DE69216356T2

DE69216356T2 - Diagnosetestsatz und spezifischer Bindungstest unter Verwendung eines Peroxidase Markierungsmittels und eines Signalmodulators

Info

Publication number: DE69216356T2
Application number: DE69216356T
Authority: DE
Inventors: Bradley Porter Boyer; Paul Bernard Contestable; Thomas Robert Kissel; Brian Anthony Snyder
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1991-10-08
Filing date: 1992-10-03
Publication date: 1997-07-17
Anticipated expiration: 2012-10-04
Also published as: CA2077015A1; DE69216356D1; JP2515954B2; EP0537826A1; US5460946A; JPH05219990A; AU2114992A; FI924546L; FI924546A0; EP0537826B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen diagnostischen Testsatz mit einer Verbindung, die das Signal moduliert, das sich aus der Einwirkung einer Peroxidase auf ihr Substrat ergibt. Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden gerichtet, wobei unter anderen Reagentien die modulierende Verbindung verwendet wird.
Es besteht ein dauerndes Bedürfnis in der medizinischen Praxis, der Forschung und bei diagnostischen Verfahren nach raschen, genauen und qualitativen oder quantitativen Bestimmungen von biologischen Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten in geringen Konzentrationen vorliegen. Beispielsweise muß das Vorhandensein von Medikamenten oder Drogen, Narkotika, Hormonen, Steroiden, Polypeptiden, Prostaglandinen oder infektiösen Organismen im Blut, Urin, Speichel, in vaginalen Abscheidungen, im Zahnbelag, in Zahnfleischtaschenflüssigkeit und in anderen biologischen Proben in genauer und rascher Weise zum Zwecke einer richtigen Diagnose oder Behandlung festgestellt werden.
Um solche Bestimmungen durchführen zu können, sind verschiedene Methoden zur Isolierung und Identifizierung von biologischen Substanzen vorgeschlagen worden, bei denen spezifische Bindungsreaktionen zwischen der zu bestimmenden Substanz (hier als ein "spezifischer Bindungsligand" bezeichnet) und einer Verbindung durchgeführt werden müssen, die mit der Substanz (gelegentlich als "Rezeptor" für den Liganden bezeichnet) reaktiv ist.
Der zwischen dem Liganden und dem Rezeptor gebildete Komplex kann nach einer Vielzahl von bekannten Methoden bestimmt werden. Die am üblichsten angewandte Methode verwendet einen ein Signal erzeugenden Rest eines gewissen Typs, der entweder bereits an eine der Komponenten des Komplexes gebunden ist oder zum Teil des Komplexes durch eine weitere Reaktion wird. Bei der Erzeugung eines Komplexes aus Biotin mit Avidin beispielsweise kann der Komplex bestimmt werden unter Verwendung einer Markierung an entweder dem Avidin- oder Biotinmolekül. Eine solche Markierung kann ein Radioisotop sein oder ein Enzym, das mit dem Avidin oder Biotin konjugiert ist. Alternativ kann der Avidin-Biotin-Komplex bestimmt werden durch weitere Umsetzung mit einem markierten Molekül, das spezifisch ist für einen oder beide Teile des Komplexes. Es ist allgemein bekannt, in gleicher Weise mit Antigenen und ihren entsprechenden Antikörpern zu verfahren.
Bevorzugte Markierungen im Falle spezifischer Bindungsreaktionen sind eindeutig Enzyme, da bei ihrer Verwendung die Handhabungs- und Abfallbeseitigungsprobleme, die mit der Verwendung von Radioisotopen verbunden sind, vermieden werden können. Viele Enzyme sind dafür bekannt, daß sie diesbezüglich geeignet sind, wobei Peroxidasen die üblichsten sind.
Im Falle von diagnostischen Tests, die bestimmt sind für eine rasche und leichte Handhabung durch mäßiges Training in einer Arztpraxis oder Klink, wird der spezifische Bindungsligand von Interesse (wie zum Beispiel ein Antigen von einem infektiösen Mittel) oftmals bestimmt unter Anwendung colorimetrischer oder chemilumineszierender Signale, die bei der Reaktion der Enzymmarkierung mit ihrem entsprechenden Substrat anfallen. Es besteht ein Bedürfnis, das Signal schnell und intensiv zu erzeugen, wenn der Ligand vorhanden ist.
Es besteht jedoch ferner ein Bedürfnis danach, daß das Signal in einem definierten Bereich einer Testzone in einer Testvorrichtung erzeugt wird, so daß ein angrenzender oder umgebender Bereich als ein Hintergrundvergleich verwendet werden kann. In solchen Fällen sollte die Erzeugung des Signals moduliert oder nach einer bestimmten Zeitdauer unterbrochen werden, um eine eindeutige Unterscheidung zwischen Testzone und Hintergrundzone zu erzeugen. Ein Fortschritt nach dem Stande der Technik im Falle der Bestimmung von Mikroorganismen, die bei periodontalen Erkrankungen auftreten, wird in dier EP-A- 0 439 210 beschrieben und beansprucht. Diese Patentschrift beschreibt die gleichzeitige Bestimmung und Differenzierung von diesen Mikroorganismen und insbesondere von Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis (im Stande der Technik früher bekannt als Bacteroides gingivalis) und Prevotella intermedia (früher bekannt als Bacteroides intermedius) im Rahmen einer immunometrischen Bestimmungsmethode (auch bekannt als "Sandwich"-Methode), unter Verwendung von in Wasser unlöslichen Reagentien in definierten Bereichen einer mikroporösen Filtrationsmembran. Die gleichzeitige Bestimmung und Differenzierung von diesen Mikroorganismen hat eine beträchtliche klinische wie auch kommerzielle Bedeutung.
Das Bestimmungsverfahren, das in der EP-A-0 439 210 beschrieben wird, wird unter Verwendung von Peroxidase als Markierung an Antikörpern durchgeführt, die spezifisch für das bakterielle Antigen sind. Es ist allgemein bekannt, in solchen Testverfahren eine abgepufferte Lösung von Natriumazid zu verwenden, um die Erzeugung eines colorimetrischen Signals zu unterbrechen, wenn Peroxidase mit einem geeigneten Substrat reagiert. In den meisten Fällen wirkt eine geringe Konzentration (zum Beispiel 0,1 Gew.-%) an Natriumazid zufriedenstellend.
Es wurde jedoch festgestellt, daß, wenn Natriumazid bei einem hohen pH-Wert verwendet wird, die Erzeugung des colorimetrischen Signals nicht vollständig unterbrochen wird, und zwar insbesondere dann, wenn das Signal auf einer porösen Matrix bestimmt werden soll, in der Reagentien leicht wandern können. Mit anderen Worten, die Erzeugung des colorimetrischen Signals wird durch das Azid abgeschwächt, jedoch nicht gestoppt. Dies bedeutet, daß das spezifishe Signal und der umgebende Bereich auf der porösen Matrix fortfahren, das Signal zu entwickeln. Es ist erwünscht, dies zu verhindern.
