DE68928532T2

DE68928532T2 - Funktionelles, durch ein rekombinantes verfahren hergestelltes synthetisches proteinpolymer

Info

Publication number: DE68928532T2
Application number: DE68928532T
Authority: DE
Inventors: Joseph Cappello; Franco Ferrari
Original assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Current assignee: Protein Polymer Technologies Inc
Priority date: 1988-11-09
Filing date: 1989-11-07
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2009-11-08
Also published as: ATE161879T1; EP0406357B1; DK163690A; NO903025D0; EP0406357A1; KR0176966B1; AU630643B2; DK163690D0; JP3338441B2; WO1990005177A1; NO178625C; EP0406357A4; NO903025L; DE68928532D1; AU4642589A; FI101706B1; FI101706B; JPH03502935A; KR900702026A; NO178625B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von hochmolekularen Polymeren aus Aminosäuren auf der Grundlage biologisch und chemisch aktiver Strukturpolymere.
Rekombinante DNA-Technologie ist bei der Isolierung natürlicher Gene und der Expression dieser Gene in einer Vielzahl von Wirtzellen zur Anwendung gekommen. Typischerweise wurde diese Technologie zur Herstellung biologisch aktiver Polypeptide, wie z.B. von Interferonen oder Peptidhormonen, eingesetzt, die auf anderem Wege nur mit Schwierigkeiten in brauchbaren Mengen herzustellen waren. Es war weiters möglich, modifizierte Proteine herzustellen, indem natürliche Gene isoliert und die Verfahren stellenspezifischer in vitro-Mutagenese angewendet wurden, um diese Gene und dadurch die produzierten Polypeptide zu verändern. Andere Polypeptide wurden durch Kombinieren von Abschnitten verschiedener nativer Gene gebildet, um neue Polypeptide zu erzeugen, die chimärische Moleküle der verschiedenen natürlich vorkommenden Moleküle sind.
Mit dem Aufkommen wirkungsvoller und automatisierter Verfahren zur chemischen Synthese von DNA wurde es möglich, ganze Gene zu synthetisieren und solche synthetische Gene im Verlauf der Synthese nach Belieben zu modifizieren. Diese Verfahren wurden jedoch zur Produktion natürlicher oder modifizierter Versionen natürlicher Polypeptide herangezogen. Es wurden sehr wenige Versuche unternommen, diese Technologien zur Bildung von im wesentlichen neuen Polypeptiden einzusetzen. In der Natur besitzen Polypeptide eine Vielzahl chemischer, physikalischer und physiologischer Eigenschaften. Dennoch gibt es kommerzielle Anwendungen, für die bekannte, natürlich vorkommende Polypeptide nicht geeignet sind.
Die Biotechnologie ist zwar sehr vielseitig, doch sie war üblicherweise auf Anwendungen im Bereich natürlich vorkommender Produkte oder Modifikationen natürlich vorkommender Moleküle beschränkt. Ein großer Vorteil organisch-chemischer Synthese war hingegen die Fähigkeit, billige Kohlenstoffmaterialien in eine Vielzahl polymerer Moleküle, einschließlich von natürlich vorkommenden Molekülen, aber vor allem in ganz neue chemische Strukturen, wie z.B. Polypropylen und Polyacrylate, umzuwandeln, die definierte und vorhergesagte chemische Eigenschaften aufweisen, welche natürlich vorkommende Moleküle nicht besitzen.
Es zeigte sich, daß solche Materialien, insbesondere hochmolekulare Polymere, die wiederkehrende Sequenzen von Aminosäuren enthalten, auf biochemische Weise schwierig herzustellen sind. Diese Gene, die zur Erzeugung großer, wiederkehrende Aminosäureeinheiten enthaltender Peptide notwendig sind, waren instabil und oft intermolekularer Rekombination unterworfen, die zu Deletionen wiederkehrender Einheiten im Gen führte. Die Entwicklung einer Biotechnologie, die polymere Moleküle durch biologische Prozesse erzeugen könnte, die jenen der organischen Synthese ähneln, würde den Anwendungsbereich der Biotechnologie stark ausdehnen.

