DE69131969T2

DE69131969T2 - Für Spinnenseideprotein kodierende DNS, DNS enthaltender Vektor, transformierte Zelle und Produkte davon

Info

Publication number: DE69131969T2
Application number: DE69131969T
Authority: DE
Inventors: Michael Hinman; Randolph V. Lewis; Ming Xu
Original assignee: University of Wyoming
Current assignee: University of Wyoming
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2011-04-19
Also published as: EP0452925A2; JP2852822B2; DE69131969D1; EP0452925A3; EP0452925B1; ATE189699T1; JPH0698771A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das ein Seidenprotein codiert, einen Vektor oder ein Plasmid, der/das das DNA-Molekül enthält, ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Spinnenseidenproteine und Spinnenseidenproteine sowie deren Fragmente und Varianten.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Hauptampullen- (Zug-) seide von Kugelspinnen besitzt einzigartige physikalische Eigenschaften und erhebliche Elastizität, Denny, M. W., J. Exp. Biol. 65, 483-506 (1976); Lucas, F., Discovery 25, 20-26 (1964). Frühere Untersuchungen legen nahe, dass die Spinnenseide aus einem einzigen großen Protein besteht, das hauptsächlich pseudokristalline Bereiche aus gestapelten β-Faltblättern enthält, die mit amorphen Domänen abwechseln, Warwicker, J. O., J. Mol. Biol. 2, 350-362 (1960); Lucase, F., et al., J. Text. Inst. 46, T440-T452 (1985); Hepburn, H. R., et al., Insect Biochem. 9, 69-71 (1979). Die molekulare Grundlage für die Elastizität von Spinnenseide ist zur Zeit unbekannt. Es wurde jedoch angenommen, dass ein entropiegetriebener Prozess, wie er bei Gummi vorliegt, beteiligt ist, Gosline, J. M., et al., Nature 309, 551-552 (1984). Man hat auch spekuliert, dass die amorphen Bereiche erheblich zu den elastischen Eigenschaften der Faser beitragen, Hepburn, H. R., et al., Insect Biochem. 9, 69-77 (1979).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung der DNA sowie von Mitteln zur Herstellung von Seidenproteinen und deren Varianten durch DNA-Rekombinationsverfahren. Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Fragmente und Varianten der rekombinanten Seidenproteine bereitzustellen. Diese Aufgaben werden von der Erfindung gelöst, wie in den Ansprüchen 1 bis 53 definiert. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Die Erfinder haben insbesondere entdeckt, dass das Spinnenseidenprotein von Nephila clavipes in der Natur als. Gemisch mindestens zweier Spinnenseidenproteine vorkommt. Die Erfinder klonierten Abschnitte dieser Proteine und bezeichneten diese Proteine als Seidenprotein 1 und Seidenprotein 2. Diese beiden Gene wurden unabhängig voneinander kloniert, so dass die beiden Proteine unabhängig voneinander durch Rekombinationstechniken hergestellt werden können. Die Seidenproteine lassen sich dann reinigen, d. h. von verunreinigenden Materialien im Expressionssystem trennen. So werden reines oder homogenes Seidenprotein 1 oder reines oder homogenes Seidenprotein 2 hergestellt. Das Spinnenseidenprotein 1 enthält somit kein Spinnenseidenprotein 2 und das Spinnenseidenprotein 2 kein Spinnenseidenprotein 1. Diese Proteine lassen sich in reiner Form einsetzen oder miteinander mischen, so dass man annähernd die Eigenschaften natürlicher Spinnenseide erhält. Seidenprotein 1 und Seidenprotein 2 werden in einer Menge von 100 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise 10 : 1 bis 1 : 2, stärker bevorzugt 5 : 1 bis 1 : 1 gemischt.
Die erfindungsgemäße isolierte cDNA codiert vorzugsweise Spinnenseidenprotein mit der in Fig. 6 oder Fig. 7 gezeigten Sequenz oder ein Fragment oder eine Variante davon.
Die Aminosäurezusammensetzung des Fragments oder der Variante kann mit derjenigen des natürlichen Spinnenseidenproteins übereinstimmen. Die mittels FTIR erhaltene Struktur kann hauptsächlich eine β-Faltblattstruktur sein. Das Fragment oder die Variante sollte wie das native Protein nur in hoch chaotropen Lösungsmitteln wie LiSCH, Li- Perchlorat oder Ameisensäure löslich sein.
Das Spinnenseidenprotein ist durch wiederholte α- und β-Bereiche und gegebenenfalls variable Bereiche gekennzeichnet. Von Spinnenseidenprotein 1 und Spinnenseidenprotein 2 ist keine vollständige cDNA kloniert oder sequenziert. Man erwartet aber, dass Spinnenseidenprotein 1 und Spinnenseidenprotein 2 jeweils ein Molekulargewicht unter 300000 Dalton, möglicherweise mehr als 100000, aber weni ger als 300000 Dalton, vorzugsweise 120000 bis 300000 Dalton aufweisen. Spinnenseidenprotein 1 und Spinnenseidenprotein 2 können jeweils 900 bis 2700 Aminosäuren mit 25 bis 100, vorzugsweise 30 bis 90 Repeats aufweisen. Das Spinnenseidenprotein lässt sich beispielsweise darstellen durch die Formel [(α)(β)]P,
wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein Bereich ist, der (in gefalteter Konformation) β-Faltblätter bilden kann und p für Fragmente eine ganze Zahl von 1 bis 100, vorzugsweise 15 bis 50, stärker bevorzugt 18 bis 22 ist und p für das Volllängen-Spinnenseidenprotein eine ganze Zahl von 25 bis 100, vorzugsweise 30 bis 90 ist. Die Sequenz kann gegebenenfalls auch Bereiche enthalten, die zwischen die α- und/oder β-Bereiche eingestreut sind.
Ein verwendbares Protein oder Fragment sollte (I) in der Zelle, in der es exprimiert wird, unlöslich sein oder (2) sich unter Bedingungen, unter denen gewöhnlich Fasern hergestellt werden, zu einer unlöslichen Faser formen lassen. Vorzugsweise ist das Protein unter den Bedingungen (1) und (2) unlöslich. Das Protein oder Fragment sollte insbesondere in einem Lösungsmittel wie Wasser, Alkohol (Methanol, Ethanol usw.), Aceton und/oder organische Säuren usw. unlöslich sein. Man sollte das Protein oder Fragment zu eine Faser mit hoher Zugfestigkeit, z. B. einer Zugfestigkeit von 0,5x bis 2x, formen können, wobei x die Zugfestigkeit einer Faser ist, die aus der entsprechenden natürlichen Seide oder dem gesamten Protein besteht. Man sollte das Protein oder Fragment auch zu einer Faser formen können, die eine Elastizität von mindestens 15%, stärker bevorzugt etwa 25% besitzt.
Varianten des Spinnenseidenproteins können zu einer Faser mit einer Zugfestigkeit und/oder Elastizität geformt werden, die größer ist/sind als bei der natürlichen Spinnenseide oder bei dem natürlichen Protein. Die Elastizität lässt sich möglicherweise bis auf 100% erhöhen. Die Varianten können ebenfalls die Eigenschaften der oben beschriebenen Fragmente besitzen.
Das Fragment oder die Variante kann im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie die natürliche Spinnenseide haben. Das natürliche Protein ist insbesondere in Faserform unlöslich und widersteht dem Abbau durch die meisten Enzyme.
Bei der Erfindung kann die isolierte cDNA Spinnenseidenproteine codieren, wie das Hauptampullen- (Zug-) seidenprotein von Nephila clavipes, das Nebenampullenseidenprotein von Nephila clavipes, das Kokonseidenprotein von Nephila clavipes, das Hauptampullenseidenprotein von Araneus gemmoides und das Kokonseidenprotein von Araneus gemmoides.
Die Erfindung betrifft zudem einen replizierbaren Vektor, der cDNA enthält, die ein Spinnenseidenprotein codiert, und Spinnenseidenprotein exprimieren kann.
Die Erfindung betrifft außerdem eine transformierte Zelle oder einen transformierten Mikroorganismus, der cDNA oder einen Vektor enthält, die/der ein Spinnenseidenprotein oder ein Fragment oder eine Variante davon codiert und Spinnenseidenprotein exprimieren kann.
Die Erfindung betrifft zudem ein neues Seidenprotein und ein Verfahren zur Herstellung des Proteins, umfassend das Züchten der oben beschriebenen transformierten Zelle oder des Mikroorganismus unter Bedingungen, dass die Expression des Seidenproteins möglich ist, gegebenenfalls Gewinnen des so exprimierten Seidenproteins und gegebenenfalls Reinigen des gewonnenen Seidenproteins. Das so hergestellte Seidenprotein kann sich von natürlichem Spinnenseidenprotein unterscheiden. Das durch rekombinante Verfahren hergestellte Seidenprotein kann auch geringe Mengen verunreinigender Materialien aus dem Mikroorganismus, den Zellen und/oder dem Fermentationssystem, in denen es hergestellt wurde, enthalten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Erfindung wird aufgrund der folgenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen, die zur Veranschau lichung gezeigt werden und daher die Erfindung nicht einschränken, besser verstanden. Es zeigt:
Fig. 1 die FTIR-Spektren einer Zugseidenfaser aus der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes als Funktion der ausgeübten Kraft, wobei die Faserachse rechtwinklig (C und D) und parallel (A und B) zur polarisierten Strahlung liegt; A) und C): Originalspektren; B) und D): teilweise entfaltete Spektren von A) bzw. C);
Fig. 2 die FTIR-Spektren einer Zugseidenfaser aus der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes, wobei die Faserachse parallel (A) und rechtwinklig (B) zur polarisierten Strahlung liegt; (i): 0 g axiale Spannung; (ii): 2,0 g axiale Spannung; (iii): 29 min nach Nachlassen der axialen Spannung; (iv): 12 Std. nach Nachlassen der axialen Spannung;
Fig. 3 die FTIR-Spektren einer Zugseidenfaser aus der Hauptampullendrüse von Araneus gemmoides als Funktion der ausgeübten Kraft, wobei die Faserachse rechtwinklig (C und D) und parallel (A und B) zur polarisierten Strahlung liegt; A) und C): Originalspektren; B) und D): teilweise entfaltete Spektren von A) bzw. C);
Fig. 4 die FTIR-Spektren von 3 Zugseidensträngen aus der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes, die auf der Probenplatte zufallsgemäß angeordnet sind und ohne Polarisator nachgewiesen werden; durchgezogene Linie: Originalspektrum; gestrichelte Linie: partiell entfaltetes Spektrum;
Fig. 5 die entfalteten FTIR-Spektren einer Seidenfaser aus der Nebenampullendrüse von Nephila clavipes; A): Faserachse rechtwinklig zur einfallenden polarisierten Strahlung; B): Faserachse parallel zur einfallenden polarisierten Strahlung;
Fig. 6 die gesamte cDNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für das Spinnenseidenprotein 1 aus der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes. Das Spinnenseidenprotein wird von der DNA bis zur Position 2154 codiert. Also ist die letzte Aminosäure Ser (Aminosäure 718) an den Positionen 2152-2154. Die cDNA-Sequenz und die ent sprechende Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NR. 1 dargestellt. Das Stopcodon TAG an den Positionen 2155-2157 wird genauso wenig translatiert wie die übrigen Codons; und
Fig. 7 die gesamte cDNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz für Spinnenseidenprotein 2 aus der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes. Das Spinnenseidenprotein wird von der DNA bis zur Position 1785 codiert. Die cDNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz sind in SEQ. ID. NR. 3 dargestellt.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Gene für zwei verschiedene Spinnenseidenproteine, z. B. Spinnenseidenprotein 1 und Spinnenseidenprotein 2, sind kloniert worden.

