DE69223337T2

DE69223337T2 - Wachstumsstimulierung durch antiidiotypische Antikörper erzeugt gegen einen für Schweinewachstumshormon spezifischen Antikörper

Info

Publication number: DE69223337T2
Application number: DE69223337T
Authority: DE
Inventors: Araceli L Lumanglas; Eugene Szewcyzk; Bosco S Wang
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1991-04-03
Filing date: 1992-02-27
Publication date: 1998-03-26
Anticipated expiration: 2012-02-28
Also published as: AU1400692A; EP0502416A1; KR920019374A; EP0502416B1; AU659830B2; JPH05252985A; ZA922421B; DE69223337D1; IL101450A0; ES2109954T3; CA2064635A1; ATE160786T1; IE921042A1; DK0502416T3; NZ242168A; GR3026132T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung anti-idiotypischer Antikörper durch Verabreichen eines Antikörpers gegen ein Wachstum ermöglichendes Polypeptid an Wirbeltiere. So behandelte Wirbeltiere erzeugen einen anti-idiotypischen Antikörper, der die Aktivität des Polypeptids nachahmt und Wachstum in Wirbeltieren anregt.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die EP-A-0 439 797 offenbart monoklonale Antikörper, die mit Wachstumshormon bindendem Protein reagieren. "J. Endocrinol.", Band 125, Seiten 53-59 (1990) und "J. Endocrinol.", Band 114, Erganzungsband Nr.14 (1986) offenbaren anti-idiotypische Antikörper gegen Wachstumshormon, die als Hormon-Ersatzstoffe wirken, die Wachstum fördernde Wirkungen zeigen.
Es wurden verschiedene Klassen von Polypeptiden identifiziert, die Wachstum von Zellen in Wirbeltieren oder das Wachstum von Wirbeltieren an sich ermöglichen. Solche Klassen von Polypeptiden schließen Somatotropine, Cytokine und Lymphokine, insulinartige Wachstumsfaktoren, transformierende Wachstumsfaktoren und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren ein.
Im besonderen ist Somatotropin ein Polypeptid, das in warmblütigen Tieren durch den Hypophysen-Vorderlappen ausgeschieden wird und durch spezifische Zellen-Oberflächenrezeptoren, die in erster Linie in der Leber angeordnet sind, wirkt (J.P. Hughes und H.G. Friesen, "Ann. Rev. Physiol.", 47, 469-482 (1985). Somatotropin ist brauchbar zum Fördern des Wachstums von solchen Tieren wie Rindern, Schweinen, Ziegen, Geflügel (Hühnern, Puten, Gänsen usw.) sowie Kaninchen, neben anderen. Somatotropin ist auch bauchbar zum Fördern des Wachstums anderer Wirbeltiere, wie Fisch.
Spezifisch das Wachstumshormon Schweine-Somatotropin (pST ) kommt natürlich in Schweinen vor und sorgt für die Entwicklung des Tieres, einschließlich der Erhöhung der Wachstumsrate und des Verhältnisses von mager zu fett. Es wurde festgestellt, daß pST ein einkettiges Polypeptid von 191 Aminosäuren mit zwei Cystin-Brücken ist, das die Reste 53-164 bzw. 181-189 verbindet (S.S. Abdel-Meguid et al., "Proc. Nat. Acad. Sci.", 84, 6434-6437 (1987).
Da endogene Mengen von pST gering sind, haben sich die Anstrengungen auf die Herstellung von exogenem pST zum Einsatz in der Landwirtschaft in großem Rahmen konzentriert. Es wurden auch Anstrengungen auf die Identifikation kleiner Abschnitte des PST-Moleküls, die Erzeugung von Antikörpern gegen solche Abschnitte und die Verabreichung solcher Antikörper zusammen mit pST gerichtet, um Wachstum zu fördern. Siehe; z.B., die EP-A-0 284 406. Die Verabreichung solcher wachstumsfördernden Mittel, entweder allein oder in Kombination, muß häufig vorgenommen werden, um das Wachstum des Tieres zu fördern.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Obwohl die oben beschriebenen Verfahren sich als förderlich für das Wachstum von Wirbeltieren gezeigt haben, gibt es einen fortgesetzten Bedarf, zusätzliche Strategien und Techniken auf diesem Gebiet zu entwickeln.
Es ist demgemäß eine Aufgabe dieser Erfindung, das Wachstum zu stimulieren, indem man Wirbeltieren einen Antikörper gegen ein Wachstum ermöglichendes Polypeptid verabreicht, so daß ein anti-idiotypischer Antikörper erzeugt wird, der die Aktivität des Polypeptids nachahmt.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, das Wachstum zu stimulieren, indem man Wirbeltieren ein Fragment eines Antikörpers gegen ein Wachstum ermöglichendes Polypeptid verabreicht, um einen anti-idiotypischen Antikörper zu erzeugen, der die Aktivität des Polypeptids nachahmt.
Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst, wie im folgenden beschrieben.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1, Diagramm A, zeigt eine Untersuchung der Immunspezifität des monoklonalen Antikörpers PS-7.6 gegen verschiedene Antigene, wobei pST, bST, cST und hST Schweine-, Rinderund Hühner-Somatotropin sind und hST menschliches Wachstumshormon ist. Die Immunospezifitat wird durch einen Konkurrenz-Radioimmunoassay gezeigt. Figur 1, Diagramm B, zeigt einen ähnlichen Konkurrenz-Radioimmunoassay, bei dem PRL Prolactin, SRIF Somatostatin und GRF der die Freisetzung von Wachstumshormon stimulierende Faktor ist.
Figur 2 zeigt eine Untersuchung, bei der drei Gruppen hyposektomisierter (hypox) Ratten (A) unbehandelt, (B) mit 5 µg pST behandelt oder (C) mit einer Kombination von 5 µg pST plus 1 mg monoklonalem Antikörper PS-7.6 behandelt sind. Nach zwei Monaten wurden Serum-Proben von jeder der drei Gruppen von Tieren gewonnen und auf die Anwesenheit von gegen monoklonalen Antikörper PS-7.6 gerichteten Antikörpern getestet, die sich mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 verbinden. ELISA-Platten wurden mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 überzogen, und dann wurden Serum-Proben von jeder der drei Gruppen hinzugegeben. Dann gab man Ziegen-Antiratten-Immunoglobolin (Ig)-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, zu den Platten hinzu. Dann wurde zur Farbentwicklung ein Substrat, p-Nitrophenylphosphat, hinzugegeben und die resultierende, optische Dichte auf einem Spektrophotometer gemessen.
