DE69132216T2 - Pflanzentransformationverfahren mit Früherkennung von Keimbahn-Transformationsereignissen - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die genetische Transformation von Bohnenpflanzen und insbesondere eine effiziente Keimbahntransformation von Sojabohnenpflanzen unter Verwendung des Partikel-vermittelten Verfahrens zur Transformation von Pflanzen.
• In einige der wesentlichen Nutzpflanzen kann man inzwischen fremde Gene, die möglicherweise von Interesse sind, einführen. Das Verfahren zur genetischen Veränderung wurde in bestimmten Modellarten, wie Tabak, Petunia und Möhre durchgeführt und wurde inzwischen auch in wesentlichen Arten von Nutzpflanzen, wie Sojabohnen und Baumwolle erzielt. Bei den Verfahren zur genetischen Veränderung von Pflanzen ist es bevorzugt, dass die genetische Transformation des Pflanzengewebes die Keimbahn des Pflanzengewebes umfasst. Mit Keimbahn bezeichnet man das vererbbare genetische Material der Pflanze, welches durch das Transformationsverfahren dauerhaft so verändert wird, dass das eingeführte Fremdgen von der Pflanze an ihre Nachkommen durch normale genetische Vererbung übertragen wird. Während die Transformation somatischer Zellen oder von Zellen außerhalb der Keimbahn in einigen Fällen bevorzugt sein mag, ist es bei der genetischen Veränderung von Nutzpflanzen grundsätzlich bevorzugt, dass eine Keimbahntransformation der Pflanzenlinien so schnell und effizient wie möglich erzielt wird.
• Das am häufigsten verwendete Verfahren zur genetischen Veränderung von Pflanzen umfasst die Verwendung des im Boden wachsenden und für Pflanzen pathogenen Bakteriums Aarobacterium tumefaciens. A. tumefaciens weist natürlicherweise die Fähigkeit auf, einen Teil seiner DNS, der als T-DNS bezeichnet wird, in das Genom dafür empfänglicher Pflanzenzellen zu übertragen. Durch Veränderung der nativen T-DNS eines Agrobacterium-Stammes ist es möglich, diese einzigartige Eigenschaft des Agrobacterium zur Transformation von ausgewählten Genen in einzelne Pflanzenzellen zu verwenden. Wenn das eingefügte Gen einen nachweisbaren Marker, wie eine Herbizid- oder Antibiotika-Resistenz aufweist, kann anschließend auf transformierte Zellen in Gewebekultur selektiert werden, indem das möglicherweise transformierte Gewebe einem Selektionsdruck durch das geeignete Antibiotikum oder Herbizid ausgesetzt wird. Leider sind die meisten Züchtungen der Sojabohnen resistent gegen eine Agrobacterium-Infektion und daher sehr resistent gegenüber einer Transformation mittels Agrobacterium. Ferner konnte gezeigt werden, dass Antibiotika- Resistenz-Marker, wie beispielsweise Kanamycin-Resistenz, welche üblicherweise in Pflanzen-Transformationsverfahren unter Verwendung von Agrobacterium bei anderen Pflanzenarten eingesetzt werden, einen beschränkten Nutzen in Transformationsversuchen mit Sojabohnen aufweisen. Obwohl es dementsprechend möglich sein kann Agrobacterium-vermittelte Transformationsverfahren auch bei Sojabohnen zu verwenden, ist es jedoch aufgrund des fehlenden effizienten, selektiven Markers ein schwieriges Unterfangen.
• Andere Verfahren zur Transformation von Pflanzen stehen jedoch zur Verfügung. Insbesondere existiert ein allgemeines Verfahren für die Transformation von Pflanzenzellen, das darauf basiert, die zu transformierende DNS in die Pflanzenzellen einzubringen, indem die DNS auf kleine, inerte Trägerpartikel geschichtet werden, die physisch in das Pflanzen-Zielgewebe beschleunigt werden. Dieses Verfahren der Partikel-vermittelten Pflanzenzell- Transformation wurde erstmalig an somatischen Zellen in Geweben, wie beispielsweise Epidermisgewebe von Zwiebeln und anderen, ähnlichen Modell-Zellkulturen gezeigt. Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987). Die Begründer des Partikel-vermittelten Transformationsverfahrens konnten später genetisch veränderte Tabakpflanzen durch Transformation von Tabak-Gewebekultur unter Verwendung eines selektierbaren Markers erzeugen, die anschließend in ganze Pflanzen regeneriert wurden. Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8502-8505 (1988). Anstelle des Versuches die Partikel-vermittelten Transformationsverfahren auf Pflanzenzel len in Kultur anzuwenden, wurde ein weiteres Verfahren entwickelt, bei dem wachsende Meristeme von Pflanzen einem Partikelvermittelten Transformationsereignis ausgesetzt wurden. Ausgehend von diesem Verfahren konnte die stabile Transformation der Keimbahn von Sojapflanzen erzielt werden. McCabe et al., Bio/- Technology, 6: 923-926 (1988), siehe auch Christou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, Vol. 86, 7500-7504. Dieses Verfahren hängt nicht von der Verfügbarkeit eines selektierbaren Markers für die Pflanzenart ab.
• Bei der Entwicklung des Verfahrens zur Keimbahntransformation von Sojapflanzen unter Verwendung des Partikel-vermittelten Verfahrens und basierend auf einer Transformation des Meristems wurde festgestellt, dass die Transformationsereignisse häufig zu chimären Pflanzen führen, welches Pflanzen sind, in denen ein Teil, jedoch nicht sämtliches Gewebe genetisch mit der eingeführten DNA transformiert wurde. McCabe et al., supra. Obwohl dieses Verfahren somit geeignet war, genetisch veränderte Pflanzen zu erzeugen, ist es aufwendig in dem Sinne, dass eine Vielzahl von Geweben den Transformationsereignissen unterworfen werden muss und ausgehend von den möglicherweise transformierten Geweben eine Vielzahl von Pflanzen kultiviert werden muss, um solche Triebe und Pflanzen zu ermitteln, welche die eingeführte DNS richtig exprimieren. Die Fähigkeit Transformationsereignisse, die zu einer vererbbaren Keimbahntransformation des Gewebes führen, frühzeitig in den Verfahren zu identifizieren, schafft die Möglichkeit, wesentliche Einsparungen in der praktischen Durchführung einer Kosteneffizienten genetischen Pflanzentransformation zu erzielen, woraus verringerte Arbeitskosten und verringerter Zeit- und Energieverbrauch für die Kultivierung nicht-transformierter Gewebe, die den Transformationsereignissen unterworfen wurden, resultiert.
• Für die Identifizierung einer Keimbahntransformation in einer Pflanzenart, wie beispielsweise der Sojabohne, wäre es hilfreich, wenn das aus den Keimzellen hervorgehende Gewebe der Pflanze in dem wachsenden Meristem oder Trieb identifizerbar wäre. Die Kenntnisse der Entwicklungsmorphologie von Pflanzenzellen hat sich jedoch leider nicht zu einem Punkt entwickelt, an dem die Vorläuferzellen der Sojabohnen-Keimzellen bekannt sind. Wenn dementsprechend ein Pflanzenmeristem oder Embryo transformiert wird, existiert derzeit kein Wissen darüber, welche Zellen genau transformiert werden müssen, um ein Keimbahntransformationsereignis zu erzielen. Jede Korrelation zwischen Kategorien transformierter Zellen innerhalb einer wachsenden Sojapflanze und einem Keimbahntransformationsereignis müsste daher empirisch bestimmt werden.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Sojabohnenpflanzen mit einer Keimbahntransformation zur Verfügung, bei dem man:
• (a) ein exogenes genetisches Konstrukt erzeugt, das für eine Insertion in Sojabohnen geeignet ist, wobei das Konstrukt Expressionskonstrukte sowohl für ein Marker-Gen als auch ein ausgewähltes Gen umfasst, wovon jedes eine kodierende Sequenz und eine flankierende regulatorische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, das durch die kodierende Sequenz kodierte Genprodukt in den Zellen der Sojabohnen zu erzeugen;
