DE69222716T2

DE69222716T2 - Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Thrombin-Konzentrats für therapeutische Verwendung

Info

Publication number: DE69222716T2
Application number: DE69222716T
Authority: DE
Inventors: Dominique Dernis; Catherine Michalski
Original assignee: AETSRN
Current assignee: LFB SA
Priority date: 1991-07-18
Filing date: 1992-07-02
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2012-07-03
Also published as: EP0528701A1; GR3025889T3; JP4101309B2; FR2679251B1; DK0528701T3; US5304372A; FR2679251A1; NO922809L; DE69222716D1; NO305036B1; CA2073734C; CA2073734A1; ES2108738T3; JPH05186369A; EP0528701B1; NO922809D0; ATE159288T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein Konzentrat aus menschlichem Thrombin, das für eine therapeutische Verwendung bestimmt ist, gereinigt im Industriemaßstab, ausgehend von einer Fraktion von menschlichem Plasma.
Das Thrombin ist eine Serin-Protease, die im Blutkreislauf durch Aktivierung ihres inaktiven Vorläufers, des Prothrombins, gebildet wird. Seine Rolle ist grundlegend im Koagulationsablauf: Es spaltet das Fibrinogen in die Fibrin-Monomere und aktiviert durch proteolytische Spaltung den Faktor XIII, der das Fibrinnetz stabilisiert.
Es spielt außerdem eine Rolle bei anderen physiologischen Abläufen: Es startet die Sekretionsreaktionen und die Blutplättchenaggregation, und erleichtert dadurch die Bildung eines hämostatischen Pfropfens. Außerdem aktiviert es die Proteine des Komplementsystems. Es hatte auch eine mitogene Wirkung auf die Fibroblasten, was die Vernarbung der verletzten Blutgefäße beschleunigt.
Aufgrund dieser unterschiedlichen Eigenschaften findet das Thrombin eine therapeutische Anwendung als lokales hämostatisches Mittel. Zur Zeit verwendet man bei diesen klinischen Anwendungen tierisches Thrombin, das vom Pferd oder Rind abstammt. Diese Präparationen sind nicht immer vollständig gereinigt und ihre Anwendung kann der Ursprung von immunologischen Reaktionen sein, die aufgrund einer Überlagerung mit heterologen Proteinen entstehen. Die Verwendung von Rinder- Thrombin trägt außerdem das Risiko einer Übertragung von infektiösen Krankheiten in sich, die in letzter Zeit erkannt wurden und die noch sehr schlecht zu behandeln sind, z.B. die spongiforme Rinderenzephalitis (oder Krankheit der verrückten Kühe).
Die Reinigung des Thrombins, wie auch von vielen anderen Enzymen, ergibt das Problem, daß die vollständige enzymatische Aktivität erhalten bleiben soll. Tatsächlich ist das native α-Thrombin allgemein instabil und ergibt durch Autolyse oder durch begrenzte Proteolyse β- und γ-Thrombin-Derivate, die einen großen Teil ihrer koagulierenden Aktivität auf das Fibrinogen verloren haben.
Die bekannten Reinigungsverfahren wenden sich vollständig an das bovine Thrombin: sie umfassen die Chromatographie aus lonenaustauschharzen, wie z.B. DEAE- Zellulose (Yin et al., J. Biol. Chem., 1968, 243,112), unter Umständen in Verbindung mit einer Filtration auf Sephadex -G100 (Baughman et al., J. Biol. Chem., 1967, 242, 5252-5259); bestimmte Verfahren ermöglichen es, die β- und γ-Formen auf einer Phosphozellulose-Säule (Rosenberg et al., 1970, 245, 5049) und durch Verbindung mit mehreren Ionenaustauschchromatographien abzutrennen (Batt et al., J. Biol. Chem., 1970, 245, 4857).
Neue Harze wurden ebenfalls verwendet, wie z.B. Sulfoethyl- oder Sulfopropyl- Sephadex (Lundlad-Biochemistry, 1971,10, 2501), wie auch eine Affinitätschromatographie auf Trägern, wie z.B. Heparin-Sepharose (Nordeman et al., Thromb. Res., 1977,11, 799-888) und p-Aminobenzamidin-Agarose (Hixson et al., Arch. Biochem. Biophys., 1973,154-501).
Zwei Veröffentlichungen beschreiben die Reinigung von humanem Thrombin, einmal auf Benzamidin-Spherodex (Lorne et al., Rev. Fr. Transf. Hemobiol., 1989, 32, 391-403) mit einem ziemlich schwachen Ertrag (11 bis 20 U/NIH/nl), das andere auf neuen Polystyrolen (Fischer et al., J. Chromatography, 1986, 363, 95-100), wobei dieses Produkt jedoch Faktor V vom Rind (siehe weiter unten) enthält.