Kurze Beschreibung der relevanten Literatur

Das Klonieren mehrerer Lactose-Operatoren bis zu vier im Tandem wird von Sadler et al., Gene (1980), 8:279-300, geoffenbart Bakterielle Hybridplasmide, die oft wiederkehrende Satelliten-DNA enthalten, werden von Brutlag et al., Cell (1977), 10:509-519, geoffenbart Die Synthese eines Poly(asparagylphenylalanins) in Bakterien wird von Doel et al., Nucleic Acids Research (1980), 8:4575-4592, geoffenbart Ein Verfahren zum Anreichern des Prolingehalts durch Klonieren eines Plamids, das für die Produktion eines Prolinpolymers kodiert, wurde von Kangas et al., Applied and Environmental Microbiology (1982), 43:629-635 geoffenbart. Die biologischen Einschränkungen bezüglich der Länge oft wiederkehrender DNA-Sequenzen, die innerhalb der Plasmidreplikone stabil aufrechterhalten werden können, werden von Gupta et al. in Bioltechnology, S. 602-609, September 1983, besprochen. WO 88/03533 offenbart ein hochmolekulares Polymer, das wiederkehrende Aminosäuresequenzeinheiten oder Stränge davon enthält.
Im Gegensatz dazu werden in der vorliegenden Erfindung die Strukturkomponenten wiederkehrender Oligomereinheiten oder -stränge durch unterschiedliche Aminosäuresequenzen mit bestimmten funktionellen Fähigkeiten getrennt. (Unter "Strang" ist hierin eine geordnete Sequenz zu verstehen, die zur gegenseitigen Ausrichtung mit einem zweiten Strang in der Lage ist, der im wesentlichen die gleiche oder eine komplementäre Sequenz aufweist; beispielsweise richten sich hydrophob mit hydrophob und hydrophil mit hydrophil aus.) Die Komponenten der wiederkehrenden Einheiten sorgen für eine Struktur, welche die dazwischenliegenden Einheiten zugänglich macht, um mit der Umgebung, wie z.B. Lösungen, Gase, Gele und dergleichen, in Wechselwirkung zu treten, wobei die dazwischenliegende Sequenz im Vergleich zu den Strängen im wesentlichen frei von sterischer Hinderung ist, um mit anderen Molekülen in Wechselwirkung zu treten. Lange Nukleinsäuresequenzen werden durch Synthetisieren von Nukleinsäureoligomeren aufgebaut, die eine Vielzahl verschiedener wiederkehrender Peptideinheiten exprimieren, und diese Oligomere werden verbunden, um ein Polynukleotid mit gewünschter Länge zu liefern. Durch das Vorsehen spezifischer, relativ gleichmäßig beabstandeter Restriktionsstellen können zusätzliche Sequenzen an Stellen eingeführt werden, die für Drehungen oder andere funktionelle Einheiten zwischen wiederkehrenden Strängen sorgen. Die resultierenden offenen Nukleinsäure-Leserahmen können dann zur Expression des gewünschten Proteinprodukts in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden.
Es werden neue Polypeptide bereitgestellt, die Polyoligomere wiederkehrender, relativ kurzer Aminosäuresequenzeinheiten sind, die Stränge bilden, worin die Stränge durch eine unterschiedliche Oligomer-Einheit getrennt sind, was eine Sequenz ergibt, die der Umgebung des Polypeptids für eine Vielzahl von Funktionen zugänglich ist: die dazwischenliegenden Oligomere sind nicht au.sgerichetet und umfassen eine bindende oder chemisch aktive Aminosäuresequenz
Die Polypeptide, für die die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kodieren, sorgen für Stränge, die sich ausrichten können, um eine Grundstruktur zu bilden. Die Stränge sind Proteinkettensegmente mehr oder weniger linearer Konformation. Die Stränge können in umgekehrter oder direkter Ausrichtung ausgerichetet sein, wobei eine Vielzahl von Strängen durch eine andere Sequenz als die wiederkehrende Sequenz als funktionelle Einheit zwischen den Strängen getrennt ist, um für gelöste Stoffe oder Komponenten im Medium zugänglich zu sein. Die Stränge basieren vor allem auf wiederkehrenden Einheiten natürlich vorkommender Polymere, wobei die wiederkehrenden Einheiten im allgemeinen zumindest drei Aminosäuren umfassen und die gleiche Aminosäure zweimal enthalten können.
Die Polymere der Erfindung können dazu dienen, vielerlei Strukturen verschiedene Zwecke bereitzustellen. Je nach den wiederkehrenden Einheiten und ihrer Beziehung zu bekannten Polymerstrukturen können analoge mechanische, z.B. Zugfestigkeitseigenschaften, erzielt werden, die für bestimmte Verwendungszwecke modifiziert werden können. Die vorliegenden Polymere können als solche zur Herstellung von Fasern, Filmen, Membranen, Klebern, Emulsionen und dergleichen herangezogen oder mit anderen Verbindungen oder Zusammensetzungen zur Bildung von Verbundstoffen, Laminaten oder Kombinationen der obigen Produkte verwendet werden.
Die strukturell miteinander ausgerichteten Elemente der Polymere können β-Faltblätter, α-Helices, dynamische β-Spiralen, Kollagenhelix, vom Typ I oder II, oder Kombinationen davon sein, wobei dazwischenliegende Elemente vorhanden sind, die eine unterschiedliche Sequenz und Struktur aufweisen und üblicherweise nicht Teil der miteinander ausgerichteten Elemente sind. Zumeist sind diese dazwischenliegenden Sequenzen Schleifen oder Windungen.
Die Gene der Erfindung umfassen Multimere von DNA-Sequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenzeinheit kodieren, wobei zwei oder mehrere unterschiedliche Multimere, die für unterschiedliche Aminosäureinheiten kodieren, zur Bildung eines Blockcopolymers miteinander verbunden werden können. Die einzelnen Einheiten können 3 bis 30 Aminosäuren (9 bis 90 nt), noch häufiger 3 oder 4 bis 25 Aminosäuren (9 bis 75 nt), insbesondere 3 oder 4 bis 15 Aminosäuren (9 bis 45 nt), vor allem 3 oder 4 bis 8 Aminosäuren (9 bis 24 nt), aufweisen, wobei üblicherweise die gleiche Aminosäure zumindest zweimal in der gleichen Einheit vorkommt, im allgemeinen getrennt durch zumindest eine Aminosäure. Die Einheiten des Multimers, die für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, können zwei oder mehrere Nukleotidsequenzen umfassen und beruhen auf der Codonredundanz, um die gleiche Aminosäuresequenz zu erzielen.
Die Einheiten der Stränge umfassen im allgemeinen zumindest etwa 25 Aminosäuren und nicht mehr als etwa 150 Aminosäuren, üblicherweise nicht mehr als etwa 100 Aminosäuren, vorzugsweise etwa 30 bis etwa 75 Aminosäuren. Die andere, die Stränge trennende Sequenz umfaßt im allgemeinen zumindest etwa 4, noch üblicher 6 Aminosäuren und nicht mehr als etwa 50, üblicherweise nicht mehr als etwa 30 Aminosäuren, noch üblicher nicht mehr als etwa 20 Aminosäuren, wobei die längeren Sequenzen mit parallelen und nicht mit antiparallelen Strängen assoziiert sind und die Stränge in N-C- Richtung miteinander ausgerichtet sind.
Verschiedene natürliche Proteine besitzen wiederkehrende Strukturen, wie z.B. Kollagen mit einer wiederkehrenden G-X-Y-Einheit (worin X eine beliebige Aminosäure ist, häufig Ala oder Pro, und Y eine beliebige Aminosäure ist, häufig Pro oder Hydroxy-Pro), Elastin mit VPGG-, VPGVG- und/oder PGVGV-Einheiten, Keratin mit einer wiederkehrenden sog. "Heptaden"-Einheit, die aus einem Oligopeptid mit 7 Aminosäuren besteht, dessen Positionen 1 und 4 durchwegs mit hydrophoben aliphatischen oder aromatischen Resten besetzt sind, z.B. AKLKLAE oder AKLELAE, oder Muscheladhäsiv mit einem Decapeptid oder Hexadecapeptid innerhalb der Sequenz A-K-P-P*-S-T-Y-X-P-P*- P-S-T-Y-X-K (P* ist Hydroxyprolin und X ist eine aromatische Aminosäure, insbesondere L-Dopa; siehe US-A-4.585.585 und 4.687.740). Die wiederkehrenden Einheiten können einzeln oder in Kombination eingesetzt werden, wobei manche Einheiten in einem bestimmten Muster alternieren können, oder es können individuelle Stränge vorgesehen sein.
Von besonderem Interesse sind Polypeptide, die als wiederkehrende Einheit SGAGAG (G = Glycin; A = Alanin; S = Serin) aufweisen. Diese wiederkehrende Einheit findet sich in einem natürlich vorkommenden Seidenfibrom-Protein, das als GAGAG- (SGAGAG)&sub8;SGAAGY (Y = Tyrosin) dargestellt werden kann.
Für die dazwischenliegenden Oligomere oder Windungen zwischen den Strängen können je nach Verwendungszweck des Polymers verschiedene Sequenzen verwendet werden. So kann die dazwischenliegende Sequenz nicht ausgerichtet, flexibel, zugänglich oder funktionell sein oder eine Kombination dieser Eigenschaften aufweisen. Daher kann die dazwischenliegende Sequenz in Verbindung mit der Strangsequenz so ausgebildet sein, daß sie eine Vielzahl von Produkten liefert, die geformt, verarbeitet, extrudiert, gesponnen, gewebt, beschichtet oder dergleichen werden können. Die dazwischenliegende Sequenz kann einen Liganden bereitstellen, der dazu dienen kann, sich an Antikörper, natürlich vorkommende Rezeptoren, Nicht-Aminosäuremoleküle oder dergleichen zu binden. Auf diese Weise können die Polymerstrukturen dazu verwendet werden, eine Vielzahl von Molekülen spezifisch zu binden, die als Affinitätssäulen, Diagnostika, Sensoren, zur Zelltrennung, als Gerätebeschichtungen mit z.B. antithrombotischen Eigenschaften, als Zellsubstrate und dergleichen dienen.
Die dazwischenliegende Sequenz kann chemisch aktive Aminosäuren für chemische Vernetzungsstellen bereitstellen, die dazu dienen können, funktionelle Peptide, synthetische oder natürliche Polymere oder Proteine, Nicht-Aminosäuremoleküle und dergleichen kovalent daran zu binden. Die dazwischenliegende Sequenz kann eine natürlich vorkommende Sequenz oder eine modifizierte natürlich vorkommende Sequenz sein. Natürlich vorkommende Sequenzen können aus einer Vielzahl von Quellen mit sehr unterschiedlichen Funtionen erhalten werden. Solche Sequenzen sind z.B. Zellwachstumsinhibitor-Sequenzen, beispielsweise aus Tenascin (Chiquet-Ehrismann et al. (1981), Cell 53:383-390); Bindungsfaktoren zur Förderung des Zellwachstums, z.B. aus Fibronectin, -RGD-, -REDV-); Humphries et al. (1988), J. Cell Biol., 103:2673-2647 Fibronectin (-RGD-); Suzuki et al. (1985), EMBO J., 4:2519-2524, Laminin B1 (-YIGSR); WO 89/03392, Kollagen; Graf et al. (1987), Cell, 48:989-996, Vitronectin (-XAP-); Bakterienadhäsiv (-SLF-, -AlF-) Jacobs et al. (1987), J. Bacteriology, 1691:735-741; Wachstumshormon und Insulin; Zellfunktionsaktivatoren, wie z.B. große Histokompatibilitätskomplex-Antigene, Klasse I und II, insbesondere die α&sub1;, α&sub2;-, β&sub1;- und β&sub2;-Bereiche, z.B. HLA-A2-Aminosäuren 50-80 und 140-170 (Bjorkman et al. (1987), Nature, 329:512-518) und HLA-D-Aminosäuren 1-90 (Todd et al. (1988), Science, 240:1003- 1009; Wachstumsfaktordomänen, z.B. EGF, TGF und VGF, IL-1-8, insbesondere -2 und -4, sowie Erythropoietin; virale Bindungssequenzen, wie z.B. die Aminosäuren 35-60 (Clayton et al. (1988), Nature, 335:363-366) und 70-95 (Lifson et al. (1988), Science, 241:712-716) von menschlicher CD4; Sequenzen, die die Bindung von Nicht-Proteinmolekülen fördern, z.B. die Heparin-Bindedomäne von Vitronectin, Metallbindedomänen, z.B. Metallothioneine, Glucose und ander Zuckerbindedomänen, z.B. Lectine, B- Ketten von Toxinen, wie z.B. Abrin, Ricin und Diphtherietoxin, Safratoxin oder Fragmente davon usw., und Arzneimittel- oder Toxinbindedomänen zur Entgiftung; sowie chemisch aktive Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen für posttranslationelle Modifikationen, z.B. N-X-S für N-gebundene Glykosylierung und die Aminosäuren C, M, H, K, R, D, F, W, F, Y, N und Q zur chemischen Modifikation.
Sequenzen von besonderem Interesse als dazwischenliegende Sequenzen enthalten:
D P G K G X Y
worin zumindest eines von X und Y = C ist;
E P G Y I G S R C D A G Y;
P K G D R G D A G P K und
A V T G R G D S P A S;
worin konservative Substitutionen an anderer als der funktionellen Stelle vorgenommen werden können.
Für das Cysteinprodukt ist es wünschenswert, zwei oder drei Cysteine in einer Multimereinheit zu haben, vorzugsweise mit einem Cystein, das proximal zu jedem Ende der Multimereinheit positioniert ist. Bei der chemischen Spaltung ist das Dipeptid DP oder EP wünschenswert.
Andere Sequenzen von Interesse können Epitope von Mikroorganismen, wie z.B. Viren, Bakterien, Pilzen und Protozoen, Phosphorylierungsstellen, Peptidase-Erkennungsstellen oder dergleichen sein.
Der Einsatz von Gentechnik bei der Herstellung von Copolymeren mit wiederkehrenden Einheiten und dazwischenliegenden Sequenzen ist ein sehr wirkungsvolles Verfahren, das sich für verschiedene Eigenschaften eignet, indem eine geeignete Auswahl der unterschiedlichen Einheiten, der Anzahl an Einheiten in jedem Multimer, des Abstands dazwischen und der Zahl an Wiederholungen der Multimer-Kombinationsanordnung getroffen wird. Durch Variieren der Zahl und Anordnung der primären Multimere können somit viele verschiedene physikalische und chemische Eigenschaften erzielt werden.
Beispiele für die Verwendung der Blockcopolymere sind Kombinationen von Seide- und Elastineinheiten, um Produkte mit Eigenschaften zu liefern, die sich von Polymeren unterscheiden, die nur die gleiche monomere Einheit aufweisen.
Bei der Herstellung der Strukturgene können verschiedene Vorgangsweisen angewandt werden. Zur Bildung der Oligomere können komplementäre DNA-Stränge synthetisiert werden, sodaß mittels Hybridisierung doppelstrangige DNA mit den geeigneten Termini erhalten wird. Falls gewünscht können alle Oligomer-Einheiten gleich sein, sodaß je nach Hybridisierungsbedingungen in einem einzigen Schritt ein Concatemer erhalten werden kann. Normalerweise herrschen herkömmliche Annelier- und Ligationsbedingungen, wie sie in den weiter unten folgenden Beispielen beschrieben sind.
Falls gewünscht können zwei unterschiedliche oligomere Einheiten gebildet werden, worin die Termini der zwei Einheiten zueinander komplementär, die Termini der gleichen Einheit zur Bindung aneinander nicht fähig sind. Auf diese Weise können einzelne Oligomer-Einheiten zusammengesetzt und dann zur Bildung des Concatemers verbunden werden, wobei die dazwischenliegenden Verbindungssequenzen zumindest teilweise durch die Termini definiert werden. Je nach dem Konstrukt kann der 5'-Terminus das Initiationscodon Methionin liefern, oder das Strukturgen kann mit einem Adapter verbunden werden, der eine (gegebenenfalls durch enzymatische oder chemische Behandlung spaltbare) spezielle Sequenz am 5'-Terminus bereitstellen oder in einen Abschnitt eines Gens (üblicherweise endogen zum Wirt) im richtigen Leserahmen eingesetzt werden kann, um ein Fusionsprodukt zu liefern. Durch Vorsehen der geeigneten komplementären Termini zwischen dem Adapter oder verkürzten Gen und dem 5'-Ende des vorliegenden Strukturgens können die Sequenzen im richtigen Leserahmen miteinander verbunden werden, um das gewünschte Protein zu erzeugen. Die Verwendung von Adaptern oder Fusionsproteinen mit spezifischen Sequenzen für spezielle Zwecke, z.B. zur Verbindung, Sekretion, Komplexbildung mit anderen Proteinen, Affinitätsreinigung oder dergleichen, ist mit Vorteilen verbunden. Der 3'-Bereich kann ähnlich modifiziert werden, um analoge Funktionen zu bieten.
Sobald das Strukturgen zusammengesetzt wurde, kann es kloniert werden; Klone mit dem gewünschten Gen (insbesondere bezüglich der Sequenzlänge) können isoliert werden; und das Gen kann entfernt und zur Verbindung an eine Sequenz zur Expression verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt enthält Transkriptions- und Translations-Initiations- und -Terminationssteuerregionen 5' bzw. 3' des Strukturgens. Wie bereits erwähnt, können diese Bereiche unter Einsatz eines Fusionsproteins gebildet werden, wobei das vorliegende Strukturgen in ein anderes Strukturgen stromab von seinem Initiationscodon und im Leserahmen mit dem Initiationscodon insertiert wird. Alternativ dazu stehen verschiedene Transkriptions- und Translations-Inititationsbereiche aus einer Vielzahl von Genen zur Verwendung in Expressionswirten zur Verfügung, sodaß diese Transkriptions- und Translations-Initiationsbereiche mit dem vorliegenden Strukturgen verbunden werden können, um für die Transkriptions- und Translations-Initiation der vorliegenden Strukturgene zu sorgen. Es steht eine Vielzahl von Terminationsbereichen zur Verfügung, die aus dem gleichen Gen wie der Transkriptions-Initiationsbereich oder aus einem anderen Gen stammen können. Zahlreiche Konstrukte wurden in der Literatur geoffenbart, und die gleichen Vorgangsweisen wie bei anderen Strukturgenen können für das vorliegende Gen gewählt werden.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung eines induzierbaren Transkriptions- Initiationsbereichs. Auf diese Weise kann der Wirtstamm vor signifikanter Expression des gewünschten Produkts bis zu hoher Dichte vermehrt werden. Das Vorsehen induzierbarer Transkription ist besonders nützlich, wenn das Peptid im Zellwirt zurückgehalten und nicht vom Wirt sekretiert wird.
Einige induzierbare Transkriptionsinitiationsbereiche sind verfügbar bzw. können in bestimmten Situationen eingesetzt werden. Die induzierbaren Bereiche können durch bestimmte Chemikalien, wie z.B. Isopropylthiogalactosid (IPTG), gesteuert werden, um das β-Galactosidase-Gen zu induzieren. Andere induzierbare Bereiche enthalten linke und rechte λ-Promotoren; verschiedene Aminosäure-Polycistrone, z.B. Histidin und Tryptophan; temperaturempfindliche Promotoren; und Regulatorgene, z.B. clts857.
Ein alternatives System, das vorteilhaft verwendet werden kann, besteht im Einsatz einer Kombination von Transkriptions-Initiationsbereichen. Es wird ein erster Transkriptions- Initiationsbereich verwendet, der die Expression des gewünschten Gens reguliert, jedoch im Expressionswirt nicht funktionell ist, da er mit der endogenen RNA-Polymerase nicht funktionell ist. Ein zweiter Transkriptions-Initiationsbereich, wie z.B. ein induzierbarer Bereich, kann dann verwendet werden, um die Expression einer RNA-Polymerase zu regulieren, mit der der erste Transkriptions-Initiationsbereich funktionell ist. Auf diese Weise tritt die Expression nur nach Aktivierung des Regulatorbereichs ein, der die Expression der exogenen RNA-Polymerase steuert. Ein Beispiel für dieses System ist der T7-Phagen-Transkriptions-Initiationsbereich, genauer gesagt die Initiationsbereiche der Gene 9 und 10 von T7-Phagen.
Ein alternatives System basiert auf der Verwendung von Mutanten, die je nach Veränderung der Umgebung, wie z.B. Mangel eines Nährstoffs, Temperatur, osmotischem Drück, Salzgehalt oder dergleichen, eine Entwicklungsänderung erfahren. Als Beispiele für dieses System können Stämme von B.subtilis erhalten werden, die zu keiner Sporenbildung fähig sind, aber jene Komponenten erzeugen können, die die Expression von an der Sporenbildung beteiligten Produkten initiieren können. Daher wird durch eine Änderung im Zustand des Mediums ein mit der Sporenbildung assozuerter Transkriptions-Initiationsbereich aktiviert. In dieser Situation bietet der Wirt das notwendige Induktionsmittel bzw. den notwendigen Induktionsaktivator, um die Expression zu initiieren.
Es gibt auch verschiedene andere Verfahren, die für die induzierbare Regulierung der Transkription und Translation eines Gens in einem bestimmten Wirt sorgen.
Größtenteils ist der Wirt ein einzelliger Organismus, entweder ein Prokaryot oder ein Eukaryot, ausgewählt aus Bakterien-, Algen-, Pilz-, Fadenpilz-, Pflanzen- oder Tiergewebekultur-Zellen usw. Beispiele für Wirte sind E.coli, B. subtilis, B. stearothermophilus, S. cerevisiae, Aspergillus, Neurospora, CHO-Zeilen, HeLa-Zellen usw. Alternativ dazu können ganze Pflanzen verwendet werden.
Das Expressionskonstrukt zur Expression des gewünschten Gens - als solches oder in Kombination mit beliebigen an der Transkription beteiligten Hilfsgenen - wird normalerweise zwecks Einführung in den Expressionswirt mit einem geeigneten Vektor verbunden. Eine große Anzahl an Vektoren ist im Handel erhältlich, und andere werden in der Literatur beschrieben. Die Vektoren sind normalerweise dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere einzigartige Restriktionsstellen, ein Replikationssystem zum extrachromosomalen Verbleib im Wirt, sowie einen oder mehrere Marker aufweisen, die für selektiven Druck auf den Wirt sorgen. Die Marker können Komplementierung, Prototrophie gegenüber einem auxotrophem Wirt, Resistenz gegenüber einem Biozid, z.B. einem Antibiotikum wie Penicillin oder Kanamycin, oder dergleichen bewirken. in einigen Fällen wird kein selektiver Druck sondern ein Markergen verwendet, das den Nachweis bestimmter, das Gen enthaltender Kolonien ermöglicht. Diese Situation wird durch das Gen für β-Galactosidase veranschaulicht, worin ein Substrat verwendet wird, das ein gefärbtes Produkt liefert.
Das Expressionskonstrukt kann einschließlich aller Hilfsgene nach bekannten Verfahren in den Expressionsvektor eingefügt werden, insbesondere durch Restriktion, Insertion und Ligation.
Das Expressionskonstrukt kann dann zur Transformation des geeigneten Wirts verwendet werden. Je nach Wirt kommen entweder intakte Zellen oder Protoplasten zum Einsatz, wobei Transformation oder Konjugation angewendet wird. Geeigneterweise können mit Calciumphosphat gefällte DNA oder nichtionogene Detergentien verwendet werden, um das Plasmid in den Wirt einzuführen. Es ist festzuhalten, daß es nicht erforderlich ist, Vektoren zur Wirtstransformation zu verwenden, da bloße DNA zur Integration in das Genom eingeführt werden kann. Selbst wenn Integration gewünscht wird, wird durch Verwendung von Vektoren eine viel größere Integrationseffizienz erzielt, weshalb der Einsatz von Vektoren bevorzugt wird.
Je nach Beschaffenheit des Vektors kann das Expressionskonstrukt auf einem extrachromosomalen Element gehalten oder in den Wirt integriert werden. Falls Integration gewünscht wird, ist es bei Prokaryoten und einigen Eukaryoten üblicherweise günstig, eine Sequenz zu haben, die zu einer Sequenz im Chromosom des Wirts homolog ist. Üblicherweise umfaßt die Sequenz zumindest etwa 200 bp und nicht mehr als etwa 5.000 bp, üblicherweise nicht mehr als etwa 2.000 bp. Die Wahl der homologen Sequenz ist etwas willkürlich, kann jedoch zwecks Komplementierung vorgenommen werden, falls der Wirt eine auxotrophe Mutante ist und die Homologie für Prototrophie sorgt.
Die Transformanten oder Integranten können dann in einem geeigneten Nährstoffmedium bis zu hoher Dichte vermehrt werden, gefolgt von Einleitung der Transkription entsprechend der Beschaffenheit des Transkriptionssystems des Expressionskonstrukts. Falls das gewünschte Protein im Zytoplasma zurückgehalten wird, werden diese Zellen geerntet und lysiert, und das Protein kann - je nach Vewendung - nach herkömmlichen Verfahren, wie z.B. Chromatograph je, Solvent-Solvent-Extraktion, Affinitätschromatographie oder dergleichen, weiter gereinigt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind nicht einschränkend.

