ｓ等に記載の微生物起源のベルオ
キシダーゼ（ＥＣＩ。

１１．１．７）を用いることができる。これらのうちで
は植物起源または微生物起源の非特異的ベルオキシダー
ゼが好ましい。好ましいベルオキシダーゼの例として西
洋わさび、大根から抽出したペルオキシダーゼ、Ｃｏｃ
ｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、Ｃｕ　ｒｖｕ　ｌａ　ｒ　ｌａ
属の微生物から抽出したペルオキシダーゼ等がある。

指示薬層に用いられる親木性ポリマー７Ｘイノターとし
ては特公昭５３−２１６７７号、特公昭５６−４５５９
９号、特公昭５７−５５１９号、特開昭５５−１６４３
５６号、特開昭５７−２０８９９７号等に記載の多層分
析要素の試薬層の親水性ポリづ−パインターとして用い
られている公知の親木性ポリマーから適宜に選択して用
いることができる。親水性ポリマーの例としてはセラチ
ン（例、酸処理ゼラチン、脱イオン化セラチン等）、ゼ
ラチン誘導体（例、フタル化セラチン、ヒドロキシメチ
ルアクリレートグラフトン等）、プルラン、プルシン誘
導体、アカロース、ポリビニルアルコール、ポリヒニル
ビロリＩ・ン、ポリアクリルアミド等がある。これらの
うちではセラチンか一般的でかつ好ましい。

指示薬層の乾燥厚さは約５ｐｍから約６０ルｍ、好まし
くは約１０μｍから約３０ｐＬｍの範囲である。ベルオ
キシダーゼの指示薬層における含有量は約５千Ｕ／ｒｎ
’から約１０万Ｕ　／　ｍ’、Ｉｌｆましくは約１万Ｕ
　／　ｒｎ’から約６万Ｕ　／　ｍ’の範囲である。過
酷化水素指示薬の指示薬層における含有量は本州液体試
料に含有される被検成分の予想される含有Ｆ１１．に紀
、して適宜定めることができる。

指示薬層にはペルオキシダーゼの最適ｐＨ値ま。

たはその近傍の値に維持するｐＨ緩衝剤、またはペルオ
キシダーゼの活性が実質的に阻害されずかつ過酸化水素
指示薬の発色（または変色）反応が速かに進行する範囲
のｐＨ値に維持するｐＨ緩衝剤を含有させることかでき
る。ペルオキシダーゼの最適ＰＨ値は西洋ワサビ起源の
ものｐＨ約７。

０　、　Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　ｍｉｙａｂｅａｎ
ｕｓ起源のものｐＨ５、　０　−　５　、　３　、　Ｐ
ｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｓａ起源
のものｐ　Ｈ　４　、　７〜４．９というように起源に
より異なる。従って分析条件下において指示薬層のｐ　
Ｈイ，ｒｉを約４．０から７．５、好ましくは約４。

５から約７．０の範囲に維持するｐＨ緩衝剤を指小薬層
に含有させることができる。ｐＨＨ衝剤とＬ７てはｒＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、５（２）、４６７−４７
７（１９６Ｂ）、Ｒ。

Ｍ．Ｃ．Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．編ｒＤａｔａ　ｆ
ｏｒ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＪ第２
版，　（Ｏｘｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃｌａｒｅｎｄ
ｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　、　１９８９年発行）４７６−５０
８頁、ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙＪ　、出，３００−３１０（１９８０）　、　Ｂ本
化学会編「化学便覧基礎編」　（東京、互着、１９６６
年発行）１３１２−１３２０頁、日木生化学会編「生化
学データブックＩＪ　（東京化学同人、１９７９年発行
）　＋７−　２４頁，特公昭５７−２８２７７号等に記
載の公知のｐＨ緩衝剤から適宜に選択して用いることが
できる。

