DE69228378T2

DE69228378T2 - Xylanase, entsprechende rekombinante dna-sequenz, xylanase enthaltendes agens, und seine verwendung

Info

Publication number: DE69228378T2
Application number: DE69228378T
Authority: DE
Inventors: Henrik Dalboge; Torben Halkier; Hans Heldt-Hansen; Lars Pedersen; Martin Schuelein
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1991-04-02
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2012-03-28
Also published as: CA2106484A1; KR100234888B1; WO1992017573A1; JPH06506348A; US5610048A; JP3483880B2; FI934330A0; NO933525L; FI116795B; EP0579672A1; ATE176498T1; DE69228378D1; ES2130173T3; NZ242201A; EP0507723A1; EP0579672B1; NO933525D0; FI934330L; DK0579672T3

Description

Die Erfindung betrifft eine Xylanase, eine entsprechende rekombinante DNA- Sequenz, einen Vektor, einen transformierten Wirt, ein Verfahren zur Herstellung der Xylanase, eine die Xylanase enthaltende Zusammensetzung, und die Verwendung dieser Zusammensetzung.
Bei Xylan, einer Hauptkomponente von pflanzlichen Hemicellulosen, handelt es sich um ein Polymeres von D-Xylose, die über β-1,4-xylosidische Verbindungen verknüpft ist. Xylan kann durch Säure oder enzymatische Hydrolyse zu Xylose und Xylooligomeren abgebaut werden. Bei der enzymatischen Hydrolyse von Xylan entstehen freie Zucker, ohne die Nebenprodukte (z. B. Furane), die bei der Verwendung von Säure entstehen.
Gegenwärtig gibt es fünf Hauptanwendungsgebiete für Xylanasen, nämlich 1) den enzymatischen Abbau von pflanzlichen Abfällen zur Herstellung von Alkohol/Brennstoffen, 2) die enzymatische Modifizierung von Tierfutter oder Tierfutterbestandteilen, oder der Zusatz zu Tierfutter zwecks in vivo-Abbau des Hemicellulose-Anteils, 3) die Verwendung als Backhilfsmittel, 4) die Herstellung von Papierstoff zwecks Gewinnung von Cellulose und 5) die Biobleiche von Holzstoff [Detroym R. W. in: Organic Chemicals from Biomass. (CRC Press, Boca Raton, FL, 1981: 19-41; Paice, M. G. und L. Jurasek, J. Wood Chem. Technol. 4: 187-198; Pommier, J. C., J. L. Fuentes, G. Goma, Tappi Journal (1989): 187-191; Senior, D. J. et al., Biotechnol. Letters 10 (1988): 907-912].
Die Papier- und Zellstoffindustrie verwendet Xylanase-Zusammensetzungen beim Bleichvorgang zur Verbesserung des Weißgrades des gebleichten Zellstoffs, zur Herabsetzung der beim Bleichen verwendeten Chemikalienmengen, und zur Erhöhung des Mahlgrads der Papierstoffe beim Recycle-Papierherstellungsverfahren [Eriksson, K. E. L., Wood Science and Technology 24 (1990); 79-101; Paice, M. G., R. Bernier und L. Jurasek, Biotechnol. and Bioeng. 32 (1988): 235-239; Pommier, J. C., J. L. Fuentes und G. Goma, Tappi Journal (1989): 187-191].
Beim Kraft-Zellstoffverfahren, einem in der Papier- und Zellstoffindustrie weit verbreiteten Verfahren, findet ein alkalischer Sulfataufschluß zur Entfernung von 90-98% des Lignins statt. Die verbleibenden 2-10% Lignin verleihen dem Stoff eine dunkelbraune Farbe mit Tendenz zur Farbvertiefung unter UV- oder Oxidationseinwirkung. Zur Erzielung eines weißen Zellstoffs für qualitativ hochwertiges Papier wird die braune Farbe durch einen mehrstufigen Bleichprozess unter Verwendung von Chemikalien, wie Chlor, Chlordioxid, Ozon, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid entfernt.
Gegenwärtig gibt es große Bedenken über die Umweltbeeinträchtigung durch beim Bleichvorgang entstehende Chemikalien. Bei der Entfernung von Lignin aus dem Papierstoff ohne schädliche Nebenprodukte können Enzyme hilfreich sein. Es ist bekannt, daß das Lignin im Holz an Xylan gebunden vorliegt [Eriksson, O., et al., Wood Sci. Technol. 14 (1980); 267; Takashi, N. und T. Koshijüma, Wood Sci. Technol. 22 (1988); 177-189]. Durch begrenzte Hydrolyse des Xylans kommt es zu einer erhöhten Freisetzung von Lignin während des Bleichvorgangs. Durch enzymatische Behandlung des Papierstoffs vor dem Bleichen könnte deshalb die notwendige Menge an Bleichchemikalien herabgesetzt werden. [Vikari, L., et al., Proceedings of the 3rd International Symposium on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry (1986); 67.]
Nach Berichten in der technischen Literatur werden gute Ergebnisse mittels Pilzpräparationen von Trichoderma erhalten [Paice, M. G., L. Jurasek, J. Wood Chem. Technol. 4 (1989): 187-198; Senior, D. J., et al., Biotechnol. Letters, 10 (1988): 907-912], die eine pH-Einstellung der Holzstoffe auf pH- Werte unterhalb von 6,0 erfordern.
Eine Trichoderma-Xylanase-Präparation, PulpzymeTMHA (im Handel erhältlich von Novo Nordisk A/S) kann zur Delignifizierung von Kraft-Papierstoffen bei pH 5-7 verwendet werden. Bei 50ºC und einem pH über 7 zeigt dieses Enzym nur geringe Wirkung.
Weiterhin kann eine Bacillus pumilus-Xylanase-Präparation, PulpzymeTMHB (im Handel erhältlich von Novo Nordisk A/S) zur Delignifizierung von Kraft-Papierstoffen bei pH 5-7 verwendet werden. Bei 50ºC und pH-Werten über 7 zeigt dieses Enzym nur geringe Wirkung.
Humicola insolens-Xylanasen sind von Yoshioka, H. et al., Agric. Biol. Chem. 43(3) (1981) 579-586 beschrieben worden. In der Rohpräparation besitzen diese ein pH-Optimum von 6,0 und ein Temperaturoptimum von 60ºC. Bei pH 9 zeigen sie 25% der Aktivität bei pH 6. Nach den im vorgenannten Artikel enthaltenen Angaben waren die Enzyme ungereinigt und besitzen deshalb erhebliche Cellulase-Aktivität, zumal H. insolens als guter Cellulasebildner bekannt ist, siehe US-A-4 435 307. Weiterhin sind die Enzyme nicht charakterisiert mit Bezug auf Cellulasen, Mw, pI oder Aminosäurezusammensetzung, und sind nicht auf ihre Wirkung in Kraft-Papierstoffen, beim Backen oder in Tierfutter untersucht worden.
Die aus Agric. Biol. Chem. bekannte Xylanasepräparation von Humicola insolens YH-8, und die anderen bekannten oben beschriebenen Xylanasepräparationen sind für die Delignifizierung von Kraft/Papierstoffen nicht so gut geeignet, teilweise wegen des relativ hohen Cellulasegehalts.
Somit besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, eine Xylanase zur Verfügung zu stellen, die sich in Form einer Präparation mit sehr geringen Mengen an anderen Enzymaktivitäten herstellen läßt, insbesondere Cellulase- Aktivitäten und anderen Xylanase-Aktivitäten, und die gut geeignet ist zur Delignifizierung von Kraft-Papierstoffen, als Backhilfsmittel und als Zusatz zu Tierfutter.
Gegenstand der Erfindung ist eine rekombinante DNA-Sequenz, die für eine Xylanase codiert, welche mit der folgenden partiellen DNA-Sequenz unter relativ stringenten Bedingungen (1,0 · SSC, 0,1% SDS, 65ºC) zu hybridisieren vermag:
wobei auf T. Maniatis, A laboratory Manual (CSH) Bezug genommen wird.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin diese rekombinante DNA-Sequenz, die für eine Xylanase mit folgenden partiellen Aminosäuresequenzen codiert:
1. Thr-Asn-Thr-Gly-Asn-Phe-Val-Gly-Gly-Lys-Trp-Asn-Pro-Gly-Thr-Gly-Arg- Thr-Lys-Asn-Tyr-;
2. Thr-Ala-Asn-Pro-Leu-Val-Glu-Tyr-Tyr-;
3. Ser-Trp-Trp-Ser-Asp-Gly-Gly-Gly-Gln-Val-Gln-Tyr-;
4. Val-Ser-Thr-Arg-Tyr-Asn-Gln-Pro-Ser-Ile-Asp-Gly-Thr-Arg-Thr-Phe-Gln- Gln-Tyr-Trp-Ser-Ile-Arg-Lys-;
5. Tyr-Val-Ile-Glu-Ser-Tyr-Gly-Thr-Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Gln-Ala-Gln-Tyr- Lys-Gly-Thr-Phe-Tyr-Thr-Asp-Gly-Asp-Gln-Tyr-Asp-; und
6. Gln-Val-Thr-Pro-Asn-Ala-Glu-Gly-Trp-His-Asn-Gly-Tyr-Phe-Tyr-
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er die erfindungsgemäße rekombinante DNA-Sequenz enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße Vektor dadurch gekennzeichnet, daß er als Promotor den Aspergillus oryzae Takaamylase-Promotor und/oder als Terminator den Aspergillus oryzae AMG- Terminator enthält.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein transformierter Wirt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er den erfindungsgemäßen Vektor enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße transformierte Wirt dadurch gekennzeichnet, daß es sich hierbei um einen Aspergillus- Stamm handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße transformierte Wirt dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Stamm handelt, der den Spezies Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori angehört.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße transformierte Wirt dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Mikroorganismus handelt, der in nicht transformiertem Zustand keine Xylanase oder nur in unwesentlichen Mengen Xylanase produziert, vorzugsweise Bacillus sp., E. Coli oder S. cerevisiae.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Xylanase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen erfindungsgemäßen transformierten Wirt einsetzt.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Xylanase, die durch die erfindungsgemäße DNA-Sequenz codiert wurde.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Zusammensetzung, die die erfindungsgemäße Xylanase, vorzugsweise in Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms, enthält, wobei die Xylanase mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 30% des gesamten Enzymproteins aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Xylanase-Aktivität zu Cellulase-Aktivität, ausgedrückt als das Verhältnis zwischen der Xylanase- Aktivität in EXU/g zu Cellulase-Aktivität in ECU/g, einen Wert von über 10, vorzugsweise über 30 und insbesondere über 100 besitzt. Die Cellulase- Aktivität-Einheit ECU ist definiert in AF 302-1.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Xylanase-Aktivität von mindestens 10 EXU/mg Enzymprotein, vorzugsweise mindestens 100 EXU/mg Enzymprotein und insbesondere über 300 EXU/mg Enzymprotein enthält.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin, die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für den Xylanabbau.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die erfindungsgemäße Zusammensetzung Anwendung für chemische Papierstoffe oder Recycle-Papierstoffe, vor dem Bleichen oder als Teil des Bleichvorgangs, vorzugsweise bei einem pH-Wert über 7.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform findet die erfindungsgemäße Zusammensetzung Anwendung bei der Herstellung von Brot, das Weizenmehl enthält.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung findet die erfindungsgemäße Zusammensetzung Anwendung für Tierfutter.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß es möglich ist, die erfindungsgemäße Xylanase als Teil einer Xylanasepräparation herzustellen, die Enzymaktivitäten, z. B. Cellulasen neben Xylanase, nur in sehr geringen Konzentrationen enthält. Insbesondere ist festzuhalten, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Xylanase um eine spezielle Xylanase handelt, die aus den verschiedenen inherent von Humicola insolens, DSM 1800 produzierten Xylanasen ausgewählt ist, und die ausgezeichnet geeignet ist, sowohl als Additiv für Papierstoff, als Backhilfsmittel, als auch als Zusatzstoff für Tierfutter. Darüber hinaus wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Xylanase eine größere spezifische Aktivität als sämtliche bekannten Xylana sen besitzt. Es ist in höchstem Maße überraschend, daß die erfindungsgemäße Xylanase in all diesen technischen Anwendungsgebieten überlegene Eigenschaften besitzt, die keinen Zusammenhang untereinander aufweisen.
