DE69215665T2

DE69215665T2 - Esterderivate von antibiotikum-a 40926

Info

Publication number: DE69215665T2
Application number: DE69215665T
Authority: DE
Inventors: Romeo I-20026 Novate Milanese Ciabatti (Mi); Maurizio I-20090 Opera Denaro (Mi); Rolf Heinz I-20159 Milano Hermann; Enrico I-27027 Gropello Cairoli Selva (Pv)
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2012-02-22
Also published as: IL101326A0; JP3314930B2; WO1992017495A1; CA2099866A1; HU9302712D0; HU210665B; IL101326A; DE69215665D1; ES2095459T3; AU652615B2; EP0505735A1; JPH06505716A; KR100209971B1; EP0578644A1; HUT65471A; DK0578644T3; GR3022731T3; IE920960A1; CA2099866C; AU1258592A

Description

Die Erfindung betriffi neue Esterderivate des Antibiotikums A 40926 der Formel I
worin
R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion ist;
M ein Wasserstoffatom, eine α-D-Mannopyranosyl oder 6-O-Acetyl-α-D- mannopyranosylgruppe ist;
R' ein (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest ist;
R&sub3; ein (C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl-, Hydroxy-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl- oder Halogen-(C&sub1;-C&sub6;)-alkylrest ist;
und die Additionssalze davon.
Der hier verwendete Ausdruck "Alkyl" umfaßt entweder allein oder in Kombination mit anderen Substituenten sowohl geradkettige als auch verzweigte Kohlenwasserstoffreste; insbesondere bedeutet "(C&sub1;-C&sub6;)-Alkyl" eine geradkettige oder verzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, Pentyl, 1- Methylbutyl, 2-Methylbutyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 4- Methylpentyl, 3-Methylpentyl und dgl.
Der Ausdruck "Halogen-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl" bedeutet mono-oder polyhalogenierte Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, worin die Halogenatome Chlor, Fluor oder Brom sein können und an jedem Kohlenstoffatom der Alkylkette vorhanden sein können.
Bevorzugt enthalten die "Halogen-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl"-Reste eine Anzahl von Halogenatomen im Bereich zwischen 1 und 3, am meisten bevorzugt sind sie monosubstituiert.
Beispiele für "Halogen-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl"-Reste sind: 2-Chlorethyl-, 1-Chlorethyl-, 2- Bromethyl-, 2,2-Dichlorethyl-, 2,2-Dibromethyl-, 2-Fluorethyl-, 3-Chlorpropyl-, 3- Brompropyl-, 3,3,3-Tribrompropyl-, 3-Fluorpropyl-, 2-Chlorpropyl-, 2-Brompropyl-, 2- Fluorpropyl-, 4-Chlorbutyl-, 4-Brombutyl-, 4-Fluorbutyl-, 3-Brombutyl-, 3- Chlorbutylgruppen und dgl.
Der Ausdruck "Hydroxy-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl" bedeutet Mono- oder Polyhydroxyalkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, worin die Hydroxylgruppen an jedem Kohlenstoffatom der Alkylkette vorhanden sein können, mit der Maßgabe, daß jedes Kohlenstoffatom nicht mehr als eine Hydroxylgruppe enthalten kann.
Bevorzugt enthält der "Hydroxy-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl"-Rest eine Anzahl von Hydroxylatomen im Bereich zwischen 1 und 3, am meisten bevorzugt ist er monosubstituiert.
Beispiele für "Hydroxy-(C&sub1;-C&sub6;)-alkyl"-Reste sind: eine 2-Hydroxyethyl-, 3- Hydroxypropyl-, 2-Hydroxypropyl-, 2,3-Dihydroxypropyl-, 4-Hydroxybutyl-, 2- Hydroxybutyl-, 3-Hydroxybutylgruppe und dgl.
Die N-Schutzgruppe, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist eine der auf dem Fachgebiet bekannten N-Schutzgruppen, wie diejenigen, die in Nachschlagebüchem beschrieben sind (vgl. beispielsweise T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons, New York, 1981, S. 323-326, und M Mc Omie "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973), die eine Bindung mit der primären Aminogruppe in Position 15 der Antibiotika der Formel I bilden kann.
Eine bevorzugte N-Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.
Das Antibiotikum A 40926 ist ein Glycopeptid-Antibiotikum, das aus einer Kultur von Actinomadura, d.h. Actinomadura sp. ATCC 39727, in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, isoliert wurde (vgl. EP-A-177882). Gemäß dem in dem vorstehend genannten Patent beschriebenen Verfahren umfaßt die Gewinnung des Antibiotikumkomplexes, dessen Faktoren als Faktor A, Faktor B, Faktor B&sub0;, Faktor PA und Faktor PB bezeichnet wurden, die Durchführung einer Affinitätschromatographie an immobilisiertem D-Alanyl-D-alanin mit den Fermentationsbruhen nach Filtration oder nach einem ersten Reinigungsverfahren.
Die A 40926-Faktoren können durch die vorstehende Formel I dargestellt werden, worin R&sub2; und R&sub3; ein Wasserstoffatom sind, R' eine (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest bedeutet, und M eine α-D-Mannopyranosyl oder eine 6-O-Acetyl-α-D-mannopyranosylgruppe bedeutet.
Genauer, der Antibiotikum A 40926-Faktor A ist eine Verbindung der vorstehenden Formel I, worin R' eine n-Decylgruppe bedeutet, und M eine α-D- Mannopyranosylgruppe bedeutet, der Antibiotikum A 40926-Faktor B&sub0;, die Hauptkomponente von Faktor B ist die Verbindung der vorstehenden Formel I, worin R' eine 9-Methyldecylgruppe bedeutet und M eine α-D-Mannopyranosylgruppe bedeutet.