EXPERIMENTELLER TEIL

Beispiel 1

DNA-Herstellungsverfahren

1. Präparieren von Plasmid-DNA aus E.coli

A. Kleinansatz. Plasmid-DNA wurde entweder nach dem Siedeverfahren oder dem Alkali-Lyseverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)) aus 1,5 ml-Kulturen präpariert.
B. Großansatz. Ein plasmidtragender Stamm wurde über Nacht in 1 Liter Luria- Kulturlösung mit dem geeigneten Antibiotikum gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren mit 10.000 x g über 5 min gesammelt und in 10 ml eiskaltem TE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA) erneut suspendiert. Die Zellen wurden wiederum zentrifugiert, in 4 ml TES (TE und 25% (w/v) Saccharose) suspendiert und durch Rühren homogenisiert. Die Proben wurden fiir die folgenden Schritte auf Eis aufbewahrt. Lysozym (1 ml mit 10 mg/ml) wurde der Zellsuspension zugegeben und 5 min lang inkubiert, wonach Zugabe von 2 ml 0,5 M EDTA, pH 8, erfolgte. Nach 10-minütiger Inkubation wurden 50 ml Proteinase K (40 mg/ml) zugegeben, gefolgt von 15 ml Lysepuffer 10 min später (0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8). Nach 15-20 min wurde das Zell-Lysat mit 35.000 x g 90-120 min lang zentrifugiert. Der Überstand (19,8 ml) wurde in ein Kunststoffröhrchen mit 20 g CsCl und 400 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) übergeführt. Nach dem Auflösen wurde das Gemisch in zwei Polyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen aufgeteilt, heißversiegelt und in einem Beckman Ti 65-Motor bei 60.000 U/min 24 Stunden lang zentrifugiert. Das untere Plasmid-DNA-Band wurde mit einer Injektionsnadel aus dem Röhrchen entfernt. Das Ethidiumbromid wurde dreimal mit dem gleichen Volumen an mit NaCl gesättigem Isopropanol extrahiert. Der DNA- Lösung wurde das doppelte Volumen an H&sub2;O zugegeben und die DNA mit Ethanol ausgefällt.

2. Herstellung von doppelstrangiger DNA.

Eine Kultur von JM103 wurde bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 0,2 gezüchtet und dann in 2 ml-Aliquoten aufgeteilt. Jede Aliquote wurde mit einem frischen Plaque von M13 infiziert und etwa 6 h lang bei 37ºC unter heftigem Schütteln inkubiert. Dann wurden die Zellen pelletiert und der Überstand für nachfolgende Infektionen aufgehoben. Die doppelstrangige Phagen-DNA wurde nach dem Siedeverfahren (Maniatis et al.) extrahiert.

3. Entproteinisierung.

Phenolextraktion erfolgte an einem geeigneten Volumen der DNA-Probe, typischerweise zwischen 100 µl und 10 ml. Die DNA-Probe wurde in 0,01 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, verdünnt und das gleiche Volumen an mit Wasser gesättigtem Phenol zugesetzt. Die Probe wurde kurz durchgerührt und 3 min lang auf Eis gestellt. Nach 3-minütigem Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge wurde die wäßrige Schicht entfernt, in ein neues Röhrchen übergeführt und einmal mit dem gleichen Volumen an Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert.

4. Ethanolfällung.

DNA in einem wäßrigen Puffer wurde mit Ethanol ausgefällt. Der DNA-Probe wurde 1/10 des Volumens an 3 M Natriumacetat, pH 7,5, und das 2- bis 3fache Volumen an kaltem Ethanol zugegeben. Die DNA wurde 30 min lang bei -70ºC oder über Nacht bei -20ºC ausfallen gelassen und dann 15 min lang bei 4ºC durch Zentrifugieren in der Mikrozentrifuge pelletiert. Das Pellet wurde einmal mit 200 µl kaltem, 80%-igem Ethanol gewaschen und erneut 10 min lang bei 4ºC pelletiert. Nach Luftoder Gefriertrocknung wurden die Pellets in einem geeigneten Puffer erneut suspendiert.

5. Phosphatase-Behandlung von DNA.

Die Phosphatase-Behandlung von DNA erfolgte durch direkte Zugabe von 1 µl (25 Units) Kalbsdarm-Phosphatase (Boehringer Mannheim) in die Restriktionsenzym-Spaltreaktion und Fortsetzen der Inkubation über 30 min bei 37ºC. Die Phosphatase wurde vor der Entproteinisierung 60 min lang bei 65ºC durch Phenolextraktion inaktiviert.

6. Auffüllreaktion mit DNA-Polymerase I.

DNA wurde erneut in Puffer suspendiert, umfassend 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2; und jeweils 400 µM der vier Desoxynukleotidtriphosphate. 10 Units Klenow DNA-Polymerase (BRL) wurden zugegeben und die Reaktion 15 min lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die DNA wurde phenolextrahiert und ethanolgefällt.

7. T4-Polynukleotid-Kinasereaktion.

Die Reaktion (10 µl) enthielt: T4-Polynukleotid- Kinase (BRL), 150 ng DNA, 1 µl 10x Kinase-Puffer (0,7 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 M MgCl&sub2;, 50 mM DTT) und [³²P]-ATP (200-300 µCi). Sie wurde bei 37ºC 30 min lang inkubiert und die DNA dann unter Verwendung einer NACS-Säule (Bethesda Research Labs) gereinigt.

8. Spaltung mit Restriktions-Endonukleasen.

DNA wurde mit Restriktions-Fndonukleasen (RENs) in 1 x "AA"-Puffer gespalten [10 x AA-Puffer besteht aus 330 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 660 mM Kaliumacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 50 mM Dithiothreitol (DU) und 1 mg/ml Rinderserumalbumin (nukleasefrei)]. Sofern dies möglich war, wurde die DNA- Konzentration unter 1 µg/25 µl gehalten. Die Inkubation erfolgte für die meisten Restriktions-Endonukleasen - außer für Ball, Bani und Nael-Spaltungen, die über Nacht inkubiert wurden - bei 37ºC innerhalb von 1-4 h.

9. Analytische Agarosegel-Flektrophorese von DNA.

Den DNA-Proben zur Gelanalyse wurde das 0,2fache Volumen Ladepuffer (5 x Elektrophoresepuffer, 0,01% Bromphenolblau-Farbstoff, 50 mM FDTA und 50% Glyzerin) zugegeben. Dann wurden die Proben auf Bahnen einer horizontalen, eingetauchten Elektrophorese-Einheit aufgebracht, die ein 1,0%-iges (w/v) Agarosegel enthielt. Der Elektrophoresepuffer war entweder 1 x TAC oder 1/2 x TBE. Der 1 x TAC besteht aus 40 mM Tris-Base, 10 mM EDTA, mit Essigsäure auf pH 7,8 eingestellt. Der 1/2 x TBE besteht aus 0,045 M Tris-Base, 0,045 M Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8. Das Gel wurde 18 h lang bei 40-50 V laufen gelassen, dann entfernt und 30 min lang mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid gefärbt. Die DNA-Banden wurden auf einem UV-Transilluminator für lange Wellenlängen visualisiert.

10. Präparative Agarosegel-Elektrophorese.

Die Vorgangsweisen und Materialien sind die gleichen wie für die analytische Agarosegel-Elektrophorese. Der einzige Unterschied ist die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose, deren Konzentration je nach Größe des zu reinigenden DNA-Fragments im Bereich von 0,5-2,5% (w/v) reicht. DNA- Restriktionsfragmente wurden nach der Visualisierung mit Ethidiumbromid aus den LMP-Agarosegelen herausgeschnitten.

11. NACS-Reinigung.

Gel fragmente mit DNA wurden 5 min lang bei 70ºC geschmolzen und mit TEL (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,2 M NaCl) etwa auf das Fünffache verdünnt. Die Gellösung wurde auf eine NACS-Säule (BRL) aufgebracht. Die Säule wurde mit 5 ml des gleichen Puffers gewaschen. Die gebundene DNA wurde mit 300 µl entweder von TE2 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M NaCl) für DNA-Fragmente von weniger als 1.000 bp oder von TE3 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 M NaCl) für größere Fragmente eluiert. Die eluierte DNA wurde mit Ethanol ausgefällt.

12. DNA-Ligation.

Reaktionsgemische zum Ligieren kohäsiver Enden enthielten: 1 µg DNA, 1 x AA-Puffer (siehe obigen Schritt 8), 1 mM ATP und 20 Units T4-DNA-Ligase (BRL) in 20 µl Reaktions-Endvolumen. Die Ligation wurde 16-18 h lang bei 15ºC oder 1-2 h lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Für Ligationen stumpfer Enden enthielten die Reaktionsgemische 1 µg DNA, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,25 mM Spermidin, 200 mg BSA, 1 mM Hexaminkobaltchlorid (HCC), 0,5 M ATP und 400 Units T4-DNA-Ligase (NEB) in 20 µl Reaktionsvolumen. Die Ligation wurde 30 min bis 1 h lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen.

Bakterien-Transformationsverfahren

1. Herstellung von transformationsfähigen E.coli-Zellen.

Eine Kultur aus 200 ml steriler L-Brühe wurde mit einer kleinen Schlaufenmenge E.coli-Zellen beimpif. Diese wurden unter Schütteln bei 37ºC inkubiert, bis die OD&sub6;&sub0;&sub0; etwa 0,5 betrug. Die Kultur wurde 10 min lang auf Eis gestellt und 10 min lang mit 6.000 x g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 100 ml eiskaltem 0,1 M MgCl&sub2; erneut suspendiert, 30-40 min lang auf Eis gehalten und wiederum zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2 ml eiskaltem 100 mM CaCl&sub2; erneut suspendiert, in eine sterile Eprouvette übertragen und 24 h lang auf Eis inkubiert. Die geeigneten Zellen wurden dann in Aliquoten aufgeteilt und bei -70ºC gelagert.

2. Transformation von E.coli.

Eine Aliquote von gefrorenen geeigneten Zellen wurde auf Eis aufgetaut. Zu 50 µl Zellen wurden 0,1 bis 1 µg DNA zugegeben und das Gemisch 30 min lang auf Eis inkubiert. Das Röhrchen wurde aus dem Eis entfernt und 2 min lang in einem Bad mit 42ºC gehalten. L-Brühe (1 ml) wurde zugegeben und das Transformationsgemisch unter Schütteln bei der gewünschten Temperatur (üblicherweise 30ºC oder 37ºC) 2 h lang inkubiert. Dann wurde 1/10 des Transformationsgemischs auf L- Brüheplatten aufgebracht, die das notwendige Antibiotikum enthielten, und - falls erforderlich - wurden XGAL und IPTG zugegeben.

Antikörperproduktion Proteinchemie und Elektrophorese von Proteinen

1. Erzeugung von Antikörpern gegen künstlich synthetisierte Peptide.

Ein synthetisches Peptid der Sequenz (GAGAGS)&sub8;GAAGY wurde unter Anwendung des Glutaraldehydverfahrens von Kagen und Guck (1979) an BSA gebunden. Der Bindungsgrad wurde anhand von Spurenmengen an radioaktiv iodiertem, synthetischem Peptid überwacht. Peptidkonjugate in einer Konzentration von 1 mg/ml in vollständigem Freund-Adjuvans wurden dazu verwendet, Hasen am Tag 0 zu immunisieren. Die Tiere erhielten am Tag 30 eine weitere Injektion mit Antigen in unvollständigem Freund-Adjuvans und wurden am Tag 60 titriert. Positive Seren wurden mittels Mikrotiter-RIA unter Verwendung des synthetischen Peptids als Antigen nachgewiesen. Siehe Kagen und Glick (1979), Methods of Radioimmunoassay, Jaffe und Berman (Hrsg.), Academic Press, S. 328.
Ein Peptid aus 53 Aminosäuren, die der SLPIII-Sequenz (V-P-G-V-G)&sub8; entsprechen, wurde auf einem Applied Biosystems-Peptidsynthetisierer hergestellt. Die Ausbeute an diesem Material, das ein Molekulargewicht von 3.640 aufwies, betrug etwa 0,5 g. Das Peptid wurde an Rinderserumalbumin gebunden. Das Material wurde an Antibodies, Inc. geschickt, um Antikörper in Hasen zu erzeugen. Es wurden Antiseren erhalten, die mit synthetischen Peptiden der SLPIII-Sequenz reagierten. Diese Antiseren dienten zum Nachweis von Gly-Ala-Sequenzen enthaltenden Fusionsproteinen.
Unter Befolgung der oben beschriebenen Vorgangsweise wurde ein weiteres Antigen mit der Formel YTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYC von Fibronectin (dem FCB-Abschnitt) und der Sequenz (GAP[GPP]&sub4;)&sub2; (dem CLP-Abschnitt) synthetisiert, das zur Verwendung als Immunogen an Napfschnecken-Hämocyanin gebunden wurde. Polyklonale Antiseren wurde wie oben beschrieben erzeugt und banden sich an das FCB- und das CLP- Peptid.

2. Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Proteinen.

Etwa 10&sup9; E.coli-Zellen aus wachsenden Kulturen wurden durch Zentrifugieren mit 10.000 x g über 5 min pelletiert. Die Zellpellets wurden in 100 bis 500 µl 2X Probenpuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 60% Glyzerin oder Saccharose) erneut suspendiert und 30 s lang mittels eines Tekmar-Schalldisruptors ultraschallbehandelt. Die Proben wurden etwa 5 min lang aufgekocht und 20 bis 100 µl der Zell-Lysate auf ein SDS- Polyacrylamidgel (7,5-16% (w/v)) aufgegeben. Die Gele wurden nach dem Verfahren von Laemmli (Nature, 27:80-685 (1970)) hergestellt. Die Proteine in den Gelen wurden mit 2% Coomassie Brilliant Blue in 100/0 Methanol, 7,5% Essigsäure 1 h lang gefärbt und in 10% Methanol, 7,5% Essigsäure über Nacht entfärbt.

