DE69130576T2

DE69130576T2 - Impfstoffzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69130576T2
Application number: DE69130576T
Authority: DE
Inventors: Christopher L. Dollard Des Ormeaux Pq H9A 2S5 Penny
Original assignee: North American Vaccine Inc
Current assignee: North American Vaccine Inc
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-05-01
Publication date: 1999-07-29
Anticipated expiration: 2011-05-02
Also published as: CS131891A3; EP0597838A1; FI925032A0; YU79691A; ZA913214B; MX172210B; AU7777991A; JPH05506234A; FI925032A7; TW221676B; ES2124701T3; CA2082425A1; HUT65493A; WO1991016926A1; FI925032L; HRP930658A2; DE69130576D1; NO924271D0; IL97985A0; ATE173936T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Impfstoffzusammensetzungen mit verbesserter Immunogenität. Genauer umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung ein Polypeptid-Immunogen in Kombination mit einer langkettigen Alkylverbindung, die als Immunoadjuvans wirksam ist.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist wohlbekannt, daß Impfstoffe bei der Krankheitsprophylaxe sehr wichtig sind. Impfstoffe wirken dadurch, daß man auf ein Wirtstier ein Fremdmaterial einwirken lässt, das zum Aktivieren des Immunsystems ausgelegt ist, um dem Wirt Immunität gegenüber dem Material zu verleihen, ohne den Wirt dem Risiko einer Erkrankung auszusetzen. Derzeit sind etwa 20 Impfstoffe zur gewerbsmäßigen Verwendung entwickelt worden. Die meisten dieser Impfstoffe werden durch Entgiften des krankheitsverursachenden Organismus oder eines Teils dieses Organismus durch eines aus mehreren Verfahren wie etwa zum Beispiel Isolieren eines spezifischen, nichttoxischen Teils des Organismus oder durch Behandlung eines toxischen Teils des Organismus mit Chemikalien, Wärme oder genetischer Schwächung hergestellt. Das Entgiftungsverfahren erzeugt oft heterogene Produkte, die mit toxischen Nebenprodukten ungewisser Zusammensetzung verunreinigt sind. Als Ergebnis kann sich die Wirksamkeit der unreinen, entgifteten Impfstoffe als immunogene Materialien verschlechtern. Außerdem können daraus unangenehme und manchmal dauerhaft schädigende Nebenwirkungen folgen. Ein wohlbekanntes Beispiel ist die Verwendung unversehrter B. pertussis- Bakterien als Grundlage für einen Impfstoff für Kinderkeuchhusten. Der gegenwärtig in den Vereinigten Staaten verwendete Impfstoff ist im wesentlichen derselbe wie die in den vierziger Jahren eingeführte Version. Nebenwirkungen schwanken von geringfügigen Reaktionen bis zu behaupteten Fällen von Läh mung, Hirndauerschaden und sogar Tod. Die europäische Patentanmeldung EP-0 336 736 bezieht sich auf Verfahren zum Reinigen und Entgiften von Keuchhusten-Toxin.
Das Aufkommen rekombinanter und anderer hochentwickelter chemischer Technologien hat die Entwicklung reinerer und somit sicherer Impfstoffe erleichtert. Aufgrund dieser verbesserten Reinheit, was häufig bedeutet, daß natürliche Immunstimulantien entfernt worden sind, sind diese Impfstoffe jedoch insbesondere beim Vergleich mit ihren Vorgängern oft schwach oder schlecht immunogen. Zum Ausgleichen dieser Wirkung werden in Verbindung mit den Impfstoffen Immunoadjuvantien zum Hervorrufen einer verstärkten Antikörperbildung eingesetzt.
Gegenwärtig werden nur Aluminium- und Calciumsalze als Adjuvantien für gewerbsmäßige Impfstoffe eingesetzt. Aluminium- und Calciumsalze sind jedoch keine wirksamen Immunoadjuvantien. Calciumsalze haben nur eine begrenzte Verwendung gefunden und Aluminiumsalze können an der Injektionsstelle ein vorübergehendes oder chronisches örtliches Granulom hervorrufen. L. H. Collier gibt in Lancet auf Seite 1364-1367 (1970) an, daß das Auftreten und die Schwere von Reaktionen auf den Tetanustoxoid-Impfstoff sowohl von der Reinheit des Antigens als auch der Anwesenheit von Aluminiumadjuvantien abhängt. Die Herstellung von Aluminiumadjuvantien ist nicht immer reproduzierbar. Weiterhin kann Aluminium allein die Produktion von IgE-Antikörpern stimulieren, die für die Vermittlung unmittelbarer Überempfindlichkeitsreaktionen verantwortlich sind. Dies ist von T. Matuhasi et al., J. Infectious Disease, 146, 290 (1982), beschrieben worden. Die europäische Patentanmeldung EP-0-177 015 bezieht sich auf Hepatitis-B-Antigene, die mit Adjuvantien auf Aluminiumgrundlage ergänzt sind.
