DE69104602T2

DE69104602T2 - Stressprotein aus bakterien.

Info

Publication number: DE69104602T2
Application number: DE69104602T
Authority: DE
Inventors: James Burnie
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: Neutec Pharma Ltd
Priority date: 1990-07-25
Filing date: 1991-07-25
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-07-26
Also published as: JPH05503943A; EP0494294B1; US5985277A; WO1992001717A1; DK0494294T3; US6040148A; ATE112783T1; ES2062809T3; EP0494294A1; DE69104602D1; GB9016315D0; JP3747057B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf bakterielle Streß-Proteine, auf deren Inhibitoren und ihre Verwendung in der Medizin und zur Diagnose.
Umweltbedingter Streß kann eine Erhöhung der Syntheserate des sogenannten Wärmeschocks oder der Streß- Proteine sowohl in procaryotischen als auch eucaryotischen Zellen induzieren (siehe beispielsweise Schlesinger et al (eds) in Heat Shock from Bacteria to Man, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972)). Obwohl die Funktion der Streß-Proteine noch endgültig gelöst werden muß, wurde von einigen berichtet, daß sie beim Aufbau und bei der strukturellen Stabilisierung von bestimmten zellulären und Virusproteinen beteiligt sind und ihr Vorhandensein bei hohen Konzentrationen könnte eine zusätzliche stabilisierende Wirkung während der Exposition bei ungünstigen Bedingungen aufweisen.
Viele Erregerorganismen wurden gezeigt, um Streß-Proteine zu erzeugen (siehe zum Beispiel Young D., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4267-4270 (1988)). Es wurde angenommen, daß die Proteine als Antwort auf den Streß der Infektion erzeugt wurden, um zu helfen, den eindringenden Krankheitserreger zu beschützen. Daher wurde die Fähigkeit, Streß-Proteine zu erzeugen, mit dem Überleben der bakteriellen Krankheitserreger in Makrophagen in Zusammenhang gebracht (Christmas, M.F., et al, Cell, 41, 753-762 (1985) und Morgan R.W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83 8059-8063 (1986)).
Es wurde vorgebracht, daß das Vorhandensein von Streß-Proteinen in einer Vielzahl von humanen Krankheitserregern zeigt, daß die Streßantwort eine allgemeine Komponente der Infektionen ist und daß Streß- Proteine zwischen den Anwärtern für Untereinheiten- Impfstoffe berücksichtigt werden sollten (Young, D. et al, ibid)
Die Coryneformbakterien sind übliche Bewohner der gesunden menschlichen Haut und der Schleimhäute. Einige sind bekannte Krankheitserreger, zum Beispiel bewirkt die Species Corynebakterium diphtheriae Diphtherie im menschlichen Körper. Eine andere Species Corynebakterium jeikeium bewirkt Septikämie bei neutropenischen Patienten (siehe beispielsweise Hande, K.R., et al, Ann. Intern. Med., 85, 423-426 (1976)), und C.jeikeium Infektionen wurden mit Endokarditis assoziiert (Jackman, P.J., et al, Syst. Appl. Microbial., 9, (1-2), 83-90 (1987)). Diese Species C.jeikeium sind dadurch gekennzeichnet, daß sie Katalase-positive, Oxidase-negative, fermentativ grampositive aerobe Stäbchen sind, die Nitrat nicht reduzieren (Riley, P.S., et al, J.Clin. Microbial., 9, 418-424, (1979)). Sie unterscheiden sich von anderen Coryneformen darin, daß sie stark resistent gegen Antibiotika, einschließlich Ampicillin, Cephalothin, Chloramphenicol, Erythromycin, Gentamicin, Penicillin G, Streptomycin und Tetracyclin sind (Jackman, P.J., Pelczynska, S., J. Gen. Microbial., 132, (Pt. 7), 1911-1915 (1986)).
Eine konventionelle Therapie für eine C.jeikeium Infektion ist systemisches Vancomycin, das potentiell nierenschädigend ist. Dies steht gegen dessen blinde Verwendung bei fiebrigen neutropenischen Patienten, so daß es wichtig wurde, einen Marker der C.jeikeium Infektion zu entwickeln. Es besteht auch die Notwendigkeit für ein Verfahren zum Behandeln von C.jeikeium Infektionen, insbesondere bei neutropenischen Patienten, das die mit der konventionellen Therapie verbundenen schädigenden Wirkungen vermeidet.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben nun herausgefunden, daß die Genesung von der C.jeikeium Septikämie bei Menschen mit der Erzeugung von Antikörpern sowohl der IgM- als auch der IgG-Klasse gegen ein Protein mit einem scheinbaren (apparenten) Molekulargewichts von 52 kDalton (kDa) einhergeht. Weitere Tests unter Verwendung von Antikörpern gegen ein bekanntes pilzartiges Streß-Protein haben gezeigt, daß das 52 kDa Protein ein Abbauprodukt eines 86 kDa Antigen-Analogons zu dem 90 kDa Hitzeschockprotein des Candida albincans ist. Wir haben diese Entdeckung dazu benutzt, Mittel für eine verbesserte Diagnose und Behandlung von Infektionen und Erkrankungen durch Corynebakterium zu entwickeln, die durch verwandte Gram-positive Bakterien bewirkt werden.
Daher wird entsprechend einem Aspekt der Erfindung ein bakterielles Streß-Protein mit einem scheinbaren (apparenten) Molekulargewicht von ungefähr 86 kDa oder ein Fragment oder ein Analog davon mit den folgenden Merkmalen bereitgestellt:
(1) es ist ein immundominates konserviertes Antigen;
(2) Patienten mit C.jeikeium Septikämie im Heilprozeß haben Antikörper zu einem 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins; und
(3) Patienten mit C.jeikeum Endokarditis haben Antikörper zu einem 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins;
(4) es kreuzreagiert mit einem Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern der Maus gegen das Peptidantigen; und
(5) die Kreuzreaktion des Streß-Proteins und des monoklonalen Antikörpers der Maus gegen das Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE wird durch Peptid KVIRKNIVKKMIE neutralisiert.
Der Begriff "apparentes Molekulargewicht", wie er hier verwendet wird, soll das apparente bzw. scheinbare Molekulargewicht bezeichnen, wie es durch 10 % Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter Verwendung von Molekulargewichtmarkern, die von Amersham International (Prestained Rainbow Markers, Code RPN. 756) geliefert werden, bestimmt wird.
Das Streß-Protein nach der Erfindung kann bakteriellen Ursprungs sein und kann beispielsweise aus Grampositiven Bakterienstämmen gewonnen werden. Besondere Stämme schließen die ein, die zu der Gattung des Corynbakteriums gehören, beispielsweise Stämme des Corynebakterium diphtheriae oder insbesondere Corynebakterium jeikeium und von verwandten corynebakteriellen Spezies.
Das Streß-Protein, das Fragment oder Analog davon entsprechend der Erfindung kann ein rekombiniertes Protein, Fragment oder Analog sein, d.h. ein Protein, Fragment oder Analog, das unter Verwendung von Rekombinanten DNA Techniken erzeugt wurde.
Ein Fragment eines Streß-Proteins entsprechend der Erfindung kann jedes kürzere Abbauprodukt des Proteins oder ein Analog davon sein. Spezielle Fragmente schließen solche mit scheinbaren Molekulargewichten von ungefähr 52 kDa oder 50 kDa ein.
Analoge eines Streß-Proteins nach der Erfindung schließen solche Proteine ein, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren des Proteins durch eine andere Aminosäure ersetzt ist unter der Bedingung, daß die Gesamtfunktionalität des Proteins beibehalten wird.
Ein Streß-Protein nach der Erfindung kann in einer gereinigten Form erhalten werden und somit sehen wir entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung ein im wesentlichen reines bakterielles Streß-Protein vor, das ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 86 kDa aufweist, oder ein Fragment oder ein Analog davon.
Der Begriff "im wesentlichen rein" soll bedeuten, daß das Streß-Protein nach der Erfindung frei von anderen Proteinen bakteriellen Ursprungs ist. In den verschiedenen im folgenden beschriebenen Aspekten der Erfindung soll verstanden werden, daß ein Bezug auf das bakterielle Streß-Protein auch im wesentlichen reine Zubereitungen des Proteins umfaßt.
Durch dieses Dokument hindurch werden Peptide unter Verwendung eines einzigen Buchstabens identifiziert, um jede getrennte Aminosäure darzustellen. Jeder Buchstabe ist das übliche Symbol mit einem einzigen Buchstaben, das für Aminosäuren verwendet wird.
Ein Streß-Protein nach der Erfindung weist eine Vielzahl von Verwendungen auf. So kann das Protein beispielsweise die Grundlage eines Diagnosetests für bakterielle Infektionen bilden, beispielsweise eines immunologischen Tests, wie ein enzymgekoppeltes Immun-Assay, ein Radioimmun-Assay oder ein Latexagglutinations-Assay, hauptsächlich um zu bestimmen, ob für das Protein spezifische Antikörper in einem Wirtorganismus vorhanden sind. Der Test kann gewöhnlich durch Kontaktieren von Körperflüssigkeit des Wirts mit dem Streß-Protein und Bestimmen des Komplex- Materials durchgeführt werden.
In einer anderen Verwendung kann das Streß-Protein nach der Erfindung unter Verwendung von konventionellen Techniken für Tests verwendet werden, um aktivitätsverzögernde Mittel für die Verwendung in der Behandlung von bakteriellen Infektionen zu erhalten. Solch ein Trennverfahren bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
In einer weiteren Verwendung ist das Streß-Protein nach der Erfindung besonders gut für die Erzeugung von Antikörpern geeignet. Daher sehen wir nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ein bakterielles Streß- Protein oder ein Fragment oder ein Analog davon für die Verwendung als Immunogen vor, das ein scheinbares Molekulargewicht von 86 kDa aufweist.
Standard-Immuntechniken können mit dem Streß-Protein durchgeführt werden, um es als Immunogen zu verwenden. Daher kann beispielsweise jeder geeignete Wirt mit dem Protein und dem gesammelten Serum injiziert werden, um den gewünschten polyklonalen Antistreß- Protein-Antikörper nach Reinigung und/oder Konzentration zu erhalten. Vor der Injektion des Wirts kann das Streß-Protein in ein geeignetes Vehikel formuliert werden und somit sehen wir nach einem weiteren Aspekt der Erfindung eine Zusammensetzung vor, die ein Pilzstreß-Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 86 kDa oder ein Fragment oder ein Analog davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Stoffträgern umfaßt.