3. Immunblotten von Proteinen in Gelen.

Nach der Proteinelektrophorese wurde eine der flankierenden Glaspiatten vom Polyacrylamidgel entfernt. Die Geloberfläche wurde mit Transferpuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 20% Methanol) benetzt. Ein Stück Nitrocelluiosepapier (Sartonus, SM11307) wurde mit Transferpuffer gesättigt und auf das Gel gelegt. Luftblasen zwischen dem Filter und dem Gel wurden entfernt. Das Gel und das Nitrocellulosefilter wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad) in die Transfereinheit eingebracht. Der Transfer erfolgte bei 200 mA über 3-4 h. Dann wurde das Nitrocellulosefilter entfernt und 3 min lang mit Amido-Schwarz eingefärbt (0,05% Amido Black, 45% entionisiertes H&sub2;O, 45% Methanol, 10% Essigsäure) und in H&sub2;O entfärbt. Das Filter wurde zumindest 10 min lang bei Raumtemperatur in "BLOTTO" (5% (w/v) Trockenmagermilch, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% (w/v) NaCl, 0,2% (w/v) Natriumazid) inkubiert. Das Filter wurde in Serum eingebracht, das in geeigneter Weise (1:50 bis 1:500) mit 0,5X Blotto (2,5% Trockenmagermilch, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) verdünnt worden war, und vorsichtig etwa 16 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Filter wurde mit 5 Portionen TSA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,2% Natriumazid) gewaschen. Der Blot wurde in 15 ml 0,5X BLOTTO-Lösung eingelegt, die 1x10&sup7; cpm des ¹²&sup5;I-Proteins A enthielt, und vorsichtig 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Filter wurde 2 h lang mit mindestens 7 Portionen TSA gewaschen, einmal mit entionisiertem H&sub2;O gespült und luftgetrocknet. Der Blot wurde mit Saran-Band abgedeckt und autoradiographiert.

4. Aminosäureanalyse.

Die Aminosäurezusammensetzungen wurden nach dem PTC- Derivatisierungsverfahren von Henrickson und Meredith (1984) bestimmt. Proteinproben wurden mit 5,7 N konstant siedender HCl bei 108ºC 24 h lang in Vakuum hydrolysiert. Nach dem Umsetzen mit PITC wurden Aminosäurederivate bei 254 nm mittels RP-HPLC unter Verwendung eines Hewlett Packard 1090-Systems und einer Supelco C18-Säule (4,6 mm x 25 cm) mit einem linearen Gradienten von 0-50% Acetonitril in 0,1 M NH&sub4;OAc, pH 6,78, als mobile Phase nachgewiesen. Siehe Henrickson, R. L. und Meredith, S. C. (1984), Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography, Anal. Biochem., 137: 65-74.

5. Aminosäureseguenzanalyse.

Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch automatisierten Edman-Abbau mit einem Applied Biosystems Modell 470A Gasphasen-Proteinsequenator bestimmt. Die PTH-Aminosäurederivate wurden mittels RP-HPLC mit einem Hewlett Packard 1090-System und einer Altex C18-Säule (2 mm x 25 cm) mit einem komplexen Gradientpuffersystem analysiert.

6. Peptidsynthese.

Synthetische Peptide wurden durch Festphasensynthese auf einem Applied Biosystems Modell 430A-Peptidsynthesizer unter Anwendung der vom Hersteller bereitgestellten symmetrischen Standard-Anhydridchemie erzeugt. Die Bindungsausbeute in jedem Schritt wurde nach dem quantitativen Ninhydrin-Verfahren von Sann et al. (1981) bestimmt. Das synthetische Peptid wurde vom festen Träger abgespalten und die Aminosäureschutzgruppen mit wasserfreiem HF entfernt (Stewart und Young, 1984). Die rohen Peptide wurden durch Chromatographie über Sephadex G-50 entsalzt. Siehe Sann, V. K., Kent, S. B. H., Tam, J. P. und Merrifield, R. B. (1981), Anal. Biochem. 237:927-936. Stewart, J. M. und Young, J. D. (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA, S. 85-89.

Synthetische DNA-Verfahren

1. In vitro-DNA-Synthese.

Die N,N-Diisopropylphosphoramidite, Glassäulen mit kontrollierter Porengröße und alle Synthesereagentien stammten von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA.
Synthetische Oligonukleotide wurden nach dem Phosphittriester-Verfahren mit einem Applied Biosystems Modell 380A-DNA-Synthesizer unter Verwendung eines 10fachen Überschusses an geschützten Phosphoramiditen und von 1 µMol von an der Syntheseträgersäule gebundenem Nukleotid hergestellt. Die zur Synthese angewandte Chemie besteht in den Standardarbeitsvorschriften, die zur Verwendung mit dem Synthesizer empfohlen werden, und wurde bereits beschrieben (Matteucci et al., J. Amer. Chem. Soc. 103:3185-3319 (1981)). Die Entfernung der Schutzgruppen und die Abspaltung der Oligomere vom festen Träger erfolgten im Einklang mit Standardverfahren, wie von McBride et al., Tetrahedron Letters 24:245-248 (1983) beschrieben. Die wiederholte Ausbeute der Synthese, die anhand der optischen Dichte der entfernten Schutzgruppen gemessen wurde (laut Empfehlung von Applied Biosystems (1984)), betrug mehr als 97,5%.
Das Oligonukleotid-Rohgemisch wurde durch präparative Gelelektrophorese gereinigt, wie in den Applied Biosystems-Arbeitsvorschriften vom 9. November 1984 (User Bulletin, Nr.13) beschrieben. Die Acrylamidgel-Konzentration variierte je nach Länge des Oligomers von 10-20%. Das gereinigte Oligomer wurde durch UV-Abschattung identifiziert, aus dem Gel herausgeschnitten und nach Zerkleinern und Einweichen extrahiert ("crush and soak"; Smith, Methods in Enzymology, 65:371-379 (1980)).

2. Sequenzieren von DNA.

DNA-Sequenzen wurden durch die folgenden Verfahren bestimmt. Fragmente, die den Bereich von Interesse enthielten, wurden in die Mehrfachklonierungsstelle von M13mp18 oder M13mp19 kloniert (Maniatis et al., 1982, und Norrander et al., 1983). Es wurde einstrangige DNA präpariert und nach dem Primer- Extensionsverfahren (Sanger et al., 1977, und Biggin et al., 1983) unter Verwendung von 355-Desoxyadenosin-5'-(α-thio)triphosphat (New England Nuclear) als Marker sequenziert. In einigen Fällen wurde Reverse Transkriptase (Molecular Genetics) zur Extension des Primers verwendet; dabei kamen die Didesoxy:Desoxynukleosidtriphosphat- Verhältnisse von Zagursky et al. (Gene Anal. Tech. (1985), 2:89-94) zur Anwendung. In diesen Reaktionen wurde Desoxyadenosintrisphosphat, markiert mit ³²P oder ³&sup5;S, verwendet. Stauchungsartefakte, die in einigen G-C-reichen Sequenzen auftauchten, wurden durch Eliminieren von Desoxyguanosintriphosphat aus der G-Reaktion und Verwendung von Desoxyinosintriphosphat (P-L Biochemicals) in einer Endkonzentration von 37,5 µM vermieden. In anderen Gemischen betrug die Konzentration von Didesoxygtp bei der G-Reaktion 0,5 mM. Alle Sequenzen wurden auf 6- oder 8%-igen Polyacrylamidgelen mit 8 M Harnstoff (Sanger et al., 1 978) laufen gelassen. Die Primer zum Sequenzieren wurden von P-L Biochemicals erstanden. Die Lagerung und Analyse der Daten erfolgte mit Software von Dnastar und International Biotechnologies, Inc.

Fermentationsbedingungen

Der Fermenter war ein 15 L Chemap mit 10 l Betriebsvolumen. Die Kulturbedingungen waren: Temperatur 30ºC, pH = 6,8; NaOH 2,5 M wurde zur pH-Einstellung verwendet. Der Headspacedruck lag unter 0,1 bar. Der gelöste Sauerstoff wurde auf 50% eingestellt. Der Luftstrom variierte von 0,5 l/min bis 20 l/min. Die Rührgeschwindigkeit schwankte zwischen 200 und 1500 U/min.
Der Fermenter wurde mit 10%-igem (v/v) Impfmaterial beimpft, das in Medium A 15 h lang bei 30º unter Rühren gezüchtet worden war.
Medium B war das Fermentermedium. Das Anfangsvolumen betrug 5l.
Als die Glucose-Konzentration 1 %erreichte, wurde eine konzentrierte Lösung (5x) von Medium B in den Fermenter eingefüllt, um die Glucose-Konzentration etwa bei 1 % zu halten. Als die Kultur eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 60,0 erreichte, wurde die Temperatur für 10 min auf 42ºC erhöht und dann für 2,5 Stunden auf 39ºC gesenkt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren geerntet und bis zur Verarbeitung bei -70ºC eingefroren. Tabelle 1

Beispiel 2

Zusammensetzung und Express ion des SLPIII-Gens

1. Zusammenfassung des Schemas zur Zusammensetzung des SLPIII-Gens.

SLPIII weist eine starke Ähnlichkeit mit dem Seidefibroin-Molekül auf, da es die Aminosäure Tyrosin in regelmäßigen Abständen (etwa 60 Reste) enthält. Das SLPIII-Gen wurde aus kleineren Teilen zusammengesetzt. Zunächst wurden drei doppelstrangige DNA-Abschnitte mit einer Länge von 60 bp chemisch synthetisiert. Jeder Abschnitt wurde durch Insertion in Bakteriophagen M13 kloniert und die DNA-Sequenz verifiziert. Diese Abschnitte wurden dann aus dem Vektor entfernt und in einer bestimmten Reihenfolge miteinander verbunden. Diese Verbindung von etwa 180 bp wird als SLPIII-"Monomer" bezeichnet. Die "Monomere" wurden dann in einer bestimmten Reihenfolge verbunden, um Dimere, Trimere, Tetraere usw. von SLPIII zu ergeben. Die Multimere wurden dann entweder direkt in Plasmidexpressionsvektoren kloniert, um das SLPIII-Protein nachzuweisen, oder anfänglich in ein Adapterplasmid kloniert. Die Insertion der SLPIII-DNA in den Adapter ermöglicht weitere Genmanipulationen und wird weiter unten beschrieben. Das Zusammensetzungsschema ist nachstehend veranschaulicht:
Synthese doppeistrangiger DNA-Abschnitte: Abschnitt 1 - Abschnitt 2 - Abschnitt 3 - Zusammensetzung des "Monomers" Multimerisation
Die DNA und entsprechende Aminosäuresequenzen der drei Abschnitte des SLPIII-Gens sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
Die doppelstrangige DNA-Sequenz ist in 5'-zu-3'-Richtung dargestellt. Die Aminosäuren (G = Glycin, A = Alanin, S = Serin, Y = Tyrosin), für die die Sequenz kodiert, sind unmittelbar unter jedem Abschnitt veranschaulicht.
Es wurden die obigen sechs Einzelstränge synthetisiert. Nach der Synthese wurden die DNA-Stränge gereinigt und die homologen Stränge anneliert Etwa 1 µl (0,5 µg) jedes Strangs wurde mit 2 µl 10X AA (10XAA, definiert in Beispiel 1, Punkt 8), Puffer und 16 µl sterilisiertes entionisiertes H&sub2;O in einer 1,5 ml Eppendorf-Eprouvette aus Polypropylen vermischt. Das Röhrchen wurde 10 min lang in ein Bad mit siedendem Wasser (500 ml in einem 1 I-Becherglas) gestellt, das Becherglas dann von der heißen Platte entfernt und am Arbeitstisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Dies dauerte etwa 1-2 h.
Jeder der drei doppelstrangigen Abschnitte wurde getrennt in M13mp18 kloniert. Abschnitt 1 wurde zwischen der 5mal- und der BamHI-Restriktionsstelle der Mehrfachklonierungsstelle ligiert. Abschnitt 2 wurde zwischen der BamHI- und der PstI-Stelle ligiert. Abschnitt 3 wurde zwischen der PstI- und der HindIII-Stelle insertiert. Die jeweiligen Klone sind: M13mp18.1, M13mp18.2, M13mp18.3. Die DNA-Sequenz wurde für jeden klonierten Abschnitt bestimmt. Ein repräsentatives Beispiel jedes Abschnitts, das die korrekte DNA-Sequenz aufwies, wurde gewonnen und diente als Material für den nächsten Schritt - die Zusammensetzung des "Monomers".

2. Zusammensetzung des "Monomers" von SLPIII.

Die DNA-Abschnitte 2 und 3 wurden durch Spaltung der M13-Klone mit Restriktionsenzymen isoliert. Für Abschnitt 2 wurde M13mp18.2 mit BamHI und PstI gespalten; für Abschnitt 3 wurde M13mp18.3 mit PstI und HindIII gespalten. Die beiden Abschnitte wurden gereinigt und in äquimolaren Mengen mit M13mp18.1 vermischt, das zuerst mit BamHI und HindIII gespalten worden war. T&sub4;-DNA-Ligase wurde zugegeben, um die homologen überlappenden Enden in der Reihenfolge 1-2-3 zu verbinden. Aufgrund der Hybridisierungsspezifität der kohäsiven Enden sind die drei Abschnitte in dieser Reihenfolge effizient miteinander verbunden. Die DNA-Sequenz des klonierten "Monomers" in der Zusammensetzung mit der Bezeichnung M13mp18.1.2.3 stellte sich als korrekt heraus (siehe 2).

3. Multimerisierung des "Monomers" von SLPIII.

Um große Mengen des "Monomer"- Strukturgens herzustellen, wurde zuerst das "Monomer" in den Plasmidvektor pUC12 subkloniert. M13mp18.1.2.3 wurde mit dem EcoRI- und dem HindIII-Restriktionsenzym gespalten. Das SLPIII-"Monomer" wurde gelgereinigt und in mit EcoRI und mit HindIII gespaltenen pUC12 ligiert. Es wurde die resultierende Plasmid-DNA präpariert, das "Monomer" durch Spaltung mit BanI-REN aus dem Vektor freigesetzt und das Fragment gelgereinigt.
Um Multimere zu erzeugen, wurde "Monomer"-DNA mit Bani-Enden duch Ligation verbunden. Die nichtpalindrome terminale BanI-Erkennungssequenz ermöglicht nur die Verbindung in Kopf-an-Schwanz-Anordnung. Das Ausmaß der Multimerisierung wurde durch Gelelektrophorese und Färbung der DNA mit Ethidiumbromid überwacht. Nach diesem Verfahren wurden Multimere mit mehr als 20 Einheiten erhalten.