Um das Thrombin zu erhalten, mus man nicht nur eine Quelle seines Vorläufers bereitstellen, nämlich das Prothrombin, sondern auch, abhängig von der gewählten Aktivierungsweise, eine ausreichende Konzentration anderer, am Aktivierungsprozeß beteiligter Koagulationsfaktoren. Verschiedene Verfahren wurden beschrieben, die die Aktivierung des Prothrombins zu Thrombin, ermöglichen. Fenton et al. (Biochim. Biophys. Acta, 1971, 229, 26-32 und J. Biol. Chem., 1977, 252, 3587- 3598) haben die Herstellung von Thrombin, ausgehend von der Fraktion III des Cohn-Extrakts auf Harz beschrieben, durch Zugabe von Calciumchlorid und von Gewebe-Thromboplastin, extrahiert aus menschlichem Gehirn. Die Reaktion kann durch Zugabe des Faktors V von Rinderursprung beschleunigt werden (Bernamon- Djiane-Coagulation, 1968,1, 259).
Man kann auch spezifische Aktivatoren verwenden, die aus Schlangengift extrahiert wurden (Gosh et al., Thromb. Res., 1980, 20, 281).
Zwei Herstellungsverfahren für menschliches Thrombin für die therapeutische Verwendung wurden bereits beschrieben:
- in der Patentanmeldung EP 0 378 798 umfaßt das Verfahren eine Adsorption an Plasma auf einer Matrix, bestehend vorzugsweise aus DEAE-Fractogel , die Aktivierung und Elution des Thrombins und unter Umständen eine zusätzliche Reinigung auf Fractogel -Sulfat. Das erhaltene Thrombin hat eine sehr hohe spezifische Aktivität, der Ertrag ist jedoch ziemlich gering;
- in der Patentanmeldung EP 0 443 724, zitiert unter Artikel 54 (3) und (4) EPÜ, umfaßt das Verfahren eine Adsorption des Plasmas auf einem Ionenaustauscher auf der Basis von Agarose, die Aktivierung des Thrombins durch Zugabe von CaCl&sub2;, von Phospholipiden und von Thromboplastin aus dem Gehirn von Kaninchen und eine Reinigung durch Chromatographie auf Sulfoproypl-Sepharose .
Die unterschiedlichen beschriebenen Methoden stellen verschiedene große Nachteile dar, wenn man die Herstellung von sehr großen Volumina menschlichen Thrombins, bestimmt für die therapeutische Verwendung, anstrebt. Außerdem ist Thromboplastin aus menschlichem oder tierischem Hirn schwierig zu erhalten und stellt einen begrenzenden Faktor für die Behandlung mehrerer 100 Liter Plasma dar.
Die Aktivierung mit Vipergift ist schwierig mit der Verwendung beim Menschen zu vereinbaren. Die Verwendung von bovinem Faktor V hat sich als besonders gefährlich erwiesen, da die Restmengen, die man dem Patienten injiziert, der Ursprung für schwere immunologische Reaktionen sind.
Daher hat die Anmelderin ein Verfahren entwickelt, das die Herstellung von gereinigtem und konzentriertem menschlichen Thrombin ermöglicht, keinerlei Zugabe von heterologem Material umfaßt und außerdem einer Behandlung zur viralen Inaktivierung unterzogen wurden. Das Verfahren ist einfach und mit einer Verwendung für große Volumina im Industriemaßstab vereinbar.
Das Ausgangsmaterial ist die PPSB-Fraktion von menschlichem Plasma (PPSB: Proconvertin oder F VII, Prothrombin, Stewart Faktor oder F X und antihämophiler Faktor B oder F IX), so daß alle für die Aktivierung des Prothrombins geeigneten Moleküle in der Ausgangsmischung vorhanden sind: die Faktoren VII, IX, X, die Phospholipide und die Kofaktoren V und VIII.
Das von der Anmelderin vorgeschlagene Verfahren umfaßt die Abfolge der folgenden 6 Schritte:
a) Die PPSB-Fraktion, die ein Derivat des Überstands von cryopräzipitiertem Plasma ist, wird auf DEAE-Sephadex adsorbiert und mit Citratpuffer bei pH 7 gewaschen, der Natriumchlorid, 0,2 M bis 0,23 M und vorzugsweise 0,23 M enthält, was es ermöglicht, Fibrinogen und Spuren von Inhibitoren zu eliminieren, die die folgende Aktivierungsreaktion des Thrombins hemmen können. Das PPSB wird danach durch Erhöhung der Natriumchloridkonzentration auf 0,5 M eluiert.
b) Die Aktivierung des Prothrombins zu Thrombin wird durch Zugabe von Calciumchlorid mit einer endgültigen Konzentration zwischen 5 und 10 mM und vorzugsweise 7 mM in Gang gebracht. (Man hat beobachtet, daß ein Überschuß an CaCl&sub2; die Aktivierungsreaktion inhibieren kann.) Dieser Schritt umfaßt eine erste Inkubation von kurzer Dauer, gefolgt von einer zweiten, längeren, und wird bei einer tieferen Temperatur durchgeführt.