SEIDENPROTEIN 1

Die cDNA codiert ein Spinnenseidenprotein, umfassend repetitive Einheiten, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt
[(α)(β)]p (I)
wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein β-kristalliner Bereich ist und p für Fragmente eine ganze Zahl von 1 bis 100, vorzugsweise 15 bis 50, stärker bevorzugt 18 bis 22 und für das Volllängenprotein 25 bis 100, vorzugsweise 30 bis 90 ist.
Der α-Bereich ist vorzugsweise ein alaninreicher Bereich, der 4 bis 10 As, vorzugsweise 5 bis 8 As und stärker bevorzugt 6 oder 7 As enthält. Der α-Bereich enthält mindestens 50% Alanin, vorzugsweise mindestens 60% Alanin, stärker bevorzugt etwa 70-80% Alanin und umfasst etwa 35 bis 50%, vorzugsweise 30 bis 40% des Gesamtproteins, bezogen auf die Gesamtanzahl der Aminosäuren. Der α-Bereich kann andere Aminosäuren wie Glycin und/oder Serin enthalten.
Der β-Bereich ist eine Sequenz, die eine β-kristalline Struktur bildet oder β-Faltblätter bildet. Der β-Bereich umfasst vorzugsweise 40-70% des Gesamtproteins, stärker bevorzugt 50-60% des Gesamtproteins. Die obigen Prozentangaben (%) betreffen % Aminosäuren. Für jeden Repeat "p" in der obigen Formel können der α- und der β- Bereich gleich oder unterschiedlich sein.
Die cDNA codiert Spinnenseidenprotein, das repetitive Einheiten umfasst, die auch dargestellt werden können durch die allgemeine Formel
[(v)(α)(β)] (II)
wobei α, β und p wie oben definiert sind, v ein variabler Bereich ist und der variable Bereich (v), wenn vorhanden, ein Bereich ist, der 0 bis etwa 12 Aminosäuren enthält und gewöhnlich mit der Sequenz AGR beginnt. Ein größerer Teil der repetitiven Einheiten im Spinnenseidenprotein kann die in diesem Abschnitt definierten Einheiten enthalten. Beispielhafte Sequenzen, die unter diese Formel fallen, sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Die isolierte erfindungsgemäße cDNA kann ein Protein codieren, das repetitive Einheiten umfasst, umfassend eine durch die folgende Formel wiedergegebene Sequenz
-[(A)m(X)n]p- (III)
wobei m 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8 und stärker bevorzugt 6 oder 7 ist, n 10 bis 20, vorzugsweise 12 bis 18 und stärker bevorzugt 14 bis 16 ist, p wie oben definiert ist und die Reste X, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus G, A, Q, Y und L, wobei mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60% der Reste X aus G bestehen. Für jeden Repeat "p" in der obigen Formel können m und n jeweils gleich oder unterschiedlich sein.
Mindestens 50% der repetitiven Einheiten des Spinnenseidenproteins lassen sich durch die Formel (I), (II) bzw. (III) darstellen, vorzugsweise lassen sich mindestens 70% der repetitiven Einheiten durch die Formel (I), (II) bzw. (III) darstellen.
Die isolierte erfindungsgemäße cDNA enthält repetitive Einheiten, die die Sequenz codieren
-[(A)mGGAGQGGYGGLGGQG]- (IV)
wobei m 6 oder 7 ist.
Die Spinnenseide oder deren Fragment oder Variante hat gewöhnlich ein Molekulargewicht von mindestens etwa 16000 Dalton, vorzugsweise 16000 bis 100000 Dalton, stärker bevorzugt 50000 bis 80000 Dalton für Fragmente und mehr als 100000, aber weniger als 300000 Dalton, vorzugsweise 120000 bis 300000 Dalton für das Volllängenprotein. Das Molekulargewicht des in Fig. 6 gezeigten und in SEQ. ID. NR. 2 aufgelisteten Spinnenseidenproteins beträgt 64492 Dalton.
In den obigen Formeln (I) bis (IV) kann das Protein noch zusätzliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen besitzen, die in das Protein in dessen Mitte oder an dessen Enden inseriert sind, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt. Ebenso können einige der Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen aus dem Protein deletiert sein, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt. Auch Aminosäuresubstitutionen können in der Sequenz vorgenommen werden, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt.
Das Hauptprotein der Zugseide von Nephila clavipes ist kloniert worden. Die Sequenz umfasst ein repetitives Hexamer Gly-Gly-X-Gly-Y-Gly, wobei X und Y hauptsächlich Gln und Ala sind, aber auch andere Aminosäuren sein können. Diese Repeats werden durch Aminosäureinsertionen variabler Länge aus Ala und Ser, wobei kleine Anteile anderer Aminosäuren möglich sind, voneinander getrennt. Eine beispielhafte Sequenz lautet wie folgt:
-[G-G-Q-G-A-G]-A-A-A-A-[G-G-A-G-Q-G]-
G-Y-[G-G-V-G-S-G]-A-S-A-A-S-A-A-A-S-
Das Protein besteht hauptsächlich aus Repeats der Sequenz
AGRGGXGGZGAG(A)&sub6;&sub7;GGAGQGGYGGLGGQG,
wobei X und Y L, Y oder Q sind, aber X nicht gleich Z ist.