• (b) Trägerpartikel aus biologisch inerten Material, welche im Verhältnis zur Größe der Sojabohnenzellen kleins sind, mit Kopien des exogenen genetischen Konstrukts beschichtet;
• (c) die beschichteten Trägerpartikel in Zellen eines regenerierbaren Sojabohnengewebes beschleunigt;
• (d) Triebe aus dem Gewebe regeneriert;
• (e) eine Segment des Stammes eines jeden Triebes abtrennt;
• (f) das Stammsegment auf die Expression des Genproduktes des Marker-Gens hin untersucht,
• (g) nur solche Triebe, deren Stamm-Segmente das Genprodukt des Marker-Gens wenigstens in einem wesentlichen Teil des Markes des exprimieren, zu vollständigen, sexuell reifen Sojabohnenpflanzen regeneriert;
• (h) die ganzen Pflanzen sexuell fortpflanzt, um Nachkommenpflanzen zu erzeugen; und
• (i) die Expression des Genproduktes des Marker-Gens in den Nachkommenpflanzen untersucht, um Keimbahninsertionen des gewünschten Gens in die Keimbahn der Nachkommenpflanzen zu identifizieren.
• Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Keimbahntransformation von Bohnenpflanzen, wie beispielsweise Sojabohnenpflanzen, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man:
• (a) ein exogenes genetisches Konstrukt erzeugt, das eine kodierende Sequenz und eine flankierende regulatorische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, ein Genprodukt, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird, in den Zellen der Pflanze zu exprimieren;
• (b) Trägerpartikel, die aus biologisch inertem Material bestehen und im Vergleich zur Größe der Pflanzenzellen klein sind, mit Kopien des exogenen genetischen Konstruktes beschichtet;
• (c) die beschichteten Trägerpartikel in die Zellen eines regenerierbaren Gewebes der Pflanze beschleunigt;
• (d) das Gewebe zu Pflanzen regeneriert;
• (e) während des Regenerationsverfahrens ausgewählte Teile des Stammes einer jeden regenerierten Pflanze auf die Gegenwart des genetischen Konstrukts hin untersucht, wobei der ausgewählte Teil des Stammes einen Mark-Bereich umfasst und bei dem Nachweisverfahren bestimmt wird, ob das genetische Konstrukt in dem Mark-Bereich exprimiert wird;
• (f) vorzugsweise solche Pflanzen sexuell vermehrt, deren ausgewählten Teile einen positiven Nachweis auf die Gegenwart des genetischen Konstruktes erbrachten, um Nachkommenpflanzen zu erzeugen; und
• (g) die Gegenwart des genetischen Konstrukts in den Nachkommenpflanzen verifiziert.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Partikel-vermitteltes Transformationsverfahren für Pflanzen zur Verfügung zu stellen, das aufgrund von inhärenten Merkmalen effizienter und Kosten-effektiver als die bisher verfügbaren Verfahren ist.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die genetische Veränderung von Pflanzen und insbesondere von Sojabohnenpflanzen Kosteneffizienter zu machen, indem zu dem frühestmöglichen Stadium in dem Verfahren solche Pflanzen, die Keimbahntransformationsereignisse mit größter Wahrscheinlichkeit aufweisen, identifiziert werden, so dass lediglich diese Pflanzen zu reifen Pflanzen kultiviert werden müssen.
• Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung von Reporter- oder Markergenen in Pflanzentransformationsversuchen auch in Abwesenheit von selektierbaren Markern zu optimieren, um eine genetische Veränderung von Pflanzen auch für solche Pflanzen zu ermöglichen, für die verlässliche, dominant selektierbare Marker nicht verfügbar sind.
• Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den begleitenden Figuren deutlich.
• Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines für die Partikel-vermittelte Transformation von Pflanzengeweben geeigneten Gerätes.
• Fig. 2 ist eine planare Aufsicht der Funken-Entladungskammer des Gerätes der Fig. 1.
• Fig. 3 ist eine stilisierte Darstellung eines Querschnitts durch einen Sojabohnenstamm.
• Figs. 4-8 sind weitere stilisierte Darstellungen eines Querschnittes durch einen Sojabohnenstamm, die verschiedene Phänotypen einer Marker-Gen-Expression zeigen.
• In Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren werden eine Reihe von Indikatoren beschrieben, die dazu verwendet werden, Keimbahntransformationsereignisse in den Trieben und Pflanzen mit hoher Wahrscheinlichkeit zu identifizieren, die in einem Partikel-vermittelten Pflanzen-Transformationsverfahren erzeugt werden. Diese Indikatoren basieren auf einer Klassifizierung der Expression des Markergens bestimmter Phänotypen in Geweben einer regenerierenden Pflanze in bestimmten, definierten Stadien.
• Um die Vorteile des vorliegenden Verfahrens vollständig zu verstehen, ist es hilfreich, bestimmte Überlegungen zur Natur des Pflanzen-Transformationsverfahrens mittels beschleunigter Partikel zu berücksichtigen. Da die transformierende DNS auf den Partikeln in das Pflanzengewebe getragen wird und da die Zahl der Partikel begrenzt sein muss, um eine Zerstörung der transformierten Pflanzengewebe zu verhindern, wird lediglich ein bestimmter Prozentsatz der Zellen eines behandelten Pflanzengewebes transformierende DNS erhalten und nur ein Prozentsatz dieser Zellen wird transformiert werden. Bei Abwesenheit eines selektierbaren Agens, welches bevorzugt nicht-transformierte Zellen tötet, wird das Ergebnis der Regeneration von Pflanzen aus derart behandeltem Geweben daher Pflanzen sein, deren Gewebe in der Mehrzahl nicht transformiert wurde. Es wurde festgestellt, dass sogar bei den Pflanzen, die wenigstens teilweise mittransformiert wurden, die meisten der Transformationen nicht in Keimbahntransformationen resultierten. Die Erfindung zielt daher darauf ab, gewünschten Keimbahntransformationsereignisse zu einem frühen Stadium zu identifizieren, damit die Regeneration von Nicht-Keimbahnpflanzen minimiert werden kann.
• Es ist daher nicht notwendig, das hier beschriebene Verfahren zur frühen Identifizierung von Keimbahntransformationen zu verwenden, um eine Keimbahntransformation von Sojapflanzen zu erreichen. Es ist möglich, alle Pflanzen, die aus dem behandelten Gewebe gewonnen wurden, zu regenerieren, alle Pflanzen sexuell fortzupflanzen und das Nachweisverfahren an den Nachkommen durchzuführen. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass der Großteil des Aufwandes für Regenerations- und Vermehrungsverfahren auf Nicht-Keimbahntransformationsereignisse verschwendet wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Verschwendung zu vermeiden, wodurch die effiziente Erzeugung von Züchtungen genetisch transformierter Sojabohnen erleichtert wird.
• Die vorliegende Erfindung basiert daher auf einem Verfahren, das eine Partikel-vermittelte Transformation von Pflanzenzellen umfasst. Um das Umfeld der vorliegenden Erfindung besser zu verstehen, ist es daher notwendig das allgemeine Verfahren der Partikel-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen und des dafür verwendeten Gerätes zu verstehen.
• Bei dem Verfahren der Partikel-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen wird ein Trägerpartikel, bestehend aus einem kleinen, inerten, relativ dichten Partikel aus Material mit einem transformierenden genetischen Konstrukt an DNS beschichtet und anschließend physisch beschleunigt, so dass es in das Innere des wachsenden Gewebes oder der embryonalen Zellen, die transformiert werden sollen, eingebracht wird. Die transformierende DNS wird somit in einzelne Zellen eingebracht, wobei die Trägerpartikel ausreichend klein sind, so dass die einzelnen Zellen weder zerstört noch schwer beschädigt werden. Es wurde festgestellt, dass durch die Einbringung von DNS auf derartigen Trägerpartikeln in Pflanzenzellen, wie Sojabohnen, in dieser Art und Weise ganze, Pflanzen mit Keimbahntransformation erhalten werden können, welche in transgenen Pflanzen und Pflanzenzüchtungen resultieren.