指示薬層の上に、直接または中間層（後述）を介して、
オキシダーゼを含むオキシダーゼ層を設ける。オキシダ
ーゼ層に含有させるオキシダーゼは被検物質を酸素（０
２）により醇化してＨ２Ｏ２を生成させるオキシダーゼ
であればよい。オキシダーゼは被検物質に応して選択す
ることができる。本発明において用いることができるオ
キシダーゼ具体例として次のもがある。

グルコースオキシダーゼ （ＥＣ１．１．３．４；最適ｐＨ約５．６）コレステロ
ールオキシクーセ （ＥＣ１，１，３，６；最適ＰＨ約５．８）ウリカーゼ （ＥＣ１，７，３，３；最適ＰＨ約７．５−８．０）サ
ルコシンオキシダーゼ （ＥＣ１，５，３，１，最適ＰＨ約７．０〜９．０）ラ
クテートオギシダーゼ、ピルペートオキシターゼ、グル
タメートオキシターゼ、グリセロールオキシダーセ、ビ
リルビンオキシダーゼ、″弓゛。

この他にも４、シ聞昭５３−２４８９３　ヒ、特公昭５
６−４５５９９号、特開昭５７−２０８９９８５じ、＃
′ｒ酊！昭５７−１６５２３３号等に記載のオキシダー
ゼまたはオキシダーゼを含む複数種の酵素の組合せを用
いることができる。必要に応じてオキシダーゼとともに
補因子および／または補酵素を組合せて用いることがで
きる。

オキシダーゼ層はオキシダーゼ（必要に応じて組合せら
れる補因子および／または補酵素とともに）か被膜形成
能を有する親水性ポリマーバインダーの中に分散（また
は溶解）されてなる層である。親木性ポリで一へインダ
ーとしてＩ走指示薬層の親木性ポリマーバインダーとし
て用いられるポリマーの中から選択して用いることかで
きる。代表的な親水性ポリマーバインターはゼラチンで
ある。オキシダーゼ層の乾燥厚さは約０　、５　ｐ、ｍ
から約５ｐＬｍ、Ｉ７ましくは約１ｐｍから約３μｍの
範囲である。オキシダーゼ層におけるオキシダーゼの含
有量はオキシダーゼの種類により異なるか、概して約ｌ
千Ｕ　／　ｒｎ’から約１０万０　／　ｍ’、好ましく
は約３千Ｕ　／　ｍ’から約５刀Ｕ　／　ｍ’の範囲で
ある。グルコースオキシダーゼの場合には含有量は約２
千ｉＪ　／　、ｆから約４万Ｕ／ｍ’、（ｌｆましくは
約４千Ｕ　／　ｍ’から約３万Ｕ　／　ｍ’の範囲であ
る。

オキシダーゼ層には含有させるオキシダーゼの最適ＰＨ
値またはその近傍のｐＨ（ｆ口こ分析条件−ドに維持す
るｐｉ−を緩衝剤を含有させることができる。ｐＨ緩衝
剤としては前述の諸文献、特許に記載の公知のｐＨＨ街
剤から選択して用いることができる。指示薬層とベルオ
キシグーゼ層のｐＨ値が大きく異なる場合には少なくと
も一方の層に特願昭５８−１７５４２号、特願昭５８−
１１８５９４ひ等に記載のカルボキシル基またはスルホ
ン酸〕、（含有酸性ポリマー、または同４、シ許に記載
の堪り、（性ポリマーをｐＨＭ衝剤として含有させるこ
とができる。