4. Klonieren der Multimere von SLPIII.

Plasmid pCQV2 (Queen et al., J. Appl. Mol. Gen., 2:1-10 (1983)) wurde mit der EcoRI- und der BamHI-Restriktionsendonuklease gespalten und ein Fragment mit etwa 900 bp gereinigt. Dieses DNA-Fragment enthält das λ-cl-857-Bakteriophagen-Repressorgen, den eng damit verbundenen rechten Promotor PR und den Beginn des cro-Gens. Plasmid pSY335 (in Ferran et al., J. Bacteriology, 161:556-562 (1985) als pJF751 beschrieben) wurde mit dem EcoRI- und dem BamHI- Restriktionsenzym gespalten und anschließend an das DNA-Fragment von pCQV2 mit etwa 900 bp ligiert. Das aus dieser Konstruktion erhaltene Plasmid pSY751 exprimiert das β-Glactosidase-Gen bei 37ºC und 42ºC, nicht jedoch bei 30ºC.
Bei dieser Vorgangsweise wird das SLPIII-Gen zuerst in eine "Adapter"-Sequenz in einem Zwischenplasmid kloniert und dann in die Expressionssysteme subkloniert. Die Adaptersequenz besitzt die folgenden nützlichen Merkmale: eine einzelne zentrale BanI-REN-Stelle, drei einzelne REN-Stellen auf beiden Seiten von BanI, Informationskodierung zur Proteinspaltung an den Aminosäuren Methionin, Aspartat-Prolin oder Arginin sowie eine geringe Größe. Die BanI-Stelle ist der Insertionspunkt für die SLPIII- Multimere mit BanI-Enden.
Der Adapter wurde mit dem Applied Biosystems 380A-Synthesizer synthetisiert, in M13mp18 kloniert und die DNA-Sequenz verifiziert. Der Adapter wurde dann in einen speziell konstruierten Plasmidvektor subkloniert, dem BanI-REN-Stellen fehlten. Das Empfängerplasmid wurde wie folgt gebildet. Plasmid pJH101 (Ferran et al., 1983) wurde teilweise mit AhaIII-Restriktionsenzym gespalten und wiederum ligiert. Transformanten von E.coli HB101 wurden auf Medium selektiert, das Chloramphenicol (12,5 mg/ml) enthielt. Nach der Restriktionsanalyse mehrerer Isolate wurde ein Plasmid ausgewählt, nämlich pSY325. Dieses Plasmid enthält nur das Chloramphenicolresistenz-Gen und den Replikationsursprung (aus pBR322) von pjhlol. Nach der vollständigen Spaltung mit XhoII wurde pSY325 mit dem gelgereinigten Adapter ligiert. Das Ergebnis war das Adapterplasmid pSY937, dessen neue REN-Stellen verifiziert wurden.
Die SLPIII-Multimere wurden in die BanI-Stelle von pSY937 kloniert. Positive Klone wurden durch Koloniehybridisierung und mit dem unteren Strang von Abschnitt 1 von SLPIII als DNA-Sonde zur Hybridisierung (Sondensequenz in Tabelle 2) identifiziert. Positive Klone wurden durch Gelelektrophorese hinsichtlich der Größe des eingesetzten Multimers charakterisiert. Schließlich wurden die SLPIII-Sequenzen unter Nutzung der REN-Stelle in den flankierenden Adapterbereichen an bestimmte Stellen von Expressionsplasmiden subkloniert.
Das SLPIII-Protein wies die folgende Aminosäurezusammensetzung auf:
(fm) soll das Initiationscodon darstellen.

SLPIII-Expressionsvektor

Plasmid-DNA pSY1086 ist ein pSY937-Derivat mit 19 Wiederholungen von SLPIII (3,5 kb). Diese Plasmid-DNA wurde mit Nrul und Pvull gespalten und die Fragmente durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt. Das gereinigte SLPIII-Multimer wurde dann in das mit PvuII-REN gespaltene Plasmid pSY751 kloniert. Mehrere Klone wurden analysiert und einer (pSY1008) für Expressionsexperimente und zur SLPIII-Reinigung ausgewählt.
Das Ampicillin-Arzneimittelresistenz-Gen von pSY1008 wurde durch den Kanamycin- Marker von pSY1010 (erzeugt durch Spaltung von pSY633 mit DraI und SspI sowie Insertion von Kanr, erhalten durch HincII-Spaltung von pUC4K) ersetzt und das erhaltene Plasmid als psyl 186 bezeichnet. Durch Entfernen des SLPIII-Abschnitts von Plasmid pSY1186 mit BanI wurde ein neues Plasmid, nämlich pSY1262, erzeugt. Dieses Plasmid enthält eine einzelne BanI-Stelle, welche die direkte Ligation von Fragmenten ermöglicht, die BanI-Enden enthalten, die durch Polymerisation von Monomeren erhalten werden. Dieses Plasmid wurde zur Erzeugung von Plasmiden verwendet, die Insertionen für die folgenden Proteine enthalten: SELP1, 2, 3 und SLP4.

Produktion und Reinigung von SLPIII

Zellkultur. E.coli werden im folgenden Medium kultiviert:
Eine über Nacht-Kultur (500 ml - 1 l), die bei 30ºC gezüchtet worden war, diente dazu, 375 l Medium zu beimpfen, das in einem 500 I-Fermenter enthalten war. Die Fermentierbedingungen umfaßten eine Tachometerablesung von 100 U/min, einen Gefäßgegendruck von 5 psi und einen Luftstrom von 170 I/min, um den Gehalt an gelöstem O&sub2; bei über 50% zu halten.
Glucose (1 g/l) und Ampicillin (0,05 g/l) wurden dem Fermentationsgemisch zugegeben, als die Kultur eine OD&sub6;&sub5;&sub0; von 1,0 erreichte, und erneut bei 2,0. Als die Kultur eine OD&sub6;&sub5;&sub0; von 2,0 erreichte, wurde die Temperatur 10 min lang auf 42ºC erhöht und dann für 2 h auf 38ºC gesenkt. Die Kultur wurde anschließend auf 10ºC abgekühlt und Zellen durch Zentrifugieren in einer kontinuierlichen Zentrifuge geerntet und bis zur Verarbeitung auf -70ºC eingefroren. Die Ausbeuten aus zwei getrennten Fermentationen betrugen 7,3 kg und 5,2 kg Naßgewicht Zellen.
Es ist zu beachten, daß auch andere Medien verwendet werden und mit unterschiedlichen Plasmiden verschiedene Selektionsbedingungen auferlegt werden können (d.h. Ersetzen von Ampicillinselektion durch Kanamycin). Diese Bedingungen wurden bei Fermentationen im Labormaßstab angewandt (10 I-Volumina).

Zell-Lyse

Verfahren 1.

Zellen werden aufgetaut und bis zu einer Konzentration von 1 kg Naßgewicht pro 6 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA suspendiert und mittels zweier Durchgänge in einem APV Gaulin-Zelldisruptor bei 8.000 psi aufgebrochen. Während des Lyseverfahrens werden die Zellen mit einem Eisbad kühl gehalten. Das Zell-Lysat wird dann bei 26.000 x g mit einer kontinuierlichen Zentrifuge zentrifugiert, z.B. mit dem TZ-28 Rotor in einer bei 4ºC betriebenen, gekühlten Sorvall RCSB-Zentrifuge. Unter diesen Bedingungen können im Pellet mehr als 90% an produziertem SLPIII festgestellt werden. Der Überstand enthält ein Produkt, das - wie unten beschrieben - mittels NH&sub4;SO&sub4;-Fällung entfernt werden kann. Das Pellet wird mit LiBr - wie unten beschrieben - extrahiert.

Verfahren 2.

Gefrorene Zellen werden aufgetaut und bis zu einer Konzentration von 1 kg Naßgewicht pro 6 1 in 50 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM EDTA und 5 mM PMSF erneut suspendiert, um Protease-Aktivität zu hemmen. Die Zellen werden in diesem Puffer bei Raumtemperatur 0,5 bis 2 Stunden lang gerührt, dann wird Lysozym bis zu einer Konzentration von 1 g/l zugegeben und die Inkubation 20 min lang fortgesetzt. β-Mercaptoethanol wird dann auf 70 mM und das Detergens NP4O bis zu einer Endkonzentration von 1 %innerhalb von 20 min unter stetigem Rühren der Zellsuspension zugegeben. Dann wird MgCl&sub2; auf 50 mM und anschließend DNASE in einer Konzentration von 1 mg/l zugegeben und die inkubation 20 min lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Zell-Lysat wird danach wie in Verfahren 1 bei 26.000 x g in einer kontinuierlichen Zentrifuge zentrifugiert, der Überstand gesammelt und ein zweites Mal bei 26.000 x g durch die kontinuierlichen Zentrifuge geschickt. Der aus diesem zweiten Zentrifugieren erhaltene Überstand enthält < 5% des gesamten SLPIII, doch das vorhandene SLPIII kann - wie unten beschrieben - mit NH&sub4;SO&sub4; gewonnen werden. Die aus dem ersten und zweiten Zentrifugieren bei 26.000 x g erhaltenen Pellets werden kombiniert und mit LiBr extrahiert, wie weiter unten beschrieben.

Verfahren 3.

Bei diesem Verfahren wird ein E.coli-Stamm verwendet, der ein zweites Plasmid enthält, das für das T7-Phagen-Lysozym kodiert. Dieses Plasmid ist mit jenem Plasmid verträglich, das für das SLPIII-Gen und die Arzneimittelresistenz-Determinante kodiert. Der Stamm wird im gleichen Medium und unter den gleichen Bedingungen wie in den ersten beiden Verfahren gezüchtet. Aufgrund der Produktion des T7-Lysozyms innerhalb der Zellen wird jedoch ihre Zellwand geschwächt, und sie können bei Abschluß der Fermentation durch Zugabe von EDTA auf > 100 mM und NP40 bis zu einer Konzentration von 0,5 bis 1,0 Vol.-% leicht lysiert werden. Die Lyse kann auch durch Zugabe von Chloroform (20 ml pro Liter) zur Fermentationsbrühe anstelle von NP40 erzielt werden. Alternativ dazu können Zellen vor der Lyse durch Zentrifugieren gesammelt, bis zu 1 kg Naßgewicht pro 6 1 in Tris-EDTA erneut suspendiert (siehe die ersten beiden Verfahren) und dann durch Zugabe von NP40 oder Chloroform lysiert werden. Nach der Zell-Lyse nahc einem der beiden Verfahren wird das Lysat in einem kontinuierlichen Rotor bei 26.000 x g zentrifugiert, wie in den ersten beiden Verfahren erläutert. Wie bei diesen Verfahren dienen LiBr-Extraktion des Pellets und NH&sub4;SO&sub4;- Fällung des Überstands dazu, das Produkt zu gewinnen.

Reinigung von SLPIII

Das durch Zentrifugieren des Zell-Lysats bei 26.000 x g erhaltene Pellet (siehe oben) wird mit dem gleichen Volumen an 9M LiBr extrahiert. Die Salzlösung wird zugegeben und das Pellet gleichmäßig durch Rühren bei Raumtemperatur (RT) suspendiert. Das Gemisch wird 1 h lang bei RT gerührt, nachdem eine gleichmäßige Suspension erhalten wurde. Das Gemisch wird dann bei 26.000 x g in einem kontinuierlichen Rotor bei 4ºC oder bei RT zentrifugiert, um ein Pellet und eine Überstandfraktion zu bilden. Der Überstand wird aufbewahrt und das Pellet mit dem gleichen Volumen an 9 M LiBr wie oben erneut extrahiert. Nach 1-stündigem Vermischen wird das Gemisch bei 26.000 x g zentrifugiert und der Überstand aus diesem Zentrifugieren mit dem Überstand der ersten LiBr-Extraktion kombiniert und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Etwa 90% des bei 26.000 x g zentrifugierten Zell-Lysat-Pellets wird nach diesem Verfahren mit LiBr extrahiert.
Beim Stehenlassen des LiBr-Extrakts über Nacht bei 4ºC bildete sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren bei 26.000 x g entfernt und verworfen wurde. Der Überstand wurde dann in Dialysebeutel gefüllt und gegen verschiedene Chargen von dH&sub2;O 2 Tage lang dialysiert. Während das LiBr duch Dialyse entfernt wird, fällt das SLPIII-Produkt in den Dialysebeuteln aus. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und zwei- bis dreimal mit dH&sub2;O gewaschen. Das gewaschene Endprodukt wird zentrifugiert und durch Lyophilisierung getrocknet.
Zur Gewinnung von SLPIII aus den 26.000 g-Überstandfraktionen wird NH&sub4;SO&sub4;-Fällung angewandt. Festes NH&sub4;SO&sub4; wird der Probe langsam zugegeben, die auf 4ºC gehalten wird, bis eine Sättigung von 38% erreicht wurde (231 g/l). Das Gemisch wird dann bei 4ºC 2 bis 3 Stunden lang gerührt. Der Überstand wird durch Zentrifugieren in einer kontinuierlichen Zentrifuge gewonnen und vier- bis fünfmal mit dem gleichen Volumen an destilliertem H&sub2;O oder mit 0,5% SDS in H&sub2;O gewaschen. Nach jeder Waschung wird der Niederschlag durch kontinuierliches Zentrifugieren gewonnen. Das Pellet wird mit jeder Waschung immer weißer, da kontaminierendes Protein entfernt wird. SLPIII wird als gewaschenes Pellet gewonnen und kann durch Lyophilisierung getrocknet werden.

Trypsinbehandlungsschritt von SLPIII

SLPIII wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M NaCl-Puffer suspendiert und in ein Wasserbad mit 37ºC eingebracht; mit TPCK behandelte Trypsinlösung wurde in die Suspension eingemischt. Die Trypsin-Endkonzentration betrug 0,1 %. Nach 3 Stunden wurde die Lösung bei 16.000 x g 15 min lang zentrifugiert und das Pellet mit dem halben Volumen an 0,5% SDS zunächst in H&sub2;O und dann mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach jeder Waschung wurde das Pellet durch Zentrifugieren gewonnen. Das Endprodukt wurde erneut in Wasser suspendiert und zur weiteren Analyse auf 4ºC gehalten.
Mit der Trypsinbehandlung wurde SLPIII bis zu einer Reinheit von 99,4% gereinigt.