Die erfindungsgemäße Xylanase ist sehr wirksam bei der Delignifizierung von Papierstoff bei pH 8, wie nachfolgend gezeigt werden wird. Die Delignifizierungswirkung ist signifikant höher als im Stand der Technik (B. pumilus), wie nachfolgend gezeigt werden wird.
Die ausgezeichnete Eignung bei alleiniger Verwendung der erfindungsgemäßen Xylanase für die Delignifizierung ist überraschend, obwohl diese Xylanase einen von mehreren Xylanase-Bestandteilen von H. insolens darstellt. Die Delignifizierung ist ökonomischer, da nur eine einzige Xylanasekomponente erforderlich ist, eine Komponente, die mittels Genetic Engineering in hohen Ausbeuten hergestellt werden kann.
Überraschenderweise läßt sich die erfindungsgemäße Xylanase ohne signifikante Cellulase-Aktivität herstellen, wodurch Ausbeuteverluste, hervorgerufen durch cellulolytischen Angriff auf die Cellulosefasern im Papierstoff infolge Verwendung der Xylanase für die Delignifizierung, vermieden werden können.
Wie nachfolgend gezeigt wird, vermag die erfindungsgemäße Xylanase überraschenderweise mehr Lignin aus Weichholz als B. pumilus-Xylanase zu entfernen, obwohl die beiden Xylanasen sehr ähnliche pH-Profile aufweisen.
Xylanase (im Bäckereigewerbe findet die Bezeichnung Pentosanase allgemein Verwendung) wird als Backhilfsmittel für Weizenbrot für verschiedene Zwecke verwendet:
- Teigentwicklung
- Verbesserung der Teigelastizität und -stabiliät
- Erhöhung des Brotvolumens
- Verbesserung der Krumenstruktur
- Verbesserung beim Altbacken werden (anti-staling).
Man geht davon aus, daß einige Xylanasen die Pentosane (Arabinoxylane) in einer Weise abbauen, daß die hierdurch modifizierten Pentosane die Teigelastizität, -stabilität und das Gehen des Teiges (Teigentwicklung) verbessern. Es ist überraschend, daß die erfindungsgemäße Xylanase die Pentosane derartig zu modifizieren vermag. Die Xylanase der Erfindung kann ohne andere Xylanasen und Xylan-modifizierende Enzyme hergestellt werden und ermöglicht hierdurch eine kontrollierte Modifizierung der Pentosane.
Der pH im Teig ist 6,0 bis 6,5, was diese erfindungsgemäße Xylanase, weil ihr pH Optimum 5,5 bis 7,5 beträgt, ideal für den Einsatz als Backhilfsmittel macht.
Die erfindungsgemäße Xylanase kann außerdem zur Modifizierung von Tierfutter oder als Tierfutteradditiv zum in vivo Abbau der Hemicellulosefraktion verwendet werden. Die erfindungsgemäße Xylanase kann als Präperation praktisch ohne Fremdaktivitäten verwendet werden, während die Xylanase des Standes der Technik, repräsentiert durch ein H. insolens Xylanase-Produkt, mehrere Fremdaktivitäten, einschließlich anderen Xylanasen, enthalten würde. Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Xylanase und die Xylanase des Standes der Technik eine ähnliche Wirkung im Hinblick auf den Gewichtszuwachs in einem Hühnchen-Fütterungsversuch zeigen. Dies zeigt, daß die erfindungsgemäße Xylanase die aktive oder eine der aktiven H. insolens-Xylanasen bei der Verwendung als Futteradditiv ist. Überdies weist die erfindungsgemäße Xylanase den bedeutsamen Vorteil auf, daß sie sehr reine Xylanase enthält, wodurch ein reproduzierbarer Gewichtszuwachs erhalten werden kann, im Gegensatz zur Xylanase des Standes der Technik, die viele verschiedene Fremdaktivitäten mit variierenden Verhältnissen von Charge zu Charge enthält. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Xylanase, die eine Einkomponentexylanase ist, eröffnet darüber hinaus die Möglichkeit eines ökonomischeren Futteradditivs.
Die erfindungsgemäße Xylanase hat einen isoelektrischen Punkt von 7,5-9,5, vorzugsweise 8,0-8,5.
Die erfindungsgemäße Xylanase weist eine spezifische Aktivität von über 330 EXU/mg Protein, vorzugsweise über 400 EXU/mg Protein auf. Die EXU- Xylanase-Aktivitätseinheit wird in AF 293.9/1 definiert. Diese AF-Publikation und andere AF-Publikationen, die in der Beschreibung erwähnt werden, sind auf Anfrage von Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark erhältlich.
Die erfindungsgemäße Xylanase kann wie folgt hergestellt werden. Xylanase wurde durch Kultivierung von Humicola insolens DSM 1800 hergestellt, wie beschrieben in US-A-4 435 307, Beispiel 6 vom Anfang bis Spalte 11, Zeile 29. Das gefriergetrocknete Pulver wurde mit Wasser bis zu einem Trockensubstanzgehalt von 10% verdünnt, und der pH wurde mit 10% HCl auf 2,3 gesenkt. Das Gemisch wurde 50 Minuten bei 22ºC stehen gelassen und der pH anschließend mit NaOH auf 8,0 erhöht. Dann wurde eine Salzpräzipitation mit 250 g Na&sub2;SO&sub4; pro kg Flüssigkeit bei pH 5,0 durchgeführt. Der Salzkuchen wurde wieder aufgelöst und dann konzentriert und durch Ultrafiltration gewaschen. Schließlich wurde die Präperation eingefroren.
In einer Lösung mit 12% Trockensubstanz wies die Xylanase-Präparation folgende Enzymaktivitäten auf: 444 CSU/ml und 144 EXU/ml. CSU ist die Cellulase Aktivitätseinheit, siehe AF 267.
Die Präparation wurde weiter gereinigt durch Ionenaustausch mit DEAE Sephadex A-50 (Pharmacia) im Batch-Verfahren, Konzentrierung durch AMICON Ultrafiltration, Gelfiltration mit Sephacryl S-200 (Pharmacia) und Kationenaustausch mit High Load S-Sepharose (Pharmacia).
Es wurde gefunden, daß die Xylanase keine dedektierbaren Cellulasefremdaktivitäten aufweist. Folglich zeigte das gereinigte Xylanase-Produkt eine Cellulase-Aktivität von weniger als 0,1 CSU/mg Protein und eine Xylanase- Aktivität von mehr als 350 EXU/mg Protein. Das gereinigte Xylanase- Produkt zeigt nur eine SDS-PAGE Bande mit einem Molekulargewicht von 22 kD. Der pI wurde mit isoelektrischer Fokussierung auf 8,5 bestimmt.
Der mit dem gereinigten Xylanase-Produkt reaktive Antikörper wurde in folgender Weise hergestellt. Das Anitserum gegen die gereinigte Xylanase wurde durch Immunisierung von Kaninchen nach dem durch N. Axelsen et. al. beschriebenen Verfahren gewonnen: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23. Gereinigtes Immunglobulin wurde aus dem Anitserum durch Salzpräzipitation ((NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;), gefolgt von Dialyse und Anionenaustausch-Chomatographie mit DEAE-Sephadex, erhalten. Die immunochemische Charakterisierung der gereinigten Xylanase wurde mit Hilfe von Rocket-Immunoelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt. Mit dem oben bezeichneten Antikörper zeigte die gereinigte Xylanase bei der Rocket-Immunoelektrophorese einen einzigen, zur Kathode wandernden Bogen.
Zur chemischen Charakterisierung der Xylanase wurde die Gesamtaminosäurenzusammensetzung bestimmt durch saure Hydrolyse nach Moore und Stein (1963), Methods Enzymol. 6, 819-831, und durch qualitative und quantitative Bestimmung der Aminosäuren im Hydrolysegemisch nach Heinrikson und Meredith (1984), Anal. Biochem. 136, 65-74 (Derivatisierung) und Edelhoch (1967), Biochemistry 6, 1948-1954 (Tryptophan-Bestimmung). Die letztgenannte Literaturstelle beschreibt die spectrophotometrische Bestimmung des Tryptophangehaltes. Die folgende Aminosäurezusammensetzung wurde gefunden.
Es wurde gefunden, daß die N-terminale Aminosäurensequenz der gereinigten Xylanase
lautet.
Nach enzymatischen Abbau mit Chymotrypsin werden außerdem drei Peptide sequenziert, wobei eins von diesen als Seitensequenz (SS) während der Sequenzierung eines anderen Peptids bestimmt wurde:
Chymo-22: Thr-Asn-Thr-Gly-Asn-Phe-Val-Gly-Gly-Lys-Trp-Asn-Pro- Gly-Thr-Gly-Arg-Thr-Lys-Asn-Tyr- (SEQ ID Nr. 1)
Chymo-22: Thr-Ala-Asn-Pro-Leu-Val-Glu-Tyr-Tyr- (SS) (SEQ ID Nr. 2)
Chymo-24: Ser-Trp-Trp-Ser-Asp-Gly-Gly-Gly-Gln-Val-Gln-Tyr- (SEQ ID Nr. 3)
Nach chemischem Abbau mit CNBr, gefolgt von enzymatischem Abbau mit Pepsin, werden zwei Peptide sequenziert.
CNBr/Pep-16: Val-Ser-Thr-Arg-Tyr-Asn-Gln-Pro-Ser-Ile-Asp-Gly-Thr-Arg- Thr-Phe-Gln-Gln-Tyr-Trp-Ser-Ile-Arg-Lys- (SEQ ID Nr. 4)
CNBr/Pep-23: Tyr-Val-Ile-Glu-Ser-Tyr-Gly-Thr-Tyr-Asn-Pro-Gly-Ser-Gln- Ala-Gln-Tyr-Lys-Gly-Thr-Phe-Tyr-Thr-Asp-Gly-Asp-Gln- Tyr-Asp- (SEQ ID Nr. 5)
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Xylanase eine schwache Homologie zu den Xylanasen des Standes der Technik, z. B. Xylanasen herstellbar aus Schizophyllum communue, Bacillus pumilus und Bacillus subtilis, aufweist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1 beschreibt die Selektion des Xylanase produzierenden Gens und die Herstellung der Xylanase durch einen genetisch modifizierten Wirtsorganismus. Beispiel 2 beschreibt die Herstellung in einer Pilotanlage für die Xylanase und die Reinigung der Xylanase. Beispiel 3 beschreibt die Verwendung der Xylanase als Bleichverstärker während der Papierstoffherstellung, und Beispiel 4 beschreibt die Verwendung der Xylanase als Backhilfsmittel.