Der Antibiotikum A 40926-Faktor PA und der -Faktor PB unterscheiden sich von den entsprechenden Faktoren A und B darin, die Mannoseeinheit durch eine 6-O-Acetyl-α- D-mannopyranoseeinheit ersetzt ist.
Die Antibiotikum A 40926-Faktoren PA und PB sind zumindest unter bestimmten Fermentationsbedingungen die Hauptantibiotika-Produkte des A 40926-produzierenden Mikroorganismus.
Die Antibiotikum A 40926-Faktoren A und B sind hauptsächlich Umwandlungsprodukte des Antibiotikum A 40926-Faktors PA bzw. des -Faktors PB und sind oft bereits in den Fermentationsbrühen vorhanden.
Alle Zuckereinheiten sind an den Antibiotikum A 40926-Kern über O-glycosidische Bindungen gebunden.
Es wurde gefunden, daß der Antibiotikum A 40926-Faktor PA in den Antibiotikum A 40926-Faktor A umgewandelt werden kann und der Antibiotikum A 40926-Faktor PB in den Antibiotikum A 40926-Faktor B unter basischen Bedingungen umgewandelt werden kann, die zur Entfernung der Acetylgruppe der Mannoseeinheit führen, ohne daß die Acylgruppe an der Aminoglucuronyleinheit ersetzt wird.
Als Folge wird ein Antibiotikum A 40926-Komplex erhalten, der an dem Antibiotikum A 40926-Faktoren A und B angereichert ist, wenn die Fermentationsbrühe oder ein das Antibiotikum A 40926 enthaltender Extrakt oder ein Konzentrat davon für eine bestimmte Zeit unter basischen Bedingungen stehengelassen wird (z.B. wäßrige Lösung einer nucleopilen Base bei einem pH-Wert > 9 über Nacht).
Während der Reinigungsverfahren des Antibiotikum A 40926-Komplexes werden die Faktoren PA und PB in großem Umfang in die Faktoren A und B umgewandelt.
Zusätzlich wurde gefünden, daß es möglich ist, den Antibiotikum A 40926- Komplex, dessen einzelne Faktoren oder Gemische der Faktoren in jedem beliebigen Verhältnis in den entsprechenden N-Acylaminoglucuronylaglycon-Komplex AB, N- Acylaminoglucuronylaglycon-Faktor A, N-Acylaminoglucuronylaglycon-Faktor B und das Mannosylaglycon durch kontrollierte saure Hydrolyse einer der Zuckereinheiten umzuwandeln (vgl. EP-A-240609 und EP-A-228015).
Bevorzugte Hydrolysebedingungen für die Produktion von N-Acylaminoglucuronylaglyconen umfassen die Verwendung eines Gemisches aus Dimethylsulfoxid/konzentrierter Salzsäure von 8:2 bis 9,5:0,5 bei einer Temperatur zwischen 40ºC und 80ºC.
Die Antibiotikum A 40926-N-Acylaminoglucuronylaglycone werden durch die vorstehende Formel I dargestellt, worin R&sub2;, R&sub3; und M ein Wasserstoffatom sind, und R' einen (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest bedeutet.
Die vollständige Abspaltung aller Zuckereinheiten der A 40926 Antibiotikums ergibt das Aglycon. Dieser Hydrolyseprozeß ist in der EP-A-240609 beschrieben.
Der Antibiotikum A 40926-Komplex, die Faktoren davon, die entsprechenden N- Acylaminoglucuronylaglycone, die Desacylderivate, das Mannosylaglycon, das Aglycon und Gemische davon in beliebigem Verhältnis wirken hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und Neisseria.
Der Antibiotikum A 40926-Komplex und dessen N-Acylaminoglucuronylaglycone sind geeignete Ausgangsmaterialien zur Herstellung der Antibiotikum A 40926-Derivate der Formel I.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen saure und basische Funktionen und können Salze mit organischen und anorganischen Gegenionen gemäß herkömmlichen Verfahren bilden.
Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen diejenigen Salze, die durch Standardreaktion sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren gebildet wurden, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsaure, Bemsteinsäure, Citronensäure, Ascorbinsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoasäure, Mucinsaure, Glutaminsäure, Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsaure, Laurinsaure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnliche Säuren.
Repräsentative Beispiele der Basen, die Salze mit den erfindungsgemäßen Verbindungen bilden können, sind: Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxide, wie Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Bariumhydroxid; Ammoniak und aliphatische, alicyclische oder aromatische organische Amine, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Picolin.
Die Umwandlung der erfindungsgemäßen "Nicht-Salz"-Verbindungen in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h. die Umwandlung eines Additionssalzes einer erfindungsgemäßen Verbindung in die Nicht-Salzform fallen in das übliche technische Können eines Fachmanns und sind Gegenstand der Erfindung.
Beispielsweise kann eine Verbindung der Formel I in die entsprechenden Salze mit Säuren oder Basen durch Auflösen der Nicht-Salzform in einem wäßrigen Lösungsmittel und Zugabe eines geringen molaren Überschusses der ausgewählten Säure oder Base umgewandelt werden. Die so erhaltene Lösung oder Suspension wird dann lyophilisiert, wodurch das gewünschte Salz gewonnen wird.
Falls das Endsalz in einem organischen Lösungsmittel, in dem die Nicht-Salzform löslich ist, unlöslich ist, wird es durch Filtration von der organischen Lösung der Nicht- Salzform nach Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen molaren Überschusses der ausgewählten Säure oder Base gewonnen.