Physikalische Messungen von SLPIII

Physikalische Messungen der gereinigten seideartigen Proteine wurden mit jenen der Bombyx mon-Seide verglichen, um festzustellen, daß mikrobiologisch produzierte wiederkehrende Aminosäurepolymere die Eigenschaften natürlich vorkommender Polymere präzise imitieren. Die physikalischen Messungen wurden durchgeführt, um das Modell antiparalleler Ketten-Faltblattstruktur für die kristallinen Bereiche von Bombyx mori- Seidefibrom zu bestätigen (Marsh, Corey und Pauling, Biochem. Biophys. Acta (1955), 16; Pauling und Corey, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1953), 39:247). Vorläufige Analysen von Röntgenbeugungsmustern von SLP-Filmen stimmen mit jenen von Fraser, MacRai und Steward (1966) überein (Tabelle 3). Die zirkuläre dichroitische (CD-) und die spektroskopische Fourier-Transformations-Infrarot-(FTLR-)Analyse von SLPIII stimmen überein, was einen hohen Grad an verlängerten β- und β-Drehungskonformationen anbelangt. Vergleiche der aus SLPIII erhaltenen Spektren mit jenen von natürlich vorkommendem Seidefibrom in verschiedenen Lösungsmitteln (lsuka und Young, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1966), 55:1175) zeigen, daß SLPIII in Lösung aus einem Gemisch aus statistischen und hochgradig geordneten Strukturen besteht, wie in Seidefibroinen zu beobachten.
Diese Daten zeigen, daß SLPIII verlängerte β-Stränge enthält, die zum Packen zu hochkristallinen Domänen fähig sind. Die Daten decken auch die Gegenwart deutlicher β- Windungs-(Umkehrwindungs-)Strukturen auf. Eine Computeranalyse der Aminosäuresequenz von SLPIII unter Verwendung eines Algorithmus zur Sekundärstruktur-Vorhersage (entwickelt von Chou und Fasman (1974), siehe weiter unten) zeigt, daß die AGYG- Sequenz eine Neigung zur β-Windung besitzt. Tabelle 3
Quelle: Fraser et al., J. Mol. Biol. (1966), 19:580.

Beispiel 3

FCP-SLPIII-Konstruktion

Konstruktion

Das SLPIII-Polymer (siehe oben und auch Anmeldung Nr.114.618, eingereicht am 29. Oktober 1987, PCT/US/87/02822) wurde aus folgenden Gründen ausgewählt: aufgrund seiner vorhergesagten Struktur, die die Herstellung nützlicher Produkte ermöglicht; seiner guten Struktureigenschaften, die sich für eine Vielzahl von Verwendungszwecken eignen; seiner β-Windungsstrukturen zwischen interaktiven Strängen; und der Möglichkeit der Substitution der Drehungssequenzen durch andere Sequenzen. Die Fibronectin-Zellbindedomäne, Aminosäuren 1405-1512, besitzt eine starke Windungsneigung, wobei das Tripeptid RGD für die Zellbindung sorgt und - laut Prognose - in einer hydrophilen Schleife zwischen benachbarten β-Strängen vorhanden ist. Eine aus 10 Aminosäuren bestehende Sequenz, die diese vorgeschlagene Schleifenstruktur überspannt (als Fibronectin-Zellbindesequenz oder FCB-Sequenz bezeichnet), wurde ausgewählt, um den funktionellen Block der in das SLPIII-Rückgrat einzusetzenden Aminosäuren zu bilden. Die insertionsstelle innerhalb des SLPIII- Rückgrats wurde so ausgewählt, daß sie der Aminosäuresequenz GAAGY entspricht, die - laut Prognose - ebenfalls eine Windungsstruktur bietet (Chou und Fassman (1974), Biochemistry, 13:222-244). Die Gestaltung ermöglicht die Konservierung der FCB- Struktur, während die SLPIII-(GAGAGS)&sub9;-β-Strang-Kristallpackungsdomänen nur minimal beeinträchtigt werden.

DNA-Synthese und Genkonstruktion

Das SLPIII-Genmonomer enthält eine PstI-Restriktionsendonukleasenstelle innerhalb der Sequenz, die für die vorgeschlagene Drehungsstruktur GAGY kodiert. Diese Stelle diente dazu, jene synthetische DNA zu insertieren, die für die 10 Aminosäuren der FCB- Sequenz kodiert. Zwei komplementäre, die FCB-Stelle umfassende DNA-Stränge (Länge: 36 Basen) wurden synthetisiert und bestanden aus der nachstehend dargestellten Sequenz:
Diese Oligonukleotide wurden nach der Vorgangsweise aus Beispiel 1 gereinigt und in die PstI-Stelle von pSY1304 kloniert. pSY1304 enthält ein einzelnes Monomer-Genfragment von SLPIII. psyl 304-DNA wurde mit PstI gespalten und mit einem Gemisch der FCB-Oligonukleotide 1 igiert. Die Ligationsprodukte wurden in E.coli-Zellen transformiert. Das Plasmid enthaltende Kolonien wurden auf Bakterienkulturplatten selektiert, die das Antibiotikum Chloramphenicol enthielten. Einzelne Kolonien wurden gezüchtet, Plasmid-DNA gereinigt sowie durch Restriktionsspaltung mit Nhel auf die Gegenwart der FCB-Oligonukleotidsequenz analysiert. Plasmide, die diese Restriktionsstelle enthielten, wurden DNA-sequenziert, wobei sich zwei Kandidaten als korrekt herausstellten. Die partielle Nukleotidsequenz eines davon (pSY1325) und die davon kodierte Aminosäuresequenz sind wie folgt: Figur 3
Das FCB-SLP-Monomer-Genfragment wurde aus psyl 325 durch Spaltung mit BanI, Agarosegel-Elektrophorese und NACS-Reinigung (Beispiel 1, Nr.11) gereinigt. Das Monomergenfragment wurde selbstligiert und in pSY937 kloniert, das mit BanI gespalten worden war. Die Produkte dieser Ligation wurden in E.coli transformiert und hinsichtlich des Wachstums auf Chloramphenicol ausgewählt. Plasmid-DNA aus einzelnen Kolonien wurde auf Insertionen analysiert, die mehrere FCB-SLP-Monomerfragmente enthielten; dies erfolgte durch Spaltung mit Nrul und EcoRV sowie Elektrophorese auf Agarosegelen. Ein Klon wurde identifiziert, der zwei Insertionen enthielt, eine mit etwa 21, kb und die andere mit etwa 2,8 kb. Beide Insertionen wurden jeweils kloniert und in den Expressionsvektor pSY751 übertragen. Plasmid pSY1325 wurde mit NruI und PvuII gespalten und die Insertionsbanden mit 2,1 und 2,8 kb gereinigt. Diese DNA- Fragmente wurden mit pSY751 ligiert, das mit Pvull gespalten worden war. Die Produkte dieser Reaktion wurden in E.coli transformiert und hinsichtlich des Wachstums auf dem Antibiotikum Ampicillin selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Kolonien wurde durch Restriktionsspaltung auf die Gegenwart des FCB-SLP-Polymergens untersucht. Zwei Klone wurden identifiziert (pSY1520 und 1521), die die Insertionen mit 2,1 bzw. 2,8 kb enthielten.

Produktreinigung

E.coli-Zellen, die pSY1520 und pSY1521 enthielten, wurden bei 30ºC in LB-Medium mit 50 µg/ml Ampicillin bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,7 gezüchtet. Die Produktion der FCB- SLP-Polymerproteine wurde durch Erhöhen der Kulturtemperatur auf 42ºC über 1,5 h herbeigeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und in Probenpuffer, der Natri umdodecylsulfat (SDS) und (3-Mercaptoethanol enthielt, durch 5-minütiges Erhitzen auf 100ºC lysiert. Proben dieser Lysate, die 5 x 10&sup8; Zellen entsprachen, wurden auf ein 8%-iges, SDS-hältiges Polyacrylamidgel aufgebracht, Elektrophorese unterzogen und durch Elektroblotting auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Filter wurden entweder mit Anti-SLP- oder Anti-FCB-Peptid-Antikörper inkubiert. Spezifische Immunreaktivität mit dem Anti-SLP-Antikörper wurde bei einer Proteinbande mit etwa 75 kD in Lysaten von pSY1520, 95 kD in Lysaten von pSY1521 und 120 kD in Lysaten des SLPIII- Klons pSY1186 beobachtet. Die Reaktivität mit dem Anti-FCB-Antikörper wurde nur bei den beiden FCB-SLP-Polymerbanden beobachtet.
pSY1521-hältiges E.coli wurde im 1 l Maßstab unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Chargen-Verfahrensbedingungen fermentiert. Zellen mit einem Naßgewicht von 25 g wurdendurch Zentrifugieren geerntet und durch French-Pressen mit 15.000 psi aufgebrochen. Das Zell-Lysat wurde 20 min lang bei 16.000 x g zentrifugiert, wodurch eine Pelletfraktion mit > 90% des FCB-SLP-Proteins (immunologisch bestimmt) erhalten wurde. Das Pellet wurde mehrmals mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, gewaschen und dann mit 5 M LiBr extrahiert. Die Überstandsphase dieser Extraktion wurde gegen entionisiertes Wasser dialysiert, was zur Bildung eines Niederschlags führte, der durch Zentrifugieren gesammelt wurde. Der Niederschlag wurde mit 3 M LiBr erneut extrahiert, und die gelösten Proteine wurden selektiv durch vierfache Verdünnung mit destilliertem Wasser gefällt. Der verbleibende Überstand wurde gegen 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM PMSF dialysiert. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in entionisiertem Wasser erneut suspendiert und auf die Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die Zusammensetzung dieser halbgereinigten Fraktion weist etwa 90% FCB-SLP auf, was anhand des Zusammensetzungsanteils der in diesem Polymer vorhandenen Aminosäuren ermittelt wurde. Das Verhältnis dieser Aminosäuren stimmte gut mit jenem, das anhand der DNA-Sequenz des FCB-SLP-Polymergens vorhergesagt wurde, überein.

Assay auf biologische Aktivität

Um zu bestimmen, ob das FCB-SLP-Polymer Zellbindungsaktivität aufwies, wurde halbgereinigtes Protein auf N itrocellulosefilternimmobilisiert und mit Säugetiergewebe- Kulturzellen inkubiert. Lysatproteine aus E.coli-Zellen, die pSY1520, pSY1521 oder psyl 186 (das für SLPIII kodierende Plasmid) enthielten, wurden SDS-PAGE unterzogen und durch Elektroblotting auf Nitrocellulosefilter übertragen. Diese Filter wurden mittels einer Modifikation des Verfahrens von Hayman et al. (1982), so., auf ihre Fähigkeit getestet, die Zellbindung zu fördern. Die Filter wurden in PBS (10 mM Na-Phosphat (pH 7,4), 1 50 mM NaCl) unter leichtem Rühren mehrmals gewaschen und 1 h lang in PBS eingeweicht, die 5%Kondensmilch enthielt. Die Filter wurden entweder mit 5% Kondensmilch in Anti-SLP- oder Anti-FCB-Serum (1:100-Verdünnung des Serums) enthaltender PBS oder mit 5% Kondensmilch in PBS alleine 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit Zellen inkubiert. Die Zellen wurden durch erneute Suspension subkonfluenter Monoschichten in 0,1% Trypsinlösung hergestellt. Die Zellen wurden bei 0ºC 30 min lang in DME-Medium inkubiert, das 10% Rinderfötenserum enthielt. Die Zellen wurden zentrifugiert (außer die H9-Lymphozyten, die absetzen gelassen wurden), in PBS gewaschen und schließlich in DME- Medium ohne Serum in einer Dichte von 2,5 x 10&sup6; Zellen/ml erneut suspendiert. Die Filter wurden mit den Zellsuspensionen in flachen Kunststoffschalen überschichtet und bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator 1 h lang inkubiert. Die Filter wurden zweimal in PBS gewaschen, um ungebundene Zellen zu entfernen, und in 3% Formaldehyd fixiert. Die Filter wurden mit Amido Black in 45% Methanol, 10% Essigsäure, 45%Wasser 3 min lang gefärbt und in 90% Methanol, 2% Essigsäure, 8% Wasser entfärbt.
Durch visuelle Beobachtungen wurde ermittelt, daß der mit Vero-Zellen (Nierenepithelzellen afrikanischer Meerkatzen) inkubierte Filter stark gefärbte Bereiche enthielt. Diese Bereiche entsprachen den Positionen der FCB-SLP-Proteinbanden, was anhand der Reaktivität auf parallele Filter mit Anti-SLP- und Anti-FCB-Antikörper bestimmt wurde. Die mikroskopische Prüfung dieser Bereiche der Filter zeigte, daß die starke Färbung auf Zellbindung zurückzuführen war. Über den Hintergrund hinaus waren keine Zellen an einen anderen Bereich des Filters gebunden, einschließlich anderer E.coli-Lysat-Proteinbanden. In jenem Bereich, der der SLPIII-Proteinbande entsprach, waren keine Zellen an das Filter gebunden. Erwartungsgemäß wurde beim Inkubieren mit H9-Lymphozyten keine spezifische Zellbindung an das Filter beobachtet.
Um die Auswirkungen der Proteinkonzentration und verschiedener Vorbehandlungen von Filtern und Zellen mit spezifischen Antikörpern auf die Zellbindung zu bestimmen, wurde ein Dot-Blot-Zellbindeassay entwickelt. Der Assay erfolgte wie oben, außer daß halbgereinigtes FCB-SLP- und SLPIII-Protein bekannter Konzentration unter Verwendung eines Dot-Blot-Verteilers von Schleicher and Schuell direkt auf Nitrocellulose-Filterdots -aufgebracht wurde. Jede Probe wurde so aufgebracht, daß der erste Dot 10 µg Protein enthielt und die nachfolgenden Dots Reihenverdünnungen auf jeweils das Doppelte dieser Probe enthielten. Sowohl das 75 kD- als auch das 95 kD-FCB-SLP-Protein von pSY1520 bzw. 1521 förderten in niedrigen Konzentrationen die Vero-Zellenbindung. Die Mindestmenge des 75 kD-FCB-SLP-Proteins, die zur Förderung der Zellbindung erforderlich war, waren 0,05 µg/cm². Beim 95 kD-FCB-SLP-Protein betrug das Minimum 0,2 µg/cm². Selbst bei 12,5 µg/cm² waren nur wenige Zellen an den SLPIII-hältigen Dots gebunden. Die Zellbindung des FCB-SLP-Proteins wurde durch Vorinkubieren des Filters mit Anti-FCB- oder Anti-SLP-Antikörper gehemmt. Die Zellbindung wurde durch Vorinkubation der Zellen mit FCB-Peptid in einer Konzentration von 300 µg/ml gehemmt, aber nicht eliminiert.
Die Einführung der 10 Aminosäuren von FCB in die SLPIII-Monomersequenz erzeugt ein Proteinpolymer, dessen Reinigungs- und Löslichkeitseigenschaften sich nicht wesentlich von jenen des SLPIII-Proteinpolymers unterscheiden, während die zusätzliche Eigenschaft der Förderung der Zellbindung hervorgerufen wird. Die vorliegenden Proteinpolymere können entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen oder Proteinpolymeren, synthetischen oder natürlichen Polymeren zu Fasern und Filmen formuliert werden, welche die Zellbindung fördern. Die biologische Aktivität von FCB-SLP ist gegenüber Denaturierung chemisch resistent. Zellbindung tritt in den FCB-SLP-Proteinen nach der Behandlung mit hohen Detergenskonzentrationen bei 100ºC sowie mit chaotropen Denaturierungsmitteln auf. Diese Stabilität erleichtert die Sterilisationsverfahren, die bei der Herstellung bioaktiver Materialien zur Anwendung kommen. Festträger-Zellbindungsmatrizen zur Steigerung des Wachstums und Differenzierung von Zellen und Gewebekulturen sind eine direkte Anwendung solcher Materialien. Die vorliegenden Polymere können leicht auf anderen Materialien oder Substraten abgelagert werden, um eine Zellbindeoberfläche zu schaffen. Zellbindungspolymere in verschiedenen Formen, z.B. Fasern, Membranen, Filmen usw., können in Bioreaktoren verwendet werden, um produzierende Zellen in einem leicht mischbaren flüssigen Wachstumsmedium zu suspendieren, wobei der Kontakt mit Nährstoffen erhöht, die Zellschädigungen aufgrund von kräftigem Rühren jedoch verringert werden. Das vorliegende Material kann zu Stoffen, Filmen oder Membranen verarbeitet oder auf diese aufgeschichtet werden sowie als Wundverband eingesetzt werden, der die Heilung aufgrund der Bindung von im Heilungsprozeß beteiligten Zellen beschleunigt. Außerdem können die vorliegenden Proteine in Wände von Prothesevorrichtungen formuliert oder darauf abgelagert werden, welche Vorrichtungen als in vivo-Ersatz von Blutgefäßen, Knochengelenken, Sehnen, Bändern oder dergleichen dienen, um die in vitround/oder in vivo-Kolonisierung der Vorrichtung zu erhöhen, wodurch ihre funktionellen Eigenschaften verbessert werden. Weiters finden die vorliegenden Proteine im Auge, als Implantate, Träger, Beschichtungen oder dergleichen Anwendung.
SLP3-Cys (SLP-C)

