DE3885394T2

DE3885394T2 - Teicoplaninähnliche Derivate.

Info

Publication number: DE3885394T2
Application number: DE88110194T
Authority: DE
Inventors: Piero Antonini; Angelo Borghi; Giancarlo Lancini; Raffaele Palumbo
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1987-09-07
Filing date: 1988-06-27
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2008-06-28
Also published as: EP0306645A3; EP0306645A2; JPH0763387B2; ES2059443T3; DK347788D0; JPS6468393A; US5085990A; CA1337645C; DK347788A; DE3885394D1; GB8720980D0; ATE96845T1; EP0306645B1; KR890005139A

Description

Ziel dieser Erfindung sind antibiotische Teicoplanin-artige Derivate der Formel
worin:
R 6-Methyloctanoyl und n-Nonanoyl bedeutet, und deren Additionssalze mit Sauren oder Basen.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung der genannten antibiotischen Derivate.
Teicoplanin ist ein Antibiotikum, welches durch Kultivieren des Stammes Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121 in einem assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Kulturmedium hergestellt wird.
Das Hauptprodukt, welches von dem oben erwähnten Stamm gebildet wird, war ein Gemisch aus drei Hauptfaktoren (A&sub1;, A&sub2; und A&sub3;), welche ursprünglich als Teichomycin (US-PS 4 239 751) bezeichnet wurden.
Die jüngeren Teicoplanin-Zubereitungen, welche durch Reinigen des aus der Fermentationsbrühe gewonnenen Produktes erhalten werden und für die chemotherapeutische Verwendung zur Behandlung von durch gram-positive Organismen verursachten Infektionen geeignet sind (H.H. Williams et al.: Journal of Hospital Infection (1986), 7 (Supplement A) , 101-103), enthalten als Hauptkomponente einen Komplex aus fünf strukturell eng verwandten Substanzen, welche ursprünglich als Ganzes als Teichomycin Faktor A&sub2; bezeichnet wurden. Die oben erwähnten fünf eng verwandten Substanzen sind nacheinander isoliert und als einzelne Komponenten des Komplexes charakterisiert worden, welcher Komplex dann gegenwärtig in den wissenschaftlichen Zeitungen und in der Patentliteratur als "Teicoplanin A&sub2;" oder "Teicoplanin-Komplex" bezeichnet wird.
Die fünf Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes (welche üblicherweise als: TA2-1, TA2-2, TA2-3, TA2-4 und TA2-5 bezeichnet werden) können durch die vorstehende allgemeine Formel (I) oben dargestellt werden, worin R jeweils
TA2-1) : N-(Z-4-Decenoyl);
TA2-2) : N-(8-Methyl-nonanoyl);
TA2-3) : N-Decanoyl;
TA2-4) : N-(8-Methyl-decanoyl);
TA2-5) : N-(9-Methyl-decanoyl);
darstellt.
Ihre jeweiligen Verhältnisse im Teicoplanin-Komplex können in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen und den zum Fermentationsmedium zugesetzten Precursoren variieren, wie es in der EP-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. 204 179 beschrieben ist.
Die Verbindungen dieser Erfindung können durch Fermentation von Actinoplanes teichomyceticus-Stämmen erhalten werden. Insbesondere hat sich ein Stamin von Actinoplanes teichomyceticus, welcher mit unserem internen Code Nr. A-184 gekennzeichnet ist, als geeigneter Produzent der vorstehend erwähnten Teicoplanin- artigen Derivate erwiesen. Eine Probe des genannten Stammes wurde am 21. Juli 1987 bei der ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A.) unter den Bedingungen hinterlegt, welche durch den Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren geschaffen wurden, wo er die folgende ATCC-Nummer 53649 erhalten hat.
Bei dem vorstehenden Stamm, welcher durch die ATCC-Nr. 53649 gekennzeichnet ist, handelt es sich um eine künstliche Mutante von Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, welche durch Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten und aufgrund ihrer Fähigkeit zur Produktion beträchtlicher Mengen Teicoplanin-artiger Antibiotika, welche sich von den fünf Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes unterscheiden, ausgewählt wurde.
Die Mutante A-184 zeigt im wesentlichen die gleichen morphologischen und physiologischen Kennmerkmale wie der Mutterstamm ATCC 31121, welcher in der US-PS 4 239 751 beschrieben ist.
Es wurde nun gefunden, daß geringe Mengen der Antibiotika dieser Erfindung auch durch den Mutterstamm Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 unter genauen Fermentationsbedingungen hergestellt werden können, aber die Isolierung der geringen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen aus den viel größeren Mengen der Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes, welche durch den genannten Mikroorganismus produziert werden, ist sehr arbeitsintensiv und zur Gewinnung der gewünschten Verbindungen in einer für experimentelle Zwecke und die praktische Verwendung geeigneten Größenordnung nicht zweckmäßig.
Die Mutante A-184 liefert ebenfalls eine bestimmte Menge der Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes zusammen mit den neuen Verbindungen dieser Erfindung, aber deren relatives Verhältnis in der Fermentationsbrühe ist viel geringer als jene, welche vom Mutterstamm erhalten wird. Daher ist die Abtrennung und die Gewinnung der neuen Verbindungen aus der Fermentationsbrühe der Mutante A-184 einfacher und es können wesentliche Mengen der neuen Teicoplanin-artigen Derivate erhalten werden.
Um die Verbindungen dieser Erfindung zu erhalten, wird der produzierende Actinoplanes teichomyceticus-Stamm unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, fermentiert.
Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Mannose, Galactose, Stärke, Maismehl und dgl. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Ammoniak, Nitrate, Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dgl. Unter den anorganischen Salzen, welche in dem Kulturmedium einverleibt sein können, sind die herkömmlichen löslichen Salze, welche fähig sind, Natrium, Kalium, Eisen, Zink, Kobalt, Mangan, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Iodid, Carbonat, Sulfat, Phosphat, Nitrat und ähnliche Ionen zu liefern.
Üblicherweise wird der das Antibiotikum produzierende Stamm in einem Schüttelkolben vorkultiviert, anschließend wird die Kultur verwendet, um Fermentergefäße zur Herstellung beträchtlicher Mengen der antibiotischen Substanzen zu beimpfen. Das für die Vorkultur verwendete Medium kann das gleiche sein wie jenes, welches für größere Fermentationen angewandt wird, aber es können auch andere Medien verwendet werden. Der produzierende Stamm kann bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC, vorzugsweise zwischen 26ºC und 32ºC, kultiviert werden.
Während der Fermentation kann die Antibiotikumproduktion durch Untersuchen von Brühe- oder Myzelextraktproben auf antibiotische Aktivität,beispielsweise durch Bioassay- oder DC- oder HPLC-Verfahren, überwacht werden.
Gegenüber den Antibiotika dieser Erfindung empfindliche Organismen wie Bacillus subtilis und S. aureus können als Testorganismen verwendet werden. Der Bioassay wird herkömmlicherweise mittels des Agar-Diffusionsverfahrens auf Agarschalen durchgeführt. Die Maximalproduktion der antibiotischen Aktivität tritt im allgemeinen zwischen dem zweiten und dem fünften Tag nach der Beimpfung auf.
Die Gewinnung der antibiotischen Substanzen dieser Erfindung aus dem Reaktionsmedium des produzierenden Mikroorganismus wird gemäß an sich bekannter Verfahren durchgeführt, welche die Extraktion mit Lösungsmitteln, die Fällung durch Zusetzen von Nicht-Lösungsmitteln oder durch Ändern des pH-Wertes der Lösung, die Verteilungschromatographie, die Umkehrphasenverteilungschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie und dgl. beinhalten.
Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt eine Affinitätschromatographie auf immobilisiertem D-Alanyl-D-Alanin, gefolgt von einer Umkehrphasensäulenchromatographie.
Immobilisierte D-Alanyl-D-Alanin-Matrizes, welche für das vorliegende Gewinnungsverfahren geeignet sind, sind in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 122 969 beschrieben. Die bevorzugte Matrix dieses Verfahrens ist D-Alanyl-D-Alanin, gekoppelt mit einem vernetzten Polydextran mit einer kontrollierten Porengröße.
Die Fermentationsbrühe kann der Affinitätschromatographie direkt nach der Filtration oder nach einem vorhergehenden Reinigungsverfahren unterworfen werden. Dieses letztgenannte Verfahren umfaßt das Alkalisch-Stellen der gesamten Fermentationsmasse, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 9 bis 11,5, um die auf dem Myzel adsorbierte antibiotische Substanz zu solubilisieren, und das anschließende Filtrieren. Das klare Filtrat wird anschließend auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und danach einer Affinitätschromatographie über immobilisiertes D-Alanyl-D-Alanin, entweder in einer Säule oder diskontinuierlich, unterworfen.
Die Eluierung wird bei basischeren pH-Werten (vorzugsweise von 9,0 bis 11,0) mittels einer wäßrigen Base durchgeführt. Diese wäßrige Base kann Ammoniak, ein flüchtiges Amin, ein Alkali- oder Alkalimetallhydroxid oder eine basisch gepufferte Lösung, wahlweise in Gegenwart eines polaren organischen Lösungsmittels, wie eines polaren wassermischbaren Lösungsmittels, sein. Die Fraktionen werden gesammelt, mit einer Säure (entweder einer organischen oder einer anorganischen, vorzugsweise mit Ameisensäure) neutralisiert und mittels HPLC untersucht, um jene Fraktionen zu bestimmen, welche verarbeitbare Mengen der Verbindungen dieser Erfindung enthalten (die Bezeichnung "verarbeitbare Menge" soll bedeuten, daß die in der eluierten Lösung gemeinsam mit den Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes vorhandene Menge an gewünschter Verbindung (gewünschten Verbindungen) ausreichend ist, um deren Isolierung in einer nennenswerten Menge mittels herkömmlicher Auftrennungs- und Reinigungsverfahren zu erlauben). Üblicherweise werden die eluierten Fraktionen, welche mindestens 2 % von einer der gewünschten Verbindungen, bezogen auf die gesamte HPLC-Fläche im Verhaltnis zu Teicoplanin und Teicoplanin-ähnlichen Produkten, enthalten, als solche betrachtet, welche eine "verarbeitbare Menge" der gewünschten Verbindung enthalten. Unter den Bedingungen aus Beispiel 2.2.3 weist die Verbindung der Formel I, worin R 6-Methyloctanoyl bedeutet (Verbindung A), einen Wert für die Retentionszeit (RT) von 19,93 Minuten auf, wogegen die Verbindung, worin R n-Nonanoyl ist (Verbindung B), einen RT-Wert von 20,96 Minuten besitzt. Als eine Referenz beträgt der RT-Wert für TA2-2 unter den gleichen Betriebsbedingungen 24,71 Minuten.
Jene Fraktionen, welche verarbeitbare Mengen der gewünschten Verbindungen beinhalten, werden gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert und anschließend lyophilisiert.