• Es gibt eine Vielzahl von Faktoren, die notwendigerweise bei der Erzeugung von Keimbahntransformationen nach diesem Verfahren berücksichtigt werden müssen. Das genetische Konstrukt muss richtig aufgebaut sein, um eine Expression in Pflanzengeweben zu ermöglichen. Das verwendete Gerät muss von einem Typ sein, der in der Lage ist, die Trägerpartikel mit der beschichteten DNS in Pflanzenzellen so einzubringen, dass eine geeignete Anzahl von Zellen transformiert werden. Es gibt eine Vielzahl von mechanischen Systemen von denen man sich vorstellen kann, dass sie biologisch inerte, kleine Trägerpartikel beschleunigen. Mögliche Verfahren umfassen ballistische, explosive Beschleunigung von Partikeln, zentrifugale Beschleunigung von Partikeln, elektrostatische Beschleunigung von Partikeln oder irgendein analoges System, das in der Lage ist, einen Impuls und eine Beschleunigung kleiner, inerter Partikel zu ermöglichen. Das hierin zur Erzielung von Partikel-vermittelter Pflanzentransformation verwendete Verfahren basiert auf einem Gerät mit einstellbarer elektrischer Funkenentladung. Das Gerät wird in schematischer Darstellung in Figs. 1 und 2 gezeigt.
• Das Gerät zur Partikelbeschleunigung ist allgemein in Fig. 1 mit 10 bezeichnet. Das Gerät besteht aus einer Funkenentladungskammer 12, in die zwei Elektroden 14 hineinreichen, die durch einen Abstand von etwa 1 bis 2 mm getrennt sind. Die Funkenentladungskammer 12 ist ein horizontal verlängertes Rechteck, das zwei Öffnungen 16 und 18 aufweist, welche sich zum oberen Ende hin erstrecken. Die Öffnung 16 ist durch eine Zugangsplatte 20 verschlossen. Die Öffnung 18, die auf der den Elektroden 14 gegenüberliegenden Seite des Rechtecks der Funkenentladungskammer 12 vorgesehen ist, wird mit einem Trägerblatt 22 bedeckt. Die Elektroden 14 werden mit einer einstellbaren Quelle für elektrische Stromentladung verbunden. Eine entsprechende Quelle für elektrische Stromentladung umfasst vorzugsweise eine geeignete elektrische Schaltung, die mit einem Kondensator verbunden ist, der einen Bereich von 1 bis 2 Mikrofarad aufweist, wobei die Menge des Stroms der Ladung, die in den Kondensator eingeführt wird, einstellbar ist, beispielsweise durch Verwendung eines Autotransformators im Bereich von möglicherweise 1 bis 50000 Volt. Eine geeignete elektrische Hochspannungsschaltung wird zur Verfügung gestellt (nicht gezeigt), sodass der Kondensator sicher über die Elektroden 14 entladen werden kann, damit das Gerät von einem Anwender praktisch benutzt werden kann.
• Das Trägerblatt 22, das dazu vorgesehen ist, auf die Öffnung 18 der Funkenentladungskammer 12 gelegt zu werden, besteht aus einem planaren Blatt von relativ steifem Material, wie beispielsweise ein Blatt eines aluminisierten, mit Saran beschichteten Mylar. Oberhalb der Öffnung 18 der Entladungskammer 12, in einer Position von etwa 15 mm darüber, befindet sich ein Rückhalteschirm 24. Oberhalb des Rückhalteschirms 24, in einer Entfernung von etwa 5 bis 25 mm oberhalb des Rückhalteschirms, befindet sich die Zieloberfläche 25. Die Zieloberfläche 26 kann aus irgendeiner geeigneten Kulturoberfläche bestehen, auf die das zu transformierende Material unmittelbar platziert werden kann, wie z. B. und am meisten bevorzugt eine umgedrehte Petrischale, auf die die Pflanzengewebe zur Zellkultur positioniert wurden. Kopien des exogenen, fremden genetischen Konstruktes, das zur Transformation der Pflanzengewebe vorgesehen ist, werden durch geeignete DNS-Herstellungsverfahren erzeugt, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, wobei eine Vielzahl an Kopien des genetischen Konstrukts erzeugt werden. Die Kopien des fremden genetischen Konstruktes in wässriger Lösung werden anschließend auf kleine Partikel eines haltbaren, dichten, biologisch inerten Trägermaterials, wie beispielsweise Gold, geschichtet, wobei die Trägerpartikel typischerweise in einer Größe im Bereich von 1 bis 3 Mikron liegen. Die Trägerpartikel mit dem exogenen genetischen Konstrukt darauf werden anschließend auf das Trägerblatt 22 platziert, welches auf der richtigen Öffnung auf der Oberfläche der Funkenentladungskammer 12 eingeführt wird. Die Zieloberfläche 26 und das darauf befindliche lebende Pflanzenmaterial wird anschließend in eine Position oberhalb des Rückhalteschirms 24 gebracht. Ein kleiner Tropfen Wasser, 30, vorzugsweise in der Größe von etwa 10 ul, wird daraufhin zur Überbrückung der Enden der Elektroden 14 eingeführt. Die Zugangsplatte 20 wird in Position oben auf die Funkenentladungskammer 12 gelegt. Zu diesem Zeitpunkt wird das gesamte Gerät in eine Vakuumkammer eingebracht und ein Vakuum wird angelegt, bis in den Bereich von etwa 500 mm Quecksilber. Während das Vakuum angelegt wird, wird eine Heliumquelle an die Vakuumkammer angeschlossen, wodurch die in der Kammer verbleibende Atmosphäre mit Helium ersetzt wird. Die geringere relative Dichte des Helium in Kombination mit dem verringerten Druck hilft den Luftwiderstand auf die Goldpartikel zu verringern.
• Jetzt kann die Funkenentladung zwischen den Elektroden 14 durch den Anwender ausgelöst werden. Dies wird mittels der geeigneten elektrischen Schaltung, die die im Kondensator gespeicherte Spannung über die Enden der Elektroden 14 appliziert. Die Kraft der elektrischen Entladung überspringt die Funkenentladungslücke zwischen den Elektroden 14, wodurch der kleine Wassertropfen, der zuvor dazwischen platziert war, unmittelbar verdampft. Die Kraft der Verdampfung dieses Wassers erzeugt eine Schockwelle innerhalb der Funkenentladungskammer 12, die in alle Richtungen nach außen abstrahlt. Der Einfluss der abstrahlenden Schockwelle auf das Trägerblatt 22 beschleunigt das Trägerblatt 22 mit gro ßer Geschwindigkeit nach oben. Das nach oben beschleunigte Trägerblatt 22 bewegt sich bis es den Rückhalteschirm 24 kontaktiert. Die Verwendung des Heliums in der Vakuumkammer für das Gerät bewirkt einen geringeren Luftwiderstand während des Fluges des Trägerblattes 22 und der Trägerpartikel. Bei dem Rückhalteschirm 24 wird das Trägerblatt 22 zurückgehalten und die Trägerpartikel, die mit dem exogenen genetischen Konstrukt zuvor beschichtet wurden, fliegen von dem Trägerblatt und bewegen sich frei in Richtung der Zielgewebe. Die kleinen Trägerpartikel bewegen sich anschließend in die Zellen des Zielgewebes, die auf der Zieloberfläche 26 platziert sind, und passieren frei in das Cytosol der darauf platzierten Zellen. Der tatsächliche Impuls auf die Trägerpartikel zu dem Zeitpunkt, zu dem sie auf der Oberfläche des Zielgewebes eintreffen, ist basierend auf der Spannung der ursprünglichen elektrischen Entladung, die auf die Elektroden 14 appliziert wird, einstellbar. Durch Veränderung der Menge der elektrischen Entladung, die über die Elektroden 14 appliziert wird, kann somit die Geschwindigkeit eingestellt werden, mit der die Partikel auf dem Ziel eintreffen und daher kann auch die Tiefe der Penetration der Trägerpartikel in das Gewebe des Zielgewebes kontinuierlich über den Bereich eingestellt werden, der als Einstellung für die elektrische Spannung zur Verfügung gestellt wird, die über Elektroden 14 appliziert werden kann.