Konstruktion eines chemisch aktiven vernetzbaren Polymers

Viele in einer Proteinkette enthaltene Aminosäuren können unter Verwendung spezifischer organischer und anorganischer Reagentien chemisch modifiziert werden. Einige dieser Aminosäuren sind Lysin (K), Arginin (R), Glutamat (E), Aspartat (D), Cystein (C), Serin (5), Threonin (T), Histidin (H) und Tyrosin (Y). Um ein Proteinpolymer zu bilden, an dem zum Zweck der Addition zusätzlicher Moleküle an spezifischen Stellen an die Kette bestimmte Reaktionen durchgeführt werden können, oder um Ketten der gleichen oder unterschiedlicher Polymere miteinander zu verbinden oder Ketten mit einer geeigneten Oberfläche zu verbinden, wurde SLP-C konstruiert. Das seidenartige Monomer von SLP3 mit 59 Aminosäuren wurde modifiziert, um die Aminosäuresequenz GAGCGDPGKGCCVA zu enthalten. Merkmale dieser Einschluß-Sequenz sind: 1. Das GAGC- und das GCCV-Tetrapeptid passen sich an die B-Strangstruktur der flankierenden seidenartigen Aminosäuren an und enthalten Cysteine, deren Sulfhydryle unter Oxidation reaktiv und kovalent vernetzbar sind; 2. DPGK paßt sich nicht an die B-Strangstruktur an, wodurch zwangsweise eine nicht ausgerichtete Struktur innerhalb der seidenartigen Stränge geschaffen wird. Letztere Sequenz besitzt den Vorteil, daß sie zwei zusätzliche chemisch modifizierbare Reste bietet, nämlich Aspartat und Lysin, und das Dipeptid DP enthält, das zu spezifischer chemischer Peptidspaltung neigt.

Polymerkonstruktion

Zwei Oligonukleotidstränge wurden nach den oben beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt.
Die beiden Oligonukleotidstränge wurden anneliert und mit der DNA von Plasmid pSY1304 (SLP3-Monomer in pSY937) ligiert, das mit PstI-REN gespalten worden war.
Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in E.coli-Stamm HB1O1 transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten wurde gereinigt und mit BanI gespalten; Klone, die Insertionen der korrekten Größe enthielten, wurden zur Bestimmung der Ausrichtung mit den RENs PstI und EcoV gespalten. Plasmid-DNA aus korrekten Klonen wurde sequenziert. Plasmid pPT0103 (in Tabelle 4 dargestellt) enthielt die gewünschte SLP-C- Monomersequenz, wobei die Oligonukleotide (1) und (2) unten fett und unterstrichen dargestellt sind. Tabelle 4
Plasmid-DNA aus pPT0103 wurde mit BanI-REN gespalten, und die Spaltfragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Das SLP-C-Genfragment mit 225 bp wurde herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt (siehe "Verfahren"). Das gereinigte Fragment wurde mit Plasmid pSY1262 ligiert, das mit der REN BanI gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Die Transformanten wurden nach Kanamycisn resistenz ausgewählt. Plasmid- DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf Größenzunahme aufgrund von SLP-C-DNA-Mehrfachinsertionen untersucht. Es wurden mehrere Klone erhalten, deren Größe von etwa 1,0 kbp bis 5,4 kbp reichte. 6 Klone (pPT0105 TpPT0110) wurden ausgwählt, um zur Expression von SLP-C verwendet zu werden.

Expression

Eine Übernachtkultur, die bei 30ºC gezüchtet worden war, diente zum Beimpfen von 50 ml Medium in einem 250 ml-Kolben. Kanamycin wurde in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugegeben und die Kultur unter Rühren (200 U/min) bei 30ºC inkubiert. Als die Kultur eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,8 erreichte, wurden 40 ml in einen neuen, auf 42ºC vorgewärmten Kolben übergeführt und etwa 2 h lang bei dieser Temperatur inkubiert.
Die Kulturen (30ºC und 42ºC) wurden auf Eis abgekühlt und die OD&sub6;&sub0;&sub0; ermittelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in Aliquoten von 1,0 OD&sub6;&sub0;&sub0; aufgetrennt und dazu verwendet, Dot-Blots und Western-Analyse unter Verwendung von SLP-Antikörpern (siehe "Verfahren") durchzuführen. Zur Reinigung und Aminosäureanalyse wurden größere Kulturen verwendet.

Analyse

E.coli-Stamm HB101, der Plasmid pPT0105 enthielt, wurde bei 30ºC bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,7 gezüchtet und dann 2,0 h lang auf 42ºC erwärmt, nachdem 40 µCi pro ml ³&sup5;S-Cystein zugegeben wurden. Die von diesen Zellen erzeugten Proteine wurden zum Nachweis von ³&sup5;S-Cystein und Reaktivität gegenüber SLP-Antikörpern mittels SDS- PAGE untersucht (siehe "Verfahren"). In beiden Analysen wurde eine stark reaktive Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 150 kD beobachtet.

SLP3-Laminin-Zellbindung (SLP-L)

Konstruktion eines biologisch aktiven Polymers zur Bindung von Nervenzellen

Die Aminosäuresequenz von menschlichem Laminin B1, einer Proteinkomponente einiger extrazellulärer Grundmembranen, an die sich Zellen binden und vermehren, enthält ein Pentapeptid, YIGSR, das offenbar an der Bereitstellung einer Rezeptor-Bindungsstelle für Nervenzellen beteiligt ist. Es wurden zwei seidenartige Polymere konstruiert, wovon eines eine aus 12 Aminosäuren bestehende Sequenz, das andere eine aus 14 Aminosäuren bestehende Sequenz enthält, die jeweils das Pentapeptid umfaßt,. Im ersten als SLP-L1 bezeichneten Polymer wurde das aus 59 Aminosäuren bestehende Monomer von SLP3 nahe seinem Tyrosinrest durch Einfügung der Sequenz YCEPGYIGSRCD unterbrochen. In SLP-L2 war die Einschlußsequenz LCVSEPGYIGSRCD. Da sie sich nicht an die B-Strangstruktur anpassen, sollten beide Sequenzen beim Einbetten in die B-Strangstruktur der seidenartigen Stränge nicht-ausgerichtete Schleifen bilden. SLP- L1 und SLP-L2 sind so konstruiert, daß sie ein synthetisches Substrat für die Bindung von Nervenzellen - sowohl in Kultur als auch in vivo - bereitstellen. Die Formulierung dieser Polymere zu Nervenbahnen zur Regenerierung verletzter Nerven ist eine mögliche Anwendung.

Konstruktion von SLP-L1

Zwei Oligonukleotidstränge wurden gemäß den oben beschriebenen Verfahren synthetisiert und gereinigt.
Diese Oligonukleotidstränge wurden anneliert und mit Plasmid pSY1304 (siehe WO 88/03533, S.65) ligiert, das mit PstI-REN gespalten worden war.
Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten wurde gereinigt und mit BanI gespalten; Klone, die Insertionen korrekter Größe besaßen, wurden mit den RENs PstI und EcoV gespalten, um die korrekte Ausrichtung zu bestimmen. Plasmid-DNA aus korrekten Klonen wurde sequenziert. Plasmid pT0120 (siehe Tabelle 5) enthielt die gewünschte SLP-L1-Monomersequenz, wobei die Oligonukleotide (i) und (ii) unten fett und unterstrichen dargestellt sind. Tabelle 5
Plasmid-DNA aus pPT0120 wurde mit BanI-REN gespalten, und die Spaltfragmente wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Das SLP-L1-Genfragment mit 216 bp wurde herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt (siehe "Verfahren"). Das gereinigte Fragment wurde mit Plasmid pSY1262 ligiert, das mit der REN BanI gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligationsreaktion wurde in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Die Transformanten wurden auf Kanamycinresistenz ausgewählt. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wurde gereinigt und auf Größenzunahme aufgrund von SLP-L1-DNA- Mehrfachinsertion untersucht. Es wurden mehrere Klone erhalten, deren Größe von 1 kbp bis 4 kbp reichte. Ein Klon, pPT0123, mit einer Insertion von etwa 3,0 kbp wurde zur Expression und Proteinanalyse ausgewählt.

Konstruktion von SLP-L2

Zwei zusätzliche Oligonukleotidstränge wurden - wie unter "Verfahren" beschrieben - synthetisiert.
iii) 5'- CTGTGTGTTAGCGAACCC -3'
iv) 3'- ACGTGACACACAATCGCTTGGG -5'
Diese Oligonukleotidstränge wurden anneliert und mit Plasmid pPT0120 ligiert, das mit den RENs PstI und SmaI gespalten worden war. Plasmid-DNA aus Transformantenkolonien, die gegenüber Chloramphenicol resistent waren, wurde gereinigt. Ein Plasmid, pPT0121 (siehe Tabelle 6), das nicht mit der REN PstI spaltbar war, wurde sequenziert und erwies sich als das gewünschte SLP-L2-Monomergen. Die Oligonukleotidstränge (iii) und (iv) sind unten fett und unterstrichen dargestellt. Tabelle 6
Plasmid-DNA aus pPT0121 wird mit BanI-REN gespalten und die Spaltfragmente mittels Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt. Das SLP-L2-Genfragment mit 222 bp wird herausgeschnitten und mittels NACS-Säule gereinigt (siehe "Verfahren"). Das gereinigte Fragment wird mit Plasmid pSY1262 ligiert, das mit der REN BanI gespalten worden war. Das Produkt dieser Ligationsreaktion wird in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Transformanten werden auf Kanamycinresistenz selektiert. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wird gereinigt und auf Größenzunahme aufgrund von SLP-L2-DNA- Mehrfachinsertionen untersucht. Es werden mehrere Klone erhalten, deren Größe von 1 bis 4 kbp reicht.

Expression von SLP-1

Eine Übernachtkultur, die bei 30ºC gezüchtet worden war, diente zum Beimpfen von 50 ml Medium, das in einem 250 ml-Kolben enthalten war. Kanamycin wurde in einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugegeben und die Kultur unter Rühren (200 U/min) bei 30ºC inkubiert. Als die Kultur eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,8 erreichte, wurden 40 ml in einen neuen, auf 42ºC vorgewärmten Kolben übergeführt und etwa 2 h lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Die Kulturen (30ºC und 42ºC) wurden auf Eis abgekühlt und die OD&sub6;&sub0;&sub0; ermittelt. Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 1,0 OD&sub6;&sub0;&sub0; Aliquoten aufgeteilt und dazu verwendet, Dot-Blot und Western-Analyse mittels SLP-Antikörper (siehe "Verfahren") durchzuführen. Zur Reinigung und Aminosäureanalyse wurden größere Kulturen eingesetzt. Protein

CLP und CLP-CB

Konstruktion eines kollagenartigen Polymers mit thermoreversiblem Geliercharakter

Chemisch hydrolysiertes natürliches Kollagen kann denaturiert und renaturiert werden, indem es erhitzt und abgekühlt wird, um Gelatine zu bilden, die u.a. für fotografische und medizinische Anwendungen zum Einsatz kommt. Die Ketteneigenschaft von Kollagen, die für dieses Phänomen verantwortlich ist, ist seine Fähigkeit, spontan kettenübergreifende Aggregate mit einer als Tripelhelix bezeichneten Struktur zu bilden. Die Helices werden durch schwache Wechselwirkungen zwischen Ketten stabilisiert, die sich aus der unmittelbaren Nähe des Peptidrückgrats an jedem dritten, von Glycin besetzten Rest sowie an Knickstellen ergeben, die durch Prolin und Hydroxyprolin an den beiden Positionen zwischen den Glycinen erzeugt werden. Die Geometrie der drei geknickten Ketten ermöglicht Wasserstoffbindungen innerhalb der Tripelhelix. Die Struktur ist lose und für Wechselwirkungen mit Wasser, kleinen organischen und anorganischen Molekülen, anderen Proteinen und Zellen gut zugänglich. Obwohl Kollagen aus vielen verschiedenen Aminosäuresequenzen besteht, existiert eines der strukturell stabileren Segmente an den Amino- und terminalen Enden der bearbeiteten Kollagenketten. Diese Enden bestehen fast ausschließlich aus der wiederkehrenden Tripeptidsequenz GPP (das zweite P ist oft hydroxyliert). Das kollagenartige Polymer CLP wurde vor allem aus wiederkehrenden GPP-Tripeptiden konstruiert (8 innerhalb jedes Monomersegments). Andere Tripeptide waren enthalten, um die Gesamtrepetitivität des Gens zu verringern und den Einsatz zusätzlicher Codons zu ermöglichen, die zur besseren Manipulation der DNA eingesetzt werden könnten. Dabei handelte es sich um GAP (zweimal), GPA, GPV und GSP. Alle diese Tripletts kommen im natürlichen Kollagen vor, wenn auch nie in der Sequenz und im Zusammenhang mit CLP. Die Eigenschaften von CLP wurden so gewählt, daß es ein Proteinpolymer liefert, das bei hohen Temperaturen thermoreversible Gelierung erfährt und nicht-immunogen ist. Die hohe Stabilität der Helices sollte den aus CLP formulierten Fasern oder Membranen hohe Zugfestigkeit verleihen. Diese Ketteneigenschaften sollten die Bildung von Hydrogelkolbiden in wäßrigen Lösungen ermöglichen, die dann beim Aufbringen auf harte Substraten als weiche Überzüge dienen sollten. Aufgrund der einfachen Sequenz von CLP sollte sein optisches Absorptionsvermögen bei allen Wellenlängen bis zu 220 nm minimal sein.