Für eine Reinigung jedes Antistreß-Protein-Antikörpers kann die Affinitätschromatographie angewandt werden, wobei ein immobilisiertes Streß-Protein nach der Erfindung als Affinitätsmedium verwendet wird. Somit sehen wir nach einem anderen Aspekt der Erfindung ein bakterielles Streß-Protein, ein Fragment oder ein Analog davon mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 86 kDa vor, das kovalent an einem nichtlösbaren Träger gebunden ist.
Die Verwendung von Streß-Proteinen nach der Erfindung als Immunogene für die Herstellung von Antikörpern erzeugt einen Typ eines Inhibitors der Wirkung des Proteins. Im allgemeinen sind Inhibitoren der Streß- Proteine potentiell nützlich in der Diagnose und insbesondere in der Behandlung von bakteriellen Infektionen und bilden ein weiteres Merkmal der Erfindung. Inhibitoren schließen jede Antagonisten der Funktion der Streß-Proteine oder Mittel, die ihre Erzeugung verhindern, ein und umfassen insbesondere solche, die in der Behandlung von bakteriellen Infektionen verwendet werden können. Geeignete Inhibitoren umfassen beispielsweise pharmazeutische Reagenzien einschließlich Antikörper und chemische Analoge der Streß-Proteine, um gegen die Wirkung des Streß-Proteins zu wirken, und Antisense-RNA und DNA Oligonucleotid-Analoge, um die Erzeugung des Streß- Proteins zu verhindern. Geeignete Inhibitoren können durch Verwendung geeigneter Screens bestimmt werden, beispielsweise durch Messen der Fähigkeit eines potentiellen Inhibitors, der Wirkung eines Streß-Proteins entgegenzuwirken, oder die Erzeugung eines Streß-Proteins zu verhindern, wobei das Entsprechende für ein Fragment oder ein Analog gilt.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung sehen wir einen Inhibitor eines bakteriellen Streß-Proteins oder ein Fragment oder ein Analog davon vor, wobei das Protein ein apparentes Molekulargewicht von 86 kDa aufweist, mit den folgenden Merkmalen:
(1) es ist ein immundominantes konserviertes Antigen;
(2) Patienten mit C.jeikeium Septikämie im Heilprozeß haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins; und
(3) Patienten mit C.jeikeium Endokarditis haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß- Proteins;
(4) es kreuzreagiert mit einem Peptidantigen KVIRNIVKKMIE unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern der Maus gegen das Peptidantigen; und
(5) die Kreuzreaktion des Streß-Proteins und des monoklonalen Antikörpers der Maus gegen das Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE wird durch Peptid KVIRKNIVKKMIE neutralisiert
für die Verwendung in der Diagnose oder Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Inhibitoren können entweder allein oder, wo es geeignet ist, in Kombination mit anderen pharmazeutischen Mitteln, beispielsweise anderen antibakteriellen Mitteln oder Antipilzmitteln verwendet werden.
Eine besonders nützliche Gruppe von Inhibitoren nach diesem Aspekt der Erfindung sind Antikörper, die in der Lage sind, die Streß-Poteine zu erkennen und zu binden.
Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sehen wird daher einen Antikörper vor, der spezifisch für ein oder mehrere Epitope des bakteriellen Streß- Proteins ist, oder ein Fragment oder ein Analog davon, wobei das Streß-Protein ein apparentes Molekulargewicht von 86 kDa aufweist, mit den folgenden Merkmalen:
(1) es ist ein immundominates konserviertes Antigen;
(2) Patienten mit C.jeikeium Septikämie im Heilprozeß haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins; und
(3) Patienten mit C.jeikeium Endokarditis haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins;
(4) es kreuzreagiert mit einem Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern der Maus gegen das Peptidantigen; und
(5) die Kreuzreaktion des Streß-Proteins und des monoclonalen Antikörpers der Maus gegen das Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE wird durch Peptid KVIRKNIVKKMIE neutralisiert
für die Verwendung in der Diagnose und der Behandlung von bakteriellen Infektionen.
Der Antikörper kann ein gesamter Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon sein und kann allgemein zu jeder Immunglobulinklasse gehören. Somit kann er beispielsweise ein Immunglobulin M Antikörper oder insbesondere ein Immunglobulin G Antikörper sein. Der Antikörper oder das Fragment können von einem Tier, beispielsweise Säugetierursprungs sein, oder können beispielsweise von der Maus, Ratte oder vom Menschen stammen. Er kann ein natürlicher Antikörper oder Fragment davon sein oder, wenn gewünscht, ein rekombinierter Antikörper oder Antikörperfragment sein, d.h. ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, die unter Verwendung von rekombinierenden DNA Techniken erzeugt wurden.