Es wurde in Betracht gezogen, größere Konzentrationen an Natriumazid einzusetzen, um das Problem zu lösen. Dies war jedoch nicht akzeptabel, da Natriumazid ein allgemein bekanntes toxisches Material ist und auch explosive Eigenschaften aufweist.
Das erwähnte Problem wurde gelöst unter Verwendung eines diagnostischen Testsatzes mit einer in Wasser löslichen, mit Peroxidase markierten spezifischen Bindungsspezies,
wobei der Testsatz dadurch gekennzeichnet ist, daß er ferner separat abgepackt aufweist eine abgepufferte Zusammensetzung mit mindestens 0,05 Gew.-% einer Verbindung mit der Struktur
R-CO-NH-R'
oder einem äquivalenten Salz hiervon, wobei R für Phenyl, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring steht, und R' eine Hydroxygruppe ist.
Uberdies weist ein Verfahren zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden auf:
A. Die Umsetzung eines spezifischen Bindungsliganden von einer biologischen Probe mit einem in Wasser löslichen Rezeptor, der für den Liganden spezifisch ist, wobei der Rezeptor mit Peroxidase markiert ist,
unter Bildung eines mit Peroxidase markierten spezifischen Bindungskomplexes zwischen dem Liganden und dem Rezeptor,
B. das Unlöslichmachen des spezifischen Bindungsliganden vor, gleichzeitig mit oder nach Durchführung der Stufe A., um einen unlöslich gemachten spezifischen Bindungskornplex zu erzeugen,
C. das Kontaktieren des unlöslich gemachten Komplexes mit einer Zusammensetzung für die Erzeugung eines colorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals als Folge von Peroxidase im Komplex, und
D. die Modulierung und Bestimmung des Grades des Signals durch Kontaktieren des unlöslich gemachten Komplexes mit einer Zusammensetzung, die mindestens 0,05 Gew.-% einer Verbindung mit der Struktur
R-CO-NH-R'
oder eines äquivalenten Salzes hiervon enthält, wobei R steht für Phenyl, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring, und worin R' für eine Hydroxygruppe steht.
Die Erfindung liefert ein wirksames Mittel für die Modulierung oder Unterbrechung der Produktion eines colorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals, das durch enzymatische Reaktion im Rahmen einer spezifischen Bindungs-Bestimmungsmethode erzeugt wird. Diese Wirksamkeit tritt insbesondere dann auf, wenn Peroxidase das in Betracht zu ziehende Enzym ist. Im Falle der Durchführung von Bestimmungsverfahren auf einer mikroporösen Membran wird das colorimetrische Signal von Reagentien auf oder über der Membran oder von Reagentien, die zurück durch die Membran fließen, faktisch eliminiert und die Bestimmungsverfahren können halbquantitativ angewandt werden.
Diese Vorteile werden erreicht durch Kontaktieren des unlöslich gemachten spezifischen Bindungskomplexes mit einer Peroxidasemarkierung hierin mit einer Hydroxaminsäure oder Acylhydrazin, wie hier definiert. Je nach der Konzentration an verwendeter Säure kann die Produktion des Signals von der enzymatischen Reaktion mit ihrem Substrat vollständig unterbrochen oder moduliert werden, um die Reaktionsgeschwindigkeit zu vermindern.
Die Verbindungen, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, sind Hydroxaminsäuren, die durch die folgende Struktur wiedergegeben werden:
R-CO-NH-R'
oder ein äquivalentes Salz hiervon, wobei R' für eine Hydroxygruppe steht. Diese Verbindungen können ferner in der Form von Hydroximinsäuren vorliegen [d.h. R-C(=NOH)-OH] und können in zwei isomeren Formen existieren.
R steht für Phenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Isopropyl und Butyl oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring, zum Beispiel Cyclopentyl und Cyclohexyl. Bevorzugte Verbindungen sind Benzohydroxaminsäure und äquivalente Salze.
Im Falle sämtlicher hier beschriebenen Säuren gehören zu äquivalenten Salzen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze.
Die oben definierten Hydroxaminsäuren lassen sich rasch herstellen unter Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Anwendung bekannter chemischer synthetischer Methoden, wie der Reaktion von Hydroxylamin mit Acylhalogeniden.
Die hier beschriebene Verbindung wird in einer abgepufferten Lösung in einer Konzentration von mindestens 0,05 %, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, bereitgestellt. Im allgemeinen liegt die Menge der Verbindung im Bereich von 0,05 bis 5 Gew.-%, wobei 0,05 bis 1 Gew.-% bevorzugte Mengen sind. Falls erwünscht, kann eine Mischung von Hydroxaminsäuren oder Salzen verwendet werden.
Im allgemeinen wird die hier beschriebene Hydroxaminsäure auf einen pH-Wert von 6 bis 11 abgepuffert, unter Verwendung von einem oder mehreren geeigneten Puffersubstanzen, wozu gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt, Phosphat, 3-(4-Morpholino)propansulfonsäure, 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure, Glycin und andere Verbindungen, die sich für den Fachmann leicht ergeben.
Zu Zusätzen, die gegebenenfalls in die abgepufferte Zusammensetzung der Verbindung eingeführt werden können, gehören anorganische Salze, oberflächenaktive Stoffe und polymere Materialien.
Die oben beschriebene abgepufferte Zusammensetzung wird im allgemeinen als Teil eines diagnostischen Testsatzes bereitgestellt, der eine Anzahl von separat abgepackten Reagentien, Zusammensetzungen und Ausrüstungsgegenständen aufweist, die für die Durchführung eines bestimmten Bestimmungsverfahrens erforderlich sind. Die abgepufferte Zusammensetzung kann jedoch für sich allein bereitgestellt werden oder zum Zeitpunkt des Bestimmungsverfahrens hergestellt werden. Zu typischen diagnostischen Testsatzkomponenten gehören jedoch eine in Wasser unlösliche, mit Peroxidase markierte spezifische Bindungsspezies, Waschlösungen, Extraktionszusammensetzungen, Signale liefernde Zusammensetzungen, Wegwerf-Testgeräte oder Vorrichtungen und anderes Zubehör, das sich für den auf dem Gebiet tätigen Fachmann von selbst ergibt.