BEISPIEL 1

Medien

YPD: 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, mit H&sub2;O auf 810 ml. Autoklaviert, 90 ml 20% Glucose (steril filtriert) zugesetzt.
10 · Grundsalz: 66,8 g Hefestickstoffbase, 100 g Bernsteinsäure, 60 g NaOH, H&sub2;O ad 1000 ml, steril filtriert.
SC-URA: 90 ml 10 · Grundsalz, 22,5 ml 20% Casaminosäuren, 9 ml 1% Tryptophan, H&sub2;O ad 806 ml, autoklaviert, 3,6 ml 5% Threonin und 90 ml 20% Glucose zugesetzt.
SC-H Agar: 7,5 g/l Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 11,3 g/l Bernsteinsäure, 6,8 g/l NaOH, 5,6 g/l Casaminosäuren ohne Vitamine, 0,1 g/l Trypthophan und 20 g/l Agar (Bacto). 20 min. bei 121ºC autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 55 ml einer 22%igen Galactoselösung und 1,8 ml einer 5%igen Threoninlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
YNB-1 Agar: 3,3 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 16,7 g/l Agar, pH eingestellt auf 7. 20 min. bei 121ºC autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden 25 ml einer 13,6%igen Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 25 ml einer 40%igen Glucoselösung, 1,5 ml einer 1%igen L-Leucin-Lösung und 1,5 ml einer 1%igen Histidinlösung pro 450 ml Agar zugesetzt.
YNB-1 Nährbouillon: Zusammensetzung wie YNB-1 Agar, jedoch ohne Agar.
Haferspelz-Xylan-Überschichtungsgel: 1% Agarose, 1% Haferspelz-Xylan (Sigma Chemical Company) in Tris-Maleinsäure-Puffer, pH 7. Das Gel wurde gekocht und dann auf 55ºC gekühlt, bevor das Überschichtungsmittel auf Agarplatten gegossen wurde.
FG-4-Agar: 35 g/l Agar, 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto Pepton, pH 7. 40 min bei 121ºC autoklaviert.
FG-4-Medium: 30 g/l Sojabohnenmehl, 15 g/l Maltodextrin (Glucidex 6), 5 g/l Bacto Pepton. 40 min bei 121ºC autoklaviert.