Besondere rekombinierte Antikörper oder Antikörperfragmente umfassen (1) solche, die einen Antigenbindungsort haben, wobei mindestens ein Teil von einem unterschiedlichen Antikörper hergeleitet ist, zum Beispiel solche, in denen die hypervariablen oder Komplementarität bestimmenden Bereiche eines Antikörpers in die variablen Gerüstbereiche eines zweiten, unterschiedlichen Antikörpers angepfropft wurden (wie in dem EP-Patent Nr. 239400 beschrieben ist); (2) rekombinierte Antikörper oder Fragmente, bei denen nichtvariable Domänensequenzen durch nichtvariable Domänensequenzen von anderen unterschiedlichen Antikörpern ausgetauscht wurden (wie in den EP-Patenten Nrn. 120694, 125020, 171496, 173494 und 194276 beschrieben ist); oder (3) rekombinierte Antikörper oder Fragmente, die im wesentlichen den Aufbau eines natürlichen Immunglobulins besitzen, aber bei denen der Gelenkbereich eine unterschiedliche Anzahl von Cystein-Rückständen zu der, die in dem natürlichen Immunglobulin gefunden wird, aufweist, oder bei denen ein oder mehrere Cystein-Rückstände in der Oberflächenvertiefung des rekombinierten Antikörpers oder Fragments anstelle eines anderen in dem natürlichen Immunglobulin vorhandenen Aminosäurerückstandes vorgesehen ist, wie in den internationalen Patentanmeldungen Nrn. W089/01974 und W089/01782 jeweils beschrieben ist).
Der Antikörper oder das Antikörperfragment können polyklonalen oder vorzugsweise monoklonalen Ursprungs sein. Sie können spezifisch für eine Anzahl von Epitopen, die dem Streß-Protein zugeordnet sind, sein, aber vorzugsweise sind sie spezifisch für ein Epitop.
Antigen bindende Antikörperfragmente umfassen beispielsweise Fragmente, die durch Enzymspaltung eines gesamten Antikörpers hergeleitet sind, wie F(ab,)&sub2;, Fab', Fab oder Fv Fragmente, oder Fragmente, die durch rekombinierte DNA Techniken erhalten werden, wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung Nr. W089/02465 beschrieben ist, ebenso wie Einkettenantikörper, zum Beispiel Einketten Fvs.
Der Antikörper oder das Fragment kann querverbunden sein, zum Beispiel wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 385601 beschrieben ist. Antikörper- oder Antikörperfragment-Moleküle können auch querverbunden sein, um multimere Formen hervorzubringen (zum Beispiel IgG Moleküle können querverbunden werden, um trimere, tetramere oder größere multimere Strukturen zu bilden) unter Verwendung von konventionellen Querverbindungsversuchen, zum Beispiel durch querverbindende Aminosäureseitenketten, die in den Molekülen vorhanden sind und eine Amino-, Sulphydryl- oder andere funktionelle Gruppen enthalten, unter Verwendung eines Querverbindungsreagens.
Die Antikörper nach der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung der allgemein bekannten immunologischen Techniken hergestellt werden, wobei das Streß- Protein als Antigen verwandt wird. Somit kann beispielsweise jeder geeignete Wirt mit dem Streß-Protein und dem gesammelten Serum injiziert werden, um den gewünschten polyklonalen Antikörper nach einer geeigneten Klärung und/oder Konzentration (zum Beispiel durch Affinitätschromatographie bei Verwendung des immobilisierten Streß-Proteins als Affinitätsmedium) hervorzubringen. Alternativ können Splenozyten oder Lymphozyten aus dem mit dem Streß-Protien injizierten Wirt wiedergewonnen und immortalisiert werden, zum Beispiel unter Verwendung des Verfahrens von Kohler et al, Eur. J. Immunol. 6, 511, (1976), wobei die resultierenden Zellen isoliert werden, um eine einzige monoklonale Antipilz-Streß-Proteine produzierende genetische Linie zu erhalten. Antikörperfragmente können unter Verwendung von konventionellen Techniken erzeugt werden, zum Beispiel durch Enzymdigerieren, beispielsweise mit Pepsin (Parham, J. Immonul, 131, 2895 (1983) oder Papain (Lamoyi und Nisonoff, J. Immunol. Meth. 56, 235, (1983)). Wo es gewünscht ist, rekombinierte Antikörper entsprechend der Erfindung zu erzeugen, so können diese beispielsweise unter Verwendung der in den europäischen Patentanmeldungen Nrn. 171496, 173494, 194276 und 239400 beschriebenen Verfahren erzeugt werden.
Antikörper entsprechend der Erfindung können mit einer detektierbaren Markierung markiert werden oder können mit einem Effektormolekül, zum Beispiel einer Droge z.B. einem antibakteriellen Mittel konjugiert werden und die Erfindung erstreckt sich auf solche markierten Antikörper oder solche Antikörperpaare.