SEIDENPROTEIN 2

Die cDNA codiert ein Spinnenseidenprotein, umfassend repetitive Einheiten, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt
[(β)(α)]p (I)
wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein Bereich aus verbundenen β-Windungen ist und eine β-Faltblatt-ähnliche Struktur bildet und p für Fragmente eine ganze Zahl von 1 bis 100, vorzugsweise 15 bis 50, stärker bevorzugt 18 bis 22 und für das Volllängenprotein 25 bis 100, vorzugsweise 30 bis 90 ist.
Der α-Bereich ist vorzugsweise ein alaninreicher Bereich, der 4 bis 10 As, vorzugsweise 6 bis 10 As enthält. Der α-Bereich enthält mindestens 50% Alanin, vorzugsweise mindestens 60% Alanin, stärker bevorzugt etwa 70-100% Alanin und umfasst etwa 35 bis 50%, vorzugsweise 30 bis 40% des Gesamtproteins, bezogen auf die Gesamtanzahl der Ami nosäuren. Der α-Bereich kann andere Aminosäuren wie Serin und/oder Glycin enthalten. Diese Substitutionen haben keine erhebliche Auswirkung auf die Funktion.
Der β-Bereich ist jede Sequenz, die verbundene β- Windungen bildet. Der Bereich der β-Windungen umfasst Repeats von GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS mit gelegentlichen Substitutionen und einer Insertion von GGY. Der β-Windungen- Bereich hat einen viel höheren Prolingehalt als der β- kristalline Bereich des Seidenproteins 1. Wahrscheinlich verursacht Prolin die Windungen oder "Kinks" im Protein. Die β-Windungen enthalten jeweils 1 Prolin, gewöhnlich 0 bis 2 Proline. Die β-Bereiche enthalten gewöhnlich mehr als 1 β-Windung, gewöhnlich 4 oder 5 β-Windungen. Der β- Bereich umfasst vorzugsweise 40-70% des Gesamtproteins, stärker bevorzugt 50-60% des Gesamtproteins. Die obigen Prozentangaben (%) betreffen % Aminosäuren. Für jeden Repeat "p" in der obigen Formel können der α- und der β- Bereich gleich oder unterschiedlich sein.
Die cDNA codiert Spinnenseidenprotein, das repetitive Einheiten umfasst, die auch dargestellt werden können durch die folgende allgemeine Formel
[(β)(α)(v)]p (II)
wobei α, β und p wie oben definiert sind, v ein variabler Bereich ist und der variable Bereich (v), wenn vorhanden, ein Bereich ist, der 0 bis etwa 20, gewöhnlich 0 bis 18 Aminosäuren enthält und gewöhnlich die Sequenz GPGGY und/oder GPGQQ enthält. Ein größerer Teil der repetitiven Einheiten im Spinnenseidenprotein kann die in diesem Abschnitt definierten Einheiten enthalten. Beispielhafte Sequenzen, die unter diese Formel fallen, sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Die isolierte erfindungsgemäße cDNA kann ein Protein codieren, das repetitive Einheiten umfasst, umfassend eine durch die folgende allgemeine Formel wiedergegebene Sequenz
-[(A)m(X)n]p- (III)
wobei m 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 10 ist, n 10 bis 20, vorzugsweise 12 bis 18 und stärker bevorzugt 14 bis 16 ist, p wie oben definiert ist und die Reste X, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus P, G, A, Q, Y und L, wobei mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60% der Reste X aus G bestehen. Für jeden Repeat "p" in der obigen Formel können m und n jeweils gleich oder unterschiedlich sein.
Mindestens 50% der repetitiven Einheiten des Spinnenseidenproteins lassen sich durch die Formel (I), (II) bzw. (III) darstellen, vorzugsweise lassen sich mindestens 70% der repetitiven Einheiten durch die Formel (I), (II) bzw. (III) darstellen.
Die isolierte erfindungsgemäße cDNA enthält repetitive Einheiten, die die Sequenz codieren
-[β(A)m]- (IV)
wobei β wie oben definiert ist und m 6 bis 10 ist.
Die Spinnenseide oder deren Fragment oder Variante hat gewöhnlich ein Molekulargewicht von mindestens etwa 16000 Dalton, vorzugsweise 16000 bis 100000 Dalton, stärker bevorzugt 50000 bis 80000 Dalton für Fragmente und mehr als 100000, aber weniger als 300000 Dalton, vorzugsweise 120000 bis 300000 Dalton für das Volllängenprotein. Das Molekulargewicht des in Fig. 7 gezeigten und in SEQ. ID. NR. 4 aufgelisteten Spinnenseidenproteins beträgt 51157 Dalton.
In den obigen Formeln (I) bis (IV) kann das Protein noch zusätzliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen besitzen, die in das Protein in dessen Mitte oder an dessen Enden inseriert sind, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt. Ebenso können einige der Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen aus dem Protein deletiert sein, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt. Auch Aminosäuresubstitutionen können in der Sequenz vorgenommen werden, solange das Protein die gewünschten physikalischen Eigenschaften besitzt.
Die hier für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen werden, wenn nicht anders angegeben, wie nachstehend beschrieben herkömmlicherweise definiert
Rekombinantes Spinnenseidenprotein kann aus Kulturen durch Lysieren der Zellen gewonnen werden, so dass das im Inneren der Zellen befindliche Spinnenseidenprotein freigesetzt wird. Zu Beginn können die Zelltrümmer mittels Zentrifugation abgetrennt werden. Die verbleibenden Trümmer und der Überstand werden dann wiederholt mit Lösungsmitteln behandelt, in denen die Zelltrümmer löslich sind, aber das Spinnenseidenprotein unlöslich ist, so dass das Spinnenseidenprotein gefällt wird. Diese Verfahren können wiederholt und mit anderen Verfahren, einschließlich Fil tration, Dialyse und/oder Chromatographie, kombiniert werden, so dass ein reines Produkt erhalten wird.
Da der genetische Code degeneriert ist, kann mindestens eine Base der Basensequenz durch eine andere Basenart ersetzt werden, ohne dass die Aminosäuresequenz des aus dem Gen erzeugten Polypeptids geändert wird. Somit kann die erfindungsgemäße DNA jede Basensequenz haben, die durch Substitution in Übereinstimmung mit dem degenerierten genetischen Code geändert worden ist. Beispielsweise ist die Aminosäuresequenz, die von einer modifizierten, durch die oben erwähnte Substitution erhaltene DNA nach Fig. 6 codiert wird, mit der Aminosäuresequenz der Fig. 6 identisch.
Die DNA lässt sich leicht durch Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden modifizieren, so dass neue DNA-Sequenzen erhalten werden, die Spinnenseidenprotein oder dessen Derivate codieren. Diese modifizierten Sequenzen werden zur Herstellung von mutiertem Spinnenseidenprotein und zur direkten Expression von Spinnenseidenprotein verwendet.
DNA-Bereiche sind funktionsfähig miteinander verbunden, wenn sie funktionell zueinander in Beziehung stehen. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader funktionsfähig mit der DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist. Ein Promotor ist mit einer codierenden Sequenz funktionsfähig verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz reguliert. Eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz fünktionsfähig verbunden, wenn sie so gelegen ist, dass sie die Translation ermöglicht. Gewöhnlich bedeutet "funktionsfähig verbunden" "ineinander übergehend" und bei Sekretionsleadern "ineinander übergehend und im gleichen Leseraster".
Geeignete Wirtszellen sind Prokaryoten, Hefe oder Zellen höherer Eukaryoten. Zu den Prokaryoten gehören gram-negative oder gram-positive Bakterien, z. B. E. coli oder Bacilli. Zellen höherer Eukaryoten umfassen bestehen de Zelllinien von Insekten, Spinnen oder Säugern, wie nachstehend beschrieben.
Prokaryotischer-Wirt-Vektor-Systeme sind für die Expression von Spinnenseidenprotein bevorzugt. Es ist eine Vielzahl geeigneter Vektoren verfügbar. Gewöhnlich enthält ein mikrobieller Vektor einen Replikationsursprung, der vom gewünschten Wirt erkannt wird, einen Promotor, der im Wirt arbeitet und ein Gen zur phänotypischen Selektion, beispielsweise ein Gen, das ein Protein codiert, das Antibiotikaresistenz verleiht oder bei Auxotrophie einen Zusatz bereitstellt.
Vektoren müssen einen Promotor enthalten, der vom Wirtsorganismus erkannt wird. Dieser Promotor ist gewöhnlich mit dem gewünschten Wirt homolog. Promotoren, die am häufigsten bei der Konstruktion rekombinanter DNA eingesetzt werden, sind u. a. die β-Lactamase- (Penicillinase-) und Lactose-Promotorsysteme, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem sowie der tac-Promotor. Diese werden zwar am häufigsten verwendet, aber es eignen sich auch andere bekannte mikrobielle Promotoren. Einzelheiten bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht, so dass der Fachmann sie funktionsfähig an DNA, die das Spinnenseidenprotein codiert, in Plasmidvektoren sowie an DNA, die das Spinnenseidenprotein codiert, ligieren kann. Der zur Zeit bevorzugte Vektor ist pGEM3Z. Andere mögliche Expressionsvektoren sind λGT11 und pGEMSZft.
Außer Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie Hefekulturen, mit Vektoren, die das Spinnenseidenprotein codieren, transformiert werden. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe wird unter den niederen eukaryotischen Wirtsorganismen am häufigsten verwendet. Es ist aber auch eine Reihe weiterer Stämme allgemein erhältlich. Hefevektoren enthalten gewöhnlich einen Replikationsursprung des 2-Mikron-Hefeplasmids oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine DNA- Sequenz, die Spinnenseidenprotein codiert, Sequenzen für Polyadenylierung und Transkriptionstermination sowie ein Selektionsgen.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren sind u. a. die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase oder andere Glycolyse-Enzyme.
Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil besitzen, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen reguliert wird, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängende Abbauenzyme sowie das bereits genannte Metallothionein und die Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactosenutzung verantwortlich sind. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden auch die mit diesen Genen verbundenen Terminationssequenzen 3' der für das Spinnenseidenprotein codierenden Sequenzen in den Expressionsvektor ligiert, so dass Polyadenylierung der mRNA und Termination bereitgestellt werden.
Außer den Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die von vielzelligen Organismen herrühren, als Wirte verwendet werden. Im Prinzip ist jede Kultur von Zellen höherer Eukaryoten, ob Vertebraten- oder Invertebratenkultur, verwendbar. Beispielsweise kann ein Insektenvirus, wie das Baculovirus, zur Expression des Seidenproteins in Insektenzellen verwendet werden. Das größte Interesse besitzen aber Vertebratenzellen. Die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist seit einigen Jahren ein Routineverfahren. Beispiele für geeignete Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Ovarzelllinien des Chinesischen Hamsters (CHO) und WI38-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zelllinien. Die Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten gewöhnlich (wenn nötig) einen Replikationsursprung, einen stromaufwärts des zu exprimierenden Gens gelegenen Promotor zusammen mit einer Ribosomenbindungsstelle, RNA-Spleiss-Stelle (wenn intronhaltige genomische DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Die Transkriptions- und Translationsregulationssequenzen in den für die Transformation von Vertebratenzellen zu verwendenden Expressionsvektoren werden oft von Vi ren bereitgestellt. Zum Beispiel rühren häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am stärksten bevorzugt vom Simian Virus 40 (SV40) her. Der frühe und der späte Promotor sind besonders geeignet, da sich beide leicht aus dem Virus als Fragment erhalten lassen, das auch den Replikationsursprung des SV40-Virus enthält. Es können auch kleinere oder größere SV40-Fragmente verwendet werden, vorausgesetzt, dass die etwa 250 bp lange Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zur im Replikationsursprung des Virus liegenden BglI-Stelle erstreckt, enthalten ist.
Man kann den Replikationsursprung bereitstellen indem der Vektor so hergestellt wird, dass ein exogener Ursprung enthalten ist, der beispielsweise von SV40 oder einem anderen Virus (z. B. Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) herrührt, oder er kann vom chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wird der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert, reicht letzteres häufig aus.
Im folgenden wird die Protein- und DNA-Sequenz des Hauptproteins in Zugseide beschrieben. Die Proteinsequenz umfasst ein Repeat-Muster, das sich in drei Segmente gliedert. Das erste Segment enthält bis zu 9 Aminosäuren. Diese Sequenz lautet AGRGGLGGQ. Das Segment kann aber auch keine Aminosäuren oder eine Kombination der ersten drei mit einer aus dem zweiten Satz von drei Aminosäuren enthalten. Das zweite Segment besteht aus 9 oder 10 Aminosäuren mit der Sequenz GAGAAAAAA(A). Diese Sequenz ist in allen Repeats zugegen. Das letzte Segment besteht aus 15 Aminosäuren mit der Sequenz GGAGQGGYGGLG QG. Dieses Segment ist an der unterstrichenen Position variabel und kann dort auch S, N oder A enthalten. Dieses dritte Segment ist in allen Repeats zugegen. In allen Segmenten kommt es selten zu Substitutionen mit anderen Aminosäuren. Es ist aber kein Muster ersichtlich, und man sieht sie in weniger als 5% der sequenzierten Repeats.
Die DNA-Sequenz dieses Proteins zeigt eine hohe Präferenz für A oder T an der dritten Codonposition. Somit enden nur etwa 10% der Codons in G oder C, wobei man bei einer zufälligen Auswahl 50% erwartet. Dies ist wahrscheinlich ein Stabilitätsfaktor für die DNA, so dass Rekombinations- und Deletionsereignisse vermieden werden.
Spinnenzugseide besitzt eine Reihe ungewöhnlicher Eigenschaften. Dazu gehören eine höhere Zugfestigkeit als Stahl oder Kohlefasern (200 ksi), eine Elastizität wie bei einigen Nylonarten (35%), eine so geringe Steifigkeit wie Seide (0,6 msi) und die Fähigkeit zur Superkontraktion in Wasser (bis zu 60%ige Längenabnahme). Diese Eigenschaften werden von keinem anderen Material erzielt. Das neue erfindungsgemäße Material stellt diese Merkmale bereit und ist zugleich sehr leicht. Das klonierte erfindungsgemäße Protein ist der Hauptbestandteil dieser Seide.
Spinnenseide, insbesondere Zugseide, hat eine Zugfestigkeit von mehr als 200 ksi und dennoch eine Elastizität von fast 35%. Durch diese Kombination ist zum Brechen der größte Energieeinsatz unter allen bekannten Fasern, einschließlich Kevlar und Stahl, nötig. Diese Kombination ist auch für alle biologischen und künstlich hergestellten Materialien einzigartig. Zur Faser gesponnen, was sich durch Lösen von Spinnenseide in einem geeigneten Lösungsmittel und Pressen durch ein kleine Öffnung erzielen lässt, findet Spinnenseide zahlreiche Anwendungen. Beispielsweise wird ein großer Teil für Bekleidung verwendet. Seide mit dieser Elastizität hat sogar zu hohen Preisen einen einzigartigen Platz auf dem Markt. Sie ist auch für bestimmte Hochfestigkeitsanwendungen, beispielsweise Seile, Chirurgiezwirne, flexible Bänder für bestimmte elektrische Komponenten und sogar als biologisches Material zur Implantation (z. B. künstliche Bänder oder Aortenbänder), anwendbar. Somit gibt es zahlreiche Anwendungen für die Erfindung, einschließlich High-Tech-Bekleidung, Seilen, Zwirnen, medizinischen Abdeckungen und anderen, bei denen verschiedene Kombinationen von Festigkeit und Elastizität erforderlich sind. Die Eigenschaften der Seidenfasern lassen sich auch durch Ändern der Proteinsequenz modifizieren.
Die Fasern lassen sich für die gleichen Zwecke wie natürliche Spinnenseidenfasern einsetzen. Sie können auch mit verschiedenen Kunststoffen und/oder Harzen gemischt werden, so dass ein faserverstärktes Kunststoff- und/oder Harzprodukt entsteht. Da Spinnenseide bis 100ºC stabil ist, können die Fasern zur Verstärkung von Wärmespritzgusskunststoff verwendet werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Varianten des natürlichen Spinnenseidenproteins, umfassend das Bestimmen der DNA-Sequenz eines Gens, das ein natürliches Spinnenseidenprotein codiert, Herstellen einer Variante der DNA-Sequenz und Exprimieren dieser Variante der DNA-Sequenz in einer Zelle oder einem Mikroorganismus, so dass ein variiertes Spinnenseidenprotein mit anderen Eigenschaften als die natürliche Spinnenseide hergestellt wird. Die Varianten natürlicher Spinnenseiden- DNA lassen sich herstellen durch Identifizieren von Bereichen der DNA des Gens, die amorphen Bereichen des natürlichen Spinnenseidenproteins entsprechen und Modifizieren der DNA-Sequenz, die dem amorphen Bereich oder den amorphen Bereichen entspricht, so dass man die Elastizitätseigenschaften des Proteins, das von der variierten DNA exprimiert wird, ändert, oder durch Identifizieren von Bereichen der DNA des Gens, die β-kristallinen Bereichen im natürlichen Spinnenseidenprotein entsprechen, und Modifizieren der DNA-Sequenz, die dem β-kristallinen Bereich oder den β-kristallinen Bereichen entspricht, so dass die Festigkeitseigenschaften des Proteins verändert werden.
Es werden DNA-Sonden auf der Basis der Aminosäuresequenz von Peptiden, die von Nephila-Zugseide herrühren, zur Identifikation mehrerer Klone aus einer SpinndrüsencDNA-Bank verwendet. Insbesondere sind mehr als 2 kb von zwei getrennten Klonen des Nephila-Zugseidenproteins wie im Beispiel 3 beschrieben sequenziert worden. Der größte der Klone (2,5 kb) ist vollständig sequenziert. Die Sequenz enthält die Poly-A-Stelle, 340 Basen des 3'- untranslatierten Bereichs und den Rest eines proteincodierenden Bereichs. Der Proteinbereich enthält einen basi schen 34-Aminosäure-Repeat, der wiederum drei Bereiche enthält. Der erste umfasst 0-9 Aminosäuren der Sequenz AGR(GGX)&sub2;. Dieser Bereich ist eindeutig nicht hoch konserviert. Der zweite Bereich weist die Sequenz GAG(A)x auf, ist in allen Repeats hoch konserviert und 8-10 Aminosäuren lang. Das dritte Segment ist (GGX)&sub5;, ist 15 Aminosäuren lang und sehr hoch konserviert. In den meisten Fällen steht X für A, Q, Y oder L. Klone für andere Seidenproteine sind isoliert und sequenziert worden. Außerdem ist die Aminosäuresequenz verschiedener Seidenproteine bestimmt worden. Dazu gehören: Nephila-Zugseide (GYGPG, GQGAG, GAGQG, GYGGLG) und Kokonseide (SAFQ) sowie Araneus- Zugseide (GPYGPGQQGP) und Kokonseide (FLGG, SVGLV-L/I -A- Y-A-L). Mehr als 18 positive Klone sind in einer Nephila- Seidendrüsen-Bank unter Verwendung einer 18-mer-Sonde auf der Basis der Zugseidenproteinsequenz identifiziert worden.
Erfindungsgemäß lässt sich das rekombinante Protein in Bakterien herstellen, falls nötig reinigen und zu Fasern spinnen. Es lässt sich für die Produktion die optimale Proteingröße bestimmen, so dass das Protein die wichtigen physikalischen Eigenschaften beibehält.
Die Sequenzen der Repeats des Spinnenseidenproteins können auf vielfältige Weise variieren und dennoch im Umfang der Erfindung liegen. Beispielsweise können Gln, Leu und Tyr in der Sequenz gegeneinander ausgetauscht werden. Die Entfernung von Poly-Ala-Segmenten führt zudem zu einer Seide mit geringerer Elastizität. Eine weitere Variante der Proteinsequenz ist der Ersatz eines Gly in jedem Gly- Paar von GGX durch Ser.
Somit kann das erfindungsgemäße Seidenprotein je nach seiner beabsichtigten Verwendung verändert werden. Ist beispielsweise ein geringere Elastizität gewünscht, sollte der Poly-Ala-Bereich der Proteinsequenz entfernt werden. Ist dagegen hohe Elastizität gewünscht, sollte der Poly- Ala-Bereich verlängert werden. Wünscht man eine weniger steife Seide, sollte Glycin durch Serin ersetzt werden.
Erfindungsgemäß lassen sich große Mengen Protein mit den gewünschten Eigenschaften erhalten. Dieses Protein lässt sich zu Fasern für jeden beabsichtigten Gebrauch verarbeiten. Es können auch Klone zur Herstellung von Nebenampullen-, Kokon- und Hüllseide sequenziert werden.
Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften sind auch gemischte Verbundmaterialien aus Fasern von Interesse. Diese gemischten Verbundmaterialien verleihen ansonsten steifen Materialien flexibles Verhalten und zugleich Festigkeit.
Die nachstehenden Beispiele sollen die beanspruchte Erfindung veranschaulichen und dem Fachmann die Erfindung eingehender verständlich machen. Die Erfindung ist jedoch nicht nur auf diese veranschaulichenden Beispiele beschränkt.