Die spezifische Bindungsspezies in dem Testsatz kann ein beliebiges Molekül biologischen oder chemischen Ursprungs sein, das spezifisch mit einem Liganden von Interesse reagiert. Beispielsweise kann die Spezies aus Avidin bestehen oder einem Derivat hiervon, Biotin oder einem Derivat hiervon, einem Antikörper, einem antigenen Material, einem Hapten, Zucker, Lectin oder einer anderen chemischen oder biologischen Verbindung, die einen Rezeptor hat, wobei dieser die aus dem Stande der Technik bekannte Bedeutung hat. Im Kontext der Erfindung ist Nucleinsäure ebenso als spezifische Bindungsspezies in Betracht zu ziehen, die "Komplexe bildet" (oder hybridisiert) mit einer komplementären Nucleinsäure, die in diesem Falle als ein Ligand betrachtet wird.
Vorzugsweise ist die in Wasser unlösliche, mit Peroxidase markierte Spezies, die zu dem Testsatz gehört, ein Antikörper. Vorzugsweise ist die Spezies mit einer Peroxidase von beliebigem tierischen, pflanzlichen, fungalen oder bakteriellen Ursprung markiert. Verfahren zur Anbindung von Peroxidase an spezifische Bindungsspezies sind ebenfalls allgemein bekannt (einschließlich beispielsweise aus Yoshitake und Mitarbeiter, Eur. Biochem., 101, Seiten 395-399, 1979).
Das Verfahren dieser Erfindung kann dazu verwendet werden, um einen spezifischen Bindungsliganden von Interesse zu bestimmen. Zu solchen Liganden gehören Oligonucleotide, Nucleinsäure, Proteine, Kohlehydrate, Lipopolysaccharide, Peptide, Polypeptide, Polysaccharide, Glykolipide, Glykoproteine und beliebige Komponenten von diesen Materialien. Solche Liganden können in jeder beliebigen menschlichen oder tierischen biologischen Flüssigkeit oder Probe bestimmt werden, einschließlich vollständigem Blut, Serum, Plasma, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, spinaler Flüssigkeit, Samenflüssigkeit, vaginalen Abscheidungen, Sputum, Schweiß, Stuhlproben, Gewebeproben, Zahnbelag, Speichel, Zahnfleischtaschenflüssigkeit und Sperma. Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Bestimmung von Mikroorganismen, die in Verbindung mit periodontalen Krankheiten vorkommen und sich im Speichel, im Zahnbelag, in Zahnfleischtaschenflüssigkeit und anderen oralen Flüssigkeiten oder Proben finden.
Insbesondere werden die Mikroorganismen Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prophyromonas gingivalis sowie Prevotella intermedia bestimmt, und zwar entweder einzeln oder gemeinsam, unter Anwendung der vorliegenden Erfindung. Es können jedoch auch andere Mikroorganismen, von denen angenommen wird, daß sie mit periodontalen Krankheiten im Zusammenhang stehen, nach dieser Erfindung bestimmt oder differenziert werden. Zu solchen anderen Mikroorganismen gehören Wolinella recta, Bacteroides forsythus, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum sowie Troponema denticola.
Bevor die erste Stufe des Verfahrens dieser Erfindung in Betracht gezogen wird, ist darauf hinzuweisen, daß vor Durchführung der Stufe A eine breite Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden können, um die Probe herzustellen, zu reinigen oder um ein Antigen oder Nucleinsäure zu extrahieren.
Ein geeignetes Verfahren, das durchgeführt werden kann, um die Empfindlichkeit der Nucleinsäurebestimmung zu erhöhen, ist aus dem Stande der Technik als Polymerasekettenreaktion (PCR) bekannt. Die Details dieses Verfahrens finden sich beispielsweise in der US-A-4 683 202. Wenn eine Nucleinsäure nach diesem Verfahren verstärkt worden ist, können verschiedene Bestimmungsmaßnahmen angewandt werden, einschließlich der Verwendung einer mit Peroxidase markierten Sonde. Die Enzymmarkierung kann dann dazu verwendet werden, um ein geeignetes bestimmbares Signal zu erzeugen, das unter Anwendung der vorliegenden Erfindung moduliert werden kann.
Bei Durchführung dieser Erfindung wird der spezifische Bindungsligand in einer biologischen Probe (oder einem hiervon erhaltenen Liganden) mit einem wasserlöslichen Rezeptor, der spezifisch für den Liganden ist, umgesetzt. Der Rezeptor ist mit einer Peroxidase, wie oben angegeben, markiert. Ein spezifischer Bindungskomplex, der mit dem Enzym markiert ist, wird dadurch hergestellt. Eine Komplexbildung erfolgt in typischer Weise in Lösung, jedoch ist der Typ des Behälters oder des Gefäßes, in dem die Komplexbildung erfolgt, nicht kritisch. In einigen Fällen wird der Komplex in der rohen Probe gebildet, nach einer Lyse oder anderen Extraktionsverfahren. In anderen Fällen wird der Komplex auf einem speziellen Substrat einer Platte oder einer Membran erzeugt, wobei diese den Komplex in gewisser Weise "einfangen" können.
Ein Kontaktieren kann in einem breiten Temperaturbereich erfolgen, beispielsweise einem Bereich von unterhalb Raumtemperatur bis zu einer Temperatur nahe dem Siedepunkt von Wasser, solange die Komponentendes Komplexes nicht nachteilig beeinflußt werden. Die Reagentien werden miteinander durch Vermischen in Kontakt gebracht, derart, daß für die Reaktionskomponenten die Gelegenheit besteht, den Komplex zu bilden.
Vor, gleichzeitig mit oder nach der Stufe A wird der spezifische Bindungsligand unlöslich gemacht, wobei der anfallende Komplex ebenfalls unlöslich gemacht wird und aus der Lösung in geeigneter Weise abgetrennt werden kann. Dies bedeutet, daß die Art des Bestimmungsverfahrens von breiter Vielfalt sein kann, die über die Jahre hinaus entwickelt wurden.
Im Falle einer Ausführungsform kann ein spezifischer Bindungsligand (zum Beispiel ein extrahiertes Antigen) unlöslich gemacht werden durch direkte Adsorption oder kovalente Bindung an ein festes Material, wie zum Beispiel Polymerteilchen oder Glasteilchen, Filtrationsmembranen, cellulosische Filterpapiere, feste Polymere oder mit Harz beschichtete Filme, Glasscheiben oder an Wände von Teströhrchen, Glas- oder Polymerküvetten und andere Materialien. Derartige Bestimmungsverfahren sind ganz allgemein aus dem Stande der Technik als "direkte Bindungs"-Testverfahren bekannt, bei denen der spezifische Bindungsligand sich direkt mit dem Material verbindet und wobei mit Peroxidase markierte Rezeptormoleküle (wie zum Beispiel Antikörper) dazu verwendet werden, um mit dem unlöslich gemachten Liganden einen Komplex zu bilden. Alternativ kann der Rezeptor unmarkiert sein und ein zweiter Rezeptor, der mit Peroxidase markiert ist und spezifisch für den ersten Rezeptor ist, kann dann eingesetzt werden. Die Bestimmung des Komplexes kann nach dem Waschen nach bekannten Methoden erfolgen. Weitere Details darüber, wie direkte Bindungs-Bestimmungsmethoden durchgeführt werden, finden sich beispielsweise in der US-A-4 497 899 sowie in der EP-A-0 439 211.