Das Rohprodukt aus der Lyophilisation wird in einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel gelöst und anschließend in mehreren Teilen einer semi-präparativen HPLC unter Verwendung eines Gradientengemisches aus einem polaren aprotischen organischen Lösungsmittel und einem wäßrigen Ammoniumsalz als mobile Phase unterworfen.
Beispiele des polaren aprotischen organischen Lösungsmittels sind (C&sub1;-C&sub4;)-Alkyl, Niederalkylamide oder Thioamide, wie vorzugsweise Dimethylformamid oder Diethylformamid.
Beispiele von Ammoniumsalzen sind Ammoniumformiat, Ammoniumacetat, Methylammoniumformiat, wobei Ammoniumformiat bevorzugt wird.
In diesem Fall ist die stationäre Phase vorzugsweise ein silanisiertes Silicagel, d.i. ein Silicagel, welches mit (C&sub8;-C&sub2;&sub2;)-Alkylgruppen funktionalisiert ist.
Die bevorzugte mobile Phase wird durch Gemische von 0,02 M Ammoniumformiat/Acetonitril im Verhältnis 95:5 und 0,02 M Ammoniumformiat/Acetonitril im Verhältnis 25:75 gebildet.
Aus den Eluaten von jedem der einer präparativen HPLC unterworfenen Teile werden die Fraktionen, welche die Verbindung A bzw. B als die Hauptprodukte (laut HPLC-Analyse) enthalten, isoliert und mit jenen der anderen Teile vereinigt. Beispielsweise werden in einem typischen Arbeitsschritt zwei Lösungen erhalten, wovon die erste etwa 80 % des 6-Methyloctanoylderivates mit geringen Mengen (etwa 1,5 %) der n-Nonanoylverbindung enthält, wogegen die zweite etwa 90 % der n-Nonanoylverbindung mit etwa 6 % der 6-Methyloctanoylverbindung beinhaltet.
Die beiden Lösungen werden unter Vakuum konzentriert, ultrafiltriert und anschließend lyophilisiert, um zwei feste Produkte zu ergeben, die durch Wiederholen der semi-präparativen HPLC weiter gereinigt werden, um die reinen Verbindungen der Formel I zu erhalten, deren Charakterisierungsdaten in den Beispielen angeführt sind.
Wie bereits erwähnt, besitzen die antibiotischen Substanzen dieser Erfindung saure und basische Funktionen und können gemäß herkömmlicher Verfahren Salze ausbilden.
Beispielhafte und geeignete Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel I umfassen jene Salze, welche durch Standardreaktion mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Trichloressigsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholinsäure, Pamoasäure, Schleimsäure, Glutaminsäure, Camphersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und dgl. Säuren.
Repräsentative Beispiele von Basen sind: Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhydroxide, wie Natrium-, Kalium- und Calciumhydroxid; Ammoniak und organische Amine, d.s. aliphatische, alicyclische oder aromatische Amine, wie Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin, Dimethylanilin und Picolin.
Die Überführung der freien Amino- oder "Nicht-Salz"- Verbindungen der Erfindung in die entsprechenden Additionssalze und umgekehrt, d.h. die Überführung eines Additionssalzes einer Verbindung der Erfindung in die Nicht-Salzform liegen im Rahmen der herkömmlichen technischen Fähigkeiten und werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Beispielsweise kann eine Verbindung der Erfindung in das entsprechende Säure- oder Basenadditionssalz übergeführt werden durch Lösen der Nicht-Salzform in einem wäßrigen Lösungsmittel und Zusetzen eines geringen molaren Überschusses von der ausgewählten Säure oder Base. Die entstehende Lösung oder Suspension wird anschließend lyophilisiert, um das gewünschte Salz zu gewinnen.
Im Fall, daß das Endsalz in einem Lösungsmittel unlöslich ist, worin die Nicht-Salzform löslich ist, wird es durch Filtration aus der organischen Lösung der Nicht-Salzform nach Zugabe der stöchiometrischen Menge oder eines geringen molaren Überschusses von der ausgewählten Säure oder Base gewonnen.
Die Nicht-Salzform kann aus einem entsprechenden Säure- oder Basensalz hergestellt werden, welches in einem wäßrigen Lösungsmittel gelöst ist, das anschließend neutralisiert wird, um die Nicht-Salzform freizusetzen.
Wenn auf die Neutralisation folgend eine Entsalzung erforderlich ist, kann ein herkömmliches Entsalzungsverfahren angewandt werden.
Zum Beispiel kann eine Säulenchromatographie über silanisiertes Silicagel, nicht-funktionalisiertes Polystyrol, Acryl- und Polydextranharze mit kontrollierter Porengröße (wie Sephadex LH 20) oder über Aktivkohle in zweckmäßiger Weise angewandt werden. Nach dem Eluieren der ungewünschten Salze mit einer wäßrigen Lösung wird das gewünschte Produkt mittels eines linearen Gradienten oder eines stufenweisen Gradienten von einem Gemisch aus Wasser und einem polaren oder apolaren organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser von 50:50 bis etwa 100% Acetonitril, eluiert.
Es ist in der Technik bekannt, daß die Salzbildung entweder mit pharmazeutisch annehmbaren Säuren (oder Basen) oder mit nicht-pharmazeutisch annehmbaren Säuren (oder Basen) als praktisches Reinigungsverfahren verwendet werden kann. Nach der Bildung und Isolierung kann die Salzform eines Antibiotikums der vorstehenden Formel I in die entsprechende Nicht-Salzform oder in eine pharmazeutisch annehmbare Salzform übergeführt werden.
Die Teicoplanin-artigen Verbindungen dieser Erfindung sind gegenüber gram-positiven Bakterien, welche für viele weit verbreitete Infektionen verantwortlich sind, wirksam. Sie können daher zur Herstellung von Arzneimitteln wertvoll sein. Darüber hinaus können die Verbindungen dieser Erfindung als das Tierwachstum fördernde Mittel verwendet werden, d.h. zur Erhöhung der Nahrungseffizienz von fleisch- oder milchproduzierenden Tieren.