BEISPIEL 1

Haupt- und Nebenseide von Nephila clavipes-Spinnen wurden geerntet, wie in Work, R. W., et al., J. Arachnol. 10, 1-10 (1982) beschrieben und dann bei Raumtemperatur vollständig trocknen gelassen. Für die FTIR-Experimente wurde jeweils eine Länge von 3-5 cm Seide eingesetzt. Die Spektren wurden mit einem Analect FX 6260-FTIR- Spektrometer durch ein Analect Micro-XA FTIR-Mikroskop bei 2 cm&supmin;¹ Auflösung aufgenommen. Es wurden routinemäßig Interferogramme von 128 Messungen erhalten. Die Spektren wurden nach dem Verfahren von Kauppinen, J. K., et al., Appl. Spectrosc. 35, 271-276 (1986) partiell entfaltet, wobei Gauss-Komponenten mit halber Breite bei einer halben Höhe von 12 cm&supmin;¹ und ein Auflösungsverstärkungsfaktor (K) von 2 eingesetzt wurden. Experimente zur axialen Dehnung wurden durchgeführt, indem ein Ende der Seide befestigt wurde und am anderen Ende kleine schwebende Gewichte der angegebenen Größe befestigt wurden.
Vor der Durchführung der eigentlichen Experimente wurde die Gleichmäßigkeit der Seidenfaser untersucht, indem FTIR-Spektren mehrerer zufällig ausgewählter Stellen entlang der Faser parallel und rechtwinklig zum polari sierten Licht aufgenommen wurden. Die Spektren unterschieden sich, bezogen auf die Peak-Position, um weniger als 2 cm&supmin;¹ voneinander (Ergebnisse nicht gezeigt). Also wurde gezeigt, dass die Seidenfaser spektral homogen ist.
Reagierte das Protein auf axiale Beanspruchung, wurden zur Untersuchung der Möglichkeit struktureller Änderungen in der Hauptampullenseide der Spinne Nephila clavipes FTIR-Spektren einzelner Seidenfasern durch ein Infrarotmikroskop aufgenommen. Das originale und das partiell entfaltete Infrarotspektrum von Seidenfasern, wobei die IR-Strahlung rechtwinklig zur Faserachse polarisiert war, sind in den Fig. 1C bzw. Fig. 1D als Funktion der axialen Spannung an der Faser gezeigt. Für die Peaks bei 1694, 1630 und 1620 cm&supmin;¹ wurde ein starker rechtwinkliger Dichroismus in der Amid 1-Bande gefunden, was mit dem hohen Gehalt an β-Struktur übereinstimmt, der zuvor in anderen Seidenformen mittels IR-Spektroskopie gefunden wurde, Suzuki, E., Spectrochim. Acta 23A, 2303-2308 (1987); Fraser, R. D., et al., Conformation in Fibrous Protein, Academic Press, New York und London (1973). Schwache Banden bei 1657 und 1675 cm&supmin;¹ waren ebenfalls sichtbar und ließen sich ungeordneten Bereichen bzw. anti-parallelem β- Faltblatt zuordnen, Fraser, R. D. B., et al.., Conformation in Fibrous Protein, Academic Press, New York und London (1973); Byler, D. M., Biopolymers 25, 469-487 (1986). Die bei 1520 und 1550 cm&supmin;¹ sichtbaren Amid II-Banden zeigten β-Faltblatt bzw. eine ganz geringe Menge helikalen Bereich an, Fraser, R. D. B., et al., Conformation in Fibrous Protein, Academic Press, New York und London (1973); Cantor, C. R., et al., Biophysical Chemistry, Teil II, 466-472, Freemnan, San Francisco (1980). Wurde auf die Seidenfaser Spannung ausgeübt, zeigte die Strahlung rechtwinklig zur Faserachse nur geringe Änderungen im Amid I-Bereich. Dagegen verringerte der Peak bei 1550 cm&supmin;¹ im Amid II-Bereich die Intensität bei ausgeübter Spannung und verschob sich nach 1557 cm&supmin;¹.
Es wurden eindeutig andere Ergebnisse erhalten, wenn die Strahlung parallel zur Faserachse gerichtet war (Fig. 1A und Fig. 1B). Es waren zwar alle β-Struktur-Peaks immer noch klar erkennbar und ihre Position unverändert, aber die Ausübung der Spannung erzeugte eine dramatische Steigerung der Absorption bei 1651 cm&supmin;¹. Ein Peak in diesem Bereich, der Paralleldichroismus aufweist, deutet stark auf eine α-helikale Struktur hin, Fraser, R. D. B., et al., Conformation in Fibrous Protein, Academic Press, New York und London (1973); Byler, D. M., et al., Biopolymers 25, 469-487 (1986). Einen ähnlichen Anstieg beobachtete man bei der Amid II-Bande bei 1559 cm&supmin;¹, der ebenfalls auf die Bildung einer Helix hindeutete. Außerdem bildete sich eine Bande bei 1512 cm&supmin;¹, die sich unter Spannung in zwei Komponenten bei 1508 cm&supmin;¹ und 1517 cm&supmin;¹ aufspaltete. Eine Absorption in diesem Bereich von Proteinen wird gewöhnlich nicht wasserstoffgebundenen Peptidgruppen, Cantor, C. R., et al., Biophysical Chemistry, Teil II, 466-472 (1980), Freemnan, San Francisco, oder Tyrosinresten zugeschrieben, Fraser, R. D. B., et al., Conformation in Fibrous Protein, Academic Press, New York und London (1973). Der Tyrosingehalt dieser Faser beträgt nur 3-4%, so dass die letztere Zuweisung weniger wahrscheinlich scheint. Dies legt auch nahe, dass durch die Spannung eine Konformationsänderung induziert wurde. Die vollständige Rückkehr der Originalspektren bei Nachlassen der Spannung bestätigte ebenfalls, dass die beobachteten Änderungen am elastischen Verhalten von Zugseide beteiligt waren. Im Entspannungsprozess konnten zwei Phasen unterschieden werden (Fig. 2). In der ersten Phase (0-1 Std. nach dem Nachlassen der Spannung) zeigten die Spektren, dass die Seidenstruktur rasch, aber unvollständig in ihre ursprüngliche Form zurückkehrte. In der zweiten Phase (1-12 Std. nach dem Nachlassen der Spannung) nahm die entspannte Seide nach und nach völlig wieder die anfängliche Konformation ein.

BEISPIEL 2

Das Beispiel 1 wurde mit Seide aus der Hauptampullendrüse einer anderen Spinnenart, Araneus gemmoides, wiederholt, die wie im Beispiel 1 beschrieben extrahiert wurde.
Die Spektren einer Seidenfaser, wobei die Faserachse rechtwinklig und parallel zum polarisierten Licht lag, sind in der Fig. 3 gezeigt. Wie bereits zuvor ersichtlich, gab es einen Peak bei etwa 1650 cm&supmin;¹, der auftrat, wenn Spannung ausgeübt wurde und die Seidenfaser sich parallel zur einfallenden polarisierten Strahlung befand. Außerdem wurde in den Parallelspektren der Hauptampullenseiden der Peak von einer ungeordneten Struktur bei etwa 1645 cml durch ein α-Helix-Signal ersetzt, wenn Spannung ausgeübt wurde.
Es wurde untersucht, ob die durch Dehnen erzeugte α- helikale Struktur von zufällig orientierten α-Helices herrührte, die bereits vor der ausgeübten Spannung vorlagen, und ob die ausgeübte Kraft die Helices lediglich in eine parallele Anordnung brachte. Dazu wurden Seidenfaser-FTIR- Spektren mit unpolarisiertem Licht gemessen. Mehrere Seidenstränge wurden ohne ausgeübte Spannung zufällig auf der Probenplatte ausgerichtet, und es wurden Spektren aufgezeichnet. Das Ergebnis ist in der Fig. 4 gezeigt. In diesen Spektren fand man kein Anzeichen für eine α-Helix, wie es der Fall wäre, wenn im entspannten Zustand α-Helices zugegen wären.
Ein weiterer Test dieser Hypothese wurde durch Untersuchung der Spektren von Seidenfasern von der Nebenampullendrüse durchgeführt. Die von der Nebenampullendrüse erzeugte Seide unterscheidet sich von der der Hauptdrüse hinsichtlich der Aminosäurezusammensetzung, Funktion und mechanischen Eigenschaften, Anderson, S. O., Comp. Biochem. Physiol. 35, 705-711 (1970); Work, R. W., et al., J. Arachnol. 15, 65-80 (1987); Work, R. W., Text. Res. J. 47, 650- 662 (1977); Tillinghast, E. K., et al., Ecophysiol. of Spiders, 203-210 (1987), Springer, Heidelberg). Diese Seide ist insbesondere weniger elastisch und hat einer geringere Festigkeit als die Seide der Hauptampullendrüse, Work, R. W., J. Text. Res. 47, 650-662 (1977); Lucase, F., et al., J. Text. Res. 46, T440-T452 (1955). Daher wurden die beiden unterschiedlichen Seidenfaserarten mittels FTIR hinsichtlich ihrer Konformationsmerkmale und molekularen Reaktionen auf Spannung verglichen. Die Spektren der Seiden aus der Nebenampullendrüse, wobei die Faserachse rechtwinklig und parallel zur einfallenden polarisierten Infrarotstrahlung lag, sind in der Fig. 5 gezeigt. Die Spektren der Haupt- und der Nebenampullenseide waren bei paralleler Faserachse zum polarisierten Licht sehr unterschiedlich. Es war besonders interessant, dass man bei den Spektren der weniger elastischen Seide bei Ausübung von Spannung kein Anzeichen für α-Helixbildung erkennen konnte. Dagegen erschien ein Peak bei 1665 cm&supmin;¹, der auf eine Zunahme der Windungen bei Nebenampullenseide bei sehr geringem Dehnen hindeutet.
Auch die strukturelle Grundlage der Elastizität von Spinnenseide wurde untersucht, indem partielle Primärstrukturinformation gewonnen wurde. Die Zugseidenproteine von Nephila clavipes und Araneus gemmoides wurden durch eingeschränkte Säurehydrolyse partiell gespalten, die erhaltenen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC isoliert und durch Gasphasen-Edman-Abbau sequenziert, Hewick, R. M., et al., J. Biol. Chem. 256, 7990-7997 (1981). Am häufigsten fand man Peptide mit einer GQGAG- und GAGQG-Sequenz, wobei bei Nephila clavipes ein Peptid mit der Sequenz GYGGLG fast genauso häufig war. In Analogie zum Bombyx mori-Fibroin bilden die Peptide, die abwechselnde Glycinreste enthalten, wahrscheinlich die β-Faltblattbereiche, Lucas, F., et al., Comprehensive Biochem. 26B, 475-558 (1968). Die partielle Araneus gemmoides-Sequenz zeigte die Gly-reichen Peptide, die ebenfalls am ehesten β-Faltblatt bildeten. Interessanterweise wurden auch Tri- und Tetrapeptide, hauptsächlich mit Alaninresten, in beiden Arten beobachtet, was nahelegte, dass sie höchstwahrscheinlich in unregelmäßigeren Konformationen in den amorphen Bereichen zugegen sind.
Die Kombination von FTIR und Peptidsequenzierung zeigt einen molekularen Mechanismus für die Elastizität von Spinnenseide auf. Die einfachste Interpretation der FTIR-Ergebnisse ist, dass die Spannung entlang der Faser zur Bildung von (wahrscheinlich α-) Helices führt. Die Se quenzierung der Spinnenseidenpeptide zeigt die Ähnlichkeit mit anderen Seidenarten mit alternierenden Glycinresten in β-Faltblattbereichen. Es gibt auch andere, strukturell weniger gut definierte Bereiche, die besonders bei Spinnenseide alaninreich zu sein scheinen. Kurze, alaninreiche Polypeptide bilden α-Helices, Yang, D. S. C., et al., Nature 333, 232-237 (1988). Es wurde auch gezeigt, dass das Dehnen von Polyalaninfasern zur Bildung einer regelmäßigen 0- Helixstruktur führt, Bamford, C. H., et al., Nature 173, 27-31 (1954). Vor kurzem wurde gefunden, dass kurze Alaninpeptide eine ungewöhnlich stabile α-Helixstruktur bilden können und einzelne Alaninreste wahrscheinlich ein hohes Helixbildungspotential aufweisen, Marqusees et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5286-5290 (1989). Somit sind sehr wahrscheinlich die alaninreichen Segmente in den amorphen Bereichen der Hauptampullenzugseide die Quelle der beobachteten spannungsinduzierten α-Helixbildung.
Hauptampullenspinnenseide lässt sich am einfachsten als semikristalline Bereiche verflochtener β-Faltblätter darstellen, die der Faser ihre bemerkenswerte Festigkeit verleihen. Diese Bereiche verändern sich anscheinend wenig, wenn eine Kraft entlang der Faserachse ausgeübt wird. Die β-Faltblattabschnitte einzelner Polypeptidketten sind mit kurzen alaninreichen Domänen durchsetzt, die bei entspannter Faser ungeordnet sind. Die Ausübung von Spannung führt dazu, dass diese Bereiche helikal werden, wobei die Energie zur Helixbildung zumindest teilweise aus den angewendeten mechanischen Kräften herrührt. Diese kraftinauzierte Bildung einer geordneten Struktur ist ein einzigartiger Befund und kann für andere biochemische Systeme allgemein relevant sein. Sie steht in eindeutigem Gegensatz zur α/β-Transformation, die beim Dehnen anderer Seide beobachtet wird (Lucase, F., et al., Comprehensive Biochem. 26B, 475-558 (1968). Lässt die Spannung nach, werden geordnete Bereiche entropisch in einen ungeordneteren Zustand getrieben, was die beobachtete Elastizität erzeugt.