Die Nicht-Salzform kann aus einem entsprechenden Salz hergestellt werden, das in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst ist und dann neutralisiert wird, um die Nicht-Salzform freizusetzen. Diese wird dann beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Losungsmittel gewonnen oder wird in ein anderes Additionssalz durch Zugabe der ausgewählten Säure und Base und Aufarbeiten wie vorstehend umgewandelt.
Wenn nach der Neutralisation eine Entsalzung notwendig ist, kann ein herkömmliches Entsalzungsverfahren verwendet werden.
Beispielsweise kann die Säulenchromatographie mit Polydextranharzen mit spezieller Porengröße (wie Sephadex LH-20) oder einem silanisierten Silicagel zweckdienlicherweise verwendet werden. Nach Elution der unerwünschten Salze mit einer wäßrigen Losung wird das gewünschte Produkt mit Hilfe eines linearen Gradienten oder Stufengradienten eines Gemisches aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser von 50:50 auf etwa 100 % Acetonitril, eluiert.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann die Salzbildung entweder mit pharmazeutisch verträglichen Säuren und Basen oder nicht-pharmazeutisch verträglichen Säuren und Basen als zweckdienliche Reinigungstechnik verwendet werden. Nach der Bildung und Isolierung kann die Salzform einer Verbindung der Formel I in die entsprechende Nicht-Salzform oder in ein pharmazeutisch verträgliches Salz umgewandelt werden.
Jedoch gelten angesichts der Ahnlichkeit der Eigenschaften der Verbindungen der Formel I und ihrer Salze die Aussagen der vorliegenden Anmeldung bei der Abhandlung der biologischen Aktivitäten der Verbindungen der Formel I auch auf ihre pharmazeutisch verträglichen Salze und umgekehrt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als semi-synthetische antibakterielle Mittel hauptsächlich gegen gram-positive Bakterien und Neisseria aktiv.
Bevorzugte Verbindungen sind diejenigen Verbindungen der Formel I, worin R' einen (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest bedeutet, R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine Benzylgruppe bedeutet, R&sub3; einen (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest, einen Hydroxy-(C&sub1;-C&sub4;)-alkylrest, einen Halogen- (C&sub1;-C&sub4;)-alkylrest bedeutet, M ein Wasserstoffatom oder eine α-D-Mannopyranosylgruppe bedeutet.
Eine stärker bevorzugte Gruppe von Verbindungen sind diejenigen Verbindungen der Formel I, worin R' einen (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest bedeutet, R&sub2; ein Wasserstoffatom bedeutet, R&sub3; eine Methyl- oder 2-Hydroxyethylgruppe bedeutet, und M eine α-D-Mannopyranosylgruppe bedeutet.
Allgemeine Verfahren können bei den Veresterungsverfahren der Verbindungen der Formel I angewendet werden, aber natürlich sind bei dem Veresterungsverfahren der Verbindungen der Formel I zwei Carboxylgruppen vorhanden, die Carboxylgruppe der N- Acylaminoglucuronyl-Einheit und die Carboxylgruppe in Position 38 des Peptidkerns, deren Reaktivitäten ganz unterschiedlich sind.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Esterderivate umfassen die Umsetzung des N¹&sup5;-geschützten A 40926-Substrats oder des A 40926- Substrats mit freier Aminogruppe oder dessen Demannosylderivats (d.h. N-Acylaminoglucuronylaglycon) mit einem Alkohol in einem sauren Medium oder eines N¹&sup5;-geschützten A 40926-Derivats oder dessen Demannosylanalogons mit einem Säurehalogenid (bevorzugt Bromid, Chlorid oder Iodid) ggf in Gegenwart eines Halogenwasserstoffsäureakzeptors.
Genauer umfassen kontrollierte Veresterungsverfahren, die zur Herstellung der A 40926-Esterderivate und der Demannosyl-A 40926-Esterderivate nützlich sind, Veresterungsreaktionen, bei denen das A 40926-Substrat mit einem Überschuß des ausgewählten Alkanols in Gegenwart einer konzentrierten Mineralsäure bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur für eine Zeit, die mit der sterischen Komplexizität der einzuführenden Gruppe variiert, in Kontakt gebracht (z.B. zur Herstellung der A 40926-6B-Alkylester, verestert an der Carboxylgruppe, die an der N- Acylaminoglucuronyl-Einheit vorhanden ist); und Veresterungsreaktionen, bei denen das A 40926-Substrat mit einem Überschuß eines Halogenalkanols ohne Anwesenheit von Säuren in Kontakt gebracht wird (z.B. zur Herstellung von A 40926-6B- Halogenalkylester).
In einigen Fällen ist es zweckdienlich, die primäre Aminofünktion in Position 15 des A 40926-Ausgangsmaterials zu schützen, um mögliche unerwünschte Nebenreaktionen zu vermindern. Dies kann nach an sich bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Lehrbüchern, wie T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, 1981 und M. Mc Omie "Protecting Groups in Organic Chemistry" Plenum Press, New York, 1973, beschrieben sind. Diese Schutzgruppen müssen bei den Bedingungen des Reaktionsprozesses stabil sein, dürfen auf die Hauptreaktion nicht nachteilig einwirken und müssen am Ende der Hauptreaktion leicht abspaltbar sein.