Konstruktion eines Hefeexpressionsplasmids

Das im Handel erhältliche Plasmid pYES II (Invitrogen) wurde mit SpeI geschnitten, mit Klenow-DNA-Polymerase + dNTP aufgefüllt und mit ClaI geschnitten. Die DNA wurde auf einem Agarosegel größenfraktioniert, und ein Fragment von etwa 2000 BP wurde vermittels Elektroelution gereinigt. Das gleiche Plasmid wurde mit ClaI/PvuII geschnitten, und ein Fragment von etwa 3400 BP vermittels Elektroelution gereinigt. Diese beiden Fragmente wurden mit einem glatt-endigen SphI/EcoRI-Fragment, das den Hefe TPI-Promotor enthält, ligiert. Das Fragment wurde von einem Plasmid isoliert, in dem der TPI-Promotor von S. cerevisiae (siehe T. Albers und G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1982, S. 419-434) leicht modifiziert war.
Eine interne SphI-Schnittstelle wurde durch Deletion der vier BP, die den Kern der Schnittstelle darstellen, entfernt. Ferner wurden redundante Sequenzen stromaufwärts vom Promotor durch Ball-Exonucleasebehandlung, gefolgt von der Addition eine SphI-Linkers, entfernt. Schließlich wurde bei Position -10 ein EcoRI-Linker addiert.
Nach diesen Modifikationen ist der Promotor in einem SphI-EcoRI-Fragment enthalten. Seine Effizienz, verglichen mit dem ursprünglichen Promotor, scheint durch die Modifikationen nicht beeinträchtigt zu sein. Das resultierende Plasmid pYHD17 wird in Fig. 1 gezeigt.

Donor-Organismus

H. insolens, DSM 1800, hochgezogen in einem zellulosereichen Fermentationsmedium unter Rühren, um ausreichende Belüftung sicherzustellen.

Isolierung der mRNA

Gesamt-RNA wurde von näherungsweise 7 g Mycel isoliert. Das Mycel wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und in einem Mörser mit 1 g Quarzsand bis zur Konsistenz von Mehl gemahlen. Die RNA wurde mit Guanidiniumthiocyanat extrahiert und durch CsCI zentrifugiert, im wesentlichen wie beschrieben in Sambrook et al., 1989, (op. cit.). Poly-A-RNA wurde durch Chomatographie auf Oligo-dT-Zellulose aus Gesamt-RNA isoliert.

cDNA-Synthese

Die cDNA Synthese wurde mit Hilfe eines cDNA-Synthese-Kits von Invitrogen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die DNA wurde an die Expressionsvektoren durch Addition eines BstxI-Linkers (Invitrogen) angepaßt und auf einem Agarosegel größenfraktioniert. Nur DNA > 5-600 BP wurde bei der Herstellung der Bibliothek verwendet. Die angepaßte cDNA wurde in einen geeigneten, mit BstxI geschnittenen Hefeexpressionsvektor einligiert. Nach Testligationen (um die größe der Bibliothek zu bestimmen), wurde die Bibliothek, die sich näherungsweise auf 5000 Transformanten pro Platte beläuft, auf 50 Agarplatten ausplatiert. Zu jeder näherungsweise 5000 Einzel- Klone enthaltenden Platte wurden 3 ml Medium gegeben. Die Bakterien wurden abgekratzt, und nach Zusatz von 1 ml Glyzerin erfolgte Lagerung in Form von 50 Aliquots bei -80ºC. Die verbleibenden 2 ml wurden zur DNA-Isolierung verwendet. Wenn die DNA-Menge unzureichend war, um die erforderliche Anzahl von Hefetransformanten (siehe unten) zu ergeben, wurde ein großer Ansatz DNA aus 500 ml Medium (TB), inokuliert mit 50 ul -80ºC Bakterienvorratsflüssigkeit und über Nacht hochgezogen, hergestellt. DNA wurde aus 20 Einzel-Klonen der Bibliothek isoliert und einer Analyse auf cDNA-Insertion unterzogen. Es wurde gefunden, daß die Inser tionshäufigkeit > 90% und die mittlere Insertionsgröße etwa 1400 BP betrug.

Transformation von Hefe

Als Hefestamm diente yNG231. (MAT alpha, leu2, ura3-52, his4-539, pep4- delta 1 cir+). Eine Kolonie wurde über Nacht bei 30ºC in 10 ml YPD angezogen. 10, 30 und 60 ul dieser Kultur wurden drei Schüttelkolben, die 100 ml YPD enthielten, zugesetzt und unter Schütteln über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die Kultur, deren OD&sub8;&sub0;&sub0; am nächsten zu 0,3-0,4 war, wurde ausgewählt. Die Zellen wurden in 50 ml Röhrchen in einer Beckman-Zentrifuge (Geschwindigkeit 6, 10 min) geerntet, die Zellen wurden in 2 · 5 ml H&sub2;O resuspendiert, zentrifugiert, wie oben beschrieben, resuspendiert in 5 ml Puffer, enthaltend 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5 und abermals zentrifugiert. Die Zellen wurden in 500 ul des obigen Puffers resuspendiert und 60 min bei 30ºC inkubiert. 250 ug Träger-DNA (sterile Lachs-Sperma-DNA 10 mg/ml, siehe unten) wurden zugesetzt und Aliquots von 100 ul hergestellt. Die zu transformierende DNA (etwa 5 ug) wurde zu dem 100 ul Aliquot gegeben, schonend gemischt und 30 min bei 30ºC inkubiert. 700 ul 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5, wurden zugesetzt, und die Inkubation wurde 60 min bei 30ºC fortgeführt. Das Transformationsgemisch wurde für 5 min bei 42ºC einem Hitzeschock unterzogen, in einer Mikrozentrifuge kurz abzentrifugiert, in 100-200 ul H&sub2;O resuspendiert und auf SC-Platten ohne Uracil ausplattiert, gefolgt von einer Inkubation für drei Tage bei 30ºC.

Präparation der Träger-DNA

100 mg Lachs-Sperma-DNA wurden ausgewogen und über Nacht in 10 ml 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5 (TE) aufgelöst. Die Lösung wurde dann in einem Plastikbehälter in Eiswasser beschallt, bis sie nicht mehr viskos war. Die Lösung wurde dann Phenol-extrahiert und EtOH-präzipitiert, das Pellet wurde gewaschen und in 5 ml TE resuspendiert. Die Suspension wurde EtOH-präzipitiert, und das Pellet wurde gewaschen und in 5 ml TE resuspendiert. OD&sub2;&sub6;&sub0; wurde gemessen, und die Suspension wurde mit TE auf 10 mg/ml verdünnt.