So wird die Mischung zunächst bei 37ºC für 2 Stunden inkubiert. Diese Behandlung erlaubt bereits die Erzeugung von 300 bis 350 U NIH des Thrombins pro ml des PPSB (U NIH: Einheiten, definiert durch das National Institute of Health: USA). Man hat festgestellt, daß eine längere Inkubation bei dieser Temperatur das Resultat nicht verbessert.
In einem zweiten Zeitabschnitt wird die Inkubation bei 24ºC während mindestens 16 Stunden fortgesetzt, was es ermöglicht, 700 bis 1000 U NIH des Thrombins/ml des PPSB zu erhalten.
c) Das so verkalkte PPSB wird so, wie es ist, einer viralen Inaktivierungsbehandlung durch ein Lösungsmittel-Detergenz unterzogen und insbesondere durch Zugabe von TnBP 0,3 %/Tween 1%; die Inkubation wird bei 24ºC mindestens 6 Stunden fortgesetzt und in allgemeiner Weise während einer Nacht. Man muß festhalten, daß es wichtig ist, diese Behandlung nach der Aktivierung des Thrombins durchzuführen, da man Faktoren, wie z.B. die Phospholipide, die notwendig für die Aktivierungsreaktion sind, eliminiert, wenn man sie vor, d.h. direkt an dem PPSB, durchführt.
d) Die Reinigung des Thrombins wird daraufhin durch einen einzelnen lonenaustauschchromatographieschritt bewirkt und insbesondere durch einen starken Kationenaustauscher. Man verwendet vorzugsweise ein festes Gel, bestehend aus einer Agarosematrix, substituiert mit CH&sub2;-SO&sub3;, z.B. S-Sepharose FF (Pharmacia). Die Chromatographie wird in einem Milieu bewirkt, das Natriumgluconat, 40 mM, und Natriumchlorid, 0,01 M, bei einem pH von 6,5 umfaßt. Das Natriumgluconat hat einen Schutzeffekt, der sich günstig auf die biologische Aktivität des Thrombins auswirkt.
Nach Adsorption des Thrombins auf der Säule wird diese im Natriumgluconatmedium, 150 mM, NaCl 0,04 M bei einem pH von 6,5 gewaschen.
Die Elutionsbedingungen des Thrombins sind so eingestellt, daß ein schmaler chromatographischer Peak erhalten wird und insbesondere durch Erhöhung der Natriumchloridkonzentration auf 0,2 M und des Gluconats auf 150 mM
Die Verwendung eines Mileus auf der Grundlage von Natriumgluconat stellt außerdem den Vorteil bereit, daß ein Dialyseschritt vermieden wird, der unvermeidlich ist, wenn klassische Phosphatpuffer verwendet werden.
e) Ausgehend von der Elution von der chromatographischen Säule wird das Thrombin in Lösung in dem Gluconatpuffer mit einer Mischung aus Stabilisatoren versetzt, umfassend 2 g/l Albumin, 5 g/l Saccharose und 60 mM CaCl&sub2;, wobei die Rolle dieser Stabilisatoren insbesondere im folgenden Schritt wichtig ist.
f) Die Thrombin-Präparation wird danach, vorzugsweise durch Ultrafiltration, konzentriert, auf Volumen eingestellt, die an die schließliche therapeutische Verwendung angepaßt sind und lyophilisiert.
Die Gegenwart von Albumin als Stabilisator hat sich im Verlauf des Konzentrationsschritts als unersetzlich erwiesen.
Man hat festgestellt, daß die Saccharose, die allen anderen Zuckern und Aminsäuren vorzuziehen ist, die getestet wurden, eine sehr deutlich stabilisierende Rolle auf das Konzentrat im flüssigen Zustand spielt, und zwar im Schritt der Einstellung, der sehr lang dauern kann, wenn man von einer Lösung mit einem Volumen von 1 bis 5 ml ausgeht.
Die Gegenwart von CaCl&sub2; und Saccharose hat sich als essentiell als Stabilisator im Verlauf der Lyophilisierung erwiesen.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung stellt verschiedene Besonderheiten bereit, die es eindeutig von anderen beschriebenen Verfahren unterscheiden (insbesondere von Lorne et al. und Fischer et al., wie oben zitiert) und die ein Endprodukt bereitstellen, das einen deutlichen Vorteil an Reinheit und eine sehr hohe spezifische Aktivität aufweist.
Zusammengefaßt sind die Eigenschaften die folgenden:
- Verwendung einer PPSB-Fraktion, die vorher gewaschen und von Fibrinogen und Inhibitoren befreit wurde;
- Die Wahl von Bedingungen für die Verkalkung: Konzentration des Calciumchlorids und der zwei aufeinanderfolgenden Inkubationstemperaturen;