Die Antikörper entsprechend der Erfindung haben eine diagnostische und/oder therapeutische Anwendung. Somit können für eine diagnostische Anwendung die Antikörper dazu verwendet werden, um festzustellen, ob das Streß-Protein in einem Wirtorganismus vorhanden ist oder nicht, um zu bestätigen, ob der Wirt eine spezielle bakterielle Infektion hat, zum Beispiel eine Infektion aufgrund eines Gram-positiven Organismus, insbesondere eines Coryneformorganismus, besonders C.diphtheriae oder C.jeikeium, zum Beispiel in der Diagnose der Septikämie oder Endokarditis, und/oder um den Fortschritt einer therapeutischen Behandlung solcher Infektionen zu überwachen. Diagnostische Verfahren dieser Art bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung und können allgemein Standardtechniken verwenden, zum Beispiel immunologische Verfahren, wie enzymgebundene immunsorbierende Verfahren, Radioimmunverfahren, Latexagglutinationsverfahren und Immunoblottingverfahren. Diese Tests bringen den Antikörper und die Wirtkörperflüssigkeit in Kontakt und detektiert jeden resultierenden komplexierten Antikörper.
Antikörper entsprechend der Erfindung haben auch eine therapeutische Anwendung in der Behandlung von bakteriellen Infektionen, beispielsweise aufgrund von Gram-positiven Bakterien, besonders Coryneformorganismen wie gerade beschrieben, und können allein oder konjugiert mit einem Effektormolekül verwendet werden (in letzterem Fall, um das Effektormolekül, zum Beispiel ein antibakterielles Mittel gegen den infizierenden Organismus zu treffen), optional in Kombination mit anderen pharmazeutischen Mitteln, wie anderen antibakteriellen oder Antipilzmitteln. Für die therapeutische Verwendung kann der Antikörper in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren formuliert werden, zum Beispiel mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger oder einem Arzneimittelträger, z.B. einem isotonischen Salz für eine Verabreichung in einer geeigneten Dosierung, abhängig von der Natur der zu behandelnden Infektion und dem Alter und dem Zustand des Patienten.
Ein besonders nützlicher Antikörper nach diesem Aspekt der Erfindung ist der, der das Peptid KVIRKNIVKKMIE erkennt und entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung sehen wir einen Antikörper vor, der in der Lage ist, das Peptid KVIRKNIVKKMIE oder ein Analog davon für die Verwendung in der Behandlung oder Diagnose von bakteriellen Infektionen zu erkennen.
Wenn gewünscht, können Mischungen von Antikörpern für die Diagnose oder Behandlung verwendet werden, zum Beispiel Mischungen von zwei oder mehr Antikörpern, die unterschiedliche Epitope eines bakteriellen Streß-Proteins entsprechend der Erfindung erkennen können und/oder Mischungen von Antikörpern einer unterschiedlichen Klasse, zum Beispiel Mischungen von IgG und IgM Antikörpern, die das gleiche oder unterschiedliche Epitope eines bakteriellen Streß-Proteins der Erfindung erkennen.
Die Streß-Proteine entsprechend der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von Prozessen hergestellt werden, bei denen eine geeignete Bakterienzellkultur, z.B. eine C.jeikeium Zellkultur als Startmaterial verwendet werden. So können beispielsweise geeignete bakterielle Zellen geerntet, aufgelöst werden und nach Trennung der Zelltrümmer kann der resultierende Zellenextrakt unter Verwendung von üblichen Trenntechniken, wie Ionenaustausch und Gelchromatographie und Elektrophorese und Immunreinigungsverfahren, zum Beispiel Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Antikörpers, der in der Lage ist, das Protein zu erkennen, zum Beispiel ein Antikörper, der in der Lage ist, das Peptid KVIRKNIVKKMIE zu erkennen, fraktioniert werden. Während der Herstellung kann das Vorhandensein des gewünschten Proteins unter Verwendung irgendeiner geeigneten analytischen Standardtechnik auf der Grundlage beispielsweise eines Antikörpers, der in der Lage ist, ein Epitop auf dem Protein zu erkennen, zum Beispiel ein Antikörper, der in der Lage ist, das Peptid KVIRKNIVKKMIE zu erkennen, überwacht werden. Bei Verwendung der obigen Techniken kann erwartet werden, daß das Streß-Protein in einer gereinigten Form hervorgebracht wird.
Alternativ kann das Protein kloniert und exprimiert werden, ausgehend von einer geeigneten C.jeikeium genomische Bibliothek und unter Verwendung von Standarduntersuchungen und rekombinierten DNA Techniken.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In der folgenden Beschreibung werden verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert, in denen:
Fig. 1 zeigt sequentielle Immunblots (Immunkleckse) der IgG Antwort auf eine C.jeikeium Septikämie in einem Patienten, der die Infektion überlebt hat.
Fig. 2 zeigt ein Immunblot der IgM und IgG Antwort auf eine C.jeikeium Endokarditis in einem Patienten, der die Infektion überlebt hat.
Fign. 3 und 4 zeigen jeweils ein Immunblot eines C.jeikeium Isolats, sondiert mit Kaninchenantiseren gerichtet gegen ein Pressat von C.albincans und gegen das Peptid LKVIRKNIVKKMIE-Cys, und einen monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen das gleiche Peptid, beide vor und nach einer Kreuzabsorption mit Peptid LKVIRKNIVKKMIE.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.