Screening-Verfahren für Hefe

Wie oben beschrieben, wurde DNA aus der Humicola-Bibliothek, Aliquots 1-10, in Hefe transformiert, wobei 20-25.000 Kolonien enthaltende Platten von jedem Aliquot erhalten wurden. Die Kolonien wurden abgekratzt und in Glycerin bei -80ºC gelagert.
Hefezellen aus der Bibliothek werden auf YNB-Agar zu einer Gesamtzahl von etwa 400 000 Kolonien ausgestrichen. Die Zahl der Kolonien pro Platte variierte von 50 bis 500. Nach 4 oder 5 Tagen Wachstum wurden die Agar-Platten auf einen Satz von SC-H Agar-Platten replikaplattiert. Diese Platten wurden dann 2-4 Tage bei 30ºC inkubiert, worauf die Agar-Platten mit einem Haferspelz-Xylan-Überschichtungsgel für den Nachweis von Xylanase überschichtet wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 40ºC wurden die Enzymreaktionen mit Kongorot sichtbar gemacht. 10-15 ml einer 0,1%igen Kongorot-Lösung wurden auf die Überschichtung gegossen und nach 10-20 min entfernt. Die Platten wurden dann ein- oder zweimal durch Gießen von 10-15 ml 2M NaCl auf die Platten gewaschen. Die NaCl- Lösung wurde nach 15-20 min entfernt. Xylanase-positive Kolonien wiesen sich auf den Pattenüberschichtungen als farblose oder blaßrote Lichtungszonen auf einem roten Hintergrund aus.
Zellen von emzympositiven Kolonien wurden zur Isolierung einer Einzelkolonie auf Agar ausgestrichen und eine enzymproduzierende Einzelkolonie für jede der identifizierten Xylanase produzierenden Kolonien ausgewählt.

Charakterisierung der Xylanase-positiven Klone

Jede der 147 Xylanase produzierenden Kolonien wurde isoliert. Einige dieser Kolonien wurden in 20 ml YNB-1 Nährbouillon in einem 50 ml Glasteströhrchen inokuliert. Das Röhrchen wurde 2 Tage bei 30ºC geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 3000 U/min geerntet.
Die Zellen wurden in 1 ml 0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, ph 7,5 resuspendiert. Das Pellet wurde in ein Eppendorf-Gefäß überführt und 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die Zellen wurden in 0,4 ml 0,9 M Sorbit, 0,1 M EDTA, 14 mM β-Mercaptoethanol suspendiert. 100 ul 2 mg/ml Zymolase wurden zugesetzt, und die Suspension wurde bei 37ºC 30 min inkubiert und 30 Sekunden zentrifugiert. Das Pellet (Sphäroblasten) wurde in 0,4 ml TE resuspendiert. Nach Zusatz von 90 ul von (1,5 ml 0,5 M EDTA pH 8.0; 0,6 ml 2 M Tris-HCl pH 8,0; 0,6 ml 10% SDS) wurde die Suspension wurde bei 65ºC 30 min inkubiert. Nach Zusatz von 80 ul 5 M KOAc wurde die Suspension auf Eis mindestens 60 min inkubiert und 15 min bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Gefäß überführt, das mit EtOH (Raumtemperatur) gefüllt war, gefolgt von gründlichem aber sanftem Mischen und 30 Sekunden Zentrifugieren. Das Pellet wurde mit kaltem 70%igem EtOH gewaschen, 30 Sekunden zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde in 50 ul TE resuspendiert und 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Gefäß überführt. 2,5 ul 10 mg/ml RNase wurden zugesetzt, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC und Zugabe von 500 ul Isopropanol unter sanftem Rühren. Das Gemisch wurde 30 Sekunden zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde mit kaltem 96%igem EtOH gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde in 50 ul Wasser zu einer Endkonzentration von etwa 100 ul/ml aufgelöst.
Die DNA wurde in E. coli durch Standardverfahren transformiert. Zwei E. coli-Kolonien wurden von jeder Transformation isoliert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI analysiert, die die DNA-Insertion herausschnitten. DNA von einem dieser Klone wurde in Hefe retransformiert und abermals auf Enzymaktivität untersucht.
Die DNA-Sequenzen mehrerer positiver Klone wurden partiell bestimmt. Basierend auf der DNA-Sequenz wurden 15 Klone als zur selben Familie zugehörig klassifiziert, die Sequenz dieser Xylanase-Familie zeigte volle Homologie mit der Aminosäuresequenz der gereinigten erfindungsgemäßen Xylanase. Eine Partialsequenz erscheint in Anspruch 5.
Ein E. coli Stamm, der das Xylanase HindIII/XbaI-cDNA Fragment in pYES2 enthält, wurde beim DSM am 18. März 1992 als DSM 6995 hinterlegt. Das Xylanase-cDNA-Fragment wurde von einem der Klone durch Schnitt mit HindIII/XbaI isoliert. Das HindIII/XbaI-Fragment wurde durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt, elektroeluiert und für Ligationsreaktionen vorbereitet. Das cDNA-Fragment ist ligiert mit dem HindIII/XbaI-verdauten pHD414 (siehe unten), wobei pHD 450 entsteht, in dem die cDNA sich unter transkriptionaler Kontrolle des TAKA-Promotors von Aspergillus oryzae und dem AMG-Terminator von Aspergillus niger befindet.
Nach der Amplifikation der DNA in E. coli wurde das Plasmid, wie im folgenden beschrieben, in Aspergillus oryzae transformiert.

Konstruktion eines Aspergillus Expressionsvektors

Der Vektor pHD414 (Fig. 2) ist ein Abkömmling des Plasmids p775 (beschrieben in EP 238 023). Im Gegensatz zu diesem Plasmid hat pHD414 eine Reihe von singulären Restriktionsschnittstellen zwischen dem Promotor und dem Terminator. Das Plasmid wurde durch Entfernung eines etwa 200 BP-langen Fragments (das unerwünschte Restriktionsschnittstellen enthält) aus dem 3'-Ende des Terminators und durch anschließende Entfernung eines etwa 250 BP-langen Fragments aus dem 5'-Ende des Promotors, das ebenfalls unerwünschte Schnittstellen enthält, konstruiert. Die 200 BP-Region wurde durch Schneiden mit NarI (lokalisiert im pUC-Vektor) und XbaI (unmittelbar 3' zum Terminator) entfernt, anschließendes Auffüllen der generierten Enden mit Klenow-DNA-Polymerase + dNTP, Reinigung des Vektorfragmentes durch ein Gel und Religation des Vektorfragments. Dieses Plasmid wurde pHD413 genannt. pHD413 wurde mit StuI (lokalisiert im 5'- Ende des Promotors) und PvuII (im pUC-Vektor) geschnitten, auf einem Gel fraktioniert und religiert, wobei pHD414 erhalten wurde. Fig. 2 ist eine Karte des Plasmids pHD414, wobei "AMG Terminator" den A. niger Glucoamylase-Terminator und "TAKA Promotor" den A. oryzae TAKA-Amylase- Promotor bezeichnet.

Transformation von Aspergillus oryzae

100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) werden mit Sporen von A. oryzae inokuliert und unter Schütteln bei 380C zwei Tage inkubiert. Das Mycel wird durch Filtration durch Miracloth geerntet und mit 200 ml 0,6 M MgSO&sub4; gewa schen. Das Mycel wird in 15 ml 1,2 M MgSO&sub4; 10 mM NaHPO&sub4;, pH = 5,8 suspendiert. Die Suspension wird auf Eis gekühlt worauf 1 ml 120 mg Novozym® 234 enthaltender Puffer zugesetzt wird. Nach 5 Minuten wird 1 ml 12 mg/ml DSA (Sigma Typ H&sub2;&sub5;) zugesetzt und die Inkubation unter sanftem Schütteln 1,5-2,5 Stunden bei 37ºC fortgesetzt bis eine große Anzahl von Protoplasten in einer unter dem Mikroskop betrachteten Probe sichtbar ist.
Die Suspension wird durch Miracloth filtriert, das Filtrat in ein steriles Röhrchen überführt und mit 5 ml 0,6 M Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0 überschichtet. Nach 15 Minuten Zentrifugieren bei 100 g werden die Protoplasten von der Spitze des MgSO&sub4;-Kissens gesammelt. Nach Zusatz von 2 Volumina STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl&sub2;) zur Protoplastensuspension wird das Gemisch 5 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Protoplasten-Pellet wird in 3 ml STC resuspendiert und repelletiert. Dies wird wiederholt. Schließlich werden die Protoplasten in 0,2-1 ml STC resuspendiert.
100 ul der Protoplastensuspension werden mit 5-25 ug der geeigneten DNA in 10 ul STC gemischt. Die Protoplasten werden mit p3SR2 (ein A. nidulans amdS-Gen tragendes Plasmid) gemischt. Das Gemisch wird 25 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5 werden zugesetzt und vorsichtig gemischt (zweimal), und schließlich werden 0,85 ml von derselben Lösung zugesetzt und vorsichtig gemischt. Das Gemisch wird 25 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, bei 2500 g 15 Minuten zentrifugiert, und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert. Nach einer weiteren Sedimentation werden die Protoplasten auf geeigneten Platten ausgestrichen. Die Protoplasten werden auf Minimalplatten ausgestrichen (Cove, siehe Biochem.Biophys.Acta 113 (1966) 51-56), die 1,0 M Saccharo se, pH = 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und 20 mM CsCl zur Unterdrückung von Hintergrundwachstum enthalten. Nach Inkubation für 4-7 Tage bei 37ºC werden Sporen gestochen und zum Erhalt von Einzelkolonien ausgestrichen. Das Verfahren wird wiederholt und Sporen einer Einzelkolonie nach der zweiten Re-Isolierung als definierte Transformante gelagert.