オキシダーゼ層にはカチオン性媒染剤を含有させること
ができる。オキシダーゼ層にカチオン性媒染剤を含有さ
せることにより水性液体試料が血靜、ことに溶血血液（
全面１Ｍ■漿または血清）の場合にカタラーセ、ことに
ヘモグロビン等の過醇化水、（、分解活性物質による妨
害または干怨、を著しく減少させるかまたは実質的に除
去することができる。カチオン性媒染剤として特公昭５
８−１８６２８壮、特開昭５４−２９７００号、特開昭
５６−１．９４５４吋、４シ開閉５３−７２６２２弓、
特開Ｉ＋／＋　５４〜１３８４３２号等に記載されてい
る多層分析要素のレジストレーション層（検出層）また
はミグレーション阻止層（拡散防止層）等に用いられて
いる、あるいはハロゲン化銀カラー写真材料に用いられ
ている公知のアンモニウム基、ホスホニウム基またはス
ルホニウ入り、（含有カチオン性ポリマニを用いること
ができる。好ましい媒染剤＋−ｉニア　：／モニウムノ
、（含イ１カチオン性ポリマー媒染剤であり、好ましい
其体例として、スチレン／ｐ−［（Ｎ−ヘンシル−Ｎ、
Ｎ−ジメチルアンモニオ）メチル］スチレン／ジビニル
ベンゼン・コポリマー、スチレン／ｐ−［（１−メチル
−１−ヒヘリジニオ）メチル］スチレン／シヒニルヘン
ゼン・コポリマ＝（対陰イオンはいずれもＪ１Ａ素陰イ
オン等）等がある。媒染剤の含有量は親水性ポリマーバ
インダーに対し＋１１　ｂｉ比で約５％から約２００％
、好ましくは約２０％から約１００％の範囲である。オ
キシダーゼ層にカチオン性媒染剤が含有される場合にも
オキシダーゼ層の乾燥厚さは約０．５．ｍから約５ｐ−
ｍ、！Ｉｆ’ましくは約１ｇｍから約３ルｍの範囲であ
る。

オキシダーゼ層（またはカチオン性媒染剤を含むオキシ
ダーゼｒ：！７）の上に＃素透過性蛋白質不透過性光遮
蔽層（以下、単に光遮蔽層ということかある。）が設け
られる。酎素透過性蛋白賀不透過性とは、分析条件下に
、すなわち水性液体試料の溶媒である水がこの層に浸透
してこの層が湿潤または膨潤しているときに、この層を
空気中の酸素（０２）は実質的に通過可能であり、一方
正白質は実質的に通過不可能であることを意味する。ま
たここでいう蛋白質とは分子量約５千以上の通常の７’
Ｊ、味での蛋白質であり、牡にはへモグロビン（分子−
：、：約６万５千）に代表されるヘム蛋白質、カタラー
ゼ（分子量約２５万）等の過酸化水素分ＩＮ″活性を有
する複合蛋白質である。酸素透過性蛋白質不透過性光遮
蔽層は光遮蔽性微粉末が少峨の被′欣形成能を有する親
木性（または弱親水性）ポリマーバインダーに分融保持
されれいる実質的にＪ１孔性の層である。光遮蔽層は指
示薬層における発色または変色を光透過性支持体側から
反射測光する際に後述する展開層に点着された水性液体
試料１の色、特に全面の場合のヘモグロビンによる赤色
等を遮蔽し同時に光反射層および背景層としても機能す
る。

光遮蔽性微粉末の例として、二酸化チタン微粉末、硫酸
バリウム微粉末、カーボンブランク、アルミニウム微粉
末または微小フレーク等があり、これらのうちで二酸化
チタン微粉末、ｇｔ　Ｍバリウム微粉末等が好ましい。

被膜形成能を有する親木性（または弱親水性）ポリマー
バインダーとしてはゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱
イオン化セラチン搾）、ゼラチン１；誘導体（例フタル
化セラチン、ヒドロキシメチルアクリレートグラフトラ
チン／ｙ，４　）、ポリビニルアルコール、１１）生セ
ルロース、セルロースアセテート（例、セルロースジア
セテ−１・）等があり、これらのうちではセラチン、ゼ
ラチン誘導体等が好ましい。ゼラチン、ゼラチンｉｔＡ
　４体は公知の硬化剤（架橋剤）とともに用いることが
できる。なお、後述する接着層・にこれらのポリマーを
用いる場合には光遮蔽層のポリマーバインクーとしては
指示薬層に用いるのと同様に広範囲の親木性ポリマーか
ら選択して用いることができる。