BEISPIEL 3

1. Reinigung und Identifikation von Seidenproteinen

Die in dieser Untersuchung verwendeten Spinnen waren Nephila clavipes, erworben von Marine Specimens Ltd., Florida. Der erste Schritt war die Gewinnung reiner Seide von einer einzigen Seidendrüsenart. Unter Verwendung des von Work et al., J. Arachnol. 10, 1-10 (1982) beschriebenen Verfahrens wurde ein Gerät zum Ziehen einer einzelnen Seidenfaser aus einer Spinndrüse der Spinne konstruiert. Die einzelne Seidenfaser wurde an einer Spule befestigt. Dann wurde ein Elektrobohrer mit variabler Geschwindigkeit zur zwangsweisen Entfernung von 0,5-1 mg reiner Seide aus der Spinndrüse verwendet. Die reine Seide wurde in 5 M LiSCH, 100% TFA (Trifluoressigsäure) bei Raumtemperatur gelöst und dann mittels Umkehrphasen-HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) aufgetrennt, wobei eine C-18-Säule mit Puffer A, der 0,4 M Essigsäure/Pyridin, pH 4,0, und Puffer B, der aus Puffer A mit 40% Propanol bestand, verwendet wurden. Unter Fluoreszenz wurden zwei Peptidpeaks beobachtet.

2. Aminosäurezusammensetzung des/der Protein(s/e)

Die reine Seide wurde in 6 N HCl 35 min bei 155ºC unter Vakuum zur Verhinderung von Oxidation hydrolysiert. Nach dem Trocknen und der Entfernung der HCl wurde die Probe durch die Verfahren OPA (Ophthalaldehyd) (Jones et al., J. Lig. Chromat. 4, 565-586 (1985)) und PITC (Phenylisothiocyanat) (Heinrickson, R. L., et al., Anal. Biochem. 136, 65-74 (1984)) mittels HPLC auf einer C-18- Umkehrphasensäule untersucht.

3. Proteinspaltung und Reinigung der Fragmente

Vorläufige Ergebnisse zeigten einen "ausgefransten" Aminoterminus des gesamten Seidenproteins. Also hatten entweder die Proteine in der Seide nicht die gleiche Sequenz oder ihre N-terminalen Sequenzen begannen nicht an derselben Stelle. Es wurden Proteinspaltung und Fragmentreinigung durchgeführt, um Seidenfragmente für die parti elle Sequenzierung bereitzustellen. Die Fragmente wurden mittels Hydrolyse in 6 M HCl 3 min unter Einer Temperatur von 155ºC gespalten. Die Fragmente wurden gereinigt, indem sie mittels HPLC unter Verwendung einer C-18- Unkehrphasensäule aufgetrennt wurden.

4. Partielle Aminosäuresequenzierung des Proteins

Die reinen Fragmente wurden durch ein Applied Biosystems-Gasphasenproteinsequenziergerät (470A) auf der Basis der Aminosäureanalyse der Fragmente sequenziert, was Informationen darüber lieferte, ob die Fragmente eine geeignete Sequenz für eine DNA-Sonde darstellen, z. B. , oder .

5. Konstruktion der synthetischen DNA-Sonde

Die Synthese synthetischer DNA-Sonden wurde unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes von Applied Biosystems (430A) durchgeführt. Die Produkt-DNA konnte als Hybridisierungssonde verwendet werden. Da Glycin und Alanin die Hauptbestandteile des Proteins sind, erhöhte die Verwendung von vier an der dritten Position unterschiedlichen Codons für diese Aminosäuren die Wahrscheinlichkeit, dass das häufigste Codon dieser Fragmente getroffen wurde.
5'CCnCGnCCnGT(C oder T)CC3'
n = ACGT, vier verschiedene Basen.

6. Klonierung von cDNA aus Seidendrüsen-mRNA

Zur Gewinnung von mRNA aus den Seidendrüsen wurde die Seide der Spinnen unter Zwang entnommen, so dass die mRNA- Synthese stimuliert wurde, Canceles, G. C., et al., J. Exp. Zoo. 216, 1-6 (1981). Die Hauptampullenseidendrüsen wurden aus dem Abdomen der Spinnen präpariert (Bild der anatomischen Lage der Seidendrüsen s. im Buch von Foelix, F. R., Biology of Spider) und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht. Nach Überführen einer kleinen Menge an flüssigem Stickstoff und der Seidendrüsen in einen Mörser mit Pistill wurden die Drüsen zu einem Pulver zermahlen. Die RNA wurde durch das SDS-heißes-Phenol-Verfahren extrahiert, Taylor, D. W., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 10, 305-318 (1984). Zur Isolation der mRNA aus der Gesamt-RNA wurde eine oligo-dT-Säule verwendet, Haim Aviv et al., PNAS 69, 1408-1412 (1972).
Die reverse Transkription der mRNA in cDNA erfolgte unter Verwendung des RiboClone-cDNA-Synthesesystems von Promega (technische Beschreibung). Nach dem Herstellen wurde die radioaktiv markierte cDNA über eine Sepharose- 4B-Gelfiltrationssäule aufgetrennt, so dass große von kleinen Fragmenten getrennt wurden. Größere cDNAs als 500 bp wurden in die Vektoren ligiert und in E. coli XL1-blue transformiert, so dass eine cDNA-Bank hergestellt wurde (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982)).
Die pBluescriptSK-Plasmide, die unter dem Einfluss von Helferphagen einzelsträngige DNA produzieren sollen (Beschreibung von Stratagene), wurden als Vektoren zur Klonierung der cDNA verwendet. Die pBluescriptSK-Plasmide von Stratagene wurden im großen Maßstab präpariert (Großpräparation mit dem Triton-Lyseverfahren, Frederick M. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, 1987), wobei die Lysozym-Inkubationszeit 20 min bei 37ºC betrug, und mittels CsCl-Gradient in einer Ultrazentrifuge (L7-55, Beckman) (Frederick M. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, 1987, veröffentlicht von Greene Publishing Associates und Wiley- Interscience), wobei ein vti80-Rotor verwendet wurde, bei 24ºC, 54000 U/min über Nacht gereinigt. Die weitere Plasmidreinigung erfolgte durch einen SDS-Saccharosegradienten, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor.
Die pBluescriptSK-Plasmide wurden mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten, so dass ein glattes Ende ebtstand. Zur Verringerung der Selbstligationsrate der Plasmide wurde alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) (Boehringer, Mannheim) zur Entfernung des Phosphates am 5'-Ende des Plasmids verwendet (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor). Die Desaktivierung der CIP erfolgte bei 75ºC anstelle von 68ºC für 30 min. Zur Reinigung und Klärung der Vektoren wurde eine Elutip-d-Säule (Schleicher und Schüll, Hersteller, Beschreibung der DNA-Reinigung) verwendet.
Die Ligation der cDNA mit pBluescript erfolgte bei 4ºC über Nacht mittels T4-DNA-Ligase (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor). Dies wurde dann in kompetente E. coli XL-1 blue transformiert. Die Bakterien wurden über Nacht in 1 · YT überimpft und bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,3-0,6 gezüchtet. Die Bakterien wurden 5 min bei 5000 U/min in einem JA20-Rotor sedimentiert, dann in ¹/&sub2; ursprünglichen Volumen 50 mM CaCl&sub2; + 10 mM Tris, pH 8, resuspendiert. Die Lösung wurde 20 min auf Eis belassen. Die Zellen wurden wie oben sedimentiert und in 1/20-1/50 des ursprünglichen Volumens 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert sowie zu je 0,3 ml aliquotiert. Die DNA wurde in die entsprechenden Gefäße überführt, 60 min auf Eis belassen, 3 min bei 45ºC einem Wärmeschock ausgesetzt, auf die Platten aufgetragen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kolonien der Bakterienzellen mit dem Plasmid, das Ampicillin-Resistenzmarker besaß, überlebten in den YT-Agarplatten mit Ampicillin.

7. Synthetische Oligodesoxynukleotide zur Durchmusterung der cDNA-Bank

Die synthetischen Oligodesoxynukleotid-Sonden wurden mittels T4-Polynukleotidkinase mit P³² markiert (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor). Die weißen Kolonien von den Platten wurden in 96-Mulden-Testplatten überführt, die YT-Medium mit Ampicillin enthielten, und erneut über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Dann wurden die Bakterien mit Plasmid unter Verwendung eines Stempels mit 32 Stiften auf Hybond-N-Hydridisationstransfermembranen (Amersham) überführt und über Nacht auf Ampicillinplatten wachsen gelassen. Der Stempel mit 32 Stiften wurde selbst hergestellt und bestand aus Stiften, die so in einen Styrofoam-Block gesteckt wurden, dass sie mit den Mulden der 96-Mulden- Platte übereinstimmten. Dann wurde die Anzahl der Plasmide auf Chloramphenicolplatten erhöht. Zur Lyse der Bakterien wurde NaOH verwendet. Die DNA wurde auf den Membranen durch Backen in einem Ofen für 2 Std. bei 80ºC unter Vakuum fixiert (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor).
Die Banken wurde mit einer radioaktiv markierten Oligodesoxynukleotid-Sonde durchmustert, wobei aufgrund der hochkomplexen DNA-Struktur das Verfahren von Wood und Lawn verwendet wurde, Wood, W. I., et al., PNAS 82, 1585-1588 (1985).

8. Anwendung von Southern-Transfer und -Hybridisierung der DNA zur Erkennung positiver Kolonien aus der ersten Durchmusterung

Es wurden positive Kolonien gepickt und in YT-Medium gezüchtet. Die Plasmid-DNA mit Insertionen wurde mittels. Mini-Präparation extrahiert. (Promega-Katalog und Frederick M. Ausubel et al., Current Protocols in Molekular Biology, Band 1, 1987). Nach der Auftrennung der DNA im Agarosegel wurden die Proben auf N-Membranen übertragen (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), veröffentlicht von Cold Spring Harbor) und wiederum mit den oben genannten Sonden hybridisiert, Wood, W. I., et al., PNAS 82, 1585-1588 (1985).

9. Restriktionsenzymspaltung der DNA positiver Kolonien

Da sich bei der Sondenhybridisierung mehr als eine Kolonie als positiv erwiesen hatte, wurden Restriktionsenzyme, einschließlich BamHI, EcoRI, PstI, HaeIII, Apal, ClaI, HincII, Hindill, KpnI, SalI, Salil, XhoI, SspI und SphI angewendet (Spaltungsbedingungen für die jeweiligen Enzyme nach Angeben des Herstellers), so dass Unterschiede zwischen diesen positiven Kolonien nachgewiesen sowie Informationen für die weitere DNA-Sequenzanalyse gewonnen werden konnten.