Figur 3 zeigt eine Untersuchung, bei der ELISA-Platten mit Serum-Proben jeder der drei Gruppen von Hypox-Ratten, die bei Figur 2 beschrieben sind, überzogen sind. Es wurde Ziegen- Antimäuse-Ig, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, zu den Platten hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe des Substrates. Die Proben wurden auf die Anwesenheit restlichen monoklonalen Antikörpers PS-7.6 getestet. Eine frische Quelle monoklonalen Antikörpers PS-7.6 wurde als eine positive Vergleichsprobe benutzt.
Figur 4 zeigt eine der von Figur 3 ähnliche Untersuchung mit der Ausnahme, daß polyklonaler Kaninchen-Anti-pST Antikörper zu den Platten hinzugegeben wurde, gefolgt von der Zugabe von Ziegen-Antikaninchen-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, und dann des Substrates und der Serum-Proben, die auf die Anwesenheit von restlichem pST getestet wurden. Eine frische Quelle von pST wurde als eine positive Vergleichsprobe benutzt.
Figur 5 zeigt eine Konkurrenz-Untersuchung, bei der Mikrotiter-Bohrungen mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 überzogen wurden. Serum-Proben von den drei Gruppen von Hypox-Ratten, die bei Figur 2 beschrieben sind, wurden in unterschiedlichen Verdünnungen zusammen mit ¹²&sup5;I- pST (50.000-80.000 cpm) zu den Bohrungen hinzugegeben. Nach der Inkubation wurden Radioimmunoassay (RIA)-Platten gewaschen und einzelne Bohrungen in einem Zahler gezählt.
Figur 6 zeigt eine Wiederholung der Konkurrenz-Untersuchung von Figur 5 mit der Ausnahme, daß nur das Serum der Ratten der Gruppe C (verdünnt auf 5%), behandelt sowohl mit PST als auch monoklonalem Antikörper PS-7.6, zum Untersuchen der weiteren Zugabe von 1% normalem Mäuse-Ig (Säule 2), verglichen mit der Abwesenheit von normalem Mäuse-Ig (Säule 1), benutzt wurde sowie die weitere Zugabe von normalem Mäuse-Ig zu Bohrungen, die mit einem anderen monoklonalen Anti-pST Antikörper PS-11.2 (Säule 4) überzogen waren, verglichen mit der Abwesenheit von normalem Mäuse-Ig (Säule 3).
Figur 7 zeigt eine Wiederholung der Konkurrenz-Untersuchung von Figur 5 mit der Ausnahme, daß Serum der Ratten der Gruppe C verglichen wird mit den gebundenen (Ig) und ungebundenen (nicht-Ig) Fraktionen des Serums, das durch Fraktionierung mit Protein G-Affinitäts- Säulenchromatographie erhalten wurde.
Figur 8 zeigt eine weitere chromatographische Fraktionierung des Serums der Ratten der Gruppe C durch FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie. Die Fraktionen wurden dann in einer Konkurrenz-RIA auf Konkurrenz mit ¹²&sup5;I-pST beim Binden an monoklonalen Antikörper PS-7.6 getestet.
Figur 9 zeigt die Wirkung der täglichen Verabreichung (5 Tage lang) von 0,5 ml der drei Gruppen von Seren auf das Wachstum einer zweiten Gruppe von Hypox-Ratten. Die Sternchen in dieser Figur sowie in Figur 10 repräsentieren folgende, statistisch signifikante Ergebnisse:
* = p< 0,05; ** = p< 0,01; *** = p< 0,001.
Figur 10 zeigt die Wirkung der täglichen Verabreichung (5 Tage lang) von 1 mg pro Injektion der unfraktionierten und fraktionierten Seren der Gruppe C (von Figur 7) auf das Wachstum einer zweiten Gruppe von Hypox-Ratten.
Figur 11 zeigt eine Untersuchung, bei der ELISA-Platten entweder mit einem F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers PS-7.6 oder einem F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers OKT4 (als eine Vergleichsprobe) überzogen wurden und Serum-Proben, wie bei der in Figur 4 abgebildeten Untersuchung, getestet wurden. Diagramm A: Serum von unbehandelten Ratten; Diagramm B: Serum von mit pST behandelten Ratten; Diagramm C: Serum von mit pST plus monoklonalem Antikörper PS-7.6 behandelten Ratten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung ist auf die Erzeugung anti-idiotypischer Antikörper PS-7.6, erzeugt durch das als ATCC 10416 bezeichnete Hybridom gemäß Anspruch 1 gerichtet, wobei der Antikörper gegen einen Antikörper auf ein Wachstum ermöglichendes Polypeptid gebildet wird. Ein anti-idiotypi scher Antikörper ähnelt in einem zweckdienlichen Teil einem entsprechenden Antigen, das die Bildung eines Antikörpers induziert. Im besonderen trägt ein anti-idiotypischer Antikörper das innere Bild eines Bereiches eines Antigens und ahmt so die Gestalt des Antigens nach. Damit ein anti-idiotypischer Antikörper die erwünschte Aktivität eines Antigens nachahmt, muß sich der anti-idiotypische Antikörper in oder nahe dem gleichen Bereich des Rezeptors für ein Antigen binden, an den sich das Antigen selbst bindet. Anders ausgedrückt, muß sich ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen ein entsprechendes Antigen in oder nahe dem gleichen Bereich an das Antigen binden, wie sich das Antigen an seinen Rezeptor bindet.
Die Antigen nachahmenden, anti-idiotypischen Antikörper dieser Erfindung werden aus Antikörpern auf eine weite Vielfalt Wachstum ermöglichender Polypeptide erzeugt. Die Polypeptide schließen die Somatotropine, wie Schweine-, Rinder-, Ziegen-, Vogel-, Kaninchen- und Fisch-Somatotropine ein. Die Polypeptide schließen auch Cytokine und Lymphokine ein, wie die Interleukine, die Interferone oder andere Cytokine oder Lymphokine, die immunmodellierende Aktivität aufweisen. Die Polypeptide schließen weiter Somatostatin und Somatomedine, wie insulin-artige Wachstumsfaktoren, ein. Zusätzliche Polypeptide schließen Insulin, Prolactin, die Freisetzung von Wachstumshormonen stimulierenden Faktor, transformierende Wachstumsfaktoren, Fibroblasten- Wachstumsfaktoren, epidermale Wachstumsfaktoren und Kolonie stimulierende Faktoren ein. Die Wachstum ermöglichenden Polypeptide schließen Proteine, Peptide und physiologisch aktive Teile davon ein.
Das Wachstum fördernde Polypeptid wird hier beispielhaft durch Schweine-Somatotropine erläutert. Das Konzept der Erzeugung nachahmender anti-idiotypischer Antikörper kann durch den Fachmann unter Anwendung der hier beschriebenen Techniken auch auf andere Wachstum ermöglichende Polypeptide angewendet werden.