Beispiel 1

Im folgenden wird über die Ergebnisse des Immunoblottings von Seren von Patienten mit einer C.jeikeium Septikämie oder Endokarditis berichtet und es werden die Daten mit Immunoblots verglichen, die von Seren erhalten wurden, die für die JK Coryneform negativ waren (Jackmann, P.J.H. und Pelezynska, J., J. Gen. Microbiology (1986), 132, 1911-1915).

Patienten

Kontrollen - Es wurden Seren von 18 fieberhaften neutropenischen Leukämien untersucht, bei denen alle Kulturen für die JK Coryneform negativ waren. Dies schließt Blut und solche ein, die von irgendeiner innenliegenden intravenösen Linie genommen wurden.

Septikämien

Zwei bis fünf sequentiellen Seren wurden von vierzehn Patienten mit C.jeikeium Septikämien untersucht. Dreizehn von den vierzehn Fällen kamen von neutropenischen Patienten, die bei einer Vancomycintherapie genasen. Ihre Fieberzustände korrespondierten mit einer mit C.jeikeium positiven Blutkultur. Drei der Fälle hatten akute lymphatische Leukämie und die verbleibenden zehn hatten akute Knochenmarkleukämie. Der vierzehnte Fall kam von einem Patienten, der aufgrund eines Verkehrsunfalls in einer Intensivtherapieeinheit aufgenommen wurde. Er war nicht neutropenisch und sein C.jeikeium Septikämie folgte einer Kolonisierung einer langwirkenden innenliegenden zentralen Linie. Er antwortete auf eine Vancomycintherapie.

Endokarditis

Fall 15 kam von einem Patienten mit ulzeröser Kolitis mit einer intravenösen Versorgungslinie, die durch C.jeikeium kolonisiert wurde. Darauf entwickelte sich bei dem Patienten eine Endokarditis, wie durch ein positives Echokardiogramm und kontinuierliche Fieberzustände festgestellt wurde. Drei Sätze von Blutkulturen entwickelten das C.jeikeium und der Patient genas allmählich nach systematischer Vancomycintherapie.

Stamm

Ein klinisches Isolat des von einem Septikämiefall erhaltenen C.jeikeium wurde die ganze Zeit über verwendet.

Herstellung von Proteinextrakten

Das C.jeikeium Isolat wurde auf Columbia Blutagar (Oxoid) subkultiviert und bei 35º C für 48 Stunden aerob inkubiert. Die Platten wurden mit einer Schleife in destilliertem Wasser geerntet und die resultierende Zellsuspension bei 6.000 g für 20 Minuten gewirbelt. Das Pellet wurde in seinem eigenen Volumen von sterilem, destilliertem Wasser wieder suspendiert und in einer X-Presse plaziert. Es wurde bei -20º C zerbrochen und für 20 Minuten bei 12.000 G zentrifugiert. Der Überstand wurde in folgenden Experimenten verwendet und bei -20º C gelagert. Er wurde auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml standardisiert.

Immunoblotting von Patientenseren

Nach Aufheizen mit einem Spaltpuffer (2,6 % Natriumdodecylsulfat, 1,3 % 2-Merkaptoethanol, 6 % Glyzerin, 50,2 % Bromphenolblau, 0,05 % M Tris-hydrochlorid (pH 6,8)) bei 10º C für 2 Minuten wurde 30 ug des C.jeikeium Pressats auf jede Quelle eines 10 % Polyacrylamidgels geladen. Elektrophorese und Transblotting wurden durchgeführt, wie bei Matthews, R.C. et al, (Lancet, ii 1415-1418 (1984); und J. Clin. Microbiol. 25, 230-237 (1987)) beschrieben ist. Das Gel wurde auf eine Nitrozellulosemembran in einem LKB Transblotter (LKB Laboratorien) transferiert. Der Puffer enthielt Methanol (20 %), 25 mM Tris und 192 mM Glyzin bei pH 8,3 und eine Transfer wurde erlaubt, um bei 25º C für 45 Minuten weiter zu verfahren. Das Nitrozellulosepapier wurde in Rinderserumeiweiß (3 %) in gepuffertem Salz (NaCl 0,9 % und 10 mM Tris, pH 7,4) bei 4º C über Nacht gehemmt. Die Nitrozellulose wurde dann bei 35º C für 2 Stunden mit dem Patientenserum, das 1:10 in gepuffertem Salz, enthaltend Rinderserumeiweiß (3 %) und Tween 20 (0,05 %) verdünnt, inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen für 30 Minuten in Salz (0,9 %) und Tween 20 (0,05 %) wurde die Nitrozellulose für eine Stunde bei 35º C mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-Antihuman- Immunoglobin M (IgM) oder IgG (Sigma Chemical Co.) inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Membrane für 15 Minuten bei 25º C mit Puffer (100 mM Tris Hydrochlorid pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;), enthaltend eine Mischung von 66 ul/pro 10 mls Nitro-Tetrazolblau (NBT 50 mg pro ml in N,N-Dimethylformamid 70 %) und 33 ug pro 10 mls von 5-Bromo-4-chloro-3- indolylphosphat (BCIP 50 mg/ml) in N,N-Dimethylformid 70 %) inkubiert. Die Reaktion wurde durch Waschen in Wasser gestoppt. Alle Immunoblots wurden untersucht und in Spurantworten (wobei ein Reflexionsdensitometer eine Spur mit einer Höhe von weniger als 40 mm erzeugte) und positive Antworten (wobei die Höhe größer als 40 mm war) aufgespalten.
Molekulargewichtsmarker waren "Prestained Rainbow Markers" (code RPN. 756 Amersham International). Diese waren Myosin, 200 kDa; Phoshorylase b, 92,5 kDa; Rinderserumeiweiß, 69 kDa; Eiereiweiß, 46 kDa; Carbonanhydrase, 30 kDa; Trypsininhibitor, 21,5 kDa; und Lysozym, 14,3 kDa.