10. Subklonierung der mittels Restriktionsenzymen gespaltenen Fragmente und Durchmustern mit der Sonde

Damit keine Zeit mit der Sequenzierung zweifelhafter Kolonien verschwendet wurde, wurden die mittels HaeIII und PstI gespaltenen Fragmente mit den vier dNTPs ACGT unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-DNA-Polymerase aufgefüllt (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982)), so dass Fragmente mit glatten Enden erhalten wurden. Diese Fragmente wurden zufallsgemäß mit dem gleichen Verfahren wie bei der Klonierung in M13- Phagen subkloniert. Die Plaques wurden erneut mit den Sonden durchmustert (s. o.). Die positiven Plaques wurden wiederum mittels Southern-Hybridisierung sondiert, Wood, W. I., et al., PNAS 82, 1585-1588 (1985).

11. Sequenzierung positiver Subklonfragmente

Positive Plaques der M13-Phagen mit Insertionen wurden über Nacht bei 37ºC mit E. coli BSJ72 gezüchtet, so dass einzelsträngige DNA für die DNA-Sequenzierung produziert wurde. Zur Reinigung der einzelsträngigen DNA wurde 1 ml Phage mit dem Überstandsgemisch und 0,25 ml RNase/PEG (10% PEG, 2,5 M NaCl, 0,015 M EDTA) 2-3 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann zur Sedimentation der Phagen 5 min in einer Mikrofuge zentrifugiert. Die Lösung wurde so weit wie möglich entfernt. Das Sediment wurde in 0,07 ml Proteinase-Lösung (0,01 M Tris, pH 8, 0,001 M ED- TA, pH 8, 0,2% Sarkosyl, 0,07 mg/ml Proteinase K) gelöst und 20 min bei 55ºC inkubiert. Es wurde 0,05 ml 0,25 M NaCl zugegeben, mit 0,15 ml wassergesättigtem Phenol, mit 0,130 ml Phenol/CHCl&sub3;/Isoamylalkohol (50/45/5%) und dann mit 0,120 ml CHCl&sub3; extrahiert, mit 0,2 ml EtOH mehr als 20 min bei -80ºC oder mehr als 1 Std, bei -20ºC gefällt und 15 min zentrifugiert. Das Sediment wurde mit 70% EtOH gewaschen, getrocknet und in 40 ml H&sub2;O resuspendiert. Nach der Reinigung der einzelsträngigen DNA wurde der Universalprimer für M13-Phagen an die Matrize hybridisiert und die DNA nach dem Verfahren von Sanger, F., et al., PNAS 74, 5463-5467 (1977) sequenziert. Als Markierung für ein Expositionsbild der Sequenzierung wurde S³&sup5;-dATP verwendet. Das Gerät von Sequencing Gel Electrophoresis System (Modell 52) (erhalten von BRL, Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc.) wurde nach den Angaben des Herstellers betrieben.
Laufbedingungen: 70 Watt, Dauer: 3-7 Stunden.
Die größere Gelplatte wurde silanisiert. Nur, wenn das Glas neu war oder mit NaOH gewaschen worden war, wurde es dann 4 Stunden bei 90ºC gebacken. Die größere Platte wurde jeweils ohne Backen vor Gebrauch silanisiert.
Die kleinere Platte wurde jeweils vor Gebrauch mit 2 ml einer 2%igen 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilanlösung (Sigma) in Ethanol behandelt. Beide Platten wurden mit Detergenz und destilliertem Wasser gründlich gereinigt. Vor der Silanisierung wurde zur abschließenden Reinigung 90% Ethanol verwendet, dann mit 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan behandelt und mit Gel gefüllt.
Es wurde jeweils ein 7% Acrylamid/Bis-8 M Harnstoff- Gel verwendet.

Für 500 ml Acrylamidstammlösung

Acrylamid 33,2 g
Bis-Acrylamid 1,75 g
Harnstoff 240 g
Die Lösung wurde mit 25 g Amberlite MB-3-Monbed-März (Sigma) pro 500 ml Lösung deionisiert.

Für 1 l 10 X-Sequenzierpuffer TBE

Tris-Base 160 g
Borsäure 38 g
Dinatrium-EDTA 9 g
Es wurde mit einem Gemisch aus 1 · TBE-Puffer und 7% Acrylamid/Bis-Harnstoff-Lösung gearbeitet.
Zur Katalyse der Polymerisation eines Gelvolumens von insgesamt 60 ml wurde 15% Ammoniumpersulfat (0,20 ml) und TEMED (0,05 ml) verwendet.

12. Sequenzierung der Kolonien, deren Sequenz mit der Sonde hybridisiert

Es wurden drei Kolonien unter Verwendung des Verfahrens von Sanger, F., et al., PNAS 74, 5463-5467 (1977) sequenziert. Es wurde S³&sup5;-dATP zur Markierung verwendet, so dass ein Expositionsbild der Sequenzierung gewonnen werden konnte. Da die Kolonien unterschiedlich groß waren, von 800 bp bis 2,4 kbp, konnten die Sequenzreaktionen nur von 300 bis 350 bp eindeutig gelesen werden. Zur Bestimmung der DNA-Gesamtsequenz wurde ein Kit zur partiellen DNA- Deletion von Promega, das "Erase-a-Base-System", verwendet, mit dem unterschiedlich große DNA-Längen für die Sequenzierung hergestellt wurden (technische Beschreibung "Erase-a-Base-System", Promega).

13. Sequenzierung der 2,4 kb großen Spinnenseidenprotein- DNA

Die partiellen Sequenzergebnisse der 2,4 kb großen DNA zeigten eine repetitive Sequenz sowie eine komplexe Struktur mit hohem GC-Gehalt, wodurch die Fragmente deletieren und religieren konnten. Zur Gewinnung der korrekten Sequenzinformation wurden die 2,4 kb mit dem Restriktionsenzym HaeIII in kleine Fragmente von 150 bis 900 bp geschnitten. Diese HaeIII-Fragmente wurden mit 1%iger Agaro se mit niedrigem Schmelzpunkt (Bethesda Research Laboratories) getrennt, dann mit heißem Phenol, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982), und Elutip-d gereinigt. Die reinen Fragmente unterschiedlicher Größe wurden für die Sequenzierung in pBluescriptKS(+/-)- Plasmide und M13mp18- bzw. -mpl9-Phagen (von Stratagene) subkloniert (gleiches Verfahren wie Klonierung).

14. Northern-Blot und -Hybridisierung zur Bestimmung der Größe der Seidenprotein-mRNA

Es wurde mRNA gereinigt, indem Gesamt-RNA mit einer oligo-dT-Affinitätssäule (s. o.) und in einem denaturierenden Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt wurde, Frederick M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, 4.9.5-4.9.8 (1987). Die mRNA wurde auf Zeta-probe- Membranen übertragen, Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982). Die HaeIII-gespaltenen Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese (s. o.) aufgetrennt. Es wurde ein Nick-Translations-Kit (Nick Translation reagent Kit, Bethesda Research Laboratories) zur Herstellung radioaktiv markierter Sonden verwendet, wobei das 900 bp-Fragment als Matrize eingesetzt wurde. Die Membran mit der mRNA wurde bei 75ºC mit den Sonden hybridisiert, wobei die Größe der Seidenprotein-mRNA bestimmt wurde, Bio-Rad, Beschreibung 4.3, Zeta-probe- Blotmembranen.
Die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der Seidenproteine sind in der Fig. 6 gezeigt.

BEISPIEL 4

Es wurde ein Klon der Spinnenseiden-DNA (2,0 kb) (s. Fig. 6) in pBluescriptSK(+/-)-Plamiden ausgewählt. In die Smal-Stelle wurde eine Insertion eingebracht. Der p- BluescriptSK+-Vektor wurde wie unter 6. im Beispiel 3 durch SmaI-Restriktionsenzyme gespalten.
Die Insertion wurde an der BamHI- und der EcoRI- Stelle aus p-BluescriptSK+ gespalten ("NEB", New England Biolabs). Die EcoRI-Stelle wurde mit einem Klenow-Fragment (Promega, Inc., lieferte das Fragment und das Protokoll) aufgefüllt, so dass an der EcoRI-Stelle ein glattes Ende bereitgestellt wurde. Der BamHI-Überhang wurde belassen, damit die Insertionen im neuen Vektor pGEM3Z die richtige Richtung erhielten. Dieser pGEM3Z-Vektor wurde hergestellt, indem er mit BamHI (BamHI-Spaltung erfolgte 30 min bei 37ºC im BRL-Reaktionspuffer (Bethesda Research Labs.)) gespalten wurde, was einen Überhang erzeugte, und mit HincII (NEB), was zu einem glatten Ende führte. Die beiden Plasmide wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Die Ligation mit T4-DNA-Ligase erfolgte über Nacht bei 4ºC, wobei 10 x-Ligationspuffer verwendet wurde (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual (1982).
Die ligierte DNA wurde durch Zugabe zu vorher kompetent gemachten Zellen transformiert. Zellen und DNA wurden 2 Std. bei 0ºC inkubiert und dann mit 0,85% Kochsalzlösung-Weichagar (3 ml Weichagar) versetzt und auf LB-Agar- Platten gegossen, die mit 40 ug/ml X-Gal, 50 ug/ml Ampicillin und 40 ug/ml IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) angereichert waren. X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolylβ-D-galacatopyranosid), Ampicillin und IPTG sind Wachstumszusätze, die für das ausreichende Wachstum der Transformanten nötig sind (Stratgene, BRL). Die drei verwendeten Wirtszelllinien waren JM109 (Stratagene), DH5αF (Bethesda Research Laboratories) und SURE (Stratagene).
Die Expression des Spinnenseidenproteins wurde durch Zugabe von IPTG (Bethesda Research Laboratories (BRL)) in die Wachstumsmedien induziert, wobei bei 37ºC gezüchtet wurde. Das extrahierte Protein (50 ul) wurde mittels PAGE- SDS-Phastgel (Pharmacia) untersucht. Da nur kleine Proteinmengen hergestellt wurden, wurde im Plasmid eine Verschiebung des Leserasters induziert.
Die Verschiebung des Leserasters erfolgte durch Spaltung des Plasmids mit 1 Einheit SphI (die SphI-Spaltung erfolgte 30 min bei 37ºC unter Verwendung des Promega- SphI-10 X-Puffers (Promega, Inc.)) und anschließendes Abspalten des 3'-Überhangs von 4 Basen mit 1 Einheit T4-DNA- Polymerase (Promega). Der 3'-Überhang wurde durch Zugabe von 1 Einheit T4-DNA-Polymerase 10 min bei Raumtemperatur entfernt. Die entfernten Basen waren CGTA. Die Selbstligation erfolgte in einem Volumen von 4ºC über Nacht bei 4ºC. Dieses Plasmid wurde dann mit 1 Einheit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit sich selbst ligiert, so dass das Plasmid pLM-4 erhalten wurde, das wie oben für die früheren Plasmide beschrieben in E. coli-SURE-Wirtszellen (Stratagene) transformiert wurde (Stratagene, BRL). Diese E. coli-Zellen wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Md., U.S.A., am 27. März 1991 kraft der Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielten die Depot-Nr. 68567.
Die Expression von 20-30 mg/l Spinnenseidenprotein wurde durch Zugabe von 40 ug/ml Isopropylthiogalactosid (IPTG) (BRL) zu den Wachstumsmedien induziert. Das Protein wurde mittels PAGE-SDS (Pharmacia) nachgewiesen. Es hatte die in der Fig. 6 gezeigte Sequenz.
Die Isolation des Proteins erfolgte durch Zentrifugation der Bakterien 15 min bei 600 · g und Aufbrechen der Bakterien in 1 M Essigsäure sowie eine anschließende Zentrifugation für 20 min bei 3000 · g. Das Sediment ließ sich in 5% SDS (1 : 10 Vol./Vol.) lösen. Die Zentrifugation wurde wiederholt. Das Sediment wurde dann mit RNase und DNase (0,01 mg/g) behandelt, und die Zentrifugation wurde wiederholt. Das Sediment wurde in 5 M Li-Perchlorat gelöst und gegen Wasser ((1 : 100 Vol./Vol.) dialysiert, wobei das Wasser 4mal gewechselt wurde. Die dialysierte Suspension wurde 30 min bei 15000 · g zentrifugiert. Das Lösen in Li- Perchlorat, die Dialyse und Zentrifugation wurden 3mal wiederholt.

BEISPIEL 5

Es wurden 10-20 mg der Proteinseide aus einem der Beispiele 1, 2 oder 4 (vorausschauend) gewonnen. Die Seide wurde bis zur Sättigung in 5 M LiSCH oder Li-Perchlorat gelöst. Die Lösung mit der gelösten Seide wurde durch eine lange Kanüle mit kleinem Durchmesser (Größe 24 oder kleiner) und dann in eine 1 M Essigsäurelösung gedrückt. Die Faser bildet sich beim Austritt aus der Kanüle.