- Die virale Inaktivierungsbehandlung durch ein Lösungsmittel-Detergenz, bewirkt zwischen dem Schritt der Aktivierung und der Reinigung des Thrombins und nicht direkt am PPSB, wie dies aus Gründen der Bearbeitungssicherheit wünschenswert erscheint, was jedoch in diesem Stadium die Phospholipide denaturiert, die für die Aktivierungsreaktion des Thrombins notwendig sind;
- Die Chromatographie auf einem starken Kationenaustauschgel und in diesem Schritt Verwendung von einem spezifischen Schutzmileu auf der Basis von Natriumgluconat;
- Die Wahl einer Mischung von Stabilisatoren des fertigen Produkts, die seine Aktivität während der drei letzten Behandlungen schützen, nämlich der Konzentration Verteilung und Lyophilisierung.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Herstelungsverfahren eines humanen Thrombinkonzentrats anzugeben, das für die therapeutische Verwendung geeignet ist, wie angegeben in Anspruch 1, umfassend eine Reinigung auf dem chromatographischen Weg einer PPSB-Fraktion von vorher durch Zugabe von CaCl&sub2; verkalktem Plasma, umfassend insbesondere eine Behandlung einer PPSB- Fraktion, beginnend mit einer Eliminierung von Fibrinogen und Inhibitoren der Aktivierung des Thrombins durch Waschen mit NaCl und anschließend eine chromatographische Reinigung auf einem starken Kationenaustauschgel in Gegenwart von Natriumgluconat.
Gemäß einem anderen Merkmal der Erfindung umfaßt das Verfahren eine Inaktivierungsbehandlung für Viren durch ein Lösungsmittel-Detergenz, die nach der Verkalkung der gewaschenen PPSB-Fraktion und vor der Reinigung des aktivierten Thrombins durch Chromatographie durchgeführt wird.
Gemäß einem anderen Merkmal der Erfindung umfaßt das Verfahren die Zugabe einer Mischung von Stabilisatoren, umfassend Albumin, Saccharose und Calciumchlorid, zu der aus der Chromatographie eluierten Thrombinlösung.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist insbesondere bedeutsam, da es für sehr große Ausgangsmaterialvolumen geeignet ist und so ermöglicht, daß in einer einzigen Charge bis zu 16 Millionen Einheiten NIH Thrombin hergestellt werden (d.h. 150 mal mehr als durch die anderen beschriebenen Verfahren, wie z.B. das in der Patentanmeldung EP 0378798 beschriebene Verfahren), wobei dies möglich ist, ohne in die Reinigung anderer Blutderivate einzugreifen, die eine größere ökonomische Bedeutung aufweisen (wie z.B. den Blutkoagulationsfaktoren, dem Albumin, den Immunoglobulinen usw.).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Thrombinkonzentrat bereit, erhalten durch das beschriebene Verfahren, das eine koagulierende Aktivität mindestens von 500 U NIH/ml und eine spezifische Aktivität von mindestens 1000 U NIH/mg Protein bereitstellt.
Seine erhöhte Konzentration und seine spezifische Aktivität unterscheiden dieses Konzentrat von anderen Produkten, die nach einem anderen Verfahren hergestellt wurden (Lorne et al., oben zitiert) und die nur eine Aktivität von 11 bis 20 NIH/ml erreichen.
Außerdem ist die koagulierende Aktivität des lyophilisierten Konzentrats im Verlauf der Zeit außergewöhnlich stabil.
Das Thrombinkonzentrat ist daher ausgezeichnet für eine therapeutische Verwendung beim Menschen geeignet.
Es kann, so wie es ist, als lokales hämostatisches Mittel verwendet werden.
Es kann auch verwendet werden, um einen biologischen Kleber zu bilden, indem es einem Fibrinogenkonzentrat zugefügt wird, das geringe Mengen des Faktors XIII und Fibronektin umfaßt, wie beschrieben in der Patentanmeldung EP 0305243 der Anmelderin. Die Bildungsweise des biologischen Klebers entspricht der letzten Phase der Koagulation, d.h. der Bildung eines Fibrinnetzes. Das Thrombin spaltet das Fibrinogenmolekül in Fibrin-Monomere. Es aktiviert den Faktor XIII in Gegenwart von Calciumionen, der in seiner aktiven Form das lösliche Fibrin in einem unlöslichen, festen und nicht brüchigen Blutgerinsel stabilisiert. Die hämostatische Wirksamkeit des Produkts erlaubt so die Begrenzung von postoperativen Blutungen und Blutungen während Operationen und die Verstärkung einer lokalen Hämostase bei Patienten, die ein konstitutionelles oder erworbenes Koagulationsdefizit aufweisen (insbesondere bei Kranken unter Antikoagulantien).
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung ohne ihren Umfang zu begrenzen.