Die antibakterielle Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung kann in vitro mittels Standardverdünnungstests auf verschiedenen Mikroorganismenkulturen gezeigt werden.
Die Kulturmedien und die Wachstumsbedingungen für MIC (minimale Inhibitionskonzentrations)-Bestimmungen waren wie folgt:
Isosensitest-Broth (Oxoid) , 24 h, für Staphylococcen, Strep. faecalis und gram-negative Bakterien (Escherichia coli); Todd-Hewitt Broth (Difco), 24 h, für andere Streptococcenspezies; GC-Basis-Broth (Difco) + 1% Isovitalex (BBL), 48 h, CO&sub2;-angereicherte Atmosphäre für Neisseria gonorrhoeae; Brain-Heart-Broth (Difco) + 1% Supplement C (Difco), 48 h, für Haemophilus influenzae; die Impflösungen bestanden aus etwa 10&sup4;-10&sup5; koloniebildenden Einheiten/ml für durch Broth-Verdünnung ermittelte MICen.
Die minimalen Inhibitionskonzentrationen (MIC, Mikrogramm/ml) der obigen Teicoplanin-artiger Derivate für einige Mikroorganismen sind nachstehend in Tabelle I angeführt. TABELLE I Stamm M.I.C. (ug/ml) Verbindung A Staph. aureus L165 Staph. aureus (10&sup6; Kolonie bildende Einheiten) Staph. aureus (30% Rinderserum) Staph. epidermis L147 ATCC 12228 (Koagulase negativ ) Strep. pyrogenes L49 C203 Strep. pneumoniae L44 UC41 Strep. faecalis L149 ATCC 7080 Strep. mitis L796 (klinisches Isolat) Neisseria gonorrhoeae L997 ISM68/126 Haemophilus influenzae L 970 Typ b ATCC 19418 Escherichia coli L47 SKF 12140 Proteus vulgaris L79 X19H ATCC881 Pseudomonas aeruginosa L4 ATCC10145 Staph. haemolyticus L602 (klinisches Isolat)
Zur Verwendung als Arzneimittel können die Teicoplanin-artigen Derivate dieser Erfindung auf verschiedenen Wegen als freie Verbindungen oder in der Form pharmazeutisch annehmbarer Salze verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung ist im allgemeinen der bevorzugte Weg.
Für diesen Zweck wird eine Verbindung der Erfindung vorzugsweise durch Vermischen mit einem herkömmlichen Träger zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert.
Zusammensetzungen für die Injektion werden bevorzugt und können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern annehmen und können Hilfsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel beinhalten.
In alternativer Weise kann der wirksame Bestandteil in Pulverform zur Wiederherstellung zum Zeitpunkt der Einnahme vorliegen, wenn ein geeigneter Träger wie steriles Wasser dazu zugesetzt wird.
In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg können diese Verbindungen in verschiedenen Dosierungsformen formuliert werden.
In einigen Fällen kann es möglich seine die Verbindungen der Erfindung in enterisch beschichteten Dosierungsformen für die orale Verabreichung zu formulieren, welche nach technikbekannter Weise hergestellt werden können (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, S. 1614).
Dies könnte im speziellen der Fall sein, wenn die Absorption der antimikrobiellen Substanz im Darmtrakt besonders gewünscht wird, wogegen sie durch den Magentrakt unverändert hindurchtreten soll.
Die Menge an zu verabreichendem wirksamem Prinzip hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der Größe und dem Zustand des zu behandelnden Patienten, dem Verabreichungsweg und der Häufigkeit der Verabreichung und dem involvierten verursachenden Mittel.
Die antibiotischen Substanzen der vorliegenden Erfindung und die physiologisch annehmbaren Salze hievon sind im allgemeinen bei einer täglichen Dosierung von etwa 1 bis 20 mg an wirksamem Bestandteil je kg Körpergewicht des Patienten, wahlweise in 1 bis 4 tägliche Verabreichungen aufgeteilt, wirksam.
Besonders wünschenswerte Zusammensetzungen sind jene, welche in Dosierungseinheiten hergestellt werden, die etwa 50 bis etwa 2.000 mg je Einheit enthalten.
Verzögernd wirkende Formulierungen können, wie in der Technik bekannt, auf verschiedenen Mechanismen und Verfahren basierend hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer verzögert wirkenden Formulierung, welche die Teicoplanin-artigen Antibiotika dieser Erfindung enthält, beinhaltet die Verwendung einer wasserunlöslichen Form des Antibiotikums, welche in einem wäßrigen oder öligen Medium suspendiert ist.
Zur Verwendung als ein das Wachstum förderndes Mittel wird eine Verbindung der Erfindung oral in einem geeigneten Futter verabreicht. Die genaue angewandte Konzentration ist jene, welche benötigt wird, damit das wirksame Mittel in einer das Wachstum fördernden Menge bereitgestellt wird, wenn übliche Mengen an Futter konsumiert werden.
Die Zugabe der wirksamen Verbindung der Erfindung zu Tierfutter wird vorzugsweise durch Herstellen eines geeigneten Futtervorgemisches, welches die wirksame Verbindung in einer wirksamen Menge enthält, und das Einverleiben des Vorgemisches in der vollständigen Ration durchgeführt.
In alternativer Weise kann ein Zwischenkonzentrat oder ein Futterzusatz, welche den wirksamen Bestandteil enthalten, in das Futter eingemischt werden.
Der Weg, auf welchem solche Futtervorgemische und vollständige Rationen hergestellt und verabreicht werden können, ist in Referenzbüchern beschrieben (wie "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S.Francisco, USA, 1969, oder "Livestock Feeds and Feeding", O and B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) und hierin durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele

Beispiel 1:

Isolierung der Actinoplanes teichomyceticus-Mutante Stamm A-184 (ATCC 53649)

Eine Zellsuspension des mikrobiellen Stammes Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 in S/bis-Kultur-Broth, welche 10&sup8;-10&sup9; Zellen je ml enthält, wird während 60 Minuten in Gegenwart von Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (100 ug/ml) behandelt.
Anschließend werden Proben von 0,1 ml der Suspension wieder in 10 ml frischem S/bis-Kulturmedium:
Glucose 10 g/l
Bacto-Pepton Difco 4 g/l
Bacto-Hefe-Extrakt Difco 4 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 4 g/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 7 suspendiert und auf Platten mit SM-Medium:
Glucose 10 g/l
Bacto-Pepton Difco 4 g/l
Bacto-Hefe-Extrakt Difco 4 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 4 g/l
Agar Difco 20 g/l
Sterilisation: 15 min bei 121ºC
in verschiedenen Verdünnungen (von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup6; in einer physiologischen Lösung) aufgebracht und während 13 Tagen bei 20ºC inkubiert.
Die erhaltenen Kolonien werden zufallsmäßig aufgenommen und in 500 ml Erlenmeyer-Kolben fermentiert, welche 100 ml Medium C enthalten:
Glucose (a) 2 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Asparagin 1,5 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
CaCO&sub3; 5 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,1 g/l
mineralische Ergänzung (b) 1 ml/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 6,9
(a) Die Glucose wurde getrennt sterilisiert
(b) Zusammensetzung der mineralischen Ergänzung:
Borsäure 0,50 g/l
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,04 g/l
KI 0,10 g/l
FeCl&sub3;.6H&sub2;O 0,20 g/l
MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,40 g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,40 g/l
Ammoniummolybdat 0,20 g/l
Die Kulturbrühen werden anschließend gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2 mit HPLC analysiert, um jene Kulturen zu identifizieren, welche Teicoplanin-artige Verbindungen produzieren, die von den fünf Hauptkomponenten des Teicoplanin-Komplexes verschieden sind, insbesondere jene Verbindungen, welche RT-Werte von 19,93 bzw. 20,96 zeigen.
Die genannten Kulturen werden ausgewählt, getrennt aufbewahrt und eingefroren.