以−１・余白 光遮蔽層における光遮蔽性微粉末とポリマーバインクー
（乾燥時）との比は、光遮蔽層の酸素透過刊が保たれ、
かつ同時に蛋白不透過性が保たれる程度に非孔性である
（これは多孔性展開層におけるｊＪ（間作用またはメー
タリング作用が現れる平均孔サイズよりも小さく、展開
作用またはメータリング作用を有しない程度の微孔性を
も包含する。）範囲で用いることができる。これは具体
的には体Ｘｔ−比で光遮蔽性微粉末１０に対しポリマー
バインダー（乾燥体積）約２．５から約７，５、好まし
くは約３．０から約６６５の範囲である。

光遮蔽性微粉末が二酸化チタン微粉末の場合には子−１
１：、比で二酸化チタン微粉末ＩＯに対しポリマーバイ
ンダー（乾燥重楢）約０．６から約１　８、好ましくは
約０．８から約１．５の範囲である。

光遮蔽層の乾燥厚さは約３ｐｍから約３０ｐｍ、１’ｆ
ましくは約５ルｍがら約２０ｐＬｍの範囲である。

指／ｉ′Ｘ薬層とオ午シターセ層との間，オキシターセ
層と光遮蔽層との間には必要に応して中間層を設けるこ
とができる。中間層・とじては指示薬に用いるのと同様
な被膜形成能を有する親木性ポリでーを用いることかで
きる。中間層の厚さは約０。

２ルｍから約１０μｍ．々ｒましくは約０．５μｍから
約フルｍの範囲である。光遮蔽層と後述する多孔性展開
層との間には必要に応して接着層を設けることができる
。接着層としては指示薬層に用いるのと同様な被膜形成
能を有し、木で湿ｉ１ＦＩ　しているとき、または水を
含んで膨潤しているときに多孔性展開層を接着し一体化
できる親木＋１ポリマーを用いることができる。接着層
の厚さは約０。

５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１０
ルｍの範１川である。中［１１１層および）と着層に用
いられる代表的で好ましい親水性ポリマーはセラチン、
セラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール等がある。

指示薬層、オキシターセ層またはカチオン＋１媒染剤含
有オキシダーゼ層、光遮蔽層、中間層、接着層には必要
に応して界面活性剤を含イＪさせることかで澤る。界面
活性剤としてｌオノニオン界ｒｈｉ活外削１　とくにオ
キシエチレンまたはオキシプロピレンツ１（か８〜１５
個連なった鎖状構造を含むノニオン界面活性剤か好まし
い。これらの層重こ（オこの他に必要に応して硬化剤（
架橋剤）、柔軟化剤またはり解剖等の公知の添加剤を含
有させること力１できる。

光遮蔽層の上に、直接または接着層を介して、多孔性ｊ
ｊ（諸層または定面積多孔性層（、＜、、チ）力く設け
られる。多孔性展開層（以下、単に展開層ともいう。）
としては特公昭５３−２１６７７号、！ＩＩＩ開１１？
ｌ　５５−９０８５９号、特開昭５８−１２３４５８じ
等に記載の非繊維等方的多孔性媒体層、特開＋１／、＋
　５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号等
に記載の織物展開層、特開昭５７−１４　ａ　２５０　
ｒ５に記載のポリオレフインポリマーフィラノントパル
プを含む紙からなる層などを用いることができる。定面
積多孔性層としては実開昭５７−４２９５１号等に記載
の多孔性素材がある。これらのうちでは展開層が好まし
く、また展開層としてはメンブランフィルタ一層（ブラ
・ンシュポリマー層）、ポリで一ヒースを水でｌｌｉ　
ｆｌｒｌ　Ｌないポリマー接着剤で点接触状に接着して
なる三次元格了粒状構造物層、織物展開層が好ましい。