• Um für ein Partikel-vermitteltes Transformationsverfahren geeignet zu sein, muss das zu transformierende, exogene, genetische Konstrukt in der Lage sein, irgendeine nützliche Funktion in den Pflanzenzellen des Zielgewebes zu erzielen. Das transformierende, genetische Konstrukt, welches üblicherweise ein chimäres Konstrukt in dem Sinne ist, dass seine DNS von mehr als einem Organismus abstammt, sollte in der Lage sein, in den Zielgeweben ein Genprodukt, wie beispielsweise ein ausgewähltes Fremdprotein oder ein Antisense RNS-Strang zu exprimieren. Derartige fremde genetische Konstrukte, die geeigneterweise in Expressionsvektoren zur Verwendung in Pflanzenzellen eingefügt sind, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Typischerweise weisen derartige Pflanzenexpressionsvektoren neben den kodierenden Sequenzen des gewünschten exogenen oder fremden Gens geeignete flankierende regulatorische Sequenzen auf, die die Expression des fremden Gens in den Pflanzenzellen ermöglichen, wie beispielsweise eine Promotorsequenz, die in der Lage ist, Transkription zu initiieren, und eine translationale Terminatorsequenz, um die Translation eines Messengers zu beenden, wenn Proteinsynthese gewünscht wird. Es konnte bereits gezeigt werden, dass typische Promotoren und Transkriptionsterminatoren, die in anderen Pflanzengeweben aktiv sind, auch in Sojabohnen aktiv sind.
• Das transformierende genetische Konstrukt kann auch ein Markergen umfassen. Entsprechende Markergene müssen nicht selektierbare Marker sein. Es muss sich lediglich um einen Marker handeln, dessen Gegenwart in minimaler Menge durch geeignete biochemische oder phänotypische Merkmale, welche in transgenen Pflanzengeweben festgestellt werden können, in Pflanzengewebe nachgewiesen werden kann. Ein entsprechendes Markergen kann die transformierende DNS selbst sein, wenn ein vollständig biochemischer Nachweis der Gegenwart der transformierenden DNS verwendet wird, wie beispielsweise ein Nachweis der Art der Polymerasekettenreaktion für die DNS selbst. Ein geeigneter Typ Markergen, der die Eigenschaft aufweist, durch ein phänotypisches Verfahren nachweisbar zu sein, ist das GUS-Gen, das von Jefferson et al., Embo J., 6: 3901-3907 (1987), beschrieben wurde. Das GUS-Gen kodiert für das Enzym β-Glukuronidase, welches in Pflanzenzellen exprimiert werden kann und dessen Expression in einem für das Gewebe destruktiven Nachweisverfahren ein geeignetes Substrat, Indigo-Glukuronid oder 5-Bromo-4-chloro-3-indolylglukuronid, in einem in situ Nachweis in blaue Farbe im Pflanzengewebe überführt. Die Verwendung des GUS-Gens stellt daher ein geeignetes kolorimetrisches Nachweisverfahren für die Expression der eingefügten DNS mittels phänotypischer Analyse in transformierten Pflanzengeweben zur Verfügung. In einem typi schen Transformationsverfahren würde das ausgewählte Gen in einem einzigen genetischen Konstrukt, einem DNS-Strang, in Tandem mit dem GUS-Gen gekoppelt und der Nachweis der transformierenden DNS in den Pflanzengeweben würde mittels phänotypischer Analyse der Expression des GUS-Enzyms in den Zielgeweben der Pflanzen durchgeführt.
• Verschiedene Pflanzengewebe der Sojabohne können unter Verwendung des Partikel-vermittelten Transformationsverfahrens und des in Fig. 1 gezeigten Gerätes transformiert werden. Es wurde festgestellt, dass freigelegte embryonale Achsen von unreifen oder reifen Sojabohnensamen unter Verwendung dieses Verfahrens am einfachsten transformiert werden können. Die embryonalen Achsen werden aus den Sojabohnensamen herausgeschnitten und die primären Blätter werden entfernt, um das Meristem des Embryos freizulegen. Die Achsen werden anschließend auf Zielplatten plattiert, die 1% Wasser-Agar enthalten. Die Platten werden schließlich als Zieloberfläche in dem in Fig. 1 gezeigten Gerät für ein Partikel-vermitteltes Transformationsereignis verwendet. Die Achsen können anschließend im Dunkeln auf MS-Grundmedium, modifiziert nach Barwale et al., Planta, 167: 473-481 (1986), plattiert werden, um zygotische Embryonen zu regenerieren. Dieses besondere Medium weist einen hohen Anteil an Benzylaminopurin auf, welches die Bildung mehrerer Triebe in den ausplattierten embryonalen Geweben induziert. Nach einer Inkubation für 1 bis 2 Wochen im Dunkeln, werden die Gewebe auf dasselbe Grundmedium mit geringeren Konzentrationen an Benzylaminopurin überführt und schließlich im Licht kultiviert, um eine Verlängerung der Triebe zu fördern. Unter Verwendung dieses Verfahrens werden mehrere Triebe aus primären und Hilfs-Meristemen des embryonalen Gewebes erzeugt. Diese Triebe können anschließend auf Sojabohnen-Wurzeln gepropft werden oder die Bildung von Wurzeln wird induziert, um ganze, intakte und sexuell reife Sojapflanzen zu regenerieren. Diese Triebe und die daraus regenerierten Sojabohnenpflanzen sind Gegenstand der hierin offenbarten Screeningverfahren zur Erzielung einer Vielzahl von Pflanzen mit Keimbahntransformation.
• Als Soja-Triebe oder -Pflänzchen, die aus Geweben erhalten wurden, welche einem oben beschriebenen Transformationsverfahren unterworfen wurden, zu ganzen, reifen Pflanzen regeneriert wurden, wurde festgestellt, dass lediglich eine Teilmenge der resultierenden Sojapflanzen mit der fremden DNS genetisch transformiert war. Die Pflanzen, welche aus Trieben regeneriert wurden, die von diesem Gewebe abstammen, werden als R0-Pflanzen bezeichnet, während deren Nachkommen in sukzessiven Generationen als R1 und R2, etc. bezeichnet werden. Zusätzlich zu der Tatsache, dass bei der Generation der R0-Pflanzen eine geringe Frequenz an genetischer Transformation auftritt, werden von den R0- Pflanzen, die eine teilweise genetische Transformation aufweisen, die Mehrzahl der Pflanzen Chimären sein. Durch Verwendung des Begriffes Chimäre in diesem Sinne ist beabsichtigt, darauf hinzuweisen, dass die Pflanzen aus Geweben bestehen, die nicht genetisch identisch sind, d. h. lediglich einen Teil oder eine Fraktion der Gewebe der Pflanzen wird transformiert sein, während der Rest der Gewebe nicht genetisch transformiert ist. Da es die Aufgabe des hierin offenbarten Pflanzen-Transformationsverfahrens ist, stabil transformierte Pflanzen zu erzeugen, die die fremde DNS in ihrem Keimplasma tragen und die in der Lage sind, die eingeführte DNS an ihre Nachkommen zu vererben, ist es notwendig ein Screeningverfahren zu implementieren, um zu ermitteln, wie die Keimbahntransformationsereignisse von einer Anzahl, möglicherweise einer Vielzahl, von möglicherweise transformierten R0-Pflanzen oder Pflanzengeweben wiedergewonnen werden können.
• Das hierin offenbarte Verfahren ist darauf gerichtet, das Screening der R0-Triebe und -Pflanzen der möglicherweise transformierten Pflanzenkultur zu ermöglichen, um solche Pflanzen zu isolieren, aus denen Nachkommenpflanzen hervorgehen werden oder wenigstens aller Wahrscheinlichkeit nach hervorgehen werden, deren Keimbahn transformiert wurde. In dieser Hinsicht sollte festgehalten werden, dass ausgehend von Nachkommen, die aus den R0-Pflanzen gezogen wurden, sozusagen ausgehend von der R1-Generation, alle Pflanzen klonal und dementsprechend nicht chimär sind und transformierte Keimzelllinien aufweisen, wenn die Nachkommenpflanzen die fremde DNS überhaupt enthalten. Während Ereignisse beobachtet wurden, in denen die DNS in klonaler Art in der R0-Pflanze insertiert zu sein schien, jedoch anschließend in den R1- und R2-Pflanzen vollständig fehlte, wurde gezeigt, dass wenn das Gen in der R1-Pflanze vorlag, es anschließend stabil an solche Nachkommen der R1-Pflanze vererbt wird, die das eingefügte Gen als Merkmal aufweisen.