Zu Beispielen von anderen geeigneten Bestimmungsverfahren gehören kompetitive Imminoassays sowie Enzym-gebundene Immunosorbent-Assays.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ist ein immunornetrischer Assay oder Sandwich-Assay, bei dem der extrahierte Ligand an unterschiedlichen epitopischen Zentren mit zwei Rezeptormolekülen umgesetzt wird, wobei eines mit Peroxidase markiert ist und wobei das zweite immobilisiert worden ist (oder immobilisiert werden kann, beispielsweise durch eine Avidin- Biotin-Komplexbildung). Zu geeigneten Materialien, auf denen ein Rezeptor immobilisiert werden kann, gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt, teilchenförmige Trägermaterialien, die gebildet werden aus Organismen, natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymeren, Glas, keramischen Materialien, Diatomeenerde oder magnetisierbaren Teilchen, Mikrotiter-Platten, Glasscheiben oder Glasröhrchen, Membranen, polymeren oder cellulosischen Papieren oder Filmen. Vorzugsweise werden teilchenförmige Materialien verwendet. Diese teilchenförmigen Materialien sind in weiter vorteilhafter Weise polymere Materialien und weisen eine sphärische Form auf und haben eine mittlere Teilchengröße (in der größten Dimension) von 0,01 bis 10 µmetern.
Die Rezeptoren, die unlöslich gemacht werden können und im Rahmen von immunometrischen Assays verwendet werden, können an in Wasser unlöslichen Materialien durch physikalische oder chemische Mittel gebunden werden, einschließlich durch Adsorption oder kovalente Reaktion mit reaktiven Gruppen auf der Oberfläche der Materialien. Eine kovalente Bindung wird im Hinblick auf eine bessere Assay-Ernpfindlichkeit bevorzugt angewandt. Aus dem Stande der Technik sind viele geeignete reaktive Gruppen bekannt, die Teil der chemischen Struktur des Trägermaterials sein können oder durch Beschichtung oder chemische Behandlung eines inerten Materials zugeführt werden können.
Besonders geeignete teilchenförmige Materialien sind Polymerkügelchen, wie sie beispielsweise in der EP-A-0 323 692 beschrieben werden, und die hergestellt werden können aus einer oder mehreren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren mit einem aktiven Halogenatom, aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen. Andere besonders geeignete Teilchen mit reaktiven carboxygruppen werden in der EP-A-0 466 220 beschrieben.
Zu Homo- und Copolymeren, die in der EP-A-0 323 692 beschrieben werden, gehören die folgenden repräsentativen Materialien: Poly(m & p-chloromethylstyrol), Poly(styrol-co-m & p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (molares Verhältnis 67:30:3), Poly[styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol] (molares Verhältnis 96:4), Poly{styrol-co-N-[m & p- (2-chloroethylsulfonylmehtyl)phenyl]acrylamid} (molares Verhältnis 99,3:0,7), Poly (m & p-chloromethylstyrol-co-methacrylsäure) (molares Verhältnis 95:5), Poly[styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol-co-methacrylsäure] (molares Verhältnis 93,5:4,5:2) sowie Poly[styrol-co-4-(2-chloroethylsulfonylmethyl) styrol] (molares Verhältnis 95,4:4,5).
Verfahren zur Anbindung von Antikörpern oder anderen biologischen Materialien an Teilchen mit reaktiven Gruppen sind allgemein bekannt. Im allgemeinen werden die Rezeptoren mit den Teilchen unter geeigneten Bedingungen vermischt, je nach der Bindungsforrn (Adsorption, kovalenter Reaktion direkt oder durch Verwendung einer verbindenden gruppe). Ein Fachmann auf dem Gebiet wird leicht erkennen, was für Bedingungen für jedes Verfahren angewandt werden können. Beispielsweise werden zur Anbindung an Teilchen mit reaktiven Halogenatomen, aktivierten 2-substituierten Ethylsulfonyl- oder Vinylsulfonylgruppen, die Rezeptoren im allgemeinen mit den Teilchen bis zu 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 20º bis 40ºC in einer Suspension vermischt, die auf einen pH-Wert von 7 bis 10 abgepuffert ist.
Werden Carboxygruppen zur Anbindung verwendet, so können die gut bekannten Carbodiimid-Aktivatoren verwendet werden, wie auch Carbomoyloniumverbindungen, die in der EP-A-0 308 235 beschrieben werden. Rezeptoren können an Teilchen zur Absorption gebracht werden durch Inkubierung derselben mit Teilchen in Suspension bei einer geeigneten Temperatur über einen Zeitraum von mehreren Stunden.
In vorteilhafterer Weise werden die oben beschriebenen unlöslich gemachten Rezeptoren durch Beschichtung oder Abscheidung auf einer mikroporösen Filtrationsmembran aufgebracht, die gegenüber chemischen oder biologischen Reaktionen inert ist. Sie besteht im allgemeinen aus einer oder mehreren natürlich vorkommenden oder synthetischen Substanzen, die eine ausreichende Integrität für Reagentien haben, die umgesetzt werden sollen oder hieran befestigt werden sollen ohne Verlust von Form oder Funktion. Sie ist für eine Filtration porös genug, die dazu benötigt wird, um praktisch sämtliche nicht komplex gebundenen Materialien von den Komplexen, die auf der Membran erzeugt wurden, zu entfernen. Zu geeigneten Membranmaterialien gehören poröse, natürlich vorkommende oder synthetische Polymere, gesintertes Glas, Membranen von Glas oder polymeren Filmen oder Fasern, keramischen Materialien, cellulosischen Materialien sowie teilchenförmige Strukturen, aufgebaut aus Kügelchen, die miteinander mittels eines Klebstoffes oder Bindemittelmaterials verbunden sind. Besonders geeignete Materialien sind behandelte oder unbehandelte mikroporöse Polyamidmembranen, wie zum Beispiel solche, die im Handel erhältlich sind von der Firma Pall Corp. unter den Warenzeichen LOPRODYNE und BIODYNE .
Die Membran weist im allgemeinen eine mittlere Porengröße in der größten Dimension von 0,5 bis 5 µmetern auf.
Die in Wasser unlöslichen Rezeptoren können an die Membran über ihrer gesamten Oberfläche befestigt werden oder in definierten Bereichen hiervon. Sie können in Verbindung mit hydrophilen Bindemitteln verwendet werden, um eine zusätzliche Integrität gegenüber der Beschichtung herbeizuführen.