Die tert.-Butoxycarbonyl (tBOC)-, Carbobenzyloxy (Cbz)- und Arylalkylgruppen sind Beispiele von geeigneten Aminoschutzgruppen. Möglicherweise als Folge der sterischen Hinderung ist der Schutz mit Carbamat-bildenden Reagenzien schwieriger als für andere Glycopeptidantibiotika der Ristocetinklasse, die eine freie Aminogruppe in Position 15 besitzen. Im Gegensatz dazu findet die Benzylierung mit ggf. substituierten Benzylhalogeniden in Gegenwart einer Base glatt mit quantitativer Ausbeute statt und führt ausschließlich zur Bildung des entsprechenden N¹&sup5;-Benzylderivats ohne begleitende Bildung eines Aralkylesters der Carboxylgruppen.
Der selektive Schutz der Aminogruppe in Position 15 kann bevorzugt durch Umsetzung mit Benzylbromid in Gegenwart eines Halogenwasserstoffakzeptors (d.h. eines tertiären Amins) ohne begleitende Veresterung der zwei Carboxylgruppen durchgeführt werden.
Die Bedingungen zur Entfernung der N¹&sup5;-Schutzgruppen fallen unter die auf einem Fachgebiet zur Entfernung der Aminoschutzgruppen bekannten und müssen nach einer Bewertung der Reaktivität der anderen in den Molekülen vorhandenen Gruppen aufgestellt werden. Offensichtlich, wenn die Endverbindung der Formel I Gruppen enthält, die unter sauren Bedingungen labil sind, z.B., wenn G und M Zuckereinheiten, wie vorstehend definiert, darstellen, die in einem sauren Medium hydrolysiert werden können, müssen andere Entfernungsbedingungen verwendet werden, wie beispielsweise die katalytische Hydrierung unter Verwendung von beispielsweise Palladium auf Kohle als Katalysator, um die geeignete Schutzgruppe zu entfernen. In diesem Fall sollte jedoch der Anwesenheit anderer Gruppen Aufmerksamkeit geschenkt werden, die durch katalytische Hydrierung modifiziert werden könnten.
Zusätzlich kann die Mannoseeinheit einer Verbindung der Formel I selektiv entfernt werden, wobei sie in eine andere Verbindung der Formel I umgewandelt wird, worin der Mannoserest durch ein Wasserstoffatom ersetzt ist.
Eine Verbindung der Formel I, worin M eine α-D-Mannopyranosylgruppe oder eine 6-O-Acetyl-α-D-mannopyranosylgruppe ist, und R&sub3; ein Alkylrest ist, kann in die entsprechende Verbindung, worin R&sub3; wie vorstehend definiert ist und M ein Wasserstoffatom ist, durch eine selektive saure Hydrolyse umgewandelt werden. Wie in der EP-A-240609 offenbart, umfassen bevorzugte Hydrolysebedingungen für die Bildung des Demannosyl-A 40926-Komplexes (d.h. N-Acylaminoglucuronylaglycon) die Verwendung eines Gemisches aus Dimethylsulfoxid/konzentrierter Salzsäure von 8 : 2 (Vol./Vol.) bis 9,5: 0,5 (Vol./Vol.) bei einer Temperatur von 65ºC.
Folglich können die Demannosylderivate der A 40926-Ester in einem Gemisch mit dem entsprechenden Aglycon erhalten werden, das durch präparative HPLC getrennt werden kann.
Die hydrolytischen Bedingungen können geeigneterweise modifiziert werden, um das Verhältnis zwischen den so erhaltenen Produkten zu verändern. Beispielsweise beträgt, ausgehend von in Position 6B der N-Acylaminoglucuronyl-Einheit verestertem A 40926- Komplex unter Verwendung eines Lösungsmittel/Salzsäure-Verhältnisses von 78 : 1, bei einer Reaktionstemperatur von unter 60ºC und Erhöhen der Reaktionszeiten auf etwa 7 Tage, das Verhältnis des gewünschten in Position 6B der N-Acylaminoglucuronyl-Einheit veresterten Demannosyl-A 40926-Komplexes zu dem unerwünschten Aglycon von A 40926 etwa 1,4:1,0.
Die Reaktionsverläufe werden mittels HPLC nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren überwacht.
Auf der Basis der Ergebnisse dieser Tests kann ein Fachmann auf dem Gebiet den Reaktionsverlauf bewerten und entscheiden, wann die Reaktion gestoppt werden soll und die Aufarbeitung der Reaktionsmasse nach an sich bekannten Techniken begonnen werden soll, die beispielsweise Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Nicht-Lösungsmitteln zusammen mit einer weiteren Trennung und Reinigung durch Chromatographie umfassen.
Die antibakterielle Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in vitro durch ein Mikrobrühe-Standardverdünnungsverfahren bestimmt.
Die minimale Hemmkonzentration (MHK) gilt als die niedrigste Konzentration, die kein sichtbares Wachstum nach 18- bis 24stündiger Inkubation bei 37ºC zeigt. Die MHK- Werte für Clostridum difficile, Propionibacterium acnes und Bacteroides fragilis wurden durch das Agarverdünnungsverfahren bestimmt. Wenn nicht anders angegeben, betrugen die Inokula etwa 10&sup4; KBE (Kolonie-bildende Einheiten)/ml oder pro Fleck. Die Inkubationszeiten betrugen 18 bis 24 h, ausgenommen für: N. gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Clostridum difficile, Propionibacterium acnes und Bacteroides fragilis (48 h). Alle Organismen wurden bei 37ºC inkubiert. Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influenzae wurden in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert; die Anaerobier wurden in einem anaeroben Gasgemisch inkubiert. Die verwendeten Medien waren: Oxoid Iso- Sensitest-Bruhe (Staphylococcen, Enterococcus faecalis, Escherichia coli); Difco Todd- Hewitt-Brühe (Streptococcen); Difco GC-Basenbrühe mit 1 % BBL Isovitalex für N. gonorrhoeae; Difco-Hirn-Herz-Infüsionsbrühe mit 1 % Difco-Supplement C für H. influenzae; Difco AC-Medium ohne Agar für Clostridum perfringens; Oxoid Wilkins- Chalgren-Agar für die anderen Anaerobier.