• Das vorliegende Verfahren stellt eher ein Screeningverfahren als ein Selektionsverfahren zur Verfügung. Darunter ist zu verstehen, dass die Pflanzen oder Teile der Pflanzen auf die Gegenwart bestimmter Marker-Eigenschaften hin untersucht werden, jedoch nicht Selektionskriterien unterworfen werden, wie sie mittels Antibiotika- oder Herbizid-Resistenzverfahren erzielt werden würden. Die Verwendung eines solchen Screeningverfahrens im Gegensatz zu einem Selektionsverfahren ist aufgrund der Abwesenheit von verlässlichen selektierbaren Markergenen, die in Sojabohnengewebe aktiv sind, notwendig. Das bevorzugte Markergen, das, wie bereits ausgeführt, Gegenstand des Screeningverfahrens ist, ist das GUS-Gen. Das GUS-Nachweisverfahren ist jedoch destruktiv für die Pflanzengewebe und kann daher nicht in vivo durchgeführt werden. Es muss daher in einem Teil der Gewebe durchgeführt werden, die von den zu screenenden Pflanzen gewonnen wurden und der Teil des ausgewählten Gewebes muss eine Balance zwischen der Notwendigkeit, eine akkurate Einschätzung der Aussichten für eine Keimbahntransformation der bestimmten Pflanze zu gewinnen, und der Notwendigkeit, die Wuchskraft des betroffenen Pflanzengewebes zu erhalten, schaffen, damit die gesuchten Ereignisse nicht während des Nachweisverfahrens verlorengehen.
• Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Auswahl bestimmter, strategisch platzierter Teile des Pflanzengewebes der R0- Pflanzen während des Regenerationsverfahrens. Insbesondere werden drei Indikatoren zu dem Status der Transformation der R0- Pflanzen verwendet. Der erste Indikator besteht aus einem Abschnitt eines Stamm-Segmentes des R0-Triebes, der von dem Trieb vor der Wurzelbildung gewonnen wurde. Der zweite Indikator besteht aus einem Abschnitt des Blattphänotyps im Stadium des ersten dreiteiligen Teilblättchens ("trifoliate stage") der Entwicklung des Sämlings. Der dritte Indikator besteht aus einem Abschnitt von einem Blattstiel ("petiole")/einer Mittelrippe eines dreiteiligen Teilblättchens einer reifen Pflanze im Stadium des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens ("third or fourth trifoliate stage"). Unter Verwendung histochemischer Nachweisverfahren für das Enzym, das durch das GUS-Gen kodiert wird, in jedem dieser drei Stadien, ist es mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit möglich, die Keimbahntransformationsereignisse, die stattgefunden haben, vorherzusagen. Tatsächlich ist es möglich zu einem relativ frühen Zeitpunkt des Verfahrens die meisten, (bis zu 90-99%) der regenerierten R0-Triebe und - Pflanzen zu verwerfen, um sich auf die verbleibenden Triebe oder Pflänzchen zu konzentrieren, welche eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweisen, Keimbahntransformationsereignisse zu enthalten. Während das Verwerfen von vielen dieser Triebe oder Pflänzchen überflüssig erscheinen mag und beinahe sicher auch das zeitweilige Verwerfen von tatsächlich transformierten Pflanzen umfasst, ist die Menge an Arbeit und Zeit, die gespart wird, in dem nicht eine große Vielzahl von nicht-transformierten Pflanzen bis zum Samenstadium gezogen wird, sehr groß im Vergleich zu der Zeit, die für die Erzeugung weiterer Transformationsereignisse benötigt wird. Der arbeitsreiche Teil des Verfahrens, d. h. die Entwicklung der möglicherweise transformierten Pflanzen zu Samen und Ziehen und Prüfen der Nachkommen, kann daher durch das hierin offenbarte Screeningverfahren auf ein Minimum reduziert werden.
• Die Analyse für den ersten Indikator auf transformierte Pflanzen wird durchgeführt, wenn die Regeneration der Triebe von den ursprünglich transformierten Pflanzen voranschreitet. Zu dem Zeitpunkt, zu dem die regenerierenden Soja-Triebe eine begrenzte und definierte Größe erreichen, typischerweise etwa eine Größe von etwa 2 cm, werden die Triebe von dem ursprünglichen Explantat isoliert und entweder durch Propfen oder Hormonbehandlung zur Induzierung der Wurzelbildung für die Vermehrung vorbereitet. Zu der Zeit, zu der die Triebe von den ursprünglichen Explantaten getrennt werden ist es jedoch praktisch, einen relativ schmales Segment des Stammes vom basalen Teil des abgetrennten Triebes zu entfernen, d. h. ein Segment in einer Größe von etwa 2 mm. Das Stamm-Segment kann anschließend fixiert und einem histochemischen GUS-Nachweisverfahren unterworfen werden. Das Ergebnis stellt einen Querschnitt des Stammes der Sojabohnenpflanze dar, welcher eine Farbe, d. h. blau, in den Teilen des Gewebes der Pflanze zeigen wird, die transformiert wurden. Basierend auf einer Analyse dieses Gewebes ist es anschließend möglich, für solche Stämme, die eine gewisse Enzymaktivität aufweisen, vorherzusagen, dass diese Pflanzen mit der größten Wahrscheinlichkeit ein Keimbahntransformationsereignis hervorbringen.
• Ein Klassifikationsschema wurde entwickelt, um die Ergebnisse des Nachweisverfahrens des Stamm-Segmentes in Kategorien einzuteilen. Die transgenen, primären Regenerate wurden als "B" bezeichnet, welche das GUS-Enzymnachweisverfahren zeigte, das das Gen sowohl in der Epidermis, der Rinde und auch dem untersuchten Mark-Segment exprimiert wurde. Die regenerierten Triebe wurden als "C*" oder "P*" bezeichnet, wenn die Expression des GUS-Gens zu 100% entweder auf die Rinde oder respektive das Mark des untersuchten Trieb-Segmentes beschränkt war. Die regenerierten Triebe wurden als "C" klassifiziert, wenn wenigstens die Hälfte der Rinde das Enzym exprimierte, und als "c" wenn weniger als 50% der Rinde Aktivität aufwiesen. Entsprechend weist die Klassifizierung als P oder p darauf hin, dass GUS-Aktivität in mehr oder weniger als 50% des Marks des Stamms gefunden wurde. Die Triebe wurden als "e" bezeichnet, wenn die Aktivität des GUS- Gens lediglich in der Epidermis des Triebs festgestellt werden konnte. Der Code wurde ferner dazu genutzt, um auf Beispiele mit lokaler Aktivität in mehreren Teilen hinzuweisen, beispielsweise zeigt eine Bewertung von c/P* an, dass der Trieb das GUS-Markergen in 100% des Mark-Gewebes, jedoch in weniger als 50% des Rinden-Gewebes exprimiert. Eine Klassifizierung von E*/p weist darauf hin, dass die Expression des Enzyms in 100% der Epidermis, jedoch in weniger als 50% des Markes und überhaupt nicht in der Rinde der transformierten Pflanze festgestellt wurde.
• Fig. 3 bis 8 zeigen das Klassifikationsschema des Stamm-Segmentes. Fig. 3 ist eine hochstilisierte Darstellung eines idealen Querschnitts durch einen Sojabohnenstamm, in dem 30 den gesamten Stamm bezeichnet, 32 die Epidermis bezeichnet, die in ihrer Weite stark übertrieben dargestellt ist, 34 die Rinde bezeichnet und 36 das Mark bezeichnet. Schattierungen in den Fig. 4 bis 8 sollen die blaue Farbe des GUS-Nachweisverfahrens anzeigen. Fig. 4 zeigt einen Stamm 38, der als "E" klassifiziert wurde, da lediglich die Epidermis das GUS-Gen exprimierte. Fig. 5 zeigt einen Stamm 40, der als "c/p" klassifiziert wurde, da weniger als 50% der Rinde oder des Marks Expression aufwies. Der Stamm 42 der Fig. 6 wurde als "c/P*" klassifiziert, da das gesamte Mark-Gewebe, jedoch weniger als 50% der Rinde transformiert wurde. Der Stamm 44 der Fig. 7 wurde als "C*" klassifiziert. Es sollte klar sein, dass der Stamm 46 der Fig. 8 ein "B" Stamm-Segment darstellt. Alle Ergebnisse der Fig. 4 bis 8 stellen tatsächliche Ereignisse dar.