Konstruktion eines weichen Überzugsmaterials mit Zellbindungsfunktion

Die vielseitigen Formulierungseigenschaften kollagenartiger Polymere macht sie zu idealen Biomaterialien für implantierbare Vorrichtungen. CLP könnte entweder als Beschichtung auf der Oberfläche von Prothesen oder als Strukturkomponente der Vorrichtung selbst die Gewebsintegration fördern, indem die Blut- und Kreislaufwechselwirkung verbessert wird. Letztere Funktion wird im natürlichen Kollagen durch eine bestimmte Aminosäuresequenz vermittelt, die als Ligand für einen Zelirezeptor dient. Um ein CLP-Polymer mit Zellbindungsaktivität zu bilden, wurde die Sequenz GLPGPKGDRGDAGPKGADGSP in die CLP-Monomersequenz eingebaut. Im Gegensatz zu den hydrophoben, kollagenartigen, flankierenden GPP-Sequenzen sollte dieser Block aus 21 stark geladenen, hydrophilen Aminosäuren eine destabilisierte, flexible Helix-Region bilden, die für die Wechselwirkung mit Zellen zugänglich ist. Die Förderung der Epithelbildung auf der Oberfläche einer implantierten Vorrichtung verbessert die Verträglichkeits- und Abstoßungseigenschaften, wodurch sowohl die Lebensdauer als auch die Sicherheit gesteigert werden. Die vorliegenden Zusammensetzungen können als die Gefäßneubildung unterstützende Wundverbände, für Augenanwendungen, als Matrizen für künstliche Organe und dergleichen verwendet werden.

Konstruktion von CLP-Monomer

Das synthetische CLP-(kollagenartige Protein-)Gen wurde aus kleineren Teilen zusammengesetzt. Zunächst wurden drei doppelstrangige DNA-Abschnitte mit einer Länge im Bereich von 40 bis 60 bp chemisch synthetisiert.
Die Abschnitte A und C (die Sequenz von Abschnitt C nach dem Pfeil kodiert nicht für CLP, ist aber eine Modifikation der Mehrfachklonierungsstelle des Akzeptorplasmids) wurden getrennt in Plasmid pUC19 kloniert, das mit der geeigneten REN gespalten worden war. Die DNA-Sequenz wurde verifiziert und zwei Plasmide (pPT011 und pPT0112) selektiert, welche die korrekte Sequenz trugen. Abschnitt B wurde in pPT0111 ligiert, das mit den RENs BanII und SmaI gespalten worden war. Plasmid pPT0113 wurde sequenz iert und erwies sich als korrekt.
Die Plasmide pPT0112 und pPT0113 wurden mit den geeigneten RENs gespalten, um Abschnitt C bzw. die Abschnitte A + B freizusetzen. Nach der Reinigung wurden diese DNA-Fragmente in pSY937 ligiert, das zuvor mit den RENs BanI und EcoRV gespalten worden war. Das Produkt der Ligationsreaktion wurde in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten wurde gereinigt und mit BanI gespalten; Klone mit Insertionen der korrekten Größe wurden sequenziert. Plasmid pPT0116 enthielt die gewünschte Sequenz, die für die Abschnitte A + B + C dargestellt ist (siehe Tabelle 7). Tabelle 7

Konstruktion von CLP-CB-Monomer

Zwei Oligonukleotidstränge wurden synthetisiert, wie oben unter der Überschrift "Verfahren" beschrieben.
Die zwei Oligonukelotidstränge wurden mit der DNA von Plasmid pPT0116 (CLP- Monomer in pSY937, mit AvaI-REN gespalten) anneliert und ligiert.
Die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden in E.coli-Stamm HB101 transformiert. Plasmid-DNA aus Transformanten wurde gereinigt und mit BanI gespalten; Klone mit Insertionen der korrekten Größe wurden mit den RENs PstI und BglI zur Bestimmung der Ausrichtung gespalten. Plasmid-DNA aus korrekten Klonen wurde sequenziert. Plasmid pPT0117 (in Tabelle 8 gezeigt) enthielt die gewünschte CLP-CB-Monomersequenz, wobei die Oligonukleotide (i) und (ii) unten fett und unterstrichen dargestellt sind. Tabelle 8

CLP- und CLP-CB-Expression

Eine Übernachtkultur, die bei 30ºC gezüchtet worden war, diente zum Beimpfen von 50 ml Medium, das in einem 250 ml-Kolben enthalten war. Kanamycin wurde in einer Endkonzentration von 50 µg pro ml zugegeben und die Kultur unter Rühren (200 U/min) bei 30ºC inkubiert. Als die Kultur eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,8 erreichte, wurden 40 ml in einen neuen, auf 42ºC erwärmten Kolben übergeführt und etwa 2 h lang bei der gleichen Temperatur inkubiert. Die Kulturen (30ºC und 42ºC) wurden auf Eis abgekühlt und die OD&sub6;&sub0;&sub0; ermittelt. Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, in 1,0 OD&sub6;&sub0; Aliquoten aufgeteilt und dazu eingesetzt, Dot-Blot und Western-Analyse unter Verwendung von CLP-Antiseren (siehe "Verfahren") durchzuführen. Zur Reinigung und Aminosäureanalyse wurden größere Kulturen eingesetzt. Protein Protein
Unter Befolgung der oben beschriebenen Vorgangsweisen werden weitere Polymere hergestellt. Diese Polymere beeinflussen die Zellfunktion, da sie Ligandensequenzen enthalten, die mit Zelloberflächenrezeptoren in Wechselwirkung treten. Diese Polymere werden durch Einsetzen von Oligonukleotiden, welche für die die Nervenzellenbindung unterstützende Sequenz von menschlichem Laminin B1, d.h. YIGSR, kodieren, in die Proteinpolymersequenz von ELP 1 an der SmaI-Stelle hergestellt. Außerdem wird ein Polymer erzeugt, indem Oligonukleotide, die für die T-Zellenrezeptor-Bindesequenzen von menschlichem MHC-HLA-A2 der Klasse 1 kodieren, nämlich PEYDGERKVKAHSQTHRVDTLRY (Reste 143-171) und TRKWAAHVEQLRAYEGTVEWRY (Reste 143-171), an der die PstI-Stelle enthaltenen Genposition alternierend in das SLPIII-Polymer insertiert werden.
Diese Polymere weisen Aktivitäten von chemischer Reaktivität und Vernetzung mit sich selbst oder mit anderen Polymeren oder Materialien auf. Diese Polymere werden hergestellt, indem Oligonukleotide, die für die Sequenzen DPGK, NPGC oder RPGE kodieren, in die PstI-Stelle des synthetischen Polymergens SLPIII eingesetzt werden. Andere Beispiele für chemisch reaktive Polymere werden durch Insertion von Oligonukleotiden, die für die Sequenzen GAGD, GAGC oder GAGK kodieren, in die BanII- Stelle des synthetischen Polymergens SLPIV oder durch Insertion von Oligonukleotiden, die für die Sequenzen GEGVP, GCGVP oder GKGVP kodieren, in die Smal-Stelle des synthetischen Polymergens ELP I gebildet. Die synthetischen Polymere SLPIV und ELP I werden in der oben angeführten PCT-Anmeldung beschrieben.
Zusätzliche Zusammensetzungen werden nach den obigen Vorgangsweisen hergestellt. Zu diesen Zusammensetzungen zählen: HOMOPOLYMERE CO-POLYMERE FUNKTIONELLE POLYMERE FUNKTIONELLE POLYMERE (CLP) FUNKTIONELLE POLYMERE (ADHÄSIV)
Aus den obigen Ergebnissen ist offenkundig, daß ein ein wirkungsvolles Verfahren zur Herstellung von Polymeren mit guten Struktureigenschaften sowie eine neue Vorgangsweise bereitgestellt wird, wonach spezifische Aminosäuresequenzen so gebildet werden können, daß sie für die Umgebung leicht zugänglich sind, während auch strukturelle Möglichkeiten geschaffen werden, wie z.B. die Bildung von Fasern, Filmen und Membranen. Das Polymer besteht somit aus Strängen, die miteinander in Wechselwirkung stehen, um für eine Strukturcharakteristik zu sorgen, wie z.B. Bildung von Erzeugnissen mit guten Zugfestigkeits-(d.h. mechanischen) Eigenschaften, zum Tragen kommt, während gleichzeitig Aminosäuresequenzen bereitgestellt werden, die für eine Vielzahl biologischer und chemischer Anwendungen angewandt werden können. Die vorliegenden Zusammensetzungen können zum Binden vieler verschiedener spezifischer Bindematerialien als katalytische Substanzen eingesetzt werden, worin die Aminosäuresequenz eine Vielzahl von Elementen als Reinigungsmedien, als Verbundstoffe, Laminate, Kleber, kombiniert mit anorganischen oder organischen Materialien, wie z.B. Kohlenstoffasern, Nylonfasern, Nitrocellulose usw., als Kolbenbeschichtungen zum Zellwachstum, als Affinitätssäulen, Träger für biologische Materialien und dergleichen, spezifisch chelieren kann.
Alle in dieser Beschreibung angeführten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind hierin durch Verweis aufgenommen, so als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung speziell und individuell durch Verweis aufgenommen wäre.
Obwohl die obige Erfindung zum besseren Verständnis durch Beispiele und Veranschaulichungen ausführlich erläutert wurde, ist es für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich, daß unter Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung bestimmte Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können.

Claims

-1. Polymer vom Proteintyp, umfassend Stränge wiederkehrender Einheiten, die in der Lage sind, sich zu miteinander ausgerichteten Strukturen zusammenzusetzen, um zu Gegenständen formbar zu sein, wobei zumindest zwei Stränge durch ein dazwischenliegendes Oligopeptid miteinander verbunden sind, das anders ist als die wiederkehrenden Einheiten, worin das dazwischen liegende Oligopeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es nicht ausgerichtet ist und eine bindende oder chemisch aktive Aminosäuresequenz umfaßt.
2. Polymer nach Anspruch 1, worin die wiederkehrenden Einheiten wiederkehrende Einheiten eines natürlichen Polymers sind und etwa 3 bis 30 Aminosäuren umfassen, die Stränge etwa 25 bis 150 Aminosäuren umfassen und das dazwischenliegende Oligopeptid zwischen jedem der Stränge positioniert ist und etwa 6 bis 30 Aminosäuren umfaßt.
3. Polymer nach Anspruch 1, worin die wiederkehrende Einheit aus Fibrom, Elastin, Keratin oder Kollagen oder Kombinationen von Multimeren der wiederkehrenden Einheiten besteht.
4. Polymer nach Anspruch 4, worin das dazwischenliegende Oligopeptid die Aminosäuresequenz RGD, DP, EP, DPGKGXY (worin zumindest eines von X und Y = C ist), EPGYIGSRCDAGY, PKGDRGDAGPK oder AVTGRDSPAS umfaßt, worin konservative Substitutionen an einer anderen Position als an der funktionellen Stelle vorgenommen sein können.
5. Polymer nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Blockcopolymer ist, das Multi mere zweier unterschiedlicher wiederkehrender Einheiten umfaßt.
6. Proteinhältiges Polymer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die wiederkehrenden Einheiten die Sequenz GAGAGS, VPGVG oder zumindest eine von GPP und GAP aufweisen.
7. DNA-Sequenz, die für ein Polymer vom Proteintyp kodiert, umfassend Stränge wiederkehrender Einheiten, die in der Lage sind, sich zu ausgerichteten Strukturen zusammenzusetzen, die zu Gegenständen formbar sind, wobei zumindest zwei Stränge durch ein dazwischenliegendes Oligopeptid miteinander verbunden sind, das anders ist als die wiederkehrenden Einheiten, worin das dazwischenliegende Oligopeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es nicht ausgerichtet ist und eine bindende oder chemisch aktive Aminosäuresequenz umfaßt.
8. DNA-Sequenz nach Anspruch 7, worin die wiederkehrenden Einheiten wiederkehrende Einheiten eines natürlichen Polymers sind und etwa 3 bis 30 Aminosäuren umfassen, die Stränge etwa 25 bis 150 Aminosäuren umfassen und das dazwischenliegende Oligopeptid zwischen jedem Strang positioniert ist und etwa 4 bis 50 Aminosäuren umfaßt.
9. DNA-Sequenz nach Anspruch 7, worin die wiederkehrenden Einheiten die Sequenz GAGAGS, VPGVG oder zumindest eine von GPP und GAP oder Kombinationen von Multi meren der wiederkehrenden Einheiten aufweisen.
10. DNA-Sequenz nach Anspruch 7, worin das dazwischenliegende Oligopeptid die Aminosäuresequenz RGD, DP, EP, DPGKGXY, worin zumindest eines von X und Y = C ist, EPGYIGSRCDAGY, PKGDRGDAGPK oder AVTGRDSPAS umfaßt, worin konservative Substitutionen an einer anderen Position als der funktionellen Stelle vorgenommen sein können.
11. Vektor, umfassend ein Replikationssystem und eine DNA-Sequenz nach Anspruch 7.
12. Vektor nach Anspruch 11, worin das Replikationssystem ein prokaryotisches System ist.
13. Prokaryotische Zelle, umfassend einen Vektor, der ein Replikationssystem und eine DNA-Sequenz nach Anspruch 7 umfaßt.
14. Verfahren zur Herstellung eines Polymers vom Proteintyp, umfassend Stränge wiederkehrender Einheiten, die in der Lage sind, sich zu ausgerichteten Strukturen zusammenzusetzen, die zu Gegenständen formbar sind, wobei zumindest zwei Stränge durch ein dazwischenliegendes Oligopeptid miteinander verbunden sind, das anders ist als die wiederkehrenden Einheiten, worin das dazwischenliegende Oligopeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es nicht ausgerichtet ist und eine bindende oder chemisch aktive Aminosäuresequenz umfaßt, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:

Züchten einer prokaryotischen Zelle in einem geeigneten Nährstoffmedium, wobei die Zelle einen Vektor umfaßt, der ein Replikationssystem, das in der prokaryotischen Zelle funktionell ist, und ein Gen umfaßt, das zur Expression in der prokaryotischen Zelle fähig ist und für das Polymer vom Proteintyp kodiert, wodurch das Polymer vom Proteintyp exprimiert wird.