In einer Ausführungsform können die anti-idiotypischen Antikörper in vivo erzeugt werden durch Verabreichen eines Antikörpers gegen Somatotropin an ein Wirbeltier. In einer Variation dieser Ausführungsform wird ein Somatotropin zusammen mit dem Antikörper dem Wirbeltier verabreicht. Das Wirbeltier erzeugt dann einen anti-idiotypischen Antikörper, der die Wirkung des Somatotropins nachahmt, so daß das Wachstum des Wirbeltieres angeregt wird.
In einer anderen Ausführungsform kann Serum von einem Wirbeltier genommen werden, das anti-idiotypische Antikörper gegen ein Somatotropin erzeugt, und dieses Serum kann dann einem zweiten Wirbeltier verabreicht werden. Es wird festgestellt, daß das zweite Wirbeltier wegen der Anwesenheit der anti-idiotypischen Antikörper, die ursprünglich im Serum des ersten Wirbeltieres vorhanden waren, auch eine Stimulation der Gewichtszunahme erzielt. In jeder dieser Ausführungsformen kann das erste oder zweite Wirbeltier ein warmblütiges Tier oder ein Fisch sein.
In diesen beiden Ausführungsformen der Erfindung werden die anti-idiotypischen Antikörper aus entweder monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antikörpern erzeugt. Nach einer Beschreibung, wie monoklonale Antikörper gegen ein Somatropin erzeugt werden, werden diese Ausführungsformen mit Bezug auf monoklonale Antikörper beschrieben, gefolgt von einer Beschreibung mit Bezug auf polyklonale Antikörper.
Monoklonale Antikörper werden hergestellt durch Immunisieren von Mäusen mit Schweine- Somatotropin, Entfernen der Milz aus diesen Mäusen, Zubereiten von Suspensionen von Lymphozyten, Verschmelzen dieser Lymphozyten mit Mäuse-Myelomzellen, Züchten der Zellen und Sammeln des Überstehenden überlebender Hybridome für ein Antikörper-Screening durch in fester Phase ausgeführten, enzym-gekoppelten Immunsorptionsmittel-Assay (ELISA). Solche Hybridome, die erwünschte Antikörper erzeugen, werden weiter subkloniert und in Mäuse injiziert. Aus den peritonealen Hohlräumen von Mäusen wird dann Aszites bzw. Bauchwasser gesammelt und Immunoglobulin (Ig) durch entweder Ammoniumsulfat-Ausfällung oder eine Protein A-Affinitätssaule durch rasche Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt. Proben des so gereinigten Ig werden dann unter Anwendung von ELISA gegen Antigene untersucht, um die gebildeten Antikörper zu identifizieren.
Obwohl das in dieser Anmeldung beispielöhaft eingesetzte Somatotropin pST war, kann der Fachmann die hier beschriebenen Techniken zum Erzeugen monoklonaler Antikörper gegen andere Somatotropine benutzen. Das eingesetzte pST kann aus natürlichen Quellen isoliert oder unter Anwendung rekombinanter Techniken, wie sie in den veröffentlichten EP-Anmeldungen 104920 oder 111 389 beschrieben sind, hergestellt werden. Die Quellen für das pST und das Verfahren zu seiner Isolation/Herstellung ist nicht Teil dieser Erfindung. Die Antikörper können auch zusammen mit rekombinanter pST eingesetzt werden, bei der die Aminosäuresequenz des natürlichn pST unter Anwendung einer Technik, wie der gezielt auf einzelne Stellen bzw. Nucleotide gerichteten Mutagenese, modifiziert wurde, so lange die Wachstums fördernde Funktion des pST beibehalten wird. Siehe, z.B., die veröffentlichte EP-Anmeldung 355 460 sowie die veröffentlichte EP-Anmeldung 303 972.
Mit PS-3.12, PS-7.6 und PS-8.3 bezeichnete monoklonale Antikörper sind spezifische Beispiele der so erzeugten monoklonalen Antikörper. Der monoklonale Antikörper PS-7.6 liegt im Rahmen dieser Erfindung. Dieser Antikörper erkennt Determinanten in oder nahe der Binderegion von pST als seinen Rezeptor.
Der monoklonale Antikörper PS-7.6 (ATCC-Zugangsnummer des entsprechenden Hybridoms: HBI) ist ein Immunoglobulin vom IgG&sub1;-Untertyp mit k Leichtketten-Charakteristika. Eine Immunospezifitäts-Untersuchung (Figur 1) zeigt, daß es stark reaktionsfahig mit pST ist, nicht aber mit bST, cST, PRL, SRIF oder GRF.
Ein so erzeugter monoklonaler Antikörper wird entweder allein oder zusammen mit einem Somatotropin einem Wirbeltier verabreicht. Die beispielhaft benutzten Wirbeltiere waren hypophysektomisierte (Hypox)-Ratten. Hypox-Ratten haben aufgrund der chirurgischen Entfernung der Hypophyse ein Wachstumsdefizit. Hypox-Ratten dienen als ein brauchbares Modell zum Untersuchen der Wirkung von Somatotropin auf das Wachstum (M.D. Groesbeck und A.F. Parlow, "Endocrinologie", 120, 2582-2590 (1987). Nach einer genügenden Zeitdauer zum Erzeugen anti-idiotypischer Antikörper wurden Serum-Proben aus den Hypox-Ratten entnommen und analysiert.
Um die Natur der Serum-Proben festzustellen, wurde eine Reihe von Experimenten ausgeführt. Zuerst wurden ELISA-Platten mit dem monoklonalen Antikörper überzogen und die Serum- Proben hinzugegeben. Zum Vergleich wurden auch Proben von Serum von Hypox-Ratten, die allein mit Somatotropin behandelt wurden, und von unbehandelten Ratten hinzugegeben. Als nächstes wurde Ziegen-Anti-Ratten-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, zu den Platten hinzugegeben und inkubiert, gefolgt von der Zugabe eines Substrates, wie p-Nitrophenylphosphat, zur Farbentwicklung. Werte der optischen Dichte zeigen, daß nur das Serum von Ratten, die mit dem Somatotropin und dem monoklonalen Antikörper behandelt wurden, einen monoklonalen Anti- Mäuse-Antikörper (Figur 2) enthält. Weitere unten beschriebene Experimente zeigen, daß dies ein anti-idiotypischer Antikörper ist. Die nächsten Experimente zeigten, daß das den Anti-Mäuse-Antikörper enthaltende Serum nicht länger den monoklonalen Mäuse-Antikörper oder Somatotropin enthielt. In einem Experiment wurden Serum-Proben zum Überziehen von ELISA-Platten eingesetzt. Eine frische Probe des monoklonalen Mäuse-Antikörpers, nicht aus Serum, wurde als ein positives Vergleichsmaterial benutzt. Weitere Zugaben zu den Platten (Ziegen-Anti-Mäuse-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphotase, gefolgt von Substrat) wurden vorgenommen. Werte der optischen Dichte zeigten, daß keine statistisch signifikanten Mengen des monoklonalen Mäuse- Antikörpers im Serum vorhanden waren (Figur 3).