• Bei den meisten der Triebe, die aus Transformationsverfahren unter Verwendung des Gerätes der Fig. 1 und 2 gewonnen wurden, konnte keine Expression des GUS-Gens in den Stammabschnitten gefunden werden. Von den Trieben, in denen eine Expression in dem Stamm-Segment gefunden und in eine der oben beschriebenen Kategorien eingeteilt wurde, wurde die Wurzelbildung bei einer Anzahl von Trieben jeder Kategorie induziert oder die Triebe wurden auf gesunde Wurzelstöcke gepropft und weiter zu Pflänzchen kultiviert. Als die Pflänzchen 2 oder 3 dreiteilige Teilblättchen entwickelten, wurden ein oder mehrere Blättchen des ersten dreiteiligen Teilblättchens jeder Pflanze gewonnen und das dreiteilige Teilblättchen selbst wurde auf Aktivität des GUS-Enzyms hin untersucht. Dadurch konnten neue Phänotypen identifiziert und mit den Phänotypen der Klassifizierung der ursprünglichen Stämme der primär regenerierten Triebe korreliert werden. Eine Anzahl an Pflanzen wurde gefunden, die das GUS- Enzym lediglich in Trichomen der Epidermis und/oder Haaren entweder überall im Blättchen oder nur in bestimmten Gebieten innerhalb des Blättchens exprimierte. Bei anderen Pflanzen konnte gezeigt werden, dass die GUS-Aktivität lediglich in Mesophyllzellen oder den Stomata exprimiert wurde und die Aktivität in diesen Geweben konnte sich über das gesamte Blättchen erstrecken oder auf einen oder mehrere bestimmte Gebiete innerhalb des Blättchens beschränkt sein. In weiteren Fällen wurde enzymatische Aktivität innerhalb der Mittelrippe lokalisiert oder in unterschiedlichem Ausmaß in eine oder beide Richtungen von der Mittelrippe ausgehend in Bereiche des Blättchens erstreckend gefunden. Es wurden sogar Beispiele gefunden, in denen die GUS- Aktivität sich von der Mittelrippe bis zu dem Rand lediglich in einer Hälfte des Blattes erstreckte. Der optimalste Phänotyp, der beobachtet wurde, bestand wiederum aus einem Fall, bei dem die blaue Farbe weder auf einen bestimmten Sektor lokalisiert noch auf die Epidermis beschränkt war.
• Nach weiterer Entwicklung wurde ein dritter Nachweis basierend auf Blattstiel- und Mittelrippen-Abschnitten eines dreiteiligen Teilblättchens aus einem höheren Bereich der regenerierten Pflanze entwickelt. Dabei wurde festgestellt, dass, wenn dieser letzte Nachweis nicht durchgeführt wird, bestimmte Nicht-Keimbahntransformationsereignisse zu Samen fortgeführt würden, da bestimmte Transformationsereignisse Pflanzen erzeugen, in denen die transformierten Gewebe lediglich eine begrenzte Länge in nerhalb des Stammes der regenerierten Pflanze erreichen. Es war keine unübliche Beobachtung, dass GUS-Aktivität lediglich in dem ersten dreiteiligen Teilblättchen und nicht in bestimmten weiteren dreiteiligen Teilblättchen aus dem oberen Bereich der Pflanze festgestellt wurde. Es wurde jedoch allgemein beobachtet, dass die Mehrzahl der Pflanzen, die GUS-Aktivität in den dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchen aufwiesen, selber Aktivität in allen oder den meisten Blättern der Pflanze zeigten.
• Die Verwendung dieser drei Indikatoren führte zu der Beobachtung, dass das Transformationsverfahren im Hinblick auf den Gesamtaufwand optimiert werden konnte, wenn lediglich die Pflanzen, die als "B", "P*" oder irgendeine Kombination von P und c oder C während des Nachweisverfahrens für Stamm-Segmente gekennzeichnet wurden, vollständig regeneriert wurden und es diesen Pflanzen ermöglicht wurde, sich zu R1-Pflanzen fortzupflanzen. Sogar bei Pflanzen, die als B gekennzeichnet wurden, konnten Keimbahntransformationsereignisse nicht nachgewiesen werden, wenn die Expression des GUS-Gens nicht auch in dem ersten dreiteiligen Teilblättchen und auch in dem Nachweisverfahren unter Verwendung von Blattstiel/Rippe des reifen Blattes gezeigt wurde. Der beste Nutzen der zweiten und dritten Indikatoren auf Transformationsereignisse zeigte sich, wenn diese negativ waren, womit gesagt werden soll, dass Pflanzen, in denen die GUS-Aktivität in diesen Stadien nicht gezeigt werden konnte, auch verworfen werden konnten, da gezeigt wurde, dass die Wahrscheinlichkeit, dass derartige Pflanzen Keimbahntransformationsereignisse erzielen würden, sehr gering war. Von den Pflanzen, die als B während der Analyse des Stamm-Segmentes gekennzeichnet wurden und die wesentliche GUS-Aktivität in dem Mark oder in Mark und Rinde während des Nachweisverfahrens unter Verwendung der Blattstiel- und Mittelrippen-Abschnitte des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens zeigten, wiesen alle Pflanzen eine Aktivität auf, die, wie später durch Gewinnung von Nachkommenpflanzen, welche klonal waren und das GUS-Gen expri mierten, gezeigt wurde, auf Keimbahntransformationsereignissen basierte. Alle Pflanzen, die in irgendeiner der anderen, oben beschriebenen Kategorien klassifiziert wurden, zeigten eine wesentlich geringere Frequenz an Keimbahntransformationsereignissen, obwohl solche Ereignisse in einigen Geweben der anderen Klassen auftraten. Beispielsweise brachten zwei von 363 Pflanzen eine Aktivität lediglich in der Epidermis während des Stamm- Segment-Stadiums aufwiesen, transformierte Nachkommen hervor. Die Wahrscheinlichkeit von Transformationsereignissen in irgendeiner anderen Pflanzenkategorie war jedoch so gering, dass aufgrund von praktischen Erwägungen die Verwerfung aller Pflanzen, bis auf die oben beschriebenen Pflanzen während der Stamm-Segment-Analyse gerechtfertigt war und ferner solche Pflanzen sexuell fortgepflanzt wurden, welche in eine Kategorie eingeteilt wurden, die wahrscheinlich zu Keimbahntransformationen führt, welche sowohl GUS-Aktivität im Stadium des ersten dreiteiligen Teilblättchens und wesentliche Beteiligung von Mark und Rinde während der Analyse des Blattstiel und der Mittelrippe des reifen Blattes der Pflanze aufwiesen.
• Mehr als 1/3 der Pflanzen, die als "B" klassifiziert wurden, werden zu Keimbahntransformationsereignissen führen. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass Pflanzen, die in andere Kategorien während der Analyse des Stamm-Segmentes eingeteilt worden waren, ein Keimbahntransformationsereignis mit einer wesentlich geringeren Wahrscheinlichkeit aufwiesen. Eine Pflanze, die als c/p* klassifiziert wurde, weist beispielsweise eine Wahrscheinlichkeit für ein Keimbahntransformationsereignis von weniger als 10% auf, während das Verhältnis an Transformationsereignissen bei Pflanzen, die Aktivität in mehr als der Hälfte ihrer Rinde zeigen und die demgemäß als C klassifiziert wurden, in der Größenordnung von 2% liegt. Bei Pflanzen, die wesentliche Aktivität in der Rinde und im Mark hatten und als C/P bezeichnet wurden, von denen lediglich 8 Pflanzen untersucht wurden, ergaben zwei Keimbahntransformationsereignisse. Von 6 Pflanzen, die Aktivität in weniger als 50% des Markes zeigten, wurde ein Keimbahntransformationsereignis gewonnen. Die genaue Klassifizierung Regenerate kann daher von einer Kostenanalyse abhängen, bei der die Kosten für die Regenerierung der Triebe zu Pflanzen und Samen mit den Kosten zur Erzeugung weiterer, möglicherweise transformierter Triebe verglichen wird.
BEISPIELE
• Als Zielgewebe für die Sojabohnentransformationsverfahren, die hierin beschrieben werden, wurden freigelegte embryonale Achsen von unreifen und reifen Sojabohnensamen von Elitezüchtungen der Sojabohne verwendet. Die Achsen wurden aus den Samen herausgeschnitten und auf Zielplatten mit Agar plattiert. Die Verfahren zur Zerlegung der Samen und die Durchführung der Transformationsversuche werden in McCabe et al., Bio/Technology, 6: 923-926 (1988) im Detail dargestellt. Das für die Transformationsversuche verwendete Gerät war das Gerät der Fig. 1 und 2.