Die Membran kann bei Durchführung des Assays in der Hand gehalten werden, unter Bereitstellung von Zentren für die Komplexbildung von extrahiertem Liganden und Rezeptor auf der Membran. Vorzugsweise jedoch ist die Membran in einer Wegwerf-Testvorrichtung oder einem Gegenstand mit einem geeigneten Rahmen und geeigneter Struktur zum Festhalten der Membran und der Flüssigkeit, die hierauf aufgetragen wird, angeordnet oder befestigt. Viele solcher Testvorrichtungen sind aus dem Stande der Technik bekannt. Besonders geeignete Testvorrichtungen sind solche, die von der Firma Eastman Kodak Company unter dem Warenzeichen SURECELL -Testgeräte vertrieben werden.
Bevorzugte Testgeräte weisen drei Testbehältnisse auf und zwar zur Lieferung von sowohl negativen als auch positiven Vergleichsergebnissen wie auch dem Testergebnis einer Probe. Ein jedes Testbehältnis weist eine hierin vorhandene Membran auf.
Wie im vorstehenden angegeben, kann der Rezeptor auch so ausgestaltet sein, daß er unlöslich gemacht ist, unter Verwendung eines spezifischen Bindungskomplexes, wie zum Beispiel Avidin- Biotin, einem Zucker mit einem Lectin oder anderen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind. Das Rezeptormolekül, das unlöslich gemacht werden soll, kann biotinyliert werden (wie zum Beispiel im Falle eines biotinylierten Antikörpers oder Nucleinsäure) und es kann vor, während oder nach seiner Reaktion dem Liganden mit Avidin zu einem Komplex gebunden werden, der an ein festes Material gebunden wird.
Nachdem der unlöslich gemachte Komplex erzeugt worden ist, besteht die nächste Stufe (Stufe C) des Verfahrens dieser Erfindung darin, daß der Komplex mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird, die dazu geeignet ist, um ein colorimetrisches oder chemilumineszierendes Signal aufgrund der Peroxidasemarkierung in dem Komplex zu erzeugen. Eine solche Zusammensetzung kann im wesentlichen ein Substrat für Peroxidase sein, die damit umgesetzt wird, unter Lieferung des gewünschten Signals. Wahrscheinlicher sind es zwei oder mehrere Reagentien, die in einer oder mehreren Reaktionen unter Erzeugung des Signals reagieren. Die speziellen Reagentien, die benötigt werden, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet leicht ermittelbar, da ein beträchtlicher Stand der Technik vorhanden ist, der Reagentien beschreibt, die durch Peroxidase katalysiert werden, unter Bildung eines Farbstoffes oder eines chemilumineszierenden Signals. Im allgemeinen enthält die Zusammensetzung Wasserstoffperoxid sowie eine Verbindung, die ein Signal als Folge hiervon liefert.
Beispielsweise ist eine Anzahl von Leucofarbstoffen dafür bekannt, daß sie für diesen Zweck geeignet ist, wobei zu den Leucofarbstoffen jene gehören, die in der US-A-4 089 747 und in der US-A-4 670 386 beschrieben werden. Eine bevorzugte, einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung wird in den unten folgenden Beispielen beschrieben.
Alternativ kann die Peroxidase im Rahmen von einer oder mehreren Reaktionen eingesetzt werden, um ein chemilumineszierendes Signal zu erzeugen.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in einer effektiven Modulation (Veränderung oder vollständigen Unterbrechung) des erzeugten Signals unter Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzung der Hydroxaminsäure. Dies geschieht durch Kontaktieren des das Signal erzeugenden Komplexes mit der Zusammensetzung zu einem geeigneten Zeitpunkt, nach dem die Signalerzeugung begonnen hat. Im allgemeinen erfolgt dieser Kontakt innerhalb von mindestens 2 Minuten, nach dem Farbstoffsignale beginnen aufzutreten, und vorzugsweise nach 60 bis 75 Sekunden. Zu diesem Zeitpunkt existiert ein Farbstoffsignal, doch seine Intensität hält an, sich zu erhöhen. Im Falle eines chemilumineszierenden Signals unterbricht die Zusammensetzung die Erzeugung von Licht von dem Komplex.
Das Verfahren dieser Erfindung läßt sich über jeden beliebigen geeigneten Zeitraum durchführen, wobei mindestens 3 Minuten die erforderliche Minimalzeit darstellen. Im allgemeinen wird das Testverfahren (Stufen A-D) in 3 bis 60 Minuten durchgeführt. Mit der Ausnahme der oben angegebenen Temperaturbedingungen im Falle einzelner Stufen wird das Testverfahren im allgemeinen bei Temperaturen von 15 bis 40ºC durchgeführt, wobei Raumtemperatur die bevorzugte Temperatur ist.
Das Verfahren kann eine Anzahl von gegebenenfalls durchführbaren Stufen umfassen, die bei der Beschreibung des allgemeinen Verfahrens nicht speziell aufgeführt wurden, wozu gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf erfolgt, Waschstufen, Extraktionsstufen, Filtrationsstufen und andere Stufen, die dem auf dem Gebiet der Immunoassys oder Hybridisierungsassays tätigen Fachmann bekannt sind.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung von beliebigen von Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis oder Prevotella intermedia die folgenden Stufen:
A. Das Kontaktieren einer Probe, von der erwartet wird, daß sie ein Antigen enthält, das extrahiert wurde aus beliebigen von Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis oder Prevotella intermedia mit einem in Wasser löslichen Antikörper, der spezifisch für das extrahierte Antigen ist, wobei der Antikörper mit Peroxidase markiert ist,
unter Erzeugung eines Peroxidase-markierten immunologischen Komplexes zwischen dem extrahierten Antigen und dem Antikörper,
B. das Unlöslichmachen des extrahierten Antigens vor, gleichzeitig mit oder nach Durchführung der Stufe A., um einen unlöslich gemachten immunologischen Komplex zu erzeugen,
C. das Kontaktieren des unlöslich gemachten Komplexes mit einer Zusammensetzung zum Zwecke der Erzeugung eines colorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals als Folge der Peroxidase in dem Komplex, und
D. die Modulation und Bestimmung des Grades des Signals durch Kontaktieren des unlöslich gemachten Komplexes mit einer Zusammensetzung, die mindestens 0,05 bis 5 Gew.-% einer Verbindung, wie oben beschrieben, enthält.
Die folgenden Beispiele sind beigefügt, um die Praxis dieser Erfindung zu veranschaulichen, wobei sie nicht in einem begrenzenden Sinne zu verstehen sind. Sämtliche angegebenen Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Materialien und Verfahren der Beispiele:

Es wurden SURECELL -Wegwerf-Testvorrichtungen verwendet, die mikroporöse Nylon-Filtrationsmembranen vom Typ LOPRODYNE enthielten (mittlere Porengröße 1,2 µmeter), die sich in den drei Testbehältnissen befanden. Die Membran wurde ohne jede weitere Behandlung verwendet.
Eine, einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung wurde hergestellt derart, daß sie enthielt: 4,5-Bis(4-methoxyphenyl)-2- (3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)imidazol-Leucofarbstoff (0,008 %), Poly(vinylpyrrolidon) (1 %), Natriumphosphatpuffer (10 mmolar, pH-Wert 6,8), Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) sowie Diethylentriaminpentaessigsäure (10 µmolar).
Polyklonale Antikörper, gerichtet auf einen jeden der drei Mikroorganismen Actinobacillus actinomyceterncomitans (A.a.), Prevotella intermedia (P.i.) sowie Porphyromonas gingivalis (P.g.) wurden durch intravenöse Injektion von Kaninchen hergestellt. Zu diesem Verfahren gehört im allgemeinen die Injektion der Kaninchen mit einer immunisierenden Menge von Antigen ein erstes Mal, das Injizieren der Tiere ein zweites Mal zwischen dem zweiten und vierzehnten Tag nach der ersten Injektion mit einer Booster-Menge des Antigens. Beginnend mit dem fünfzehnten Tag nach der ersten Injektion wurden die Kaninchen mindestens dreimal jede sieben Tage-Periode über einen Zeitraum von mindestens vier sieben-Tage-Perioden mit einer Booster- Menge von Antigen injiziert. Nach der letzten Booster-Injektion wurden den Kaninchen Antiserum entnommen. Durch Ammoniumsulfatausfällung wurden IGG-Fraktionen hergestellt und bei 4ºC in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (0,3-0,4 %ige Lösung) aufbewahrt. Isolate wurden auf anaeroben Platten subkultiviert. Die Mikroorganismen waren solche, die durch die Niederlegungsnummern ATCC 43717, ATCC 43718 und ATCC 43719 für A.a. identifiziert wurden (Serotypen A, B und C), ATCC 25611, NCTC 9336 und ATCC 49046 für P.i. (Serotypen A, B und C) und ATCC 33277, 53978 und 53977 für P.g. (Serotypen A, B und C).
In Wasser unlösliche Reagentien wurden hergestellt durch kovalente Bindung von Antikörpern, die spezifisch waren gegen- über jedem Mikroorganismus (sämtliche der Serotypen A, B und C) an polymere Teilchen (mittlerer Durchmesser 1 µmeter) von Poly[styrol-co-4-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol] (molares Verhältnis 95,5:4,5), die hergestellt wurden unter Anwendung der Verfahren gemäß EP-A-0 323 692. Eine kovalente Bindung wurde erreicht durch Zugabe der Antikörper (0,75 rng/ml im Falle von P.g. Gesamt-Serotypen, sowie 0,53 mg/ml für A.a. und P.i., Gesamt-Serotypen) zu einer Lösung eines Boratpuffers (0,05 molar, pH-Wert 8,5) in einem Teströhrchen und durch gutes Vermischen. Die Polymerteilchen (3 % Feststoffe) wurden der abgepufferten Mischung zugegeben und die anfallende Suspension wurde über einen Zeitraum von 4-24 Stunden bei Raumtemperatur über Kopf rotiert, um eine kovalente Bindung der Antikörper an die Teilchen zu ermoglichen. Die Suspension wurde dann bei 2800 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und der Pellet wurde in einem Glycinpuffer (0,1 %, pH-Wert 8,5) mit einem Gehalt an Merthiolat (0,01 %) suspendiert.
Eine Beschichtungssuspension des oben beschriebenen Reagens (0,35 % Feststoffe) wurde hergestellt mit Polyacrylamidbindemittel (5 %), TWEEN 20 als nicht-ionogenem oberflächenaktiven Mittel (0,1 %), Merthiolat (0,01 %) sowie UVITEX als optischem Aufheller (0,0005 %, Ciba-Geigy) in einem Glycinpuffer (0,1 molar, pH-Wert 8,5). Jedes Reagens, das auf ein verschiedenes Antigen gerichtet war, wurde in definierten Bereichen der Membran in den oben beschriebenen Testvorrichtungen aufgetragen.
Es wurden Enzym-Antikörper-Konjugate hergestellt unter Verwendung von Antikörpern, die auf jeden Mikroorganismus gerichtet waren, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war, unter Anwendung des Verfahrens von Yoshitake und Mitarbeitern, Eur. J. Biochern., 101, 395, 1979. Jede Konjugat-Zusammensetzung umfaßte die Konjugate (5,6-11,25 µg von jedem pro ml), zugegeben zu einer Lösung von Casein [0,05 %, von einer 1 %igen Lösung in 0,05 molarer, mit Phosphat abgepufferter Salzlösung, pH-Wert gleich 7], TWEE 20 als nicht-ionogenem oberflächenaktiven Mittel (0,3 %), Merthiolat (0,01 %), 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) sowie LONZAINE C als amphotärem oberflächenaktiven Mittel (0,0035 %, Lonza Corp.). Die Menge an Antikörper, die spezifisch war für A.a. (sämtliche Serotypen) und P.g. (sämtliche Serotypen) lag bei 7,5 µg/ml. Im Falle von P.i. (Serotypen A und C) lag die Menge bei 5,6 µg/ml und im Falle der Serotype B lag sie bei 11,25 µg/ml.
Die verwendete Waschlösung enthielt TERGITOL 4 als anionischem oberflächenaktiven Mittel (1,35 %) in einem Glycinpuffer (0,1 molar, pH-Wert gleich 10), enthaltend Casein (0,5 %) sowie Merthiolat (0,01 %).
Die Antigenextraktion erfolgte unter Verwendung einer Lösung von EMCOL CC-9, als kationischem oberflächenaktiven Mittel (5 %, Witco Chemical Co.), Natriurndodecylsulfat (5 %) in einem Glycinpuffer (0,1 molar, pH-Wert gleich 8,5).