Die Ergebnisse der antibakteriellen Testung der repräsentativen Verbindungen der Formel I sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt: Tabelle I Antibakterielle Aktivität in vitro von A 40926-Derivaten Tabelle I (Fortsetzung) Antibakterielle Aktivität in vitro von A 40926-Derivaten
Die getesteten Verbindungen zeigten eine antibakterielle Aktivität in vitro, die vergleichbar mit A 40926 ist oder darunter liegt.
Die zwei Demannosylderivate (Verbindungen VIII und X) besaßen eine bessere in vitro-Aktivität gegen koagulasenegative Staphylokokken als die Stammverbindungen (X vs. I und VIII vs. VII).
Überraschenderweise zeigten einige Esterderivate verbesserte in vivo Ergebnisse verglichen mit A 40926 gegen Streptokokken-Septikämie bei der Maus.
Bei diesen in vivo-Tests enthielten die Kontroll- und Behandlungsgruppen fünf CD- 1-Mäuse (Charles River) mit einem Gewicht von 18 bis 22 g. Sie wurden intraperitoneal mit 0,5 ml Bakteriensuspension, hergestellt durch Verdünnen einer Über-Nacht-Kultur von Streptococcus pyogenes C203 mit steriler peptonisierter Kochsalzlösung infiziert. Die Inokula wurden so eingestellt, daß die unbehandelten Tiere innerhalb von 48 h an Septikämie starben. Die Antibiotika wurden subkutan unmittelbar nach der Infektion verabreicht. Am 7. Tag wurde die ED&sub5;&sub0; in mg/kg nach dem Verfahren von Spearman und Kaerber (D.J. Finney, "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, S. 524, 1952) aus den Prozentsätzen der überlebenden Tiere bei jeder Dosis berechnet.
Die Ergebnisse der in vivo Testung der repräsentativen erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengefaßt: Tabelle II Aktivität von A 40926-Derivaten bei Maus-Septikämie (Streptococcus pyogenes C203)
Angesichts der vorstehend beschriebenen besseren antimikrobiellen in vivo Aktivität können die erfindungsgemäßen Verbindungen effektiv als Wirkstoffe von antimikrobiellen Präparaten verwendet werden, die in der Human- und Veterinärmedizin zur Prävention und Behandlung infektiöser Erkrankungen verwendet werden, die durch auf diese Wirkstoffe ansprechende pathogene Bakterien hervorgerufen werden.
Im allgemeinen können für eine antibakterielle Behandlung A 40926-Esterderivate und A 40926-N-Acylaminoglucuronylaglyconesterderivate sowie die nicht-toxischen pharmazeutisch verträglichen Salze davon auf unterschiedlichen Wegen, wie topisch oder parenteral, verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen der bevorzugte Verabreichungsweg.
Präparate zur Injektion können Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen, in öligen oder wäßrigen Trägern annehmen und können Adjuvanzien, wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel, enthalten.
Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Verdünnung zum Zeitpunkt der Abgabe vorliegen, wenn ein geeigneter Träger, wie steriles Wasser, zugesetzt wird.
In Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg können diese Verbindungen in verschiedene Dosierungsformen formuliert werden.
In einigen Fällen kann es möglich sein, die erfindungsgemäßen Verbindungen in Dosierungsformen mit einem magensaftresistenten Überzug zur oralen Verabreichung zu formulieren, die nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt werden können (vgl. z.B. "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, S. 1614).
Dies könnte insbesondere dann der Fall sein, wenn die Resorption der antimikrobiellen Substanz im Darmtrakt besonders erwünscht ist, während sie den Magentrakt unverändert passiert.
Die Menge des zu verabreichenden Wirkstoffs hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der Größe und dem Zustand der zu behandelnden Patienten, dem Weg und der Häufigkeit der Verabreichung und dem daran beteiligten ursächlichen Erreger.
Die erfindungsgemäßen antibiotischen Substanzen, d.h. der Antibiotikum A 40926- Komplex-6B-methylester und die physiologisch verträglichen Salze davon wirken im allgemeinen in täglichen Dosen zwischen etwa 0,5 und 50 mg Wirkstoff pro kg Patientenkörpergewicht, ggf aufgeteilt in 1 bis 4 Verabreichungen pro Tag.
Besonders erwünschte Zusammensetzungen sind solche, die in Dosiseinheiten hergestellt sind, die etwa 100 bis etwa 5.000 mg pro Einheit enthalten.
Formulierungen mit Langzeiteffekt können nach verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Mechanismen und Verfahren hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Formulierung mit Langzeiteffekt, enthaltend den Antibiotikum A 40926-6B-methylester, betrifft die Verwendung einer wasserunlöslichen Form dieses Antibiotikums, suspendiert in einem wäßrigen oder öligen Medium.
Diese Formen, d.h. entweder als unlösliches Salz oder als freie Säure, werden in der Tat sehr langsam nach intramuskulärer Injektion wegen ihrer niedrigen Wasserlöslichkeit freigesetzt, wodurch Langzeit-Blutspiegel der antibiotischen Substanz erhalten werden.

Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen:

Eine Dosiseinheit zur intramuskulären Injektion wird mit 5 ml einer sterilen Suspension USP, die 8 % Propylenglykol und 500 mg eines physiologisch verträglichen basischen Additionssalzes des Antibiotikum A 40926-6B-monomethylesters enthält, hergestellt.
Eine Dosiseinheitsform zur intramuskulären Injektion wird mit 1.000 mg des Antibiotikum A 40926-6B-monomethylesters in der wasserunlöslichen Säureform, suspendiert in 5 ml sterilem Wasser, zur Injektion hergestellt.

Beispiele

Beispiel 1: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-monomethylesters (Verbindung 1)

Der gemäß EP-A-177882 erhaltene Antibiotikum A 40926-Komplex (150 mg; 0,0866 mmol) wurde in absolutem Methanol (30 ml) aufgelöst, und der pH-Wert wurde mit konzentrierter Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Das Gemisch wurde 26 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Präzipitat erschien, wenn der pH-Wert mit 0,15 ml Triethylamin auf 6 gebracht wurde. Nach Zugabe von Diethylether wurde das Präzipitat gewonnen, gründlich mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 150 mg (99 %).

Beispiel 2: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-monoethylesters (Verbindung II)

Eine gerührte Lösung des Antibiotikum A 40926-Komplexes (250 mg; 0,144 mMol) in absolutem Ethanol (30 ml) wurde mit 2 Tropfen konzentrierter Schwefelsäure bei Raumtemperatur versetzt, wodurch der pH-Wert auf 3 gebracht wurde. 23 h später wurde der pH-Wert mit Triethylamin auf 7 gebracht. Nach Zugabe von Diethylether bildete sich ein Niederschlag, der durch Filtration gewonnen wurde. Dieser Niederschlag wurde in 130 ml Wasser suspendiert, und die wäßrige Phase wurde zweimal mit Butanol extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und auf ein kleines Volumen eingeengt. Nach Zugabe von Diethylether wurde ein fester Niederschlag mit einer Ausbeute von 125 mg gewonnen (Ausbeute: 49,2 %).

Beispiel 3: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-monopropylesters (Verbindung III)

Antibiotikum A 40926-Komplex (200 mg; 0,115 mmol) wurde in 50 ml absolutem n-Propanol gelöst. Der pH-Wert wurde mit 40 µl konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt, und die Lösung wurde 15 h bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert wurde mit NH&sub4;OH auf 7 eingestellt, und das Produkt fiel durch Zugabe von Diethylether aus. Ausbeute: 267 mg (91,2 %).

Beispiel 4: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-monobutylesters (Verbindung IV)

Antibiotikum A 40926-Komplex (200 mg; 0,115 mmol) wurde in 100 ml absolutem Butanol aufgelöst, der pH-Wert wurde wie vorstehend eingestellt, und die Lösung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Der pH-Wert wurde dann in 40 µl 32%igem NH&sub4;OH auf 5 erhöht, 100 ml Wasser wurden zugesetzt, die organische Schicht wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde zweimal mit Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden vereinigt und auf ein kleines Volumen eingeengt. Nach Zugabe von Diethylether wurden 136 mg der Titelverbindung gewonnen (Ausbeute: 65,9%).

Beispiel 5: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-(2- hydroxyethyl)esters (Verbindung V)

Antibiotikum A 40926-Komplex (150 mg; 0,0866 mmol) wurde unter Rühren bei Raumtemperatur in 20 ml Ethylenglykol gelöst. Der pH-Wert wurde mit 40 µl konzentrierter Schwefelsäure auf 2 eingestellt, und das Gemisch wurde 3 Tage stehengelassen. Die Lösung wurde auf etwa 5 ml eingeengt und direkt für eine Trennung mittels präparativer HPLC mit 5 l 31%igem CH&sub3;CN in 0,02 M NaH&sub2;PO&sub4; (isokratisch) verwendet. Das übliche Isolierungsverfahren ergab 27 mg von sehr reinem Ester (Ausbeute: 18 %).

Beispiel 6: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-(4- hydroxybutyl)esters (Verbindung VI)

Eine Lösung aus Antibiotikum A 40926-Komplex (400 mg; 0,230 nimol) in 25 ml 1,4-Butandiol wurde mit 60 µl konzentrierter Schwefelsäure unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt, und die Lösung wurde 55 h stehengelassen. Die Lösung wurde mit 50 ml Butanol verdünnt, und nach Zugabe von Diethylether fiel ein Feststoff aus, der gewonnen wurde und mittels präparativer HPLC unter Verwendung von 5 l 32%igem CH&sub3;CN in 0,02 M NaH&sub2;PO&sub4; gereinigt wurde. Unter Verwendung des üblichen Isolierungsverfahrens wurden 227 mg (54,5 %) der Titelverbindung erhalten.