Bei einem anderen ähnlichen Experiment wurden Serum-Proben zum Überziehen von ELISA-Platten benutzt. Ein frische Probe von nicht aus Serum stammendem Somatotropin wurde als ein positives Vergleichsmaterial benutzt. Weitere Zugaben zu den Platten (Kaninchen-Anti-Somatotropin-Antikörper, gefolgt von Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, dann ein Substrat) wurden vorgenommen. Werte der optischen Dichte zeigen, das keine statistisch signifikanten Mengen von pST im Serum vorhanden waren (Figur 4).
Konkurrenz-Untersuchungen zeigten, daß das den monoklonalen Anti-Mäuse-Antikörper enthaltende Serum mit Somatotropin hinsichtlich des Verbindens von einem monoklonalen Antikörper mit Somatotropin im Wettbewerb steht. Radiomarkiertes Somatotropin verbindet sich mit dem monoklonalen Antikörper. Serum wurde in zunehmenden Verdünnungen hinzugegeben. Es wurde festgestellt, daß bei höheren Serum-Konzentrationen die Zählungen des radiomarkierten Somatotropins verringert waren, was eine größere Konkurrenz vom Serum (Figur 5) anzeigt. Wurde normales Ig hinzugegeben, dann wurde die Konkurrenz vom Serum nicht verringert (Figur 6, Säulen 1 und 2). Dies zeigt, daß das Serum mit dem Somatotropin hinsichtlich des Bindens an der variablen, statt der konstanten Region des monoklonalen Antikörpers im Wettbewerb steht.
Das vorhergehende Experiment wurde unter Einsatz eines anderen monoklonalen Antikörpers (PS-11.2) wiederholt. Es wurde festgestellt, daß das Serum in einem geringeren Grade mit dem Somatotropin konkurriert (Figur 6, Säulen 3 und 4), und diese Konkurrenz zielt auf die konstante Region, weil normales Mäuse-Ig diese Wirkung vollständig aulhebt. Dies zeigt, daß unterschiedliche monoklonale Antikörper unterschiedliche Epitope des Somatotropins erkennen. Das Serum muß Antikörper enthalten, die ein Epitop mit dem Somatotropin gemeinsam aufweisen, das nur durch einen der monoklonalen Antikörper (PS-7.6) erkennbar ist.
Die Fraktionierung des Serums durch Techniken, wie die Affinitäts-Säulenchromatographie, ergibt Ig- und Nicht-Ig-Fraktionen. Der Vergleich dieser beiden Fraktionen mit nicht fraktioniertem Serum bei der Konkurrenz-Untersuchung ergibt, daß die stärkste Konkurrenz mit dem Somatotropin hinsichtlich des Bindens am monoklonalen Antikörper bei der Ig-Fraktion (Figur 7) gefunden wird. Die Fraktionierung des Serums durch FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie, gefolgt vom Testen der Fraktionen bei einer Konkurrenz-Untersuchung dient zur Isolierung der aktivsten Gruppierung (Figur 8). Die Analyse der aktivsten Fraktion (Fraktion 10) durch SDS-PAGE bestätigt, daß sie die Ig enthält.
Werden die in den Figuren 2-8 abgebildeten Ergebnisse der Untersuchungen analysiert, dann gelangt man zu der Schlußfolgerung, daß das Serum anti-idiotypische Antikörper enthält, die sich mit monoklonalen Antikörpern gegen ein Somatotropin verbinden und ein Epitop mit Somatotropin gemeinsam haben. Wegen der strukturellen Ahnlichkeit mit einer epitopen Region des Somatotropin-Moleküls sind diese speziellen anti-idiotypischen Antikörper in der Lage, die Aktivität des Somatotropins nachzuahmen, d.h., Wachstum im Wirbeltier anzuregen. Es können anti-idiotypische Antikörper erzeugt werden, die diese strukturelle Ahnlichkeit nicht aufweisen. Solche Antikörper ahmen die Aktivität des Somatotropins nicht nach und sind nicht Teil dieser Erfindung.
Die Wachstum stimulierende Wirkung der anti-idiotypischen Antikörper wird bestätigt durch Verabreichen von Serum an eine zweite Gruppe von Tieren. Dieses Serum erhaltende Tiere weisen eine statistisch signifikante Gewichtszunahme auf (Figur 9). Das Serum enthält somit antiidiotypische Antikörper, die die Wachstum stimulierende Wirkung eines Somatotropins nachahmen.
Wird das Serum durch Affinitäts-Chromatographie fraktioniert, und werden die Ig- und Nicht-Ig-Fraktionen an eine unterschiedliche Gruppe von Tieren verabreicht, dann zeigen die Tiere, die die Ig-Fraktion erhalten haben, eine statistisch signifikante Gewichtszunahme, und dies im Gegensatz zu Tieren, die die Nicht-Ig-Fraktion erhalten haben (Figur 10). Dies bestätigt weiter, daß die anti-idiotypischen Antikörper in der Ig-Fraktion gefunden werden.
Wie oben erwähnt, werden die anti-idiotypischen Antikörper auch aus polyklonalen Antikörpern erzeugt. Es wurden polyklonale Antikörper gegen ein Somatotropin aus immunisierten, warmblütigen Tieren, wie Schweinen und Kaninchen, erzeugt und gereinigt. Polyklonale Antikörper werden erzeugt durch Immunisieren von Wirbeltieren mit einem solchen Somatotropin.
Polyklonale Antikörper werden, nach einer genügenden Zeit nach dem Verabreichen des Somatotropins für zu bildende Antikörper, durch Abnehmen einer Blutprobe aus einem immunisierten Tier gewonnen. Das Serum (das die Antikörper enthält) wird durch konventionelle Mittel, wie Zentrifugieren, isoliert. Das Serum wird durch Mittel, wie Affinitäts-Säulenreinigung, in Fraktionen getrennt, die Ig enthalten, und in solche, die Immunoglobulin (Nicht-Ig) nicht aufweisen. Nur die Ig-Fraktion enthält Antikörper gegen das Somatotropin zusammen mit anderen Antikörpern.
Als nächstes werden die für das Somatotropin spezifischen, polyklonalen Antikörper von den anderen Antikörpern getrennt, indem man die Ig-Fraktion durch eine Säule schickt, an die Somatotropin gebunden wurde. Es werden sich nur solche Antikörper mit der Säule verbinden, die spezifisch für das Somatotropin sind. Die erwünschten Antikörper werden dann durch Verringern des pH der durch die Säule geschickten Pufferlösung aus der Säule eluiert. Die Antikörper werden dann durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) aus dem Eluat isoliert. Die Reinheit der so isolierten Antikörper ist größer als 98%, wie durch SDS-PAGE bestimmt. Der Antikörper-Titerwert wird unter Anwendung von ELISA gemäß konventionellen Verfahren bestimmt.