Expression der Xylanase in Asoergillus

11 Transformanten wurden erhalten und inokuliert und gesichert auf YPG- Agar. Jede der 8 ausgewählten Transformanten wurde aus YPG-Agar-Quadern (Slants) in 500 ml Schüttelkolben mit 150 ml FG-4 Medium inokuliert. Nach 4 Tagen Fermentation unter ausreichendem Schütteln, um eine gute Belüftung zu gewährleisten, wurden die Kultur-Nährbouillons 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert, und die Überstände analysiert. Der Beste ergab 72 EXU/ml. Es gab keinen Hintergrund vom untransformierten Wirtsstamm. Dieser Stamm wird mit Axy40/8 bezeichnet.

BEISPIEL 2

Der Stamm Axy40/8 wurde im Maßstab einer Pilotanlage wie folgt fermentiert. Ein Agarsubstrat der folgenden Zusammensetzung wurde in einem Fernbach-Kolben zubereitet:
Saccharose 30 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 1 g/l
NaNO&sub3; 3 g/l
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5 g/l
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,01 g/l
KCl 0,5 g/l
Agar 25 g/l
Der pH wurde zwischen 6,4-6,5 eingestellt, 20 Minuten bei 121ºC autoklaviert.
Der Fernback-Kolben wurde mit einer Sporensuspension inokuliert und 5 Tage bei 30ºC kultiviert.
Ein Substrat folgender Zusammensetzung wurde in einem 500 Liter-Startfermenter (seed fermenter) zubereitet:
Hefeextrakt, 50% 6 kg
Kartoffelstärke 9 kg
CaCO&sub3; 0,15 kg
Pluronic L61 150 ml
Termamyl® 60 (L)* 9 g
*Termamyl ist eine Alpha-Amylase erhältlich von Novo Nordisk A/S.
Leitungswasser wurde bis zu einem Endvolumen von etwa 225 Litern zugesetzt. Der pH wurde mit H&sub3;PO&sub4; auf etwa 6,5 eingestellt.
Die Temperatur wurde von 60 auf 90ºC in 30 Minuten erhöht, 30 Minuten bei 90ºC gehalten, bevor das Substrat im Startfermenter 1,5 Stunden bei 121ºC sterilisiert wurde. Das Endvolumen vor Inokulation war betrug etwa 300 Liter.
Die Fernbach-Kolben-Sporensuspension wurde in den Startfermenter überführt. Die Start-Fermentationsbedingungen waren: Fermenter-Typ: Herkömmlicher, belüfteter und gerührter Fermenter mit einem Höhe/Durchmesser-Verhältnis von etwa 2,3.
Rührer: 250 U/min
Belüftung: 300 Normal-Liter Luft pro Minute
Temperatur: 34ºC
Zeit: etwa 24 Stunden
Etwa 35 Stunden nach Inokulation wurden 150 Liter vom Startfermenter in den Hauptfermenter überführt.
Ein Substrat folgender Zusammensetzung wurde in einem 2500 Liter Hauptfermenter zubereitet:
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 2,6 kg
KH&sub2;PO&sub4; 2,6 kg
K&sub2;SO4 3,9 kg
Spurenmetallösung 650 ml
Kartoffelstärke 39,0 kg
Hefeextrakt, 50% 28,6 kg
Harnstoff 5,2 kg
Zitronensäure 1,053 kg
Pluronic L61 650 ml
Termamyl® 60 L 39 g
Die Spurenmetallösung hat folgende Zusammensetzung:
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 14,3 g/l
CuSO&sub4; · 7H&sub2;O 2,5 g/l
NiCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,5 g/l
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 13,5 g/l
MnSO&sub4; · H&sub2;O 8,5 g/l
Zitronensäure-Monohydrat 3,0 g/l
Leitungswasser wurde bis zu einem Endvolumen von etwa 900 Liter zugesetzt. Der pH wurde mit H&sub3;PO&sub4; auf 6,5 eingestellt. Die Temperatur wurde von 60 auf 90ºC in 30 Minuten erhöht und 30 Minuten bei 90ºC gehalten. Nach Einstellen des pH auf 4,5 wurde das Substrat im Hauptfermenter 1,5 Stunden bei 123ºC sterilisiert. Das Endvolumen vor Inokulation betrug etwa 1300 Liter.
Darauf wurden 150 Liter Startkultur zugesetzt.
Die Fermentationsbedingungen waren: Fermenter-Typ: Herkömmlicher, belüfteter und gerührter Fermenter mit einem Höhe/Durchmesser-Verhältnis von etwa 2,7.
Rührer: 250 U/min (zwei Turbinenimpeller)
Belüftung: 1500 Normal-Liter Luft pro Minute, ansteigend auf 1700 Nl/min bei 130 Stunden.
Temperatur: 34ºC
Zeit: etwa 130 Stunden
Nach 25 Stunden wurde in den Hauptfermenter eine Maltodextrinlösung in einer Menge, ansteigend von 1 l/h bis 4 l/h in 12 Stunden, eingespeist. Die Dextrinlösung der folgenden Zusammensetzung wurde in einem 550 Liter Beschickungsbehälter zubereitet:
Kartoffelstärke 184 kg
Biotin 0,04 g
Thiamin 0,4 g
Zitronensäure 0,2 kg
Pluronic L61 200 ml
Termamyl® 60L 360 ml
Leitungswasser wurde bis zu einem Endvolumen von etwa 300 Litern zugesetzt. Die Temperatur wurde 60 Minuten bei 90ºC gehalten, bevor das Substrat im Dosiertank 1,5 Stunden bei 123ºC sterilisiert wurde. Das Endvolumen vor dem Start der Dosierung betrug etwa 400 Liter.
Nach 25 Stunden Fermentation wurde der pH mit NH&sub3; auf 7,3-7,4 eingestellt.
Nach etwa 130 Fermentationsstunden wurde der Fermentationsprozeß gestoppt. Die etwa 1850 Liter Kultur-Nährbouillon wurden auf etwa 5ºC gekühlt und die Enzyme nach folgender Methode isoliert.
Die Kultur-Nährbouillon wurde bei pH 7 zentrifugiert und das Zentrifugat mittels eines Seitz-Scheibenfilters (Typ Supra EKS Neu) unter Verwendung von Hyflo Super-Cell Kieselgur als Filtrierhilfsmittel filtriert. Der pH im Filtrat wurde auf 4,7 eingestellt und das Filtrat durch Ultrafiltration auf einen Trockensubstanzgehalt von 5% konzentriert. Weitere Konzentration zu einem Trockensubstanzgehalt von 30% wurde durch Eindampfen erreicht. Der pH im Konzentrat wurde auf 6,5 eingestellt, das Konzentrat unter Verwendung von Hyflo Super-Cell als Filtrierhilfsmittel durch einen Rahmenfilter filtriert und durch ein Seitz-Scheibenfilter (Typ Supra EKS Neu) Keimfiltriert.
Dieses Konzentrat wird später in der Beschreibung als Präparation 1 ausgewiesen.
Präparation 1 weist eine Xylanase-Aktivität von 533 EXU/g auf.
Präparation 1 wurde wie folgt gereinigt.
Insgesamt 200.000 EXU wurden mit 25% Amoniumsulfat präzipitiert. Das Präzipitat wurde in 500 ml Wasser solublisiert und in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle mit einer GR90PP Membran von Dow Dänemark A/S gewaschen. Die Leitfähigkeit wurde auf 1,7 mS reduziert. Die Ausbeute betrug 150.000 EXU. Der pH wurde auf 5,0 eingestellt und die Probe durch einen 0,45 Micron-Filter filtriert; Ausbeute 100.000 EXU. Die Probe wurde mit Kationen-Austauschchromatographie behandelt mittels einer 200 ml S-Sepharose Fast Flow-Säulenchromatographie und eines Puffers, der 20 mM Natriumacetat mit pH 5,0 enthielt. Die Xylanase wurde bei diesem pH an die Säule gebunden. Die Xylanase wurde unter Anwendung eines linearen Gradienten, der 1 M Natriumchlorid in demselben Puffer enthielt, eluiert. Insgesamt wurden 75.000 EXU in 160 ml mit E&sub2;&sub8;&sub0; 4,1 zurückgewonnen, was 114 EXU pro E&sub2;&sub8;&sub0; entspricht.
Zum Zwecke der Peptid-Kartierung und Messung der spezifischen Aktivität und Charakterisierung wird die Xylanase durch einen Endreinigungsschritt in hoher Reinheit erhalten. Durch Größenchromatographie mit Superdex 75 ist ein kleiner Anteil der Xylanase hoch gereinigt worden. Die gereinigte Xylanase zeigt in der SDS-PAGE eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von 22 kD, und eine einzige Bande in der isoelektrischen Fokusierung mittels Pharmacia IEF-Gelen mit einem pI von 8,2.
Die native und die erfindungsgemäße klonierte Xylanase, gereinigt wie oben beschrieben, reagieren gleichermaßen mit Kaninchenserum, das gegen gereinigte native Xylanase hergestellt wurde. Unter Anwendung der Rocket-Immunelektrophorese ergeben beide Enzyme auf der gleichen EXU-Basis das gleiche Immunpräzipitat.
Unter Anwendung des EXU-Verfahrens beträgt die Aktivität der gereinigten Xylanase gegenüber farbigem Xylan 130 EXU pro E&sub2;&sub8;&sub0; oder 450 EXU pro mg Protein. Der Extinktionskoeffizient beträgt 3,5 E&sub2;&sub8;&sub0;.