BEISPIEL 1

a) - Herstellung der PPSB-Fraktion

Das Ausgangsmaterial ist ein Überstand eines Cryopräzipitats von Plasma, das man durch Auftauen und Zentrifugation bei 0 bis 3ºC erhält.
1000 bis 1500 Liter des Überstands werden auf DEAE-Sephadex A50 in Gegenwart von physiologischem Serum im Verhältnis von 1,5 g des Harzes zum Liter des Überstands adsorbiert. Nach einem Waschen mit 0,23 M NaCl in 0,01 M Citratpuffer bei pH 7 wird das PPSB durch NaCl, 0,5 Min demselben Puffer eluiert, auf 40 g/l Proteine konzentriert und mit Lysin 2,5 g/l versetzt. Daraufhin wird es auf eine Osmolarität von ungefähr 290 mosm/l bei pH 7 eingestellt.
Das so hergestellte PPSB enthält außer dem Prothrombin in einer Konzentration von ungefähr 50 U/ml, die Koagulationsfaktoren X, IX und VII in jeweiligen Konzentrationen von 45 U/ml, 45 U/ml und 5 U/ml. Es enthält außerdem 5 bis 6 U/ml der Faktoren Vc und VIIIc wie auch die Phospholipide, deren Gegenwart durch die Erzeugungszeit des Thrombins unter Beweis gestellt wird (oder TGT 50).
Das Waschen durch NaCl ermöglicht die Eliminierung von Fibrinogen wie auch von bestimmten Inhibitoren, die die Verkalkungsreaktion hemmen, wenn sie im PPSB vorliegen.

b) - Verkalkungsbedingungen

9 bis 11 Liter PPSB, das frisch hergestellt wurde, oder nach einem Auftauen, werden steril filtriert und dann mit 7 ml 1M CaCl&sub2; pro 1 PPSB versetzt, unter Rühren in einem sterilen, nicht oxidierbaren Gefäß mit 30 l und werden für 2 Stunden bei 37ºC in ein Wasserbad (bainmane) gestellt. Nach diesem ersten Schritt erhält man ungefähr 300 U NIH Thrombin/ml.
Die Temperatur wird danach auf 24ºC abgekühlt und die Mischung wird bei dieser Temperatur während weiterer 16 Stunden gehalten. Die erhaltene Thrombinmenge am Schluß der Behandlung beträgt 700 bis 1000 Einheiten NIH/ml von PPSB.
Die spezifische Aktivität des Thrombins beträgt bei diesem Schritt 20 bis 40 U NIH/ml der Proteine.

c) - Virale Inaktivierung

Die Inaktivierung von eventuellen viralen Verunreinigungen wird durch Zugabe von TNBP mit 0,3 % und Tween 80 mit 1 % endgültiger Konzentration bei einer Temperatur von 24ºC für mindestens 6 Stunden bewirkt. In der Praxis läßt man die Mischung eine zusätzliche Nacht in der TnBp/Tween 80 Umgebung stehen.
Man konnte keinerlei Verlust der Thrombinaktivität während dieses Schritts bemerken. Die spezifische Aktivität des Thrombins am Abschluß der Behandlung mit Tnbpitween 80 beträgt 20 bis 40 U NIH/mg der Proteine.
Die Mischung wird anschließend in Plastikbehältern in Aliquots von 1 bis 3 Litern bei -30ºC eingefroren.