Um polyklonale Antikörper auszuwählen, die das Verbinden des Somatotropins an seinen Rezeptor hemmen (und so nachahmende anti-idiotypische Antikörper erzeugen können), wurde das folgende Verfahren benutzt. Ein Somatotropin-Rezeptor wurde kovalent mit seinem entsprechenden Somatotropin verbunden und auch mit einer Protein-Affinitätssäule verbunden. Dann schickte man polyklonale Antikörper enthaltende Antiseren durch die Säule. Polyklonale Antikörper, die sich mit der Säule verbinden, erkennen das Somatotropin in Regionen, die in das Verbinden mit dem Rezeptor nicht einbezogen sind. Solche polyklonalen Antikörper sind nicht geeignet zum Erzeugen nachahmender anti-idiotypischer Antikörper.
Antiseren, die ohne Verbinden durch die Säule gehen, enthalten polyklonale Antikörper, die sich mit dem Somatotropin in oder nahe der Rezeptor-Binderegion verbunden haben würden, und dies aufgrund der Tatsache, daß das Somatotropin bereits mit dem Rezeptor an die Säule gebunden war. Solche eluierten polyklonalen Antikörper werden dann in der gleichen Weise wie monoklonale Antikörper einem Wirbeltier verabreicht, um nachahmende anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen.
Spezifisch hinsichtlich der Somatotropine ahmen die anti-idiotypischen Antikörper eine zweite wachstums-verwandte Funktion des Somatotropins, zusätzlich zum Stimulieren des Wachstums an sich, nach. Es ist bekannt, daß Somatotropine, wie pST, eine neu verteilende Wirkung auf das Wirbeltier ausüben; pST erhöht den Anteil des Mageren und vermindert den Anteil von Fett für eine gegebenes Gewicht des Wirbeltieres. Die anti-idiotypischen Antikörper üben diese neu verteilende Wirkung auch aus.
Die anti-idiotypischen Antikörper dieser Erfindung können durch konventionelle Mittel verabreicht werden, wie durch subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöses Fließen, sowie durch transdermale und orale Verabreichung. Es ist bevorzugt, diese Antikörper in Verbindung mit einem im Stande der Technik bekannten, pharmazeutisch akzeptablem Träger, Verdünnungsmittel oder Adjuvans zu verabreichen. Die zu verabreichende Dosis und die Anzahl der Dosen wird durch dem Fachmann bekannte Mittel bestimmt.
Wie oben beschrieben, stehen die anti-idiotypischen Antikörper hinsichtlich des Bindens an der variablen statt der konstanten Region des monoklonalen Antikörpers mit dem Somatotropin im Wettbewerb. Eine zusätzliche Ausführungsform dieser Erfindung nutzt Fragmente des monoklonalen Antikörpers oder des polyklonalen Antikörpers, die neben anderen Dingen die variable Region des Antikörpers enthalten. Die Fragmente werden zum Erzeugen anti-idiotypischer Antikörper benutzt, die zum Stimulieren von Wachstum von Wirbeltieren eingesetzt werden. Die Fragmente müssen eine Region des Antikörpers enthalten, die am Binden mit dem Rezeptor teilnimmt.
Ein mit einem Verdauungsenzym, wie Pepsin, behandelter Antikörper ergibt F(ab')&sub2;-Fragmente. Diese Fragmente enthalten die leichte Kette und einen Teil der schweren Kette des Antikörpers sowie eine antigene Bindestelle und die variable Region des Antikörpers, wobei sich die Aminosäuresequenz in Abhängigkeit von der Quelle des Antikörpers unterscheidet. In ähnlicher Weise wird ein Fv-Fragment hergestellt. Ein Fv-Fragment besteht aus variablen Abschnitten einer schweren und einer leichten Kette des Antikörpers. Andere geeignete Fragmente werden erzeugt) die eine Region enthalten, die am Binden mit dem Rezeptor teilnimmt. Zuzsätzlich zur enzymatischen Spaltung werden die Fragmente erhalten durch Bestimmen der Aminosäuresequenz des Fragmentes, gefolgt von der chemischen Synthese unter Anwendung konventioneller Techniken.
Alternativ werden die Fragmente erhalten durch rekombinante DNA-Technologie unter Benutzung konventioneller Techniken. DNA wird aus den Hybridom-Zellinien extrahiert, die die interessierenden monoklonalen Antikörper erzeugen. Die DNA-Sequenz wird ermittelt und die Sequenz-Codierung für die variable Region des monoklonalen Antikörpers identifiziert. Eine Technik, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird zum Amplifizieren der DNA-Sequenz benutzt, die für die variable Region codiert. Die Produkte der PCR-Amplifikation werden elektrophoretisch auf einem Agarose-Gel getrennt und analysiert. Die DNA-Sequenz, die für das erwünschte Fragment codiert, wird dann mit einem geeigneten Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingeführt und das Fragment exprimiert, isoliert und gereinigt.
Solche Fragmente verhalten sich in einer Weise ähnlich dem gesamten monoklonalen Antikörper (oder polyklonalen Antikörper). Fragmente werden auf ELISA-Platten aufgebracht und Serum, das die anti-idiotypischen Antikörper enthält, hinzugegeben. Das Serum erkennt die Fragmente des gesamten monoklonalen Antikörpers, nicht aber Fragmente eines nicht verwandten monoklonalen Antikörpers (Figur 11). Die Fragmente interessierender monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antikörper werden Wirbeltieren verabreicht, um anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen, die das Wachstum in der gleichen Weise wie anti-idiotypische Antikörper stimulieren, die aus dem gesamten monoklonalen Antikörper oder polyklonalen Antikörper erzeugt wurden.
In noch einer anderen Ausführungsform werden die anti-idiotypischen Antikörper unter Anwendung der Hybridom-Technologie in einer Weise analog der erhalten, die zum Erhalten monoklonaler Antikörper benutzt wird. Mäuse werden mit dem monoklonalen Antikörper (allein oder zusammen mit einem Wachstum ermöglichendem Polypeptid) immunisiert, die Milz der Mäuse wird entfernt, Suspensionen von Lymphozyten werden zubereitet, die Lymphozyten dann mit Mäuse-Myelomzellen verschmolzen, die Zellen gezüchtet und das Überstehende überlebender Hybridome gesammelt und durch ELISA auf Antikörper untersucht. Solche Hybridome, die die erwünschten Antikörper erzeugen, werden weiter subgeklont und in Mäuse injiziert. Bauchwasser wird dann aus den peritonealen Hohlräumen der Mäuse gewonnen und Ig durch entweder Ammoniumsulfat-Ausfällung oder eine Protein A-Affinitätssäule mittels FPLC gereinigt. Proben so gereinigten Ig werden unter Benutzung von ELISA gegen Antigene untersucht, um die gebildeten anti-idiotypischen Antikörper zu identifizieren.