Beispiel 7: Herstellung des Antibiotikum A 40926-Komplex-6B-(2- bromethyl)esters (Verbindung VII) und dessen Demannosyl-Analogons (Verbindung VIII)

Antibiotikum A 40926-Komplex (300 mg; 0,173 mMol) wurde in 5 ml 2- Bromethanol gelöst, und die Lösung wurde 22 h bei 0ºC gerührt. Die Temperatur wurde auf Raumtemperatur erhöht, und es wurde weitere 15 h lang gerührt. Das Ausgangsmaterial wurde vollständig in zwei lipophilere Verbindungen umgewandelt, begleitet von großen Mengen Aglycon und Mannosylaglycon. Die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt. Nach Zugabe von Diethylether bildete sich ein Niederschlag, der gewonnen wurde (295 mg) und dann unter Verwendung von präparativer HPLC (RP-18, 10 µm) mit 34 % Acetonitril in 0,02 mol/l NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer abgetrennt wurde. Zwei Fraktionen zu 15 mg (Ausbeute: 4,7 %) und 27 mg (Ausbeute: 9,3 %) wurden isoliert, die dem A 40926- 6B-(2-Bromethyl)ester (VII) bzw. dessen Demannosyl-Derivat (VIII) entsprachen.

Beispiel 8: Herstellung des N¹&sup5;-Benzyl-A 40926-Komplexes (Verbindung IX)

Antibiotikum A 40926-Komplex (1,5 g; 0,87 mMol) wurde in 100 ml trockenem DMF gelöst, und die Lösung wurde auf 0ºC abgekühlt. Der pH-Wert wurde mit 0,26 ml (1,83 mMol) Triethylamin auf 7 eingestellt. Benzylbromid (0,11 ml; 0,96 mMol) wurde unter Rühren zugesetzt, und 7 h später wurden nochmals 20,6 µl (0,145 mMol) dieses Reaktanten zugesetzt. Nach 48 h wurde Diethylether zugesetzt, der Niederschlag gewonnen, sorgfältig mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 1,53 g (96,7 %).

Beispiel 9: Herstellung von O&sup4;²-Demannosyl-A 40926-6B-methylester (d.h. A 40926 N-Acylaminoglucuronylaglycon-6B-methylester) (Verbindung X)

Eine Lösung aus 650 mg (0,086 mMol) des Antibiotikum A 40926- Komplex 6B- methylesters (I) in 7 ml DMSO wurde mit 50 µl 37%iger HCL versetzt, wodurch der pH- Wert auf 2 gebracht wurde. Das Gemisch wurde 24 h bei 50ºC erhitzt. Dann wurden weitere 25 µl HCl zugesetzt und nach 48 h wurden weitere 15 µl zugesetzt, wodurch der pH-Wert bei 2 gehalten wurde. 7 Tage später zeigte die HPLC das Verschwinden des Antibiotikum A 40926-Komplexes und das Auftreten des O&sup4;²-Demannosyl-A 40926 Komplex-6B-methylesters und des entsprechenden Aglycons in einem Verhältnis von 1,4: 1,0. Das Reaktionsgemisch wurde in ein Gemisch aus 15 ml Diethylether und 5 ml Butanol gegossen, wodurch ein fester Niederschlag (653 mg) erhalten wurde, der durch Filtration gewonnen wurde und mittels präparativer HPLC unter Verwendung isokratischer Bedingungen mit 30 % CH&sub3;CN/70 % 0,02 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (5 l), dann 33 % CH&sub3;CN/67 % 0,02 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (2 l) und schließlich 40 % CH&sub3;CN/60 % 0,02 mol/l NaH&sub2;PO&sub4; (2 l) getrennt wurde. Die die gewunschte Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf ein kleineres Volumen eingeengt und dreimal mit Butanol extrahiert; die Butanolphase wurde auf ein kleines Volumen eingeengt. Nach Zugabe von Diethylether wurden 68 mg (Ausbeute: 11,5 %) der Titelverbindung gewonnen.