Beispiel 2:

Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin R 6-Methyloctanoyl (Verbindung A) und n-Nonanoyl (Verbindung B) darstellt.

2.1 Fermentation

2.1.1 Kulturmedien:

S/bis

Glucose 10 g/l
Bacto-Pepton Difco 4 g/l
Bacto-Hefe-Extrakt Difco 4 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 2 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 4 g/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 7

Medium C:

Glucose (a) 2 g/l
Hefeextrakt 5 g/l
Asparagin 1,5 g/l
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,5 g/l
CaCO&sub3; 5 g/l
NaCl 0,1 g/l
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,1 g/l
mineralische Ergänzung (b) 1 ml/l
pH-Wert nach der Sterilisation: 6,9
(a) Die Glucose wurde getrennt sterilisiert
(b) Zusammensetzung der mineralischen Ergänzung:
Borsäure 0,50 g/l
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 0,04 g/l
KI 0,10 g/l
FeCl&sub3;.6H&sub2;O 0,20 g/l
MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,40 g/l
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,40 g/l
Ammoniummolybdat 0,20 g/l

2.1.2 Fermentationsbedingungen

Eine gefrorene Ausgangskultur des Stammes A-184 (2,5 ml) wird verwendet, um einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben zu beimpfen, welcher 100 ml vegetatives Medium (S/bis) enthält. Die Kultur wird bei 28ºC während 48 h auf einer Schüttelvorrichtung bei 200 UpM und 5 cm Auslenkung inkubiert.
Diese Kultur (400 ml) wird verwendet, um einen 4 l-Produktionsmedium (Medium C) enthaltenden Fermenter zu beimpfen. Das Gefäß wird mit steriler Luft mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 l/min belüftet und mit 900 UpM gerührt, während die Temperatur bei 28ºC gehalten wird.

2.2 Isolierung

2.2.1 Gewinnung

Die Kulturbrühe aus vier Fermentern wird 4 Tage nach der Beimpfung gesammelt und nach Einstellung auf einen pH-Wert von 11 durch Zugabe von 2N NaOH während 15 min gerührt und anschließend unter Vakuum filtriert. Der pH-Wert der kombinierten filtrierten Brühe (14 l) wird mit 2,5N HCl auf 7,5 eingestellt. Eine geeignete Menge (200 ml) von Sepharose-Acyl-D-alanyl-D-alanin-Affinitätsharz (A. Corti, G. Cassani - Synthesis and characterization of D-alanyl-D-alanine-agarose: a new bioselective adsorbent for affinity chromatography of glycopeptide antibiotics, Appl. Biochem. Biotec. 11, 101-109, 1985) wird zugesetzt, und es wird über Nacht bei 4ºC gerührt. Das Harz wird anschließend von der gewonnenen Brühe abgetrennt und in eine Chromatographiesäule geleert. Die Säule wird mit dem 5-fachen Harzvolumen an Tris-HCl-Puffer (0,05M, pH-Wert 7,5) und anschließend mit dem gleichen Volumen an Tris-Base-Lösung (0,05M) gewaschen. Die Lösung wird anschließend mit einer wäßrigen Lösung von NH&sub4;OH (1 % Gew./Vol.) eluiert und 200 ml-Fraktionen werden gesammelt und durch analytische HPLC (siehe unter 2.2.3) untersucht. Die Fraktionen, welche die gewünschte antibiotische Substanz enthalten (2 bis 6) , werden ausgewählt und gesammelt und nach Neutralisierung mit Ameisensäure durch Ultrafiltration (siehe unter 2.2.2) auf 70 ml eingeengt. Ein Rohprodukt von 2,53 g wird anschließend durch Lyophilisieren erhalten. Dieses durch HPLC analysierte Rohprodukt zeigt das Vorhandensein der Verbindungen A und B in Mengen, welche etwa 4 % bzw. 12 % der gesamten HPLC-Fläche relativ zu Teicoplanin und Teicoplaninartigen Produkten entsprechen. Dieses Rohprodukt wird anschließend einer semi-präparativen HPLC (siehe unter 2.3.1) unterworfen.