d) - Reinigung des Thrombins

Es ist das Ziel dieses Schritts, das Thrombin von der Reaktionsmischung, die Tnbpitween 80, die aktivierten Faktoren der Koagulation und alle anderen Proteine des PPSB enthält, die teilweise durch die Serinproteasen abgebaut werden können, abzutrennen.
Man führt eine Chromatographie auf einem starken Kationenaustauschgel durch: S-Sepharose FF (Pharmacia), bei dem es sich um ein festes Gel handelt, das aus einer Agarosematrix besteht, substituiert durch CH&sub2;-SO&sub3;-Gruppen.
Das Thrombin, das wenig stabil ist, wird während der Durchführung der Chromatographie durch Verwendung von Natriumgluconat bei einem pH von 6,5 unter den folgenden Bedingungen geschützt: Nach dem Auftauen werden 10 bis 12 l Ppsbithrombin/Reste des Lösungsmittels-Detergents auf einen pH von 6,5 eingestellt, daraufhin auf eine Säule mit ungefähr 16 1 S-Sepharose FF injiziert, equilibriert in einem Mileu, bestehend aus 40 mM Natriumgluconat und 0,01 M NaCl bei einem pH von 6,5. Der Großteil der Proteine des PPSB wie auch das TNBP und das Tweenor 80 werden auf der Säule nicht zurückgehalten. Das Gel wird anschließend einem Waschen im Natriumgluconatmileu, 150 mM, NaCl 0,04 M bei einem pH von 6,5 unterzogen. Das Thrombin wird anschließend durch Zugabe von 0,2 M NaCl im selben Mileu eluiert.
Nach seiner Elution von der Säule wird das Thrombin in Gegenwart der folgenden Stabillisatoren aufgenommen: 2 g/l Albumin, 5 g/l Saccharose und 60 mM CaCl&sub2; Das Produkt wird anschließend durch Ultrafiltration konzentriert und auf eine Albuminkonzentration von 5 g/l und einen pH von 6,3 bis 6,5 eingestellt.
Der Gesamtertrag dieser zwei Stufen, nämlich der Chromatographie und der Konzentration, liegt im Bereich von 90 %.
Nach einer Sterilfiration wird das Produkt in Volumen von 5 ml, 2 ml, 1 ml oder 0,5 ml verteilt und lyophilisiert, abhängig von seiner endgültigen Verwendung in Form von biologischem Kleber. Die Gegenwart der Stabilisatoren ist notwendig, um die enzymatische Aktivität des Thrombins im Verlauf dieser Behandlungen aufrecht zu erhalten, wie es die Tabellen I und II zeigen. TABELLE I Stabilität des Eluats während der Verteilung TABELLE II Stabilität der Präparation in flüssiger Form

BEISPIEL 2

Eigenschaften des Produkts

Das Thrombinkonzentrat stellt sich in seiner lyophilisierten Form dar. Nach Rekonstituierung in destilliertem Wasser wird es nach den folgenden Methoden überprüft:

a) - Koagulierende Aktivität

Die Aktivität des nativen α-Thrombins wird durch seine koagulierende Aktivität auf Fibrinogen gemessen. Sie wird in NIH-Einheiten ausgedrückt (National Institute of Health) im Verhältnis zu einem Referenzstandard: Thrombin von NIH, Charge J.
Nach Rekonstituierung in destilliertem Wasser werden 5 Verdünnungen von 1/300 bis 1/900 in Owren Koller-Puffer hergestellt (Hämostase: Untersuchungsverfahren und diagnostische Praxis Ed. L'expansion scientifique KJ. CAEN: H.J. Larrieu. M. Samama), der 0,5 % Polyethylenglycol 6000 enthält. Die Messung der Koagulationszeit wird auf einer KC 10 Amelung-Vorrichtung (Baxter) durchgeführt. In einer Reihe von Bechern führt man 200 µl der Verdünnung ein (Standard oder zu testende Probe). Nach einer Minute bei 37ºC führt man 200 µl Fibrinogen mit 1 gil ein, unter Auslösung des Chronometers. Auf bilogarithmischem Papier weist man den rechten Standard nach. Man hält die erhaltenen Zeiten für die zu testenden Proben fest und leitet davon ihre Menge der U NIH/ml-Einheiten auf der Grafik ab.