Ｉｊ（諸層、定面積多孔性層は前述の諸特許等に記載の
方Ｖ：に従って設けることかできる。

多孔性展開層には必要に応して界面活性剤、好ましくは
前述のアニオン界面活性剤を含有させることができる。

さらに多孔性展開層には特公昭５５−４５５９９　シー
に記載のごとくコレステロールエステラーゼ等の酵素を
含む試薬の一部を含有させることかできる。また、多孔
性１ｊ（諸層にも光遮蔽性微粉末を分散含有させること
かできる。

前述の諸層をｖＩ層一体化して調製された一体型多層化
学分析要素は適宜なサイスに裁断され、特開昭５４−１
５６０７９リ−１実開昭５６−１４２４５４け、特開昭
５７−６３４５２　Ｘ３、ｖｆ表昭５８−５０１１４４
号、実開昭５８−３２３５０号等に記載のスライド枠に
収容して分析スライドとじて用いるのが便利である。こ
の他に多層分析要素は長テープ状や裁断片をアパーチュ
アカー１・等に語句またはほめこんで用いることもでき
る。

、４．発明の多層分析要素を用いて前述の諸特許、およ
びｒＣｌｉｎｉｃａｌ　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　、　２
４（８）　、１３３５−１３４２（＋９７９）等に記載
の方法により主として比色分ＡＪｉ　’Ｊ）、の力；〔
理により水性ｔｆ’ａ体試料中の被検物質の定ｊ、１分
析を実施できる。

以下の実施例により本発明を具体的に説明する。

［実施例１コ ゼラチン下塗りが施されている厚さ１８０ｊＬｍの無色
透明ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）中指フィル
１、の１−に下記組成の指示薬層を乾燥層Ｊゾか約１５
μｍになるようにして水溶液を用いて塗ｒｌｒ　Ｌ乾燥
して設けた。

ベルオキシタ−ゼ　２５０００ＩＵ １．７−ジヒトロキシンフタレン　５ｇ４−アミンアン
チピリン　５ｇ セラチン　２００ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　２ｇ 指示薬層の−Ｅに下記組成のグルコースオキシターゼ層
を乾燥層厚が約２ｐ、ｍになるようにして水溶液を用い
て塗布し乾燥して設けた。

ゼラチン　４．６ｇ グルコ−スオキシダーセ　４０００ＩＵポリオキシエチ
レン ノニルフェニルエーテル　Ｏ，Ｌｇ グルコースオキシグーセ層の上に下記組成の酸素透過性
蛋白質不透過性光遮蔽層を乾煙厚さが約７ｇｍになるよ
うにして水分散液を用いて塗布し乾燥して設けた。

二酸化チタン微粉末　１００ｇ ゼラチン　Ｌｏｇ 光遮蔽層のＬに下記組成の接着層を乾燥層厚か約２ｇｍ
なるようにして水溶液を塗７１Ｊシ乾仔して設けた。

セラチン　１．０　ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０．１ｇ 次に接着層に約３０ｇ／ｍ’の割合で木を全面に供給し
て湿潤させたのち、綿ｌＯＯ％のブロード織物（１００
双ブロード）を軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥さ
せてグルコース定量用一体型多層化・Ｙ分析要素を調製
した。

［比較例１コ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりに指示薬層
の上に下記組成のグルコースオキシダーセ含有光遮蔽層
を乾３？４厚が約７ｐ、ｍになるように１７て水分散液
を塗布し乾燥させて設ζ九だ他は実施例１と同様にして
グルコース定量用化学分析スライド（比較スライ［・１
）を調製した。