Allgemeine Versuchbedingungen und analytische Verfahren

Die Verdampfüng der Lösungsmittel wurde nach Zugabe von n-Butanol zur Verhinderung des Schäumens mit einem Rotationsverdampfer bei 45ºC unter Vakuum durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Endprodukte mit Diethylether gewaschen und bei 40ºC unter Vakuum getrocknet. Die Trennungen wurden unter Verwendung von silanisiertem Silicagel 60 (0,06 bis 0,2 mm) oder Silicagel RP-8 (LiChroprep 40 bis 63 µm; Merck) mit normalen Säulen oder mittels präparativer HPLC unter Verwendung eines Waters Modell 590, ausgestattet mit einem 481 UV-Detektor und einer praparativen Lichrosorb RP-18, 10 µm-Säule (Größe 250x50 mm, Schleife 5 ml, Fließgeschwindigkeit 30 ml/min), durchgeführt. Die HPLC wurde auch zur Überwachung von Reaktionen, chromatographischen Fraktionen und Reinheit der Verbindungen unter Verwendung eines Varian 5000-Geräts, das mit einem 2050 UV-Detektor bei 254 nm und Lichrosorb RP-8, 5 µm- oder RP-18, 10 µm -Säulen (125x4 bzw. 250x4 mm) ausgestattet war, verwendet. Injektionsvolumen: 10 µl; Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min; mobile Phase, (A) 0,02 mol/l wäßriges NaH&sub2;PO&sub4;, (B) CH&sub3;CN.
Alle Verbindungen wurden nach Trocknen bei 140ºC unter N&sub2; bezüglich C, H und N analysiert. Der Gewichtsverlust wurde durch thermogravimetrische Analyse (TGA) bei 140ºC bestimmt; der anorganische Rückstand wurde nach Erhitzen der Proben bei 900ºC in O&sub2; bestimmt. Cl und Br, sofern vorhanden, wurden an, wie vorstehend beschrieben, getrockneten proben bestimmt. Die analytischen Ergebnisse entsprachen den theoretischen Werten.
Die ¹H-NMR-Spektren wurden mit AM 250 oder AM 500 Bruker-Geräten, die mit einem Aspect 3000-Computer ausgestattet waren, erhalten. Die Spektren wurden bei 40ºC in DMSO-d&sub6;-Lösung mit TMS als internem Standard aufgezeichnet.
FAB-MS-positive Ionenspektren wurden mit einem Kratos MS-50-Fokussierungs- Massenspektrometer mit einem Massenbereich von 3000 Dalton unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 8 kV erhalten. Das Gerät wurde computergesteuert betrieben. Um Daten hoher Qualität zu erhalten, wurde ein DS-90-Datensystem mit "Rohdaten"-Sammlung verwendet. Für die Kalibrierung der Masse wurde ein Gemisch aus CsI und NaI verwendet. Für FAB wurde eine Sattelfeld-Atomkanone mit Xe-Gas (Druck 2x10&supmin;&sup5; torr) bei einer Spannung von 6 kV und einer Stromstärke von 1 mA verwendet. Die Proben wurden in Methanol oder DMF in Abhängigkeit von der Löslichkeit gelöst. 1 µl dieser Lösung wurde mit 1 µl Thioglycerinmatrix, die 0,1 µl CH&sub3;COOH auf dem Target enthielt, gemischt.
Die Tabelle III faßt einige physikalisch-chemische Eigenschaften repräsentativer erfindungsgemäßer Verbindungen zusammen (die Verbindungen der Formel I, worin R' einen (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)-Alkylrest bedeutet und R&sub2;, R&sub3; und M, wie angegeben, definiert sind): Tabelle III A 40926-Derivate
Anmerkung:
a) Nach präparativer HPLC
b) M&spplus;+Na
c) Masse von MH&spplus;, basierend auf dem Isotopen-Durchschnitt

Claims

1. Neue Esterderivate des Antibiotikums A 40926 der Formel

wobei

R&sub2; ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe der Aminfunktion ist;

M ein Wasserstoffatom, eine α-D-Mannopyranosyl- oder 6-O-Acetyl-α-D-mannopyranosyl-Gruppe ist;

R' ein (C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub1;)Alkylrest ist,

R&sub3; ein (C&sub1;-C&sub6;)Alkyl-, Hydroxy(C&sub1;-C&sub6;)alkyl- oder Halo- (C&sub1;-C&sub6;) alkyl-Rest ist;

und die Additionssalze davon.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, M und R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und R&sub3; ein (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl-, Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)alkyl- oder Halo(C&sub1;-C&sub4;)alkyl-Rest ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, M eine 6-O-Acetyl-α-D-mannopyranosyl- oder α-D-Mannopyranosyl-Gruppe ist, R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat und R&sub3; ein (C&sub1;-C&sub4;)Alkyl-, Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)alkyl- oder Halo(C&sub1;-C&sub4;)alkyl-Rest ist.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, M eine 6-O-Acetyl-α-D-mannopyranosyl- oder α-D-Mannopyranosyl-Gruppe ist, R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat und R&sub3; eine (C&sub1;-C&sub4;)- Alkyl- oder 2-Hydroxyethyl-Gruppe ist.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, M eine α-D-Mannopyranosylgruppe ist, R' die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat und R&sub3; eine Methyl- oder 2-Hydroxyethylgruppe ist.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, M eine α-D-Mannopyranosylgruppe ist, R' eine n-Decyl- oder 9-Methyldecyl-Gruppe ist und R&sub3; eine Methyl- oder 2-Hydroxyethyl-Gruppe ist.

7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Umsetzung des Antibiotikum A 40926-Komplexes, seines N-Acylaminoglucuro- nyl-Aglycons oder eines N¹&sup5;-geschützten Derivats davon mit einem Überschuß des ausgewählten Alkanols in Gegenwart einer konzentrierten Mineralsäure bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur über einen von der sterischen Komplexität der einzuführenden Gruppe abhängigen Zeitraum.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei R&sub2; und M Wasserstoffatome sind und R' und R&sub3; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, das eine selektive Säurehydrolyse einer Verbindung umfaßt, in der M, R' und R&sub3; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und R&sub2; ein Wasserstoffatom ist, mit einem Gemisch von Dimethylsulfoxid/konzentrierter Salzsäure in einem Verhältnis von 78 : 1.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die N¹&sup5;-Schutzgruppe eine Benzylgruppe ist, die durch katalytische Hydrierung nach dem Veresterungsschritt entfernt wird.

10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Arzneimittel.

11. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Antibiotikum.

12. Arzneimittel, das die Verbindung nach Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.