• Nach Durchführung der Transformation wurden mehr als 5000 Triebe erzeugt und einem Stamm-Segment-Nachweisverfahren unterworfen. Zur Durchführung des Stamm-Segment-Nachweisverfahrens wurden die Triebe bis zu einer Länge von etwa 2 cm gezogen, bevor sie von dem darunterliegenden Gewebe getrennt wurden. Zum Zeitpunkt der Abtrennung wurde ein Abschnitt von 2 bis 4 mm der Basis des Triebes abgeschnitten und auf GUS-Aktivität untersucht. Von 757 untersuchten Stamm-Segmenten, die GUS-Aktivität aufwiesen, wurden die Pflanzen basierend auf der Verteilung der Aktivität, die in dem Stamm beobachtet wurde, durch das oben beschriebene System in Kategorien eingeteilt, d. h. entweder als B, C/P*, C, C/P, p, c oder e. Die Verteilung der Pflanzen entsprechend dieser Klassifizierung ist in Tabelle I dargestellt. TABELLE I
• Alle Pflanzen, bei denen das Nachweisverfahren des Stamm-Segmentes zu irgendeinem Anteil positiv war, wurden anschließend entweder gepropft oder in diesen Pflanzen wurde die Wurzelbildung induziert, um Pflänzchen zu erzeugen. Das erste dreiteiligen Teilblättchen jedes dieser Pflänzchen wurde auf GUS-Aktivität hin untersucht. Die Ergebnisse werden in der dritten Spalte der Tabelle I dargestellt. Alle Pflanzen, die weiterhin GUS-Aktivität in dem ersten dreiteiligen Teilblättchen aufwiesen, wurden anschließend zu Pflanzen mit einer Vielzahl von Blättern gezogen, und reife dreiteiligen Teilblättchen der dritten oder vierten Stufe wurden von den Pflanzen gewonnen und Blattstiel- und Mittelrippen-Schnitte wurden durch ein Blatt durchgeführt, fixiert und auf GUS-Aktivität hin untersucht. Die Ergebnisse dieser Nachweisverfahren werden in Tabelle I in der vierten Spalte gezeigt. Es wurde festgestellt, dass alle Pflanzen, die in der vierten Spalte dargestellt sind, ein Keimbahntransformationsereignis durchlaufen haben.
• Die vierte Spalte der Tabelle I zeigt solche Pflanzen, die Aktivität im Mark oder Mark und Rinde im Stadium des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens aufwiesen. Alle Pflanzen, die GUS-Aktivität aufwiesen wurde es ermöglicht, durch Selbstbe stäubung Nachkommen zu erzeugen. Die Nachkommen wurden anschließend auf GUS-Aktivität hin untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass alle Pflanzen, von denen in Spalte 4 dieser Übersicht gezeigt wurde, dass sie Aktivität in Mark oder Mark und Rinde im Stadium des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens aufwiesen, Keimbahntransformationsereignisse durchlaufen haben, was durch Gewinnung von Nachkommenpflanzen, die das GUS-Gen exprimieren, bestätigt wurde.
• Von den Pflanzen, die keine Mark oder Mark und Rinde-Aktivität im Stadium des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens aufwiesen, waren die Ergebnisse gemischter. Von den Pflanzen, die als B in dem Stamm-Segment-Nachweisverfahren bezeichnet wurden, zeigten lediglich 8 Pflanzen während des Nachweisverfahrens unter Verwendung des dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchens Aktivität in der Epidermis, während 6 vollständig negativ in dem GUS-Nachweisverfahren waren. Zwei der Pflanzen, die lediglich Aktivität in der Epidermis aufwiesen, erzeugten transformierte Nachkommen. Der Hinweis auf eine Klassifizierung als B ermöglicht daher alleine und selbstständig keine Voraussage auf ein Keimbahntransformationsereignis. Die Klassifizierung B verweist somit auf eine Wahrscheinlichkeit für die Gewinnung von Keimbahntransformationen in großer Menge, kann jedoch alleine nicht als sehr sichere Voraussage eines Keimbahntransformationsereignisses in Abwesenheit von Mark oder Mark- und Rinden-Beteiligung in dem dritten oder vierten dreiteiligen Teilblättchen der Sojapflanze eingestuft werden.
• Bei den Pflanzen, bei denen das Stamm-Segment-Nachweisverfahren eine Einteilung in eine andere Kategorie bewirkte, brachten die Ergebnisse auch Keimbahntransformationsereignisse vorher, jedoch in geringerer Frequenz. Von den 13 Pflanzen, die als C/P* gekennzeichnet wurden, wurden 5 Pflanzen gewonnen, die den Anschein hatten, als ob GUS in allen Geweben exprimiert würde, jedoch lediglich eine dieser Pflanzen konnte als Keimbahntransformationsereignis bestätigt werden. Von den 45 Pflanzen, die Aktivität in mehr als 50% ihrer Rinde aufwiesen, die als C bezeichnet wurden, wurden 20 GUS exprimierende Pflanzen identifiziert, von denen lediglich eine als Keimbahntransformationsereignis bestätigt wurde. Von den 8 Pflanzen, die aufgrund einer Aktivität von mehr als 50% in der Rinde als C/P Kategorie eingeteilt wurden, wurden 4 Pflanzen gewonnen, die GUS in ihren Blättern exprimierten, wovon lediglich zwei Pflanzen ein Keimbahntransformationsereignis bestätigt wurde. Von den 6 Pflanzen, die Aktivität in weniger als 50% ihres Marks aufwiesen, wurde ein einziges Keimbahntransformationsereignis gefunden. Von den 292 R0-Pflanzen, die geringere Aktivität in der Rinde aufwiesen, wurden 9 gewonnen, die GUS in ihren Blättern exprimierten und ein Keimbahntransformationsereignis wurde erhalten. Von 363 R0- Pflanzen, die Aktivität lediglich in der epidermalen Schicht aufwiesen, wurden 7 Pflanzen gewonnen, die GUS scheinbar in ihren Blättern exprimierten, jedoch bei lediglich einem Ereignis konnte ein Keimbahntransformationsereignis gezeigt werden.
• Basierend auf den in Tabelle 1 gezeigten Daten und den entsprechenden Versuchen wurde festgestellt, dass von den Sojapflanzen, die dem hierin beschriebenen Partikel-vermittelten Transformationsverfahren unterworfen wurden, zwischen 10 und 15% der wiedergewonnenen Triebe irgendeine Form von Expression des GUS- Gens während des Stamm-Segment-Nachweisverfahrens zeigten. Von all den Trieben, die dem Verfahren unterworfen wurden, wurde ein Prozentsatz an Keimbahntransformation ermittelt, der sich ultimativ im Bereich von 0,2 bis 0,5% der regenerierten Triebe bewegt. Bei Durchführung des Stamm-Segment-Nachweisverfahrens kann daher die Anzahl von Pflanzen, mit denen das Regenerationsverfahren durchgeführt werden muss, um einen Faktor von 85 bis 90% reduziert werden. Da festgestellt wurde, dass die höchste Konzentration an Keimbahntransformationsereignissen bei Segmenten erfolgt, die in Kategorie B, C/P*, C, oder C/P eingestuft wurden, können alle anderen Pflanzen, die in dem Stamm-Segment- Nachweisverfahren in andere Kategorien fallen, aufgrund der geringen Wahrscheinlichkeit ein Keimbahntransformationsereignis zu finden, verworfen werden. Da diese Pflanzen in Kategorien fallen, die etwa 15% aller Stamm-Segmente ausmachen, die überhaupt GUS-Aktivität aufweisen ermöglicht dies wiederum etwa 85% der gezogenen Pflanzen zu verwerfen, sodass die Anstrengungen für die Regeneration auf die verbleibenden 15% konzentriert werden können, welche eine hohe Wahrscheinlichkeit für Keimbahntransformationsereignissen aufweisen. Somit müssen etwa 2 bis 2,5% der Triebe, die aus den Transformationsverfahren gewonnen werden, ultimativ weiter gezogen werden, wodurch 97 bis 98% der Arbeit und des Aufwandes, der für die Züchtung der Pflanzen und für die Analyse der Nachkommen anfällt, gespart wird. Mittels Analyse der Nachkommen auf GUS-Aktivität konnte gezeigt werden, dass von den 2%, die durch das Transformationsverfahren regeneriert werden, zwischen 10 und 25% der Pflanzen eine Keimbahntransformation durchlaufen haben und Nachkommen bringen, die stabil transformiert sind und die eingeführte fremde DNS vererbbar enthalten.