醇化チタン微粉末　１０ｇ セラチン　１ｇ グルコースオキシターゼ　２０００ＩＵこのようにして
調製した２種の化学分析スライド各ノＪに、水性液体試
料として、グルコース濃度は同一でヘモグロビン濃度は
第１表に示したとおり５レヘルに変化させたヒト血漿を
Ｂｇ１点着し、３７°Ｃで６分インクベーションし直ち
に発色光学濃度なＰＥＴフィルム側から反射測光した（
測定中心波長５００ｎｍ）。７１１１光結果を第１表に
示す。

第１表 化゛γ分析スライｌ’　０　５０　１００　５００　１
０００実施例１（本発明）　０．９５　０，９５　０，
９５　０，９４　０．９３比較スライド１　０ｔ８５　
０，８５　０，７５　０．６！ａ　Ｏ，６１発色光学濃
度値、測光値からカブリ光学濃度値（７％アルブミン水
溶１夜（グルコース不合）を用いて前記と同様にして測
光した仙）をさしひいたイ直 第１表に示した結果から、比較スライＩ・１ではヘモグ
ロビン濃度ゼロにおいてすでに本発明の化学分析スライ
ドに比して発色光学ｃ２１ｍ　４ｒｉが小さく、さらに
ヘモグロビン１農度が増大するにつれてヘモグロビンの
過酸化水素分解活性に起因する干渉（妨害）により発色
光学濃度値が著しく低下する負１１ｊ４差が顕著に現れ
ている。一方、本発明の化学分析スライドではヘモグロ
ビンの存在による干渉（妨害）は箸しく少なく実質的に
ないといえるはとであり、かつヘモグロビンの有無にか
かわりなく大きな発色光学濃度値が得られている。

［比較例２］ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりにド記組成
の指示薬層を乾燥厚さが約１５１１．ｍになるようにし
て水溶液を用いて塗布し乾燥して設けた他は実施例１と
同様にしてグルコース定量用スライド（比較スライド２
）を調製した。

クルコースオキシターセ　２５００ＩＵペルオキシダー
ゼ　２５００ＩＵ １．７−シヒドロキシナフタレン　０．５ｇ４−アミノ
アンチピリン　０．５ｇ ゼラチン　２０ｇ ポリオキシエチレン ノニルフェニルエーテル　０．２ｇ 比較スライド２の指示薬層には単位面積当り、実施例１
の本発明のグルコース分析スライドのグルコースオキシ
ダーゼ層に含有されるのとほぼ同じ活性値割合のグルコ
ースオキシタ−セが含まれている。実施例１のグルコー
ス分析スライドと比較スライド２の各々にグルコース濃
度８６ｍｇ／ｄ文のヒト血漿およびグルコースを添加し
て第２表に示したとおり５レベルにグルコースｌ農度を
変化させたヒ！・血漿をいずれも８座文点清し、３７°
Ｃで６分インクペーションし、直ちに発色光学濃度をＰ
ＥＴフィルム側から反ＱＪ　Ａｌｌ光した（　′Ａｌｌ
＋定中心波＆、５０００ｍ）。測光結果を第２表に示す
。

Ｊｌｌ、ｚ、、白 第２表 スライｌ’　８６１５５　２９９　４８８　５５５　６
９９実施例１　０．３８　ｏ、５７　ｏ、ｅｅ　１．０
０　１．１０　１．２１（本発明） 比較スラ　０．３７　０，５５　０，８４　０゜８７　
０，９７　０．９８イ　ｌ’　２ 発色光学濃度値：測光値からカブリ光学濃度値（７％ア
ルブミン水溶液（グルコース不合）を用いて前記と同様
にして測光した値）をさしひいたイ１１１ 第２表に示した結果から、比較スライド′２ではグルコ
ース濃度測定可能範囲の上限が４８６ｍｇ／ｄｉまたは
それ未描であり、かつ発色光学濃度イ１ｒｉが小さいの
に対し、本発明の化学分析スライドではグルコース濃度
測定可能範囲の一ヒ限が少なくとも６９９　ｍ　ｇ　／
　ｄ　ｌにおよんでおり、かつ発色光学イ１６が大きく
検量線の傾きも大きいので分析精度が高いことがわかる
。またこの結果から本発明の化学分析スライドのグルコ
ース濃度測定ｉｉ）能範囲は比較スライド２のそれの約
１．５以１−に及んでいることも明らかである。