BEISPIEL 3

In diesem Beispiel wird die B. pumilus-Xylanase des Standes der Technik mit der erfindungsgemäßen Xylanase verglichen. Präparation 1, beschrieben in Beispiel 2, wurde für den Vergleich benutzt. Es zeigte sich, daß die erfindungsgemäße Xylanase bei einem Weichholzstoff eine deutlich bessere Bleichverstärkerwirkung gab.
Erfindungsgemäße Xylanase: H. insolens Xylanase, flüssige Präparation, 533 EXU/g
Xylanase des Standes der Technik: B. pumilus Xylanase, flüssige Präparation, 1070 EXU/g

Papierstoff

Ungebleichtes Weichholz von einer schwedischen Mühle. Der Papierstoff war gewaschen worden, luftgetrocknet und gelagert bei < 5ºC in einem kalten Raum.
Der Papierstoff wurde > 12 Stunden in Wasser eingeweicht, wonach er in einem Labor-Pulper bei 1% DS, 10.000 Umdrehungen aufgelöst wurde.

Tabelle 1

Meßdaten des Papierstoffs, bestimmt nach der Lagerung

Papierstoff-Meßdaten Weichholz
Kappa-Zahl 25,8
pH 7,35
Trockensubstanz % 97,0
ISO Weißgrad % 28,3
Zwei Bleichversuche wurden durchgeführt, jeder besteht aus den folgenden zwei Stufen:
1) Enzymbehandlung
2) (D50C50) E-Delignifizierung

Labor Bleichbedingungen

Enzym 50ºC, pH 8,0 (Britton-Robinson-Puffer). Behandlungsdauer und Dosierung werden später unter der Überschrift "Enzymbehandlung" beschrieben.
(D50C50) 45 Minuten, 40ºC, 5% DS, End-pH 1,9-2,9. aCl(aktives Chlor)-Faktor: 0,15; 0,19; 0,23; 0,27
E 60 Minuten, 60ºC, 12% DS, End-pH: 10,6-12,2
Die NaOH-Dosierung wird aus den in der Delignifizierungs-Stufe angewendeten Chlorchemikalien berechnet als
[0,5 · (kg CL&sub2;/Tonne + ClO&sub2;/Tonne) + 3] kg/Tonne
Die Bleichstufen wurden in Plastiktaschen durchgeführt, die in Wasserbädern erhitzt wurden. Die Taschen wurden von Hand in unregelmäßigen Abständen geknetet.

Enzymbehandlung

Zwei Papierstoffproben wurden in der selben Enzymstufe behandelt: eine mit der erfindungsgemäßen Xylanase und die andere mit der Xylanase des Standes der Technik. Die Behandlungszeit betrug 3 Stunden und die Dosierung 1000 EXU/kg. Danach wurde der Papierstoff gründlich mit kaltem Wasser gewaschen. Eine dritte Probe - die Kontrolle - wurde derselben Behandlung unterzogen, jedoch ohne Enzymzusatz.
Ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Enzymen wurde in diesem Experiment festgestellt.
Die nach Enzymbehandlung gemessenen Kappa-Zahlen und Extinktionen sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Meßwerte, bestimmt nach der Enzymstufe

(D50C50) E-Delignifizierung

Von jeder der drei Proben wurden 4 Portionen von jeweils 17 g Papierstoff mit verschiedenen Dosierungen an aktivem Chlor delignifiziert. Anschließend wurden die Kappa-Zahlen und die ISO-Weißgradwerte gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße H. insolens Xylanase eine niedrigere Kappa-Zahl und einen besseren Weißgrad als die Xylanase des Standes der Technik ergibt. Zwar mag in Tabelle 3 die Kappa-Zahl der erfindungsgemäßen Xylanase nur wenig kleiner erscheinen als die Kappa-Zahl der Xylanase des Standes der Technik; dieser kleine Unterschied entspricht jedoch einer viel größeren und signifikanten Einsparung an aktivem Chlor.
Tabelle 3 Kappa-Zahl und Weiß 2 rad nach enzymatischer (D50C50)E-Delignifizierung des Papierstoffs
* Faktor, bezogen auf die Kappa-Zahl der Kontrolle
Für den in diesem Experiment verwendeten Papierstoff kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäße Xylanase einen höheren Bleichverstärkungseffekt hervorruft als die Xylanase des Standes der Technik.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung der erfindungsgemäßen Xylanase als Backhilfsmittel.
Xylanase (im Bäckereigewerbe findet die Bezeichnung Pentosanase allgemein Verwendung) wird als Backhilfsmittel für Weizenbrot für verschiedene Zwecke verwendet:
- Gehenlassen des Teigs (Teigentwicklung)
- Verbesserung der Teigelastizität und -stabilität
- Erhöhung des Brotvolumens
- Verbesserung der Krumenstruktur
- Verbesserung beim Altbacken werden (anti-staling).
Präparation 1 ist in Weizenbrot getestet worden und hat eine sehr gute Wirkung auf die Brotqualität. Dieses Enzym hat eine ausreichende teigweichmachende Wirkung. Der Zusatz von 43-150 FXU der Präparation 1 steigert das Volumen von Brötchen um 5-20%, und die Krumenstruktur wird gleichmäßiger, wobei die Krume weicher ist als beim Brot ohne Enzym. Im Vergleich zu den im Handel erhältlichen Produkten hat es eine bessere Wirkung. Die Xylanase-Aktivitätseinheit FXU ist in AF 293.6 definiert.
Die Backhilfsmittel auf der Basis von Xylanasen des Standes der Technik enthalten mehrere enzymatische Aktivitäten, während das erfindungsgemäße Backhilfsmittel leicht mit einem sehr geringen Gehalt an anderen enzymatischen Aktivitäten als der Xylanase-Aktivität hergestellt werden kann. Daher können durch Verwendung des erfindungsgemäßen Backhilfsmittels Produkte mit konstanteren Eigenschaften von einem Backprozeß zum nächsten erhalten werden.