Ergebnisse

Die Ergebnisse von den 18 Kontrollpatienten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Sechs Bänder wurden erfaßt und die üblichste (gemeinsamste) Antikörperantwort war zu dem Band bei 110 kDa. Sequentielle Seren waren in vier der Patienten erhältlich, bei denen eine Antikörperantwort vorhanden war und die Muster änderten sich über einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen nicht. Spur und positive Ergebnisse (siehe oben) wurden für diese Tabelle kombiniert. Tabelle 1: Details der Antikörperantworten bei Kontrollpatienten. Apparentes Molekulargewicht (in kDa)

Septikämie-Patienten

Die Ergebnisse von diesen sind in den Tabelle 2 und 3 zusammengefaßt. Sie werden entsprechend vier Kriterien angegeben. Diese sind: eine konstante Spurreaktion, eine konstante positive Reaktion, eine Steigerung in der Helligkeit, die mindestens das Doppelte der Intensität betrug, wie durch Reflexionsdensitometrie gemessen wurde, und schließlich die Erscheinung eines neuen antigenischen Bandes. Die Ergebnisse von dem vor der C.jeikeium Infektion genommenen Serum wurden mit denen nach der Infektion verglichen. IgM Pegel (Tabelle 2) waren statisch für die Bänder bei 154, 86, 80, 70, 65, 60 und 43 kDa. Ein Maximum von zwei Patienten zeigte Änderungen in den Bändern bei 170, 160, 158, 148 und 57 kDa. Eine Erhöhung in oder die Erscheinung von IgM gegen die Bänder bei 110, 52 und 50 kDa waren die ausgeprägtesten Änderungen, die während der Infektion auftraten. IgG Pegel (Tabelle 3) zeigten ein ähnliches Bild auf IgM. Zwölf Patienten entwickelten eine entschiedenere Antikörperantwort auf das Band bei 110 kDa. Alle Patienten erzeugten bei Genesung IgG gegen das Band bei 52 kDa und ein Beispiel davon ist in Fig. 1 dargestellt. Dieser Patient war der Verkehrsunfall und zeigte auch eine Steigerung des Serumpegels von IgG gegen das Band bei 110 kDa. Bahn 1 ist vor der Septikämie, während die Bahnen 2 und 3 jeweils direkt nach der Beendigung der Vancomycintherapie und fünf Tage später genommen wurden. Neun der vierzehn Patienten erzeugten auch IgG gegen das 50 kDa Band.
Der Endokarditisfall (Fig. 2) hatte IgM und IgG gegen alle antigenischen Bänder, die zuvor für die Septikämiepatienten beschrieben wurden. Die IgM Antwort verging bei erfolgreicher Behandlung, während das IgG sich auf das 50 und 52 kDa Band steigerte.

Zusammenfassung

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Genesung von der Septikämie mit der Produktion von IgM und IgG gegen antigenische Bänder von 50, 52 und 110 kDa einhergingen. Antikörper gegen die 50 und 52 kDa Bänder waren spezifisch für solche Patienten, die eine aktuelle oder eine frühere C.jeikeium Infektion hatten. Im Fall der C.jeikeium Endokarditis ging die Genesung mit einer Serumumwandlung auf die 50 und 52 kDa Bänder einher. Dies illustriert das Potential, eines dieser Antigene als Basis für einen serodiagnostischen Test zu verwenden. Tabelle 2: Details der IgM Antwort in septikämischen Patienten auf individuelle C.jeikeium Bänder. Apparentes Molekulargewicht (in kDa) konstant Spur IgM positiv Erhöhung der Helligkeit Erscheinung eines Bandes Tabelle 3: Details der IgG Antwort in septikämischen Patienten auf individuelle C.jeikeium Bänder. Apparantes Molekulargewicht konstant Spur IgG positiv Erhöhung der Helligkeit Erscheinung eines Bandes

Beispiel 2

Kaninchenhyperimmunantiseren gegen das Peptid LKVIRKNIVKKMIE-Cys und gegen ein Pressat des C.albicans wurden unter Verwendung üblicher Verfahren (siehe beispielsweise Burnie, J., J. Immunol. Meth. (1985), 82, 267-280) erzeugt (errichtet).
Ein bei Mäusen vorkommender monoklonaler Antikörper wurde gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys-KLH gerichtet. Balb/c und CBA x Balb/c Fl mice (Mäuse) wurden subkutan mit 50 ug Immunogen in sterilem kompletten Freundschen- Adjuvans und danach in Intervallen von vierzehn Tagen intraperitoneal mit 50 ug Immunogen in inkomplettem Freundschen-Adjuvans bis zur Serumkonversion injiziert.
Eine Verschmelzung wurde vier Tage nach einer endgültigen Immunisierung von 50 ug Immunogen intravenös in sterilem physiologischem Salz durchgeführt. Verschmelzung, Hybridom-Screening, Kloneselektion und Antikörperanalyse wurden entsprechend Standardprotokollen durchgeführt, wie inbesondere durch de St. Groth S.F. und Scheidegger D., J. Immunol. Methods 35, 1-21 (1980) beschrieben wird. Ausgewählte Hybridome wurden auf Aktivität gegen ein C.albicans 47 kDa Antigen durch Immunoblotting gegen C.albicans untersucht. Positive Hybridome wurden rekloniert und wieder geprüft (re-assayed).

Charakterisierung eines monoklonalen Antikörpers

Eine neue Hybridomazellinie (CA-STR7-1), die entsprechend den obigen Verfahren erhalten wurde, erzeugte einen monoklonalen Antikörper, der das C.albicans 47 kDa Antigen und das Antigen von ungefähr 92 kDa auf Immunoblots von C.albicans, gewachsen bei 37º C, sowohl in der Hefe- als auch Pilzform erkannte. Bei 23º C war das 47 kDa Antigen aber nicht das 92 kDa Antigen mit diesem monoklonalen Antikörper sichtbar.