［実施例２］ 下記組成のカチオン慴ポリマー奴染剤を含むグルコース
オキシダーゼ層を乾燥層Ｊγか約２　ｐ−ｍになるよう
にして水溶液を塗布し乾燥したほかは実施例１と同様に
してグルコース分析スライドを調製した。

ゼラチン　３．０ｇ スチレン／Ｐ−［（１−メチル−１−ピペラジニオ）メ
チル］スチレン／シヒニルへンゼンコポリマ−１，５ｇ グルコ−スオキシターセ　４０００ＩＵポリオキシエチ
レン ノニルフェニルエーテル　０．１ｉ 実施例２および実施例工のグルコース分析スライドを用
い、実施例１、比較例１．２と同様にしてヘモグロビン
濃度と発色光学濃度値（第３表）およυグルコース濃度
と発色濃度値（第４表）のそれぞれの関係を得た。

第３表 ヘモグロビン濃度対発色光学濃度値 （グルコース濃度測定 化パ／分析スライド　０　５０　１００　５００　１０
００′天施例２　０．９８　０．９８　０．Ｓ８　０．
９８　０．９７実施例１　０，９５　０，９５　０，９
５　０．！９４　０．！１３１゛ノ　下　にＩ′１ 第４表 グルコース濃度対発色光学濃度値 スライド　８６　１５５　２９９　４８１３　５５５　
６！１９実施例２　０，４０　０，６０　０．８１　１
．１５　１．２２　１．３８実施例！　０．３８　０，
５７　０．８６　１．００　１．１０　１．２１発色光
学濃度値・第３表、第４表ともＡｌｌ＋光値からカブリ
光学濃度値（７％アルブミン水溶静（グルコース不合）
を用いて同様にして測光した値）をさしひいた値 第３表および第４表の結果から、カチオン＋１媒染剤を
含むグルコースオキシダーゼ層をイｊする本発明の化学
分析スライドはカチオン＋１媒染剤を含まないグルコー
スオキシダーゼ層を右する本発明の化学分析スライドに
比へて一段とへモグロビンの過酷化水素分解活性による
妨害を受けに〈〈なっており、実質的に妨害による負誤
差はなｌ、）と１／）えるぼどであり、同時に発色光学
濃度値力へ大きくかつ検量線の傾きも大きいので分析精
度力く高く、さらにグルコース濃度測定可能範囲も広（
７）こと力＼わかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、本不浸透性光透過性支持体の」−に（ａ）ペルオキ
   シダーゼとＪＳ化水素との存在下で検出可能な変化を生
   ずる過酸化水素指示薬、およびペルオキシダーゼを含む
   指示薬層、（ｂ）オキシグーセを含むオキシターゼ層、
   （ｃ）酸素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層、および（ｄ
   ）多孔性Ｍ間層がこの順に設けられてなる一体型多層化
   学分析要素。 ２、前記オキシダーゼ層に媒染剤が含有される特許請求
   の範囲第１項に記載の要素。 ３、前記光遮蔽層が、光遮蔽性微粉末が被膜形成能を有
   する親木性ポリマーバインダーに分散保持されてなる非
   孔性の層である特許請求の範囲第１項に記載の要素。 ４、前記過耐過醇化水素指示薬素供与体とカプラーとか
   らなる特許請求の範囲第１項に記載の要素。 ５、前記微粉末が、酸化チタン微粉末であり、かつ二酸
   化チタン微粉末と前記ポリマーバイングーの重量比が１
   ０対０．６から１０対１．８の範囲にある特許請求の範
   囲第３イＩに記載の要素。