BEISPIEL 6

Das Spinnenseidenprotein 2 wurde wie folgt kloniert. Von einer bestehenden cDNA-Bank der Hauptampullendrüse von Nephila clavipes wurden Replica-Nitrocellulosefilter hergestellt. Die Kolonien wurden auf den Filtern fixiert (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) und mit einer kinasebehandelten (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning, A Lab. Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) degenerierten Sonde aus 14 Nukleotiden mit der Bezeichnung Ming 1 hybridisiert, deren Sequenz auf der Basis des Pentapeptids G-Y-G-P-G lautet:
CCNGGNCCATANCC.
Die Hybridisierung erfolgte nach den Verfahren von Wood et al. (PNAS USA 82, 1585 (1985)), wobei Tetramethylammoniumchlorid verwendet wurde. Die Filter wurden einer Autoradiografie unterworfen, und die zwölf dunkelsten Klone wurden zur Herstellung alkalischer Schnellpräparationen verwendet, die mit EcoRI und BamHI gespalten wurden. Das Gel wurde nach Ethidiumbromidfärbung fotografiert und unter Vakuum auf Zetaprobe (Biorad) übertragen. Kinasiertes Ming 1 wurde als Sonde für die Hybridisierung an den Southern-Blot verwendet. Der Klon mit der anscheinend größten Insertion, Klon Nr. 6 mit etwa 2 kb, wurde für alle anschließenden Studien verwendet. Es wurde auf die gleiche Weise wie bei Beispiel 4 ein Expressionsvektor konstruiert, wobei das Plasmid pMB-2 erhalten wurde.
Der ursprüngliche Klon für Spinnenseidenprotein 2 (pER) wurde mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und SacI gespalten und 30 s bei 35ºC einer Exonuklease III- Spaltung unterworfen. Diese DNA wurde zur Herstellung einer DNA mit glatten Enden mit S1-Nuklease und Klenow behandelt sowie mit sich selbst ligiert (T4--DNA-Ligase), so dass ein pBluescriptSK+-Plasmid mit einer Insertion von Spinnenseidenprotein 2 erzeugt wurde, das 173 bp kürzer als der ursprüngliche Klon (p6B) war. Dieses Plasmid, pMB2, hatte eine DNA-Sequenz, die bei der SacI-Stelle von pBluescript begann und bis zu Nukleotid Nr. 172 (CCC) der Sequenz ID. NR. 3 reichte.
Die E. coli-SURE-Zellen mit dem Plasmid (pMB-2) wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, am 27. März 1991 unter der Depot-Nr. 68568 hinterlegt. Die Expression eines Fusionsproteins (lac-Gen + Spinnenseidenprotein) wurde durch Zugabe von IPTG wie im Beispiel 4 induziert. Das Protein ließ sich wie im Beispiel 4 isolieren und wie im Beispiel 5 zu einer Faser formen.

BEISPIEL 7 (VORAUSSCHAUENDES BEISPIEL)

Damit leicht eine hohen Expressionsrate der Spinnen- Hauptampullenseide erzielt werden konnte, wurden drei Expressionsvektoren verwendet. Sie sind sämtlich mit genauer Arbeitsanleitung von New England BioLabs erhältlich. Die Vektoren besaßen das beta-Lactamase-Gen für die Durchmusterung mit Ampiciilin und eine Polylinkerstelle für die Klonierung, die stromaufwärts einen Teil des Maltosebindenden Proteins (malE) sowie stromabwärts einen Alpha- Untereinheiten-Donor der beta-Galactosidase aufwies. Die Expression erfolgte mit dem tac-Promotor, der von IPTG reguliert wird. In alle Vektoren wurde auch das Repressorgen des Lactose-Operons eingebracht. So konnte eine hohe Ko pienzahl der Plasmid-DNA die Repressoren im Cytosol der E. coli-Zellen nicht verdünnen, da ein zur Anzahl der Plasmid-DNA in der Zelle proportionaler konkurrierender tac- Promotor-Bereich bereitgestellt wurde. Das Plasmid pLM4, das Spinnenseidenprotein 1 codiert, wurde mit EcoRI gespalten und dann auf einem Agarosegel gereinigt. Der Vektor pMAL-cRI (NEB) wurde mit EcoRI gespalten, dann mit CIP (alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm, Boehringer- Mannheim) behandelt und auf einem Agarosegel gereinigt. Zwei getrennte Fragmente wurden mit T4-Ligase (Promega) in Anwesenheit von 5% PEG8000 (Polyethylenglycol 8000, Sigma) 1 Stunde bei 37ºC ligiert. Die Ligation wurde nach der Arbeitsanleitung in kompetente SURE-Zelle n (Stratagene) transformiert, dann auf LB-Platten mit Ampicillin, X-Gal und IPTG gegossen. Richtig orientierte Klone wurden entweder mittels Restriktionsenzymspaltung oder DNA- Sequenzierung durchmustert. Das Plasmid pMH2, das Seidenprotein 2 codiert, wurde mit BamHI und XbaI gespalten, so dass die cDNA ausgeschnitten wurde. Dann wurden die 5'- Überhänge mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase I (USB) aufgefüllt. Die Reinigung erfolgte wie oben auf einem Agarosegel. Der Expressionsvektor, pMAL-c oder pMAL-p, wurde mit Stul gespalten, so dass glatte Enden entstanden, anschließend mit CIP behandelt und ebenfalls auf einem Agarosegel gereinigt. Zwei gereinigte Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und in kompetente SURE-Zellen transformiert. Zur Bestimmung der Orientierung der Insertion wurde Enzymspaltung oder DNA-Sequenzierung eingesetzt. E. coli- Zellen, die den pMAL-cRI- oder p-MAL-c-Vektor enthielten, produzierten Spinnenseide im Cytosol. Dagegen schieden E. coli-Zellen, die den pMAL-p-Vektor enthielten, Spinnenseide in das Periplasma aus. Das erste Produkt wurde wie im Beispiel 4 gereinigt. Das letztere Produkt wurde gewonnen, indem die Zellen einfach 30 min mit Lysozym in einer Konzentration von 0,1 mg/ml auf Eis behandelt und dann zur Gewinnung des Überstands zentrifugiert wurden. Das gewonnene Protein war an einen Teil des Maltose-bindenden Proteins fusioniert. Das Fusionsprotein ließ sich unter Ver wendung des Teil des Maltose-bindenden Proteins und einer von NEB mit den Vektoren bereitgestellten Affinitätssäule reinigen. Das überschüssige Maltose-bindende Protein wurde durch Spaltung des Fusionsproteins mit dem Faktor Xa entfernt, der zwischen dem Maltose-bindenden Protein und der Spinnenseide erkennt und spaltet. Faktor Xa wurde ebenfalls von NEB bereitgestellt.

BEISPIEL 8 Expression der Spinnenseide in eukaryotischen Zellen

(VORAUSSCHAUENDES BEISPIEL)

Das Baculovirus-System verwendet viele der Proteinmodifikationen, die Prozessierung und die Transportsysteme, die in Zellen höherer Eukaryoten zugegen sind. Es wurde erwartet, dass der größte Teil des rekombinanten Produktes funktionell und immunologisch den authentischen Proteinen glich. Das gesamte Baculovirus-System wurde von der Invitrogen Corporation erworben. Der pAc360-Fusionvektor wurde mit BamHI gespalten. Dann wurden die 5'-Überhänge mit dem Klenow-Fragment der E. coli-Polymerase I aufgefüllt. Das Plasmid pLM4, das Spinnenseidenprotein 1 codiert, wurde mit EcoRV und SmaI gespalten, so dass die cDNA ausgeschnitten wurde. Nach der Reinigung der Fragmente auf einem Agarosegel wurden beide Fragmente mit T4-Ligase in Anwesenheit von 5% PEG8000 1 Stunde bei 37ºC ligiert. Die Ligation wurde in kompetente SURE-Zellen transformiert und nach dem Standard-Verfahren gewonnen. Nach der Reinigung der richtigen rekombinanten DNA wurde eine Transfektion in eine Zelllinie von Spodoptera frugiperda Sf6 nach der Arbeitsanleitung durchgeführt. Es erfolgte eine homologe Rekombination in vivo und führte zum Einbau der Hybrid-DNA und zur Expression der Spinnenseiden-cDNA. Da das rekombinante Baculovirus einen aktiven Polyhedrin-Gen-Promotor enthielt, der mit der fremden Spinnenseiden-cDNA verbunden war, kam es nicht zu Viruseinschlüssen. Rekombinante Plaques wurden mittels visueller Durchmusterung identifiziert, wobei das Fehlen von Einschlüssen in den gebildeten Plaques unter einem Präpariermikroskop beobachtet wurde.
Einzelheiten des Protokolls finden sich in der Arbeitsanleitung. Mögliche rekombinante Plaques wurden gewonnen, durch Hybridisierung mit einer ³²P-markierten Sonde bestätigt und zur Herstellung von rekombinantem Protein verwendet.
Alle in dieser Anmeldung genannten Veröffentlichungen, einschließlich der U.S.-Patente, sind hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Die beschriebene Erfindung kann offensichtlich auf vielfältige Weise variiert werden. Diese Variationen werden nicht als Abweichungen vom Geist und Umfang der Erfindung angesehen, und sämtliche Modifikationen sollen, wie dem Fachmann ersichtlich ist, im Umfang der folgenden Patentansprüche umfasst sein.

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Lewis, Randolph V. Xu, Ming
(ii) Titel der Erfindung: Isolierte cDNA, die Spinnenseidenprotein codiert, ein replizierbarer Vektor und eine transformierte Zelle, die die isolierte cDNA enthalten sowie Produkte daraus
(iii) Anzahl der Sequenzen: 4

(2) Information zu SEQ ID NR: 1:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 2338 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stranganzahl: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(iv) Ursprüngliche Quelle:
(A) Organismus: Nephila clavipes
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 1..2154
(D) Weitere Information:/Produkt = "Nephila clavipes-Zugseidenprotein"
(x) Veröffentlichungsinformation:
(A) Autoren: Xu, Ming Lewis, Randolph V.
(B) Titel: Structure of a protein superfiber: Spider dragline silk
(C) Journal: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(D) Band: 87
(E) Seiten: 7120-7124
(G) Datum: Sept. 1990
(K) Relevante Reste in SEQ ID NR: 1: Von 1 bis 2338 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR: 1:

(2) Intormation zu SEQ ID NR: 2:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 718 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Stranganzahl: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR: 2:

(2) Information zu SEQ ID NR: 3:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1995 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Stranganzahl: einzel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(iii) Hypothetisch: Nein
(vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: p6B
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lokalisierung: 1..1785 (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR: 3:

(2) Information zu SEQ ID NR: 4:

(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 596 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NR: 4:

Claims

1. DNA-Molekül, das ein Spinnenseidenprotein codiert, welches repetitive Einheiten umfasst, umfassend eine durch die folgende Formel wiedergegebene Sequenz

[(A)m(X)n]p

wobei m 4 bis 10 ist, n 10 bis 20 ist, p eine ganze Zahl aus 1 bis 100 ist und die Reste X gleich oder ungleich sind und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus G, A, Q, Y und L, wobei mindestens 50% der X gleich G sind.

2. DNA nach Anspruch 1, die zudem variable Bereiche umfasst.

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, die ein Protein der Formel [(α) (β)] P codiert, wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein Bereich ist, der in gefalteter Konformation β-Faltblätter bilden kann, und p eine ganze Zahl von 25 bis 100 ist.

4. DNA nach Anspruch 1 oder 2, die ein Seidenprotein mit einem Molekulargewicht von weniger als 300000 Dalton oder ein Fragment oder eine Variante davon codiert, die repetitive α- und β-Bereiche umfassen, wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, und β ein Bereich ist, der β- Faltblätter bildet.

5. DNA nach Anspruch 1 oder 2, die ein Seidenprotein codiert, das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein funktionelles Fragment davon umfasst.

6. DNA nach Anspruch 1 oder 2, die ein Seidenprotein codiert, das die in Fig. 7 gezeigte Aminosäuresequenz oder ein funktionelles Fragment davon umfasst.

7. DNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei p 15 bis 50 ist.

8. DNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei p 25 bis 100 ist.

9. DNA nach Anspruch 3, wobei der α-Bereich ein alaninreicher Bereich ist, der 4 bis 10 A enthält.

10. DNA nach Anspruch 3, wobei der α-Bereich mindestens zu 50% Alanin enthält.

11. DNA nach Anspruch 1, die ein Protein codiert, das ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfasst, umfassend repetitive Einheiten des Hexamers GGXGZG, wobei X und Z eine beliebige Aminosäure, aber am häufigsten Glutamin oder Alanin, sind, und repetitive Einheiten mit der Aminosäuresequenz (A)mGGAGQGGYGGLGGQG, wobei m 6 oder 7 ist.