Claims (12)

1. Verfahren zur Keimbahntransformation von Bohnenpflanzen, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man:

a) ein exogenes genetisches Konstrukt erzeugt, das eine kodierende Sequenz und eine flankierende regulatorische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, ein Genprodukt, das durch die kodierende Sequenz kodiert wird, in den Zellen der Pflanze zu exprimieren;

(b) Trägerpartikel, die aus biologisch inertem Material bestehen und im Vergleich zur Größe der Pflanzenzellen klein sind, mit Kopien des exogenen genetischen Konstruktes beschichtet;

(c) die beschichteten Trägerpartikel in die Zellen eines regenerierbaren Gewebes der Pflanze beschleunigt;

(d) das Gewebe zu Pflanzen regeneriert;

(e) während des Regenerationsverfahrens ausgewählte Teile des Stammes einer jeden regenerierten Pflanze auf die Gegenwart des genetischen Konstrukts hin untersucht, wobei der ausgewählte Teil des Stammes einen Mark-Bereich umfasst und bei dem Nachweisverfahren bestimmt wird, ob das genetische Konstrukt in dem Mark-Bereich exprimiert wird;

(f) vorzugsweise solche Pflanzen sexuell vermehrt, deren ausgewählten Teile einen positiven Nachweis auf die Gegenwart des genetischen Konstruktes erbrachten, um Nachkommenpflanzen zu erzeugen; und

(g) die Gegenwart des genetischen Konstrukts in den Nachkommenpflanzen verifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Pflanzen Sojabohnen sind.

3. Verfahren zur Erzeugung von Sojabohnenpflanzen, die in der Keimbahn transformiert sind, nach Anspruch 1, bei dem man:

(a) ein exogenes genetisches Konstrukt erzeugt, das für eine Insertion in Sojabohnen geeignet ist, wobei das Konstrukt Expressionskonstrukte sowohl für ein Marker- Gen als auch ein ausgewähltes Gen umfasst, wovon jedes eine kodierende Sequenz und eine flankierende regulatorische Sequenz umfasst, die in der Lage ist, das durch die kodierende Sequenz kodierte Genprodukt in den Zellen der Sojabohnen zu erzeugen;

(b) Trägerpartikel aus biologisch inerten Material, welche im Verhältnis zur Größe der Sojabohnenzellen kleins sind, mit Kopien des exogenen genetischen Konstrukts beschichtet;

(c) die beschichteten Trägerpartikel in Zellen eines regenerierbaren Sojabohnengewebes beschleunigt;

(d) Triebe aus dem Gewebe regeneriert;

(e) eine Segment des Stammes eines jeden Triebes abtrennt;

(f) das Stammsegment auf die Expression des Genproduktes des Marker-Gens hin untersucht,

(g) nur solche Triebe, deren Stamm-Segmente das Genprodukt des Marker-Gens wenigstens in einem wesentlichen Teil des Markes des exprimieren, zu vollständigen, sexuell reifen Sojabohnenpflanzen regeneriert;

(h) die ganzen Pflanzen sexuell fortpflanzt, um Nachkommenpflanzen zu erzeugen; und

(i) die Expression des Genproduktes des Marker-Gens in den Nachkommenpflanzen untersucht, um Keimbahninsertionen des gewünschten Gens in die Keimbahn der Nachkommenpflanzen zu identifizieren.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Marker-Gen ein für das Enzym β-Glukuronidase kodierendes Gen ist und bei dem das Verfahren in den Schritten (f) und (i) auf dem Nachweis der Aktivität dieses Enzyms beruht.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Trägerpartikel Goldpartikel sind.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die antreibende Kraft in dem Beschleunigungsschritt durch Funkenentladung mittels elektrischen Stroms zur Verfügung gestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Schritt der Beschleunigung eine Ablagerung der Trägerpartikel auf einer Trägerplatte, die Platzierung der Trägerplatte nahe eines Paares von getrennten Elektroden und die Auslösung der Funkenentladung durch elektrischen Strom zwischen den Elektroden umfasst.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei dem das Sojabohnengewebe, in das die Trägerpartikel beschleunigt werden, freigelegte embryonale Achsen von Sojabohnen-Samen umfassen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die embryonalen Achsen nach dem Partikel-Beschleunigungsschritt ausplattiert werden und bei dem während des Regenerationsschrittes die Triebbildung in den ausplattierten embryonalen Achsen induziert wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, bei dem jeder der sich regenerierenden Triebe vom Sojabohnengewebe abgetrennt wird und ein Segment des Stammes im wesentlichen zum selben Zeitpunkt von jedem Trieb abgetrennt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, bei dem der Regenerationsschritt (g) nur mit solchen Pflanzen durchgeführt wird, deren Stammsegmente das Marker-Gen sowohl in Mark, Rinde und Epidermis exprimieren, und zwar in mehr als 50 % der Rinde und mehr als 50% des Markes oder in mehr als 50 % des Markes des Stammsegmentes.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei der sexuelle Fortpflanzungsschritt (h) durch Selbstbestäubung durchgeführt wird.