Beispiel 1 Verwendung von verschiedenen Zusammensetzungen zur Modulierung oder Unterbrechung des Farbstoffsignals

Dieses Beispiel veranschaulicht die Durchführung dieser Erfindung und die Verwendung einer Benzohydroxaminsäure, um die Bildung eines Farbstoffsignals unter Verwendung eines mit Peroxidase markierten Antikörpers zu modulieren.

Extraktion und Assay-Protokoll:

Die Antigen-Extraktion erfolgte durch Vermischen der Mikroorganismusprobe mit der oben beschriebenen Extraktionslösung (450 µl) über einen Zeitraum von etwa 1 Minute bei Raumtemperatur. Die Anzahl an Zellen in den endgültigen Lösungen lag bei 7 x 10&sup5; Zellen/ml P.g.
Die Bestimmung erfolgte durch Zugabe einer Probe (450 µl) des Extraktes, erhalten nach dem oben beschriebenen Extraktionsverfahren, in jedes Testbehältnis der oben beschriebenen Wegwerf-Testvorrichtung. Flüssigkeit wurde durch die Membranen in den Testbehältnissen abtropfen gelassen, wenn das extrahierte Antigen eine Komplexbildung mit dem immunologischen Reagens (enthaltend Antikörper) auf den Membranen einging.
Das Konjugat von Peroxidase und Antikörper (80 µl) wurde unmittelbar darauf in die Testbehältnisse gegeben und die Sandwich-Komplexbildung wurde durch Inkubation bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von etwa 2 Minuten ermöglicht. Ein jedes Testbehältnis wurde dann zur Hälfte mit der Waschlösung gefüllt (etwa 500 µl), welche durch die Membran abtropfte. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt.
Nach der letzten Wäsche wurde die einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung (120 µl) zu jedem Testbehältnis zugegeben, worauf sich eine 1 Minute währende Inkubation bei Raumtemperatur anschloß.
Am Ende dieser Inkubationsperiode wurde die "Unterbrecher"- Lösung zugegeben, um die Formation des Farbstoffsignals zu modulieren und das Signal wurde visuell untersucht durch Vergleich desselben mit einer Farbbewertungskarte mit Dichtewerten von 1 bis 10, wobei 10 die höchste Dichte darstellt. Eine Dichebewertung erfolgte auch bezüglich des Hintergrundes auf der Membran, wo kein Farbstoff auftreten sollte.
Die untersuchten "Unterbrecher"-Lösungen hatten die folgenden Zusammensetzungen:
Vergleich A: Natriumazid (0,1 %) in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (0,05 molar, pH-Wert = 7,3).
Vergleich B: Natriumazid (0,1 %) in 3-(4-Morpholino)propansulfonsäure (1 molar, pH-Wert = 7).
Vergleich C: Natriumazid (0,1 %) in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (1 molar, pH-Wert = 6).
Vergleich D: Natriumazid (1 %) in 3-(4-Morpholino)propansulfonsäure (1 molar, pH-Wert = 7).
Vergleich E: Natriumazid (1 %) in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (1 molar, pH-Wert = 6).
Vergleich F: Zitronensäure (1 molar, pH-Wert = 4).
Vergleich G: Zitronensüure (1 molar, pH-Wert = 3).
Vergleich H: Zitronensäure (1 molar, pH-Wert = 2).
Vergleich I: Ethanolamin (1 molar, pH-Wert = 10).
Vergleich J: Ethanolarnin (1 molar, pH-Wert = 11).
Vergleich K: Natriumazid (0,1 %), Poly(vinylpyrrolidon) (6,25 %) und TERGITOL 4 als anionischern oberflächenaktiven Mittel (0,1 %) in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (1 molar, pH-Wert = 6).
Beispiel 1: Benzohydroxaminsäure (0,1 %) in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (0,05 molar, pH-Wert = 7,3).
Tabelle I unten zeigt die Zeiten (Minuten) an, nach Zugabe der "Unterbrecher"-Lösung, bei denen eine Farbstoffentwicklung aufgrund einer nicht-spezifischen Bindung beobachtet wurde. Hierbei handelt es sich um eine unerwünschte Bindung des markierten Antikörpers im Bereich der Membran, der vom Komplex entfernt war. Ersichtlich ist, daß die "Unterbrecher"-Lösung, welche die Benzohydroxaminsäure gemäß dieser Erfindung enthielt, zu der längsten Zeitspanne führte&sub1; bevor ein Farbstoffsignal durch eine nicht-spezifische Bindung zu beobachten war. TABELLE I Tabelle II unten quantifiziert den Bereich der Membran, der durch die nicht-spezifische Bindung beeinträchtigt wurde, nach der Bildung des Farbstoffsignals nach bestimmten Zeitperioden. Die Werte von "1+" bis "4+" betreffen die Intensität und die Flächengröße der Entwicklung des Farbstoffsignals auf der Membran, wobei ein Wert von 1+ besagt, daß ein geringer Teil der Membran durch ein geringes Farbstoffsignal beeinträchtigt war, und wobei ein Wert von 4+ besagt, daß die gesamte Membran ein sehr starkes Farbstoffsignal aufwies. Diese Daten zeigen an, daß lediglich im Falle der vorliegenden Erfindung kein unerwünschtes Farbstoffsignal im Falle der gesamten Testperiode (1 Stunde) auftrat. TABELLE II "Unterbrecher"-Lösungen