12. DNA nach Anspruch 11, die ein Protein codiert, umfassend repetitive Einheiten mit der Aminosäuresequenz Ala-Gly- Arg-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Zaa-Gly-Ala-Gly-(Ala)m-Gly-Gly-Ala- Gly-Gln-Gly-Gly-Baa-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Gln-Gly, wobei m 6 oder 7 ist und Xaa, Zaa und Baa Leucin, Tyrosin oder Glutamin sind und Xaa nicht die gleiche Aminosäure wie Zaa ist.

13. DNA-Molekül nach Anspruch 12, wobei Xaa Glutamin ist.

14. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das ein Protein codiert, das im Wesentlichen aus repetitiven Einheiten besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

QGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGNQG,

AGRGGQGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGEGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

ARGGLGGQGAGAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGNQG,

AGRGGQGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAVGAVGAGQEGIRGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

SGRGGLGGQGAGAAAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAGGVRQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

VGRGGLGGQGAGAAAAGGAGQGGYGGVGSG,

ASAASAAASRLSS und Gemischen davon

15. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die repetitiven Einheiten durch eine variable Anzahl Alanin- oder Serinreste getrennt sind.

16. DNA, die ein Spinnenseidenprotein codiert, das repetitive Einheiten umfasst, umfassend eine durch die folgende Formel wiedergegebene Sequenz

[(A)m(X)n]p

wobei m 4 bis 10 ist, n 10 bis 20 ist, p eine ganze Zahl aus 1 bis 100 ist und die Reste X, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus P, G, A, Q, Y und L, wobei mindestens 50% der Reste X aus G bestehen.

17. DNA nach Anspruch 16, wobei p 15 bis 50 ist.

18. DNA nach Anspruch 16, wobei p 25 bis 100 ist.

19. DNA nach Anspruch 16, die Protein codiert, das im Wesentlichen aus repetitiven Einheiten besteht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS GPGGYGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGRYGPGQQGPSGPGSAAAAAAGSGQQGPGGY,

GPRQQGPGGYGQGQQGPSGPGSAAAASAAASAESGQQGPGGYGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAASGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAASGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGLSGPGSAAAAAAA,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS GPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGAGSAAAAAAAGPGQQGLGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPGGYGPGSASAAAAAA,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSASAAAAAAAAGPGGY,

GPGQQGPGGYAPGQQGPSGPGSASAAAAAAAAGPGGY,

GPGQQGPGGYAPGQQGPSGPGSAAAAAAASAGPGGY

und Gemischen davon.

20. DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 21, wobei das Seidenprotein ein Molekulargewicht von 100000 bis 300000 Dalton hat.

21. Plasmid PLM-4, das im ATCC-Depot Nr. 68567 enthalten ist.

22. Plasmid pMB-2, das im ATCC-Depot Nr. 68568 enthalten ist.

23. Replizierbarer Vektor, der eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 22 enthält und ein Spinnenseidenprotein oder ein Fragment oder eine Variante davon exprimieren kann, wenn er in einen geeigneten Wirt eingebracht wird.

24. Lebende Zelle oder Mikroorganismus, die/der den Vektor nach einem der Ansprüche 20 bis 23 enthält.

25. Lebende Zelle oder Mikroorganismus nach Anspruch 24, die/der ein Bakterium, vorzugsweise Escherichia coli, ist.

26. Transformierte Zelle oder transformierter Mikroorganismus, die/der die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 23 enthält, die ein Spinnenseidenprotein oder ein funktionelles Fragment davon codiert, wobei die Zelle oder der Mikroorganismus das Spinnenseidenprotein exprimieren kann.

27. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Spinnenseidenproteine oder funktioneller Fragmente davon, umfassend die Verwendung einer DNA oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und/oder eine lebende Zelle oder einen lebenden Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 24 bis 26.

28. Verfahren zur Herstellung einer Faser aus Spinnenseidenproteinen oder funktionellen Fragmenten davon, umfassend ein Verfahren nach Anspruch 27 und/oder die Verwendung von Proteinen, hergestellt durch ein Verfahren nach Anspruch 27.

29. Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Spinnenseidenprotein, umfassend das Züchten der transformierten Zelle oder des transformierten Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 24 bis 26.

30. Funktionelles Fragment eines Spinnenseidenproteins, umfassend repetitive α- und β-Bereiche, wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, und β ein Bereich ist, der β- Faltblätter bildet, das im Wesentlichen frei von natürlichen Spinnenseidenproteinen ist, wobei das Fragment oder die Variante durch ein Verfahren nach Anspruch 27 erhältlich ist.

31. Gereinigtes Spinnenseidenprotein, das im Wesentlichen ein einzelnes Protein ist und repetitive Einheiten umfasst, die eine durch die folgende Formel wiedergegebene Sequenz enthalten

L(A)m(X)n]p

wobei m 4 bis 10 ist, n 10 bis 20 ist, p eine ganze Zahl aus 1 bis 100 ist und die Reste X, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus G, A, Q, Y und L, wobei mindestens 50% der Reste X aus G bestehen.

32. Protein nach Anspruch 31, wobei für die repetitiven Einheiten "p" in der Formel [(A)m(X)n]p m und n jeweils gleich sind und vorzugsweise 10 sind.

33. Spinnenseidenprotein mit repetitiven Einheiten nach Anspruch 1, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt

[(α)(β)]p

wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein β-kristalliner Bereich ist und p eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist, das im Wesentlichen frei von einem Spinnenseidenprotein ist, das die in Fig. 7 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.

34. Spinnenseidenprotein mit repetitiven Einheiten nach Anspruch 16, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt

[(β)(α)]p

wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein Bereich ist, der eine β-Faltblatt-ähnliche Struktur bildet, und p eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist, das im Wesentlichen frei von einem Spinnenseidenprotein ist, das die in Fig. 6 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.

35. Verfahren zur Herstellung eines Seidenproteingemischs, umfassend das Mischen des Seidenproteins nach Anspruch 33 mit dem Seidenprotein nach Anspruch 34.

36. Spinnenseidenprotein mit repetitiven Einheiten nach Anspruch 1, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt

[(α)(β)p]

wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein β-kristalliner Bereich ist und p eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist, wobei für jede repetitive Einheit "p" in der obigen Formel die Bereiche α und β gleich sind.

37. Spinnenseidenprotein mit repetitiven Einheiten nach Anspruch 16, die eine Sequenz enthalten, die sich durch die folgende allgemeine Formel wiedergeben lässt

[(β)(α)p]

wobei α ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, β ein Bereich aus verbundenen β-Windungen ist und eine β-Faltblatt-ähnliche Struktur bildet und p eine ganze Zahl von 1 bis 100 ist, wobei für jede repetitive Einheit "p" in der obigen Formel die Bereiche α und β gleich sind.

38. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 37, das repetitive α- und β-Einheiten besitzt, wobei eine α-Einheit ein amorpher Bereich ist, der im gestreckten Zustand eine α-Helix bilden kann, und eine β-Einheit ein Bereich ist, der β-Faltblätter bilden kann, und das Protein ein Molekulargewicht von 16000 bis 300000 Dalton hat.

39. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 33, umfassend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die repetitive Einheiten des Hexamers GGXGZG umfasst, wobei X und Z eine beliebige Aminosäure, aber am häufigsten Glutamin oder Alanin sind.

40. Seidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei X und Z Glutamin oder Alanin sind.

41. Seidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei die repetitiven Einheiten durch eine variable Anzahl Alanin- oder Serinreste getrennt sind.

42. Seidenprotein nach Anspruch 39, das zudem repetitive Einheiten mit der Sequenz (A)mGGAGQGGYGLGGQG umfasst, wobei m 6 oder 7 ist.

43. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 33, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz (A)mGGAGQGGYGGLGGQG, wobei m 6 oder 7 ist, oder Tandemrepeats dieser Aminosäuresequenz.

44. Spinnenseidenprotein nach Anspruch 33, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Arg-Gly-Gly- Xaa-Gly-Gly-Zaa-Gly-Ala-Gly-(Ala)m-Gly-Gly-Ala-Gly-Glu-Gly- Gly-Baa-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Glu-Gly, wobei m 6 oder 7 ist und Xaa, Zaa und Baa Leucin, Tyrosin oder Glutamin sind und Xaa nicht die gleiche Aminosäure wie Zaa ist.

45. Spinnenseidenprotein nach Anspruch 33, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz GAAAAAA (A), das über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GGAGQGGYGGLGGQG, wobei Y Tyrosin ist, gebunden ist.

46. Seidenprotein nach einem der Ansprüche 30, 34 und 37, umfassend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die repetitive Einheiten mit der Aminosäuresequenz GPGQQGPGYYGGQQGPSGPGS umfasst.

47. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30, 34, 37 und 46, umfassend ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS, das über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GAGAAAAAA(A) gebunden ist, oder Tandemrepeats der Aminosäuresequenz der verbundenen Polypeptide.

48. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30, 34, 37 und 46, umfassend ein erstes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS, das über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines zweiten Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GAGAAAAAA(A) gebunden ist, das wiederum über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines dritten Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GPGGY gebunden ist, oder Tandemrepeats der Aminosäuresequenz der verbundenen Polypeptide.

49. Spinnenseidenprotein nach einem der Ansprüche 30, 34, 37 und 46, umfassend ein erstes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS, das über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines zweiten Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GAGAAAAAA(A) gebunden ist, das wiederum über eine Peptidbindung an den Aminoterminus eines dritten Polypeptids mit der Aminosäuresequenz GPGQQ gebunden ist, oder Tandemrepeazs der Aminosäuresequenz der verbundenen Polypeptide.

50. Seidenprotein nach einem der Ansprüche 30 bis 33, umfassend repetitive Einheiten eines Polypeptids, das beschrieben wird durch die allgemeine Formel

[(v)(α)(β)]

wobei

v ein Polypeptid der Konsensussequenz (A oder G oder S) GRGGL(A oder G)GQ ist;

α ein Polypeptid der Konsensussequenz GAGA (A oder S oder V)(A)m ist, wobei m 4 bis 6 ist;

β ein Polypeptid der Konsensusseguenz GGAGQ (G oder R oder E) GY(G oder R)GL(G oder V)(G oder S oder N)QG ist.

51. Protein nach Anspruch 50, umfassend repetitive Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

QGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGNQG,

AGRGGQGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGASAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGEGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGLGGQGAGAVAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQRGYGGLGNQG,

AGRGGLGGQGAGAAAAAAAGGAGQGGYGGLGNQG,

AGRGGQGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAVGAGQEGIRGQG,

AGQGGYGGLGSQG,

SGRGGLGGQGAGAAAAAAGGAGQGGLGGQG,

AGQGAGAAAAAAGGVRQGGYGGLGSQG,

AGRGGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGGQG,

VGRGGLGGQGAGAAAAGGAGQGGYGGVGSG,

ASAASAAASRLSS

und Gemischen davon.

52. Gereinigtes Seidenprotein nach Anspruch 30 und 34, umfassend repetitive Einheiten eines Polypeptids, das beschrieben wird durch die allgemeine Formel

[(β)(α)(v)]

wobei

β ein Polypeptid der Konsensussequenz GP (G oder R) QQGPG (G oder R) Y (G oder A) PGQQG (P oder L) SG (P oder A) GS ist;

α ein Polypeptid der Konsensussequenz A(A oder S)AA(A oder S)AA(A oder S)(A) ist, und

v ein Polypeptid der Konsensussequenz GPGQQG (P oder L) GGY ist.

53. Protein nach Anspruch 52, umfassend repetitive Einheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAAAAGPGGYGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGRYGPGQQGPSGPGSAAAAAAGSGQQGPGGY,

GPRQQGPGGYGQGQQGPSGPGSAAAASAAASAESGQQGPGGYGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAAASGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAAAAAAASGPGQQGPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGLSGPGSAAAAAAA,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGS GPGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGAGSAAAAAAAGPGQQGLGGY,

GPGQQGPGGYGPGQQGPGGYGPGSASAAAAAA,

GPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSASPGSAAAPSAGPGGY,

GPGQQGPGGYAPGQQGPSGPGSASAAAAAAAAGPGGY,

GPGQQGPGGYAPGQQGPSGPGSAAAAAAASAGPGGY

und Gemischen davon.