b) - Amidolytische Aktivität

Die amidolytische Aktivität des Thrombins wird auf dem Chromothrombinsubstrat von STAGO nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Sie ist in nkat/ml angegeben. Die Beziehung zwischen den Nanokatalen und den NIH-Einheiten ist 1 U NIH=2nkat.
Die auf einem chromogenen Substrat gefundene Aktivität entspricht einer Aktivität des nativen α-Thrombins wie auch denjenigen der Proteolysederivate: β- und γ- Thrombine.

c) - Menge der Proteine

Die Proteinmenge wird durch das Biuret-Verfahren bestimmt.

d) - Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel

Die Elektrophoresen werden auf dem PHAST SYSTEM(M) der Pharmacia auf Phastgel 10/15 in einem SDS-Medium durchgeführt.
e) - Eigenschaften des biologischen Klebers, gebildet durch die Koagulation des Fibrinogenkonzentrats, des Faktors XIII und des Fibronectins in Gegenwart von Thrombin (Europäisches Patent 0 305 243).
Die Eigenschaften des biologischen Klebers, gebildet in Gegenwart von Thrombin, wurden durch die folgenden Parameter bestimmt: Geschwindigkeit des Dickwerdens (Sekunden), adhäsive Wirkung an Mäusen (g/cm²). Die Zeit der Umstellung (déplacement) 50 (Sekunden) und die Gesamt-Umstellung (déplacement) (radial) wurden durch ein Rheometer bestimmt.

Eigenschaften des Thrombinkonzentrats

Die nach den oben beschriebenen Verfahren gemessenen Eigenschaften sind in der folgenden Tabelle dargestellt. TABELLE III Eigenschaften der Konzentrate von menschlichem Thrombin
Die koagulierende Aktivität im Konzentrat liegt im Bereich von 550 U NIH/ml.
Die amidolytische Aktivität liegt im gleichen Bereich bei 600 bis 700 U NIH/ml, was die Abwesenheit einer erhöhten Menge der degradierten Formen, β- und γ-Thrombinen, anzeigt.
Die Reinheit des Produkts wird durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel überprüft. In einem SDS-Medium weist man außer der Bande, die dem Albumin mit einer Molekularmasse von 67000 entspricht, eine einzigartige Hauptbande nach, die dem α-Thrombin mit einer Molekularmasse von 36000 entspricht. Nach Reduktion durch β-Mercaptoethanol erscheint eine korrespondierende Bande für die schwere Kette des α-Thrombins mit einer weniger großen Molekularmasse. Die leichte Kette mit ungefähr 4000 Daltons ist aus der Platte gewandert.
Die Stabilität des Produkts nach der Rekonstitution wurde ebenfalls getestet (Tabelle IV). Das Thrombin ist mindestens 24 Stunden im flüssigen Zustand stabil. Es ist auch im eingefrorenen Zustand (Tabelle V), wie auch in lyophilisierter Form (Tabelle VI) stabil. Diese Stabilität wird durch das Gluconat-Saccharose-Calciumchlorid-Albumin-Medium bei einem pH von 6,5 sichergestellt. TABELLE IV Stabilität des Thrombins nach Rekonstitution TABELLE V Stabilität des Thrombins in gefrorener Form TABELLE VI Stabilität des Thrombins in lyophilisierter Form bei 4ºC
Die Stabilität des lyophilisierten Thrombins wurde auch in einem Test einer "beschleunigten Alterung" gemessen (Tabelle VII). TABELLE VII Stabilität des Thrombins in lyophilisierter Form (5 ml) bei 45ºC
Die rheologischen Eigenschaften des biologischen Klebers, gegenwärtig erhalten von humanem Thrombin oder von bovinem Thrombin wurden verglichen, folgend den herkömmlichen Kontroll-Protokollen.
Die Untersuchung wurde an dem selben Konzentrat des verwendeten Fibrinogens in einer Mischung mit einem bovinem Thrombin oder menschlichem Thrombin (06510010) durchgeführt. Die verwendeten Protokolle für jeden Versuch sind vollständig identisch. Das Material ist ein Rheometer CARRIMED CSL 100 mit auferlegter Beschränkung ( contrainte imposée).

a) - Verwendung in Kriecheinflußweise.

Messuna der Geschwindigkeit des Festwerdens

Die Zeit der Verlagerung 50, t1 und t2 (notwendige Zeiten, um 50 % der Gesamtverlagerung zu erhalten) sind:
t2 (bovines Thrombin): 1,8 s.
t1 (humanes Thrombin): 0,77 s.
Kein signifikanter Unterschied.