Tabelle III unten zeigt das Farbstoffsignal an, das als Folge des Vorhandenseins von P.g. (Serotype B, 7 x 10&sup5; Zellen/ml) nach bestimmten Zeitperioden im Falle bestimmter "Unterbrecher"-Lösungen erzeugt wurde. Das Bestimmungsverfahren, das gemäß dieser Erfindung durchgeführt wurde, lieferte das stabilste Farbstoffsignal nach 15 Minuten. Die Farbstoffsignale wurden mittels einer Skala von 1 bis 10 bewertet, wobei der Wert 10 die höchste Farbstoffdichte darstellt. TABELLE III "Unterbrecher"-Lösungen
U = nicht bestimmbar
Zusammenfassend zeigen die Daten, daß die Verwendung von Benzohydroxaminsäure zur Modulierung oder Unterbrechung der Bildung eines Farbstoffsignals gemäß dieser Erfindung sehr erfolgreich ist. Es wird nicht nur das Farbstoffsignal über eine lange Zeitperiode stabilisiert, sondern in unerwarteter Weise wird das Hintergrundsignal eliminiert, das durch den Rückfluß von Reagentien durch die Membran hervorgerufen wird, auf der das Signal erzeugt wird. Dies verschafft dem Benutzer dieses Assays eine ausreichende Zeitspanne, um das Farbstoffsignal zu untersuchen und ermöglicht die Gewinnung von halb-quantitativen Ergebnissen, da ein geringerer Hintergrund vorhanden ist und ein stabileres Signal erzeugt wird.

Claims

1. Diagnosetestsatz, der eine in Wasser lösliche, mit Peroxidase markierte spezifische Bindungsspezies aufweist,

dadurch gekennzeichnet, daß der Testsatz weiter separat abgepackt umfaßt eine abgepufferte Zusammensetzung mit mindestens 0,05 Gew.-% einer Verbindung mit der Struktur

R-CO-NH-R'

oder einem äquivalenten Salz hiervon, worin R für Phenyl, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring und R' für Hydroxy stehen.

2. Testsatz nach Anspruch 1, weiter umfassend eine Zusammensetzung für die Erzeugung eines colorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals durch Ansprechen auf Peroxidase.

3. Testsatz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in dem die spezifische Bindungsspezies ein Antikörper ist, der spezifisch ist für Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis oder Prevotella intermedia.

4. Verfahren zur Bestimmung eines spezifischen Bindungsliganden, beb dem man:

A. einen spezifischen Bindungsliganden von einer biologischen Probe mit einem in Wasser löslichen Rezeptor umsetzt, der für den Liganden spezifisch ist, wobei der Rezeptor mit Peroxidase markiert ist,

unter Erzeugung eines mit Peroxidase markierten spezifischen Bindungskomplexes zwischen dem Liganden und dem Rezeptor,

B. bei dem man vor, gleichzeitig init oder nach der Stufe A den spezifischen Bindungsliganden unlöslich macht, unter Erzeugung eines unlöslich gemachten spezifischen Bindungskomplexes,

C. bei dem man den unlöslich gemachten Komplex mit einer Zusammensetzung für die Erzeugung eines colorimetrischen oder chemilumineszierenden Signals durch Ansprechen auf Peroxidase in dem Komplex in Kontakt bringt, und bei dem man

D. den Grad des Signals moduliert, durch in Kontakt bringen des unlöslich gemachten Komplexes mit einer Zusammensetzung, die mindestens 0,05 Gew.-% einer Verbindung mit der Struktur

R-CO-NH-R'

oder einem äquivalenten Salz hiervon umfaßt, wobei R steht für Phenyl, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen im Ring, und worin R' für Hydroxy steht.

5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung eines Hormons, eines Arzneimittels, eines bakteriellen oder viralen Antigens oder eines Antikörpers.

6. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung von Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis oder Prevotella intermedius.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin der Komplex auf einer mikroporösen Filtrationsrnernbran unlöslich gemacht wird und die Stufe D innerhalb von 2 Minuten nach Stufe C durchgeführt wird.

8. Testsatz oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Verbindung in einer Menge von 0,05 bis 5 Gew.-% vorliegt.

9. Testsatz oder Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Peroxidase Meerrettischperoxidase ist.