Die Aufmerksamkeit hat sich in den letzten Jahren auf die Verwendung organischer Verbindungen als Adjuvantien gerichtet.
Nur wenige organische Verbindungen wirken in einer kommerziell annehmbaren, anorganischen Salzen ähnlichen Weise, d. h. als Träger mit langsamer Freisetzung oder Antigendepot (Impfstoff), wodurch ein Antigen über einen verhältnismäßig langen Zeitraum an der Injektionsstelle freigesetzt wird. Beispiele derartiger organischer Verbindungen sind organische Tenside und Emulgatoren wie etwa Pluronics und Tetronics, die von BASF Corporation hergestellte nichtionische Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen sind. Ein derartiger Mechanismus der langsamen Freisetzung der Adjuvanseigenschaft wird seit langem für die humane Verwendung angenommen, da er die Möglichkeit der Überstimulierung des Immunsystems verringert. Die Überstimulierung des Immunsystems kann zu einer Autoimmunantwort führen, wie sie bei Verwendung eines wirksamen Immunstimulans wie etwa Freundschem Adjuvans auftritt. Somit ist der Mechanismus der langsamen Freisetzung der bevorzugte Mechanismus.
Obschon von der Mehrzahl organischer Adjuvantien gezeigt worden ist, daß sie wirksame Immunstimulantien sind, neigen derartige hochaktive Adjuvantien dazu, toxisch und deshalb für die humane Verwendung unannehmbar zu sein. Beispiele bekannter organischer Adjuvantien sind Freundsches vollständiges Adjuvans und Muramyldipeptid, die wirksame Immunstimulantien sind, aber beide Verbindungen sind aufgrund von Toxizitätserwägungen auf die Verwendung bei der Tierforschung beschränkt. Viele organische Adjuvantien, die Aluminiumsalzen ähneln, sind toxischer als Aluminiumsalze. Von langkettigen Alkylaminen, die von D. Gall in Immunology, 11 369-386 (1966), beschrieben wurden, wurde berichtet, daß es toxische Verbindungen sind, die im allgemeinen für die Zellmembranstruktur zerstörend sind.
Es ist bekannt, daß große, heterogene Antigene mit hohem Molekulargewicht und unterschiedlicher Zusammensetzung mit unlös lichen organischen Molekülen komplexieren, wovon letztere als Adjuvantien wirken. Dies ist dahingehend ein nichtspezifisches Bindungsphänomen, daß falls das antigene Material groß und verschieden genug ist, es ungeachtet der Ladung und Polarität an jedes unlösliche organische Molekül bindet. Die Komplexierung zwischen dem organischen Adjuvans und dem Biomolekül erfolgt über eine Vielfalt schwacher, nicht-kovalenter Kräfte wie etwa hydrophobe Wechselwirkungen und Wasserstoffbindung.
Dieses Phänomen ist im US-Patent 4 428 932 an Overell und dem US-Patent 4 258 029 an Moloney et al. zu erkennen. Overell offenbart, daß Alkyltyrosine als Adjuvans bei der Allergiedesensibilisierungstechnik wirken, wenn sie mit heterogenen, hochmolekularen Mehrkomponentenallergenen wie etwa Weizen-, Gras- und Pollenextrakt komplexiert sind. Moloney et al. lehren die Verwendung langkettiger Alkoholester von Aminosäuren als Adjuvantien, wenn sie mit dem heterogenen, hochmolekularen Mehrkomponenten-Tetanustoxoid und Poliomyelitis-Virus des Typs I, II und III komplexiert sind.
Pennet' et al. (J. Biol. Stand. 13 : 43-52 (1985)) beziehen sich auf Bindungsuntersuchungen verschiedener Antigene mit unterschiedlichen Adjuvantien einschließlich Octadecyltyrosin. Derartige Antigene schließen Proteine wie etwa Tetanustoxoid, Diphtherie, Toxoid, Insulin und Human- und Rinderalbumin ein. Penney et al. liefern keine Daten, die die Immunogenität immunogener Zubereitungen betreffen, die die zur Verwendung in der beanspruchten Erfindung geeigneten gereinigten Polypeptide und die verschiedenen Adjuvantien betreffen.
Landi et al. (Vaccine 4 : 99-104 (1986)) beziehen sich auf durch Formalin inaktiviertes Poliovirus, das mit Stearyltyrosinhydrochlorid und keinem homogenen Polypeptid oder einer im wesentlichen reinen Aminosäuresequenz ergänzt war. Penney et al. (J. Biol. Stand. 14 : 345-9 (1987)) beziehen sich auf Verfahren zur Analyse von Stearyltyrosin. Penney et al. (J. Org. Chem. 50 : 1457-1459 (1985)) beziehen sich auf ein Verfahren zum Synthetisieren langkettiger Aminosäurealkylester und liefern keine immunologische Daten.
Es besteht daher das Bedürfnis, nichttoxische Impfstoff- Adjuvanszusammensetzungen mit verbesserter Immunogenität zu entwickeln, bei denen sowohl das Immunogen