BEISPIEL I

1. Erzeugung monoklonaler Antikörper einschließlich des monoklonalen Antikörpers PS-7.6

Balb/C-Mäuse im Alter von sechs bis zehn Wochen wurden von den Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA, gekauft. Diese Mäuse wurden mit 100 µg pST, emulgiert in Freunds komplettem Adjuvans, immunisiert und mit 50 µg pST alle drei Wochen danach aufgefrischt. Die Milzen der Mäuse wurden drei Tage nach der letzten Auffrischung entfernt, und es wurden Einzelzell-Suspensionen von Lymphozyten zubereitet. Diese Lymphozyten wurden mit SP2/0-Mäuse-Myelomzellen, die einen Mangel an Hypoxanthin-Phyosphoribosyl-Transferase (HPRT) aufwiesen, mit 50% Polyethylenglykol verschmolzen, das in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (D-MEM) suspendiert war, das 20% fötales Kalbsserum (Gibco), 0,175 µg/ml Aminopterin, 13,6 µg/ml Hypoxanthin, 3,88 µg/ml Thymidin und 50 µg/ml Gentamicin (HAT-Medium) enthielt, und schließlich auf 96 Bohrungen aufweisenden Kulturplatten ausgebreitet. Nach dem Kultivieren für 10-14 Tage wurden die Überstehenden der Hybridome, die aufgrund des positiven HPRT-Phenotyps der Lymphozyten überlebten (etwa 30%) für ein Antikörper-Screening bei einem in fester Phase ausgeführten ELISA gewonnen. Solche, von denen bestimmt wurde, daß sie geeignete Antikörper erzeugen (indem sie beständig hohe Titer im Überstehenden erzielen - etwa 25% der oben genannten etwa 30%, für ein Netto von etwa 7%), wurden weiter durch ein begrenztes Verdünnungs-Verfahren subgeklont, um interessierende Antikörper zu erzeugen.
Drei Hybridome erzeugten Klone von besonderem Interesse. Proben dieser Hybridome wurden am 12. April 1990 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hinterlegt, und sie erhielten die in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Zugangsnummern zusammen mit den Bezeichnungen der durch solche Hybridome erzeugten, interessierenden monoklonalen Antikörper (abgekürzt als "Moab"). TABELLE 1
Die ausgewählten Klone wurden intraperitoneal in Balbig-Mäuse injiziert, die zur Produktion von Antikörper enthaltendem Bauchwasser mit Prestan gespritzt worden waren. Die Identifikation des Isotyps der monoklonalen Antikörper wurde mit einer Antikörper-Isotyp-Ausrüstung (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) ausgeführt. Der als PS-7.6 bezeichnete monoklonale Antikörper wurde als beispielhaft für die weitere Untersuchung in diesem Beispiel 1 ausgewählt.

2. Herstellung von Antikörper

Bauchwasser wurde aus den peritonealen Hohlräumen der Mäuse gewonnen und Ig mit einer Ausfäll-Technik unter Einsatz von 50%-igem Ammonlumsulfat gereinigt. Alternativ wurden Proben mit Bindepuffer (3M NaCl, 1,SM Glycin, pH 8,9) auf 50% verdünnt und auf eine präparative Protein A Superose HR 16/5-Säule auf einem FPLC-System (Pharmacia, Piscataway, NJ) zugegeben. Die Nicht-Ig-Fraktion wurde mit dem Bindepuffer aus der Säule eluiert, und das gebundene Ig wurde danach durch Spülen der Säule mit 0,1M Zitronensäure, pH 3, gesammelt. Es wurde sofort mit 2M Trispuffer, pH 8,2, auf pH 7-8 neutralisiert. Nach beiden Verfahren hergestellter Antikörper wurde ausgiebig gegen phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert, durch Ultrafiltration (Amicon, Danvers, MA) konzentriert, in Bruchteile unterteilt und schließlich bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert.

3. Festphasen-ELISA

Antigene wurden in PBS gelöst und 1 µg in 100 µl zu jeder Bohrung einer 96 Bohrungen aufweisenden Flachboden-Polystyrolplatte hinzugegeben. Nach einstündigem Inkubieren wurde die Platte dreimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween -20 mittels einer automatischen Platten-Waschvorrichtung (Dynatech Wash II, Chantilly, VA) gewaschen. Jede Bohrung wurde mit 200 µl von 2%-igem Rinderserum-Albumin (Sigma) versehen und die Platte für eine weitere Stunde inkubiert. Testproben wurden zu den Bohrungen hinzugegeben, 30 Minuten lang inkubiert, sechsmal mit PBS gewaschen und mit 200 µl von mittels alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Antimäuse- IgG F(ab')&sub2; (Zymed Laboratories South San Francisco, CA) versehen. Die Platte wurde nach einer 30-minütigen Inkubation wiederum gewaschen, und es wurden 100 µl p-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml, Sigma) in 0,1M Diethanolamin, pH 10,3, als Substrat für die Farbentwicklung hinzugegeben. Schließlich wurde die kolorimetrische Anzeige als optische Dichte (OD) durch eine ELISA-Platten-Lesevorrichtung bei einer Wellenlänge von 405 nm aufgezeichnet. Das Inkubieren wurde immer bei 37ºC ausgeführt.

4. Charakterisierung des monoklonalen Antikörpers PS-7.6

Die Immunospezifität des monoklonalen Antikörpers PS-7.6 wurde mit einer Festkörperphasen-ELISA getestet. Die Bohrungen einer 96-Bohrungen-Platte wurden mit verschiedenen Antigenen überzogen, und es wurde eine Reihe von Verdünnungen von Bauchwasser mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 zur Wechselwirkung hinzugegeben. Figur 1 zeigt, daß der monoklonale Antikörper PS-7.6 auf PST-Antigen gut anspricht, nicht jedoch auf bST, cST, PRL, SRIF oder GRF.
Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers PS-7.6, bestimmt durch einen antigen-abhängigen, biotin-avidin-amplifizierten ELISA ist IgG&sub1; mit k-Leichtketten-Charakteristika.

BEISPIEL2

Die Stufen 1-4 von Beispiel 1 wurden wiederholt, um monoklonale Antikörper PS-3.12 und PS-8.3 zu erzeugen, zu reinigen und zu charakterisieren.

BEISPIEL 3

1. Erzeugen von anti-idiotypischen Antikörpern

Hypox-Ratten wurden mit einer Kombination von 5 µg pST plus 1 mg monoklonalem Antikörper PS-7.6 behandelt. Nach zwei Monaten wurden Serum-Proben entnommen und analysiert. Wie oben beschrieben, enthielt das Serum anti-idiotypische Antikörper gegen monoklonalen Antikörper PS-7.6.

2. Anwesenheit von Antikörpern gegen monoklonalen Antikörper PS-7.6 in Serum

Es wurde ein Experiment ausgeführt, um sicherzustellen, ob die Seren der Hypox-Ratten von Teil 1 des Beispiels 3 eine Komponente enthalten, die monoklonalen Antikörper PS-7.6 bindet. Es wurden Serumproben von Hypox-Ratten zwei Monate nach der Injektion von pST und monoklonalem Antikörper PS-7.6 genommen. Zum Vergleich wurden auch Serumproben von Hypox-Ratten zwei Monate nach Behandlung nur mit 5 µg pST und von unbehandelten Ratten genommen. ELISA-Platten wurden mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 überzogen, und Serumproben jeder der drei Gruppen wurden dann hinzugegeben. Ziegen-Antiratten-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, wurde dann zu jeder Platte hinzugegeben und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurde ein Substrat, p-Nitrophenylphosphat, zur Farbentwicklung hinzugegeben und die resultierende optische Dichte auf einem Spektrophotometer gemessen. Die Ergebnisse, wie sie in Figur 2 abgebildet sind, zeigen, daß nur das Serum der Ratten, die ursprünglich mit pST und monoklonalem Antikörper PS-7.6 behandelt worden waren, einen Antikörper gegen den monoklonalen Antikörper PS-7.6 enthielt. Wie unten gezeigt, ist diese Komponente ein anti-idiotypischer Antikörper.