Rezept und Backverfahren

Das Grundrezept in diesem Beispiel lautet:
- Weizenmehl 1000 g
- Salz 16 g
- Zucker 16 g
- Hefe 50 g
- Wasser 590 g
- Enzym
Die Zutaten wurden in einer Spiralteigknetmaschine gemischt. Der Teig wurde dann 2 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und 5 Minuten bei hoher Geschwindigkeit geknetet. Die Teigtemperatur betrug etwa 26-28ºC. Nach 10 Minuten Stehenlassen wurde der Teig geteilt und zu 30 Brötchen und einem Brot geformt. Nach Gehenlassen, 45 Minuten für Brötchen und 40 Minuten für Brot bei 33ºC, 80% relativer Luftfeuchtigkeit, werden die Brötchen und das Brot bei 220ºC 15 Minuten bzw. 30 Minuten gebacken. Ergebnisse
Bei Präp. 1 ohne Amylaseaktivität wird die vom Wirtsorganismus produzierte Amylaseaktivität von der Xylanase durch herkömmliche Chromatographietechniken abgetrennt.
Die Brötchen- und Brot-Volumina werden unter Verwendung der herkömmlichen Rapssamen-Methode gemessen. Die Meßwerte werden dann in den relativen Index umgerechnet.
Die Weichheit der Krume wird mit einem SMS-Textur-Analysiergerät gemessen. Hierbei wird ein Kolben mit einem Durchmesser von 25 mm auf die Mitte einer 11 mm dicken Brotscheibe gedrückt. Die vom Kolben benötigte Kraft, um die Krume 3 mm mit einer Geschwindigkeit von 3,3 mm/s zusammenzudrücken, wird festgehalten als Krumenweichheit. Der Wert wird dann in einen relativen Index, bezogen auf die Referenzprobe, die per Definition einen Index von 100 hat, umgerechnet. Je niedriger der Index für die Krumenweichheit, desto weicher ist die Krume.
Die Symbole für Teigentwicklung und Krumenstruktur werden nach visueller Beurteilung vergeben: + bedeutet, daß der Teig normal ist, und daß die Krume ebenfalls normal ist bei grober Struktur. ++ Bedeutet, daß der Teig weicher und elastischer als die Referenz ist, und daß die Krumenstruktur gleichmäßig und seidenartig ist.
PentopanTM, ein im Handel von Novo Nordisk A/S erhältliches Präparat, ist eine Backhilfsmittel des Standes der Technik, das verschiedene Xylanasen von H. insolens und auch andere von H. insolens stammende Enzymaktivitäten enthält. Aus obigem ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Xylanase, weil sie ein größeres Volumen und eine weichere Krume ergibt, eine bessere Leistungsfähigkeit als das Backhilfsmittel des Standes der Technik besitzt. Der wichtigste Vorteil beim Backen, bezogen auf die erfindungsgemäße Xylanase im Vergleich zu der Xylanase des Standes der Technik, ist die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Xylanase als Backhilfsmittel praktisch ohne Fremdaktivitäten benutzt werden kann und deswegen in der Lage ist, Brot mit von Charge zu Charge außerordentlich gleichbleibenden Eigenschaften zu erzeugen.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: NOVO NORDISK A/S
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: XYLANASE, ENTSPRECHENDE REKOMBINANTE DNA-SEQUENZ, XYLANASE ENTHALTENDE ZUSAMMENSETZUNG UND VERWENDUNG DER ZUSAMMENSETZUNG
(iii) ZAHL DER SEQUENZEN: 7
(iv) KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: NOVO NORDISK A/S (B) STRASSE: Novo Allé (C) STADT: DK-2880 Bagsvaerd (E) LAND: Dänemark
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: Diskette (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1,25
(viii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: BACH, Niels et al. (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: GA 24307 (C) REFERENZ-NR./AKTENZEICHEN: 3588.204-WO
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: +45 4444 8888 (B) TELEFAX: +45 4449 3256 (C) TELEX: 37304

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEO ID Nr. 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (C) STRÄNGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure (C) STRANGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren (B) TYP: Aminosäure, N-terminal (C) STRANGIGKEIT: einzel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr. 7:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 516 Basenpaare (B) TYP: Nukleinsäure (C) STRÄNGIGKEIT: doppel (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: rDNA
(vi) ORIGINALQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Humicola insolens (B) STAMM: DSM 1800
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:

Claims

1. Rekombinante DNA-Sequenz, die für eine Xylanase codiert, welche mit folgender partieller DNA-Sequenz unter relativ stringenten Bedingungen (1,0 · SSC, 0,1% SDS, 65ºC) zu hybridisieren vermag:

2. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die abstammt von einem Humicola insolens DSM 1800 Xylanase HindIII/XbaI DNA- Fragment.

3. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die für eine Xylanase mit den partiellen Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1-6 codiert.

4. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die für eine Xylanase mit einem isoelektrischen Punkt von 7,5-9,5, vorzugsweise 8,0-8,5, oder einem pH-Optimum von 5,5-7,5 codiert.

5. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die für eine Xylanase codiert, welche eine spezifische Aktivität über 330 EXU/mg Protein, vorzugsweise über 400 EXU/mg Protein, aufweist.

6. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die weiterhin einen Promotor, eine für ein Signalpeptid codierende Region oder einen Transkriptionsterminator aufweist.

7. Vektor, enthaltend die rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Vektor nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Promotor um den Aspergillus oryzae Takaamylase-Promotor und/oder bei dem Terminator um den Aspergillus oryzae AMG-Terminator handelt.

9. Transformierter Wirt, der einen Vektor nach Anspruch 7 oder 8 enthält.

10. Transformierter Wirt nach Anspruch 9, wobei der transformierte Wirt ein Aspergillus-Stamm ist.

11. Transformierter Wirt nach Anspruch 10, wobei dieser den Spezies Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae oder Aspergillus awamori angehört.

12. Transformierter Wirt nach Anspruch 9, wobei dieser ein Mikroorganismus ist, der in nicht transformiertem Zustand keine Xylanase oder Xylanase nur in unbedeutenden Mengen produziert, und vorzugsweise Bacillus sp., E. coli oder S. cerevisiae ist.

13. Verfahren zur Herstellung einer Xylanase, wobei das Verfahren das Kultivieren der transformierten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 12 und die Isolierung der gebildeten Xylanase aus der resultierenden Kulturflüssigkeit umfaßt.

14. Xylanase, die durch die DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert wird.

15. Zusammensetzung, enthaltend die Xylanase nach Anspruch 14 oder erhalten nach dem Verfahren von Anspruch 13, vorzugsweise in Form eines nicht-staubenden Granulats, einer stabilisierten Flüssigkeit oder eines geschützten Enzyms, wobei die Xylanase mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 30% des gesamten Enzymproteins enthält.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Verhältnis zwischen der Xylanase-Aktivität und der Cellulase-Aktivität, ausgedrückt als das Verhältnis zwischen der Xylanase-Aktivität in EXU/g und der Cellula se-Aktivität in ECU/g, einen Wert oberhalb von 10, vorzugsweise oberhalb von 30, und insbesondere oberhalb von 100 besitzt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, die eine Xylanase- Aktivität von mindestens 10 EXU/mg Enzymprotein, vorzugsweise mindestens 100 EXU/mg Enzymprotein und insbesondere mindestens 300 EXU/mg Enzymprotein aufweist.

18. Backhilfsmittel, enthaltend eine Xylanase nach Anspruch 14 oder hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 13.

19. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17 für den Xylanabbau.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung bezogen ist auf chemischen Papierstoff oder Recycle-Papierstoff, vor dem Bleichen oder als Teil des Bleichvorgangs, vorzugsweise bei einem pH-Wert oberhalb von 7.

21. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18 für den Xylanabbau bei der Herstellung von Brot, das Weizenmehl enthält.

22. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf Tierfutter bezogen ist.