Immunoblotting

Die obigen Kaninchenantiseren und der monoklonale Antikörper wurden verwendet, um das C.jeikeium Isolat zu sondieren (siehe Beispiel 1).
Die Fign. 3 und 4 zeigen Immunoblots (siehe Verfahren in Beispiel 1), die vor und nach einer Kreuzabsorption mit dem Peptid KVIRKNIVKKMIE (1 mg/ml wie folgt) erhalten wurden:
Fig. 3 Bahn 1 Monoklonal gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys kreuzreagierend mit 52 kDa Band.
Bahn 2 Monoklonal gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys nach Kreuzabsorption (keine Reaktion).
Bahn 3 Kaninchenhyperimmunantiserum gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys kreuzreagierend mit 52 kDa Band.
Bahn 4 Kaninchenhyperimmunantiserum gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys nach Kreuzabsorption (keine Reaktion).
Bahn 5 Kaninchenpolyklonalhyperimmun gegen ein Pressat von C.albicans kreuzreagierend mit 52 kDa Band.
Fig. 4 Bahn 1 Kaninchenhyperimmunantiserum gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys nach Kreuzabsorption (keine Reaktion mit 86 kDa Band).
Bahn 2 Kaninchenhyperimmunantiserum gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys kreuzreagierend mit 86 kDa Band.
Bahn 3 Mausmonoklonal gegen LKVIRKNIVKKMIE-Cys (keine Reaktion).
Bahn 4 Mausmonoklonal gegen LKVIRNIVKKMIE-Cys nach Kreuzabsorption (keine Reaktion).

Zusammenfassung

Die Antiseren und der monoklonale Antikörper haben jeweils das C.jeikeium detektiert, wodurch sie ihr Potential für die Verwendung in einem diagnostischen Test illustrieren.
Das Kaninchenhyperimmunserum kreuzreagiert mit Banden bei 86 kDa und 52 kDa. Diese wurden beide durch das Peptid LKVIRKNIVKKMIE bei 1 mg/ml neutralisiert. Der monoklonale Antikörper reagierte mit dem 52 kDa Band und wurde durch das entsprechende Peptid neutralisiert. Das Kaninchenhyperimmunserum gegen ein Pressat von C.albincans kreuzreagierte mit dem 52 kDa Band.

Claims

1. Bakterielles Streß-Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 86 kDa oder ein Fragment oder ein Analog davon mit folgenden Merkmalen:

(1) es ist ein immundominantes konserviertes Antigen;

(2) Patienten mit C.jeikeium Septikämie im Heilprozeß haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins; und

(3) Patienten mit C.jeikeium Endokarditis haben Antikörper auf ein 52 kDa Abbauprodukt des Streß-Proteins;

(4) es kreuzreagiert mit einem Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern der Maus gegen das Peptidantigen; und

(5) die Kreuzreaktion des Streß-Proteins und des monoklonalen Antikörpers der Maus gegen das Peptidantigen KVIRKNIVKKMIE wird durch Peptid KVIRKNIVKKMIE neutralisiert.

2. Streß-Protein nach Anspruch 1, erhaltbar aus einem Gram-positiven bakteriellen Stamm.

3. Streß-Protein nach Anspruch 1, bei dem der Grampositive Stamm ein zu der Gattung Corynebakterium gehörender Stamm ist.

4. Streß-Protein nach Anspruch 3, bei dem der zu der Gattung Corynebakterium gehörende Stamm ein Stamm des Corynebakterium diphteriae oder Corynebakterium jeikeium oder eine verwandte Coryneformspecies ist.

5. Fragment eines Streß-Proteins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ein scheinbares Molekulargewicht von 52 kDa oder 50 kDa aufweist.

6. Streß-Protein oder Fragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Verwendung bei einem Diagnosetest für bakterielle Infektionen.

7. Streß-Protein oder Fragment nach Anspruch 6, bei dem der Diagnosetest ein enzymgekoppeltes Immunassay (ELISA), ein Radioimmunassay oder ein Latexagglutinationsassay ist.

8. Streß-Protein oder Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Verwendung als Immunogen.

9. Inhibator des bakteriellen Streß-Proteins nach Anspruch 1 oder ein Fragment oder ein Analog davon für die Verwendung der Diagnose oder der Behandlung von bakteriellen Infektionen.

10. Antikörper, spezifisch für ein oder mehrere Epitope des bakteriellen Streß-Proteins nach Anspruch 1 oder ein Fragment oder ein Analog davon für die Verwendung in der Diagnose oder Behandlung von bakteriellen Infektionen.

11. Antikörper nach Anspruch 10, der in der Lage ist, das Peptid KVIRKNIVKKMIE zu erkennen.

12. Antikörper nach Anspruch 10 oder 11, der ein monoklonaler Antikörper ist.

13. Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 12 für die Verwendung in der Diagnose oder Behandlung einer Infektion aufgrund eines Gram-positiven Orgnismus.

14. Antikörper nach Anspruch 13 für die Verwendung in der Diagnose oder Behandlung einer Infektion aufgrund eines Coryneformorganismus.

15. Antikörper nach Anspruch 14 für die Verwendung in der Diagnose oder Behandlung einer Infektion aufgrund eines C.diphtheriae oder C.jeikeium Organismus.