Überprüfung der Elastizität

Man bemerkt eine augenblickliche identische Elastizität für die beiden Produkte.

b) - Verwendung in Oscillationsmodus

Man bemerkt eine Reißschwelle bei ungefähr 2500 N/m² für die beiden Produkte.
Die elastischen Module G' der beiden Kleber zeigen eine ähnliche Entwicklung mit der Zeit.
Das elastische Modul G' als Funktion der Frequenz ist vergleichbar für die beiden Produkte.
Diese Ergebnisse bestätigen die bei der Verwendung des Produkts gemachten Beobachtungen im Hinblick auf die Blutgerinsel, die Exsudation und die Geschwindigkeit des Festwerdens.
Die Gesamtheit der Resultate erlaubt den Schluß, daß die rheologischen Eigenschaften und die mechanischen Eigenschaften des in Gegenwart von menschlichem Thrombin erhaltenen Klebers denen entsprechen, die in Gegenwart von bovinem Thrombin erhalten wurden, der der gegenwärtige Bestandteil der biologischen Kleber ist, die zur Zeit verwendet werden.

BEISPIEL 3

Anpassen des Verfahrens an einen großen Maßstab

Das Verfahren, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde auf mehrere Chargen von PPSB angewendet, die zwischen 10 und 15 Litern lagen, mit derselben Wirksamkeit wie in Tabelle VIII angezeigt.
Der letzte Schritt der Chromatographie und die Konzentration wird mit einem Ertrag zwischen 89 und 100 % durchgeführt.
Die Gesamtheit des Verfahrens ermöglicht so die Herstellung von standardisierten Chargen, die mehr als 10 Millionen NIH-Einheiten Thrombin enthalten. TABELLE VIII Koagulierende Aktivität des Thrombins nach Verkalkung und viraler Inaktivierung

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats aus menschlichem Thrombin mit hoher Aktivität zur therapeutischen Verwendung, ausgehend von einer Plasmafraktion, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Abfolge der folgenden sechs Schritte besteht:

a) Adsorption der PPSB-Fraktion eines Uberstands von Tieftemperatur-ausgefälltem Plasma auf einem Gel auf Basis von Dextran, das mit DEAE-Gruppen gepfropft ist, und Waschen dieser Fraktion mit Natriumchlorid in Citratpuffer, daraufhin Elution des PPSB durch Erhöhung der Konzentration des Natriumchlorids;

b) Aktivierung des Prothrombins zu Thrombin durch Verkalkung des PPSB durch Zugabe von CaCl&sub2; zu einer endgültigen Konzentration von 5 bis 10 mM und durch eine kurze Inkubation bei 37ºC, daraufhin eine Inkubation über eine längere Zeitspanne bei einer tieferen Temperatur;

c) eine Behandlung zur viralen Inaktivierung durch ein Lösungsmittel-Detergenz des verkalkten PPSB;

d) Reinigung des Thrombins durch Chromatographie auf einem starken Kationenaustauschgel in einer Umgebung, die Natriumgluconat enthält, Waschen und Elution durch Zugabe von Natriumchlorid und Natriumgluconat;

e) Stabilisierung des eluierten Thrombins durch Zugabe einer Mischung aus Albumin, Saccharose und CaCl&sub2;;

f) Konzentrierung der Thrombinlösung und ihre Verteilung auf an seine schließliche therapeutische Verwendung angepaßte Volumen und Lyophilisierung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Waschschritt in Schritt a mit 0,2 bis 0,23 M Natriumchlorid in Citratpuffer realisiert wird und daß die Elution von PPSB durch Erhöhung der Natriumchlorid-Konzentration auf 0,5 M durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Inkubation mit CaCl&sub2; in Schritt b für 2 Stunden bei 37ºC bewirkt wird und daß die zweite für mindestens 16 Stunden bei 24ºC durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie in Schritt d auf einem Agarosegel durchgeführt wird, das mit CH&sub2;-SO&sub3;- Gruppen substituiert ist, in einer Umgebung, die Natriumgluconat in einer Konzentration von 40 mM und Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,01 M bei einem pH von 6,5 enthält.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Thrombin durch Erhöhung der Natriumchlorid-Konzentration auf 0,2 M durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das eluierte Thrombin in Schritt e durch Zugabe einer Mischung stabilisiert wird, die 2 g/l Albumin, 5 g/l Saccharose und 60 mM CaCl&sub2; enthält.