2.2.2 Ultrafiltration

Die neutralisierten Eluate werden in einem 142 mm Hi-Flux U-F Cell Millipore-Gerät, welches eine PCAC Pellicon-Ultrafiltrationsmembran mit einem nominalen Molekulargewichtslimit (NMWL) von 1000 Dalton enthält, konzentriert.

2.2.3 Analytische HPLC

Gerät: Hewlett Packard-Flüssigkeitschromatograph, Modell 1084 B; der UV-Detektor ist auf 254 nm eingestellt.
Säule: Erbasil C18, 5 um, 150 x 4,6 mm (Carlo Erba)
Mobile Phase: A: 0,02M NaH&sub2;PO&sub4;/CH&sub3;CN (95:5)
B: 0,02M NaH&sub2;PO&sub4;/CH&sub3;CN (25:75) Gradient: stop
Durchflußgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
Säulendruck: 200 atm
Einspritzvolumen: 20 um
Verstärkung: 8
Vorschubgeschwindigkeit: 0,5 cm/min
Standard: Teicoplanin-A&sub2;-Komplex (A. Borghi et al.: The Journal of Antibiotics, Bd. 37, Nr. 6, S. 615-620, Juni 1984), gelöst in Wasser, um eine Lösung mit einer Konzentration von 1156,5 ug/ml zu erhalten.
Unter diesen Bedingungen zeigt die Verbindung A eine Retentionszeit (RT) von 19,93 Minuten, während die Verbindung B eine RT von 20,96 Minuten aufweist.

2.3 Reinigung und Charakterisierung

2.3.1 Semi-präparative HPLC

Das aus der Lyophilisierung resultierende Rohprodukt wird in aliquote Teile von 300 mg unterteilt und in 1 ml Dimethylformamid gelöst, zu welchem 1 ml eines Gemisches aus Wasser/Acetonitril (1:1, Vol./Vol.) zugesetzt wird. Jeder Teil wird anschließend unter den folgenden Bedingungen einer semi-präparativen HPLC unterworfen:
Gerät: Hewlett Packard-Flüssigkeitschromatograph, Modell 1084B; der UV-Detektor wurde auf 254 nm eingestellt
Säule: LiChrosorb RP-18, 7 um, 250x10 mm (Merck)
Mobile Phase: A: 0,02M HCOONH&sub4;/CH&sub3;CN (95:5)
B: 0,02M HCOONH&sub4;/CH&sub3;CN (25:75) Gradient: stop
Durchflußgeschwindigkeit: 4 ml/min
Säulendruck: 130 atm
Einspritzvolumen: 200 um
Verstärkung: 1024
Vorschubgeschwindigkeit: 0,5 cm/min
Es werden zwei Fraktionen isoliert, welche den bei RT-Werten von 10,2 Minuten (Fraktion Nr. 1) bzw. 12,4 Minuten (Fraktion Nr. 2) liegenden Peaks entsprechen. Die Eluate aus jeder Einspritzung werden vereinigt und durch analytische HPLC untersucht (siehe unter 2.2.3).
Es werden zwei Lösungen mit den folgenden Volumina und Konzentrationen erhalten. % nach HPLC Vereinigte Fraktionen Nr. Volumen (ml) Konz. (ug/ml) Gesamtmenge (mg) Verb. A.
Der größte Teil des Acetonitrils wird unter Vakuum von den Lösungen 1 und 2 entfernt, welche anschließend durch Ultrafiltration konzentriert und lyophilisiert werden, um die jeweiligen festen Produkte zu ergeben.
Die vorstehend beschriebene semi-präparative HPLC wird mit den Rohlyophilisaten wiederholt, welche aus den anderen drei Fermentationen und Gewinnungschargen der gleichen Größe, wie sie unter 2.1.2 und 2.2.1 beschrieben sind, stammen.
Die festen Produkte, welche aus den Lösungen 1 und 2 jeder Charge resultieren, werden anschließend vereinigt und durch abermaliges Unterwerfen unter semi-präparative HPLC-Schritte unter den gleichen vorstehend beschriebenen Bedingungen weiter gereinigt. Die Ausbeute beträgt 35,2 mg an Verbindung A bzw. 28,9 mg an Verbindung B, welche durch NMR-Spektroskopie und Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie (FAB-Spektroskopie) charakterisiert werden.
Die NMR- und FAB-Spektren zeigen deutlich, daß die Struktur der Verbindung A jene eines Teicoplanins ist, welches als Seitenkette einen 6-Methyloctanoylrest (Formel I, worin R 6-Methyloctanoyl darstellt) besitzt, und daß die Struktur der Verbindung B jene eines Teicoplanins mit einer n-Nonanoyl- Seitenkette ist (Formel I, worin R für n-Nonanoyl steht).