3. Serum, das die anti-idiotypischen Antikörper erzeugt, enthält keinen restlichen monoklonalen Antikörper PS-7.6 oder pST

Es wurden zwei Experimente ausgeführt, um sicherzustellen, ob die Seren der Hypox-Ratten von Teil 1 des Beispiels 3 zwei Monate nach Injektion der Hypox-Ratten mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 und pST diese Materialien noch enthalten. In einem ersten Experiment wurden Serumproben der Hypox-Ratten als Antigene benutzt, um ELISA-Platten zu überziehen. Zum Vergleich wurden auch Serumproben von Hypox-Ratten zwei Monate nach der Behandlung allein mit pST und von unbehandelten Ratten genommen; beide Serumproben wurden ebenfalls auf ELISA- Platten aufgebracht. Eine frische Probe von monoklonalem Antikörper PS-7.6 in Lösung, nicht in Serum enthalten, wurde als ein positives Vergleichsmaterial benutzt. Ziegen-Antimäuse-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, wurde dann zu den Platten hinzugegeben. Dann gab man zur Farbentwicklung ein Substrat, p-Nitrophenylphosphat, hinzu und maß die resultierende optische Dichte auf einem Spektrophotometer. Die Ergebnisse, wie sie in Figur 3 gezeigt sind, zeigen, daß keine statistisch signifikanten Mengen monoklonaler Antikörper PS-7.6 in irgendeiner der Serumproben vorhanden waren. Im Gegensatz dazu zeigte die Vergleichsmaterial-Platte, die mit dem frischen monoklonalen Antikörper PS-7.6 überzogen war, eine statistisch signifikante Menge des monoklonalen Antikörpers PS-7.6.
Im zweiten Experiment wurden die gleichen drei Arten von Serumproben zum Überziehen von ELISA-Platten eingesetzt. Eine frische Probe von pST in Lösung, nicht in Serum enthalten, wurde als ein positives Vergleichsmaterial benutzt. Kaninchen-anti-PST-Antikörper wurde dann zu den Platten hinzugegeben, gefolgt von Ziegen-Antikaninchen-Ig-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, und dann des Substrates, wie im ersten Experiment. Die Ergebnisse, wie sie in Figur 4 gezeigt sind, zeigen, daß keine statistisch signifikanten Mengen von pST in irgendeiner der Serumproben vorhanden waren. Im Gegensatz dazu zeigte die Vergleichsmaterial-Platte, die mit dem frischen pST überzogen worden war, eine deutlich positive Reaktion.

4. Konkurrenz-Assays von an monoklonale Antikörper bindendem pST mit Seren

Mikrotiter-Bohrungen von Immunlon-2-Streifen wurden mit monoklonalem Antikörper PS- 7.6 überzogen. Bei einem Festkörperphasen-Radioimmunoassay (RIA) bindet sich radio-markiertes ¹²&sup5;I-pST (50.000-80.000 cpm) an den monoklonalen Antikörper.
In einem ersten Konkurrenz-Assay wurden Serumproben der oben beschriebenen drei Gruppen von Ratten zu den Bohrungen in zunehmenden Zweifach-Verdünnungen hinzugegeben. Nach einer Inkubation von einer Stunde wurden die RIA-Platten gewaschen und einzelne Bohrungen in einem γ-Zähler gezählt. Je geringer die Zählungen, um so größer die Konkurrenz, da die unmarkierten Seren sich eher als das markierte pST an den monoklonalen Antikörper binden.
Figur 5 zeigt die Ergebnisse des ersten Konkurrenz-Assay. Das Serum der Ratten, die zwei Monate vorher sowohl mit pST als auch mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert worden waren, konkurriert mit ¹²&sup5;I-pST hinsichtlich des Bindens am monoklonalen Antikörper PS-7.6, während Seren der beiden anderen Gruppen keine Wirkung hatten.
In einem zweiten Konkurrenz-Assay wurde das Serum, das im ersten Assay konkurrierte, zur Überprüfung der weiteren Zugabe von normalem Mäuse-Ig (Säule 2 in Figur 6), verglichen mit der Abwesenheit von normalem Mäuse-Ig (Säule 1), eingesetzt. Die Hemmung des Bindens von ¹²&sup5;I-pST wird bei Anwesenheit von normalem Mäuse-Ig nicht verringert. Dies zeigt, daß das Serum mit pST hinsichtlich des Bindens an der variablen, statt der konstanten Region des monoklonalen Antikörpers PS-7.6 konkurriert.
In einer Variation dieses zweiten Konkurrenz-Assay wurden die Streifen mit einem anderen monoklonalen Anti-PST-Antikörper, mit PS-11.2 bezeichnet, überzogen und die Abwesenheit (Säule 3 von Figur 6) oder die Anwesenheit (Säule 4) von normalem Mäuse-Ig getestet. Das Serum konkurriert mit pST hinsichtlich des Bindens an monoklonalem Antikörper PS-11.2 zu einem geringeren Grade (etwa die Hälfte) als beim Binden an monoklonalen Antikörper PS-7.6. Dies zeigt, daß die monoklonalen Antikörper unterschiedliche Epitope von pST erkennen, und daß die anti-idiotypischen Antikörper im Serum ein Epitop mit pST gemeinsam haben, das durch monoklonalen Antikörper PS-7.6, nicht aber durch monoklonalen Antikörper PS-11.2, erkennbar ist. Die Hemmung des Bindens von pST an den monoklonalen Antikörper PS-11.2 durch das Serum erfolgt lediglich aufgrund der sterischen Hinderung der anti-konstanten Region des Mäuse-Ig, weil die hindernde Wirkung durch die Anwesenheit von normalem Mäuse-Ig (Säule 3) vollständig aufgehoben wird.

5. Die Wirkung der Fraktionierung von Serum auf das konkurrierende Verbinden

Serum der Ratten, die zwei Monate vorher sowohl mit pST als auch monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert worden waren, wurde durch Protein G Affinitäts-Säulenchromatographie (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fraktioniert. Die Probe wurde mit 3M NaCl und 1,5M Glycin, pH 8,9, verdünnt und auf die Säule gegeben. Die Säule wurde dann mit 3M NaCl und 1,5M Glycin, pH 8,9, gewaschen und die Fraktionen durch Spektrophotometrie bei OD&sub2;&sub8;&sub0; überwacht. Das Eluat enthielt die Nicht-Ig-Fraktion, die sich nicht an die Säule bindet. Die gebundene Ig-Fraktion wurde durch Waschen der Säule mit 0,1M Zitronensäure und NaOH, pH 3,0, abgegeben, gefolgt von einer Neutralisation mit 3M Trispuffer, pH 7,5. Die Fraktionen wurden überwacht, wie gerade beschrieben.
Die Nicht-Ig- und Ig-Fraktionen wurden mit nichtfraktioniertem Serum beim oben beschriebenen Konkurrenz-Assay verglichen. Wie in Figur 7 gezeigt, ist die Konkurrenz mit ¹²&sup5;I-pST hinsichtlich des Bindens an monoklonalen Antikörper PS-7.6 in der Ig-Fraktion am größten. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Komponente, die mit pST konkurriert, hauptsächlich in der Ig-Fraktion vorhanden ist, was zeigt, daß die Komponente anti-idiotypische Antikörper sind.

6. FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie von Serum

Das Serum der Ratten, die zwei Monate vorher sowohl mit pST als auch monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert worden waren, wurde mit 20mM Trispulfer, pH 8, äquilibriert und einer FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie unterworfen unter Einsatz einer Mono-Q HR 5/5- Säule (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Die Fraktionen wurden durch Eluieren mit einem Salzgradienten (0-100% 1M NaCl gesammelt, gefolgt vom Entsalzen mit Centricon -10-Filtern. Die Fraktionen wurden dann auf die Fähigkeit mit ¹²&sup5;I-pST hinsichtlich des Bindens am monoklonalen Antikörper PS-7.6 im oben beschriebenen RIA zu konkurrieren, getestet.
Die in Figur 8 abgebildeten Ergebnisse zeigen, daß die aktivste Gruppierung beim Konkurrieren mit ¹²&sup5;I-pST in Fraktion 10 vorhanden ist. Wird die Fraktion 10 einer SDS-PAGE unterworfen und analysiert, dann wird bestätigt, daß die Fraktion 10 Ratten-Ig und somit antiidiotypische Antikörper enthielt.

7. Wirkung von Seren auf das Wachstum einer zweiten Gruppe von Tieren

Ein Experiment wurde ausgeführt, um sicherzustellen, ob die Seren der drei Gruppen von Ratten, die zwei Monate vorher behandelt worden waren, einen das Wachstum ermöglichenden Faktor enthalten, wenn sie einer zweiten Gruppe von Tieren injiziert werden. Jedes Serum wurde in eine von drei Gruppen einer zweiten Gruppe von Hypox-Ratten, jeweils acht Ratten pro Gruppe, injiziert. Die Ratten erhielten fünf Tage lang eine tägliche intraperitoneale Injektion von 0,5 ml des Serums. Die Gewichtszunahme der Ratten ist in Figur 9 abgebildet.
Die Ratten, die Serum von Ratten erhielten, die vorher sowohl mit pST als auch mit monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert worden waren, zeigten eine statistisch signifikante Gewichtszunahme. Dies zeigt, daß das Serum einen Faktor enthält, der die Wachstum ermöglichende Wirkung von pST nachahmt. Im Gegensatz dazu hatte Serum von unbehandelten Ratten oder von Ratten, die nur mit pST behandelt worden waren, keine statistisch signifikante Auswirkung auf die Gewichtszunahme von Ratten, die eines dieser Seren erhielten.

8. Wirkung von fraktioniertem Serum auf das Wachstum einer zweiten Gruppe von Tieren

Serum der Tiere, die eine Wachstum ermöglichende Wirkung zeigten, wie in Figur 9 gezeigt, wurde mittels einer Protein G-Affinitätssäule gemäß dem in Teil 6 dieses Beispiels 3 beschriebenen Verfahren fraktioniert. Die Nicht-Ig- und Ig-Fraktionen sowie unbehandeltes Serum als ein Vergleichsmaterial wurden einer zweiten Gruppe von Hypox-Ratten, jeweils acht Ratten pro Gruppe, injiziert. Die Ratten erhielten (für fünf Tage) eine tägliche Injektion von 1 mg in PBS pro Injektion.
Wie in Figur 10 gezeigt, zeigt die zweite Gruppe von Ratten, die die Ig-Fraktion erhielten, eine statistisch signifikante Gewichtszunahme. Im Gegensatz dazu zeigen Ratten, die die Nicht-Ig- Fraktion oder das unbehandelte Serum erhielten, keine statistisch signifikante Erhöhung der Gewichtszunahme. Diese Experimente zeigen zusätzlich, daß anti-idiotypische Antikörper, die PST nachahmen, in der Ig-Fraktion des Serums von Ratten gefunden werden, die mit pST plus monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert wurden.

9. Antikörper-Reakion auf ein F(ab')&sub2;-Fragment des monoklonalen Antikörpers PS-7.6

Monoklonaler Antikörper PS-7.6 wurde 12 Stunden lang mit Pepsin bei 37ºC in Acetatpuffer, pH 4,5, verdaut, um F(ab')&sub2;-Fragmente zu erzeugen. Die Ausbeuten an den Fragmenten werden verbessert, wenn die Verdauung 15-18 Stunden lang ausgeführt wird. Die Verdauungs- Mischung wurde dann mit phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt, zuerst gegen PBS und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, gefolgt von einer Lyophilisierung. Diese Stufen minimieren die Bildung starker Niederschläge (die die Ausbeuten verringern) während der Neutralisation mit Puffer zum pH 7,0.
Das lyophilisierte Material wurde dann unter Einsatz einer Sephacryl S200-Säule (Pharmacia, Piscataway, N.J.) chromatographiert und mit PBS eluiert. Die Fraktionen wurden spektrophotometrisch (O.D. 280) überwacht. Die das F(ab')&sub2;-Fragment enthaltende Fraktion wurde einer SDS-PAGE unterworfen, und es wurde festgestellt, daß sie ein Molekulargewicht von etwa 100.000 Dalton aufwies.
Eine Gruppe von ELISA-Platten wurde mit den F(ab¹)&sub2;-Fragmenten des monoklonalen Antikörpers PS-7.6 überzogen. Eine andere Gruppe von Platten wurde mit F(ab')&sub2;-Fragmenten des OKT4 Mäuse-Antikörpers (einem monoklonalem Antikörper gegen T-Lymphozyten; Ortho Pharmaceutical, Raritan, N.J.) überzogen, die unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens erhalten wurden. Serumproben der drei Gruppen von Ratten wurden, wie in Teil 2 beschrieben, in vier verschiedenen Verdünnungen getestet, wobei jede eine Größenordnung verdünnter war als die vorhergehende Konzentration.
Die Ergebnisse sind in Figur 11 gezeigt. Das Serum der Ratten, die zwei Monate vorher sowohl mit pST als auch monoklonalem Antikörper PS-7.6 immunisiert worden waren, enthalten nun anti-idiotypische Antikörper, die die F(ab')&sub2;-Fragmente des monoklonalen Antikörpers PS-7.6, aber nicht die F(ab')&sub2;-Fragmente des OKT4 Mäuse-Antikörpers (Diagramm C) erkennen. Die Seren von unbehandelten Ratten (Diagramm A) und von Ratten, die vorher mit pST allein behandelt wurden (Diagramm B) sind uneffektiv.

Claims

1. Anti-idiotypischer monoclonaler Antikörper, wobei dieser anti-idiotypische Antikörper gegen den für Schweine-Somatotropien spezifischen Antikörper mit der Bezeichnung PS-7.6 gebildet und vom Hybridom ATCC 10416 erhältlich ist, wobei der anti-idiotypische Antikörper die Aktivität von Schweine-Somatotropie nachahmt und das Wachstum in einem Wirbeltier anregt.

2. Zusammensetzung, umfassend:

(a) eine wirksame, das Wachstum anregende Menge des anti-idiotypischen, monoclonalen Antikörpers von Anspruch 1 und

(b) ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel oder einen solchen Träger.

3. Verfahren zum Anregen des Wachstums eines Wirbeltiers mit Ausnahme von Menschen, umfassend das Verabreichen einer wirksamen, das Wachstum anregenden Menge des anti-idiotypischen monoclonalen Antikörpers von Anspruch 1 an das Wirbeltier.