2.3.2 NMR-Spektroskopie

Das Gerät ist ein Bruker Modell AM-250 mit einem Array-Prozessor, einem Magneten bei 250 MHz und einer computerisierten Konsole Aspect 3000. Die Spektren werden in DMSO- d&sub6;-Lösungen bei 25ºC mit Tetramethylsilan als Referenz erhalten.
Die Figuren 1 und 2 zeigen die ¹H-NMR-Spektren der Verbindungen A und B.
Die Zuordnung der signifikantesten Peaks ergibt sich auf Basis eines Vergleiches mit dem Teicoplanin-Spektrum und auf Basis der zweidimensionalen Spektroskopie, nämlich der ¹H homonuklearen Korrelationsspektroskopie. Die Spektren der Verbindung A und der Verbindung B unterscheiden sich von jenen der Teicoplanin-A&sub2;-Komplex-Komponenten nur in der Region der aliphatischen Kette. Tatsächlich werden in der Verbindung A zwei Methylgruppen gefunden, nachgewiesen durch ein Triplett infolge des CH&sub2;-CH&sub3;-Restes und ein Doublett infolge des (CH)-CH&sub3;-Restes, welche sich bei δ= 0,8 ppm (J=6,4 Hz) nahezu decken. Zusätzlich liegen in der Kette vier CH&sub2;-Gruppen vor, was aus dem Integral des Spektrums folgt.
In der Verbindung B wird die endständige Methylgruppe der Kette durch ein Triplett infolge des (CH&sub2;)-CH&sub3;-Restes bei δ =0,83 ppm (J=6,5 Hz) gezeigt. In der Kette sind sieben CH&sub2;-Gruppen vorhanden, was aus dem Integral des Spektrums folgt.

1.2.2 Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie

Bei dem Gerät handelt es sich um ein VG 70/250, wobei das Gemisch Thioglycerin:Glycerin (2:1, Vol./Vol.) als Matrix verwendet wird. Bombardmentgas: Xe; kinetische Energie 6-8 keV; Beschleunigungsspannung: 6 kV. Die Spektren der Positiven Ionen werden von m/z 600 bis 2000 aufgezeichnet.
Die kationisierten Molekülionen (MH&spplus; oder MNa&spplus;) oder und die Addukte mit der Matrix, welche mittels FAB-MAS bestimmt werden, weisen auf ein Molekulargewicht von 1863 (geringste Isotopenzusammensetzung) in Übereinstimmung mit den NMR-Daten für beide Verbindungen hin.

Claims

1. Teicoplanin-artiges Derivat der Formel

worin:

R 6-Methyloctanoyl und n-Nonanoyl bedeutet, oder ein Additionssalz hievon mit Säuren oder Basen.

2. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Arzneimitttel.

3. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 als Tierwachstumsfaktor.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, welches das Kultivieren eines Actinoplanes teichomyceticus-Stammes unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, bei einer Temperatur von 20ºC bis 40ºC und das Abtrennen der vorstehenden zwei Produkte von den anderen Komponenten des rohen Isolates aus der filtrierten Fermentationsbrühe mittels chromatographischer Verfahren umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin es sich bei dem Actinoplanes teichomyceticus-Stamm um Actinoplanes teichomyceticus ATCC 53649 oder einen Abkömmling hievon handelt, welcher fähig ist, eine Verbindung nach Anspruch 1 zu bilden.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin das rohe Isolat aus der filtrierten Fermentationsbrühe durch Inkontaktbringen der filtrierten Fermentationsbrühe mit einer immobilisierten D-Alanyl-D-Alanin-Affinitätsmatrix bei einem pH-Wert von 7 bis 8, Eluieren der Matrix mit einer wäßrigen Base bei einem pH-Wert von 9 bis 11, Sammeln jener Fraktionen, welche verarbeitbare Mengen der Teicoplanin-artigen Verbindungen nach Anspruch 1 enthalten, Konzentrieren der gesammelten Fraktionen durch Ultrafiltration und Lyophilisieren des Konzentrates erhalten wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, worin die Abtrennung der Verbindungen nach Anspruch 1 von den anderen Komponenten des rohen Isolates aus der filtrierten Fermentationsbrühe durch semi-präparative HPLC ausgeführt wird, wobei lineare stufenweise Gradientengemische von wäßrigen Ammoniumformiat/Acetonitril-Gemischen als mobile Phase verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die als mobile Phase verwendeten Gemische 0,02M Ammoniumformiat/Acetonitril 95:5 und 0,02M Ammoniumformiat/Acetonitril 25:75 sind.

9. Actinoplanes teichomyceticus ATCC 53649 oder ein Abkömmling hievon, welcher fähig ist, eine Verbindung nach Anspruch 1 zu bilden.

10. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung als Antibiotikum.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Verbindung nach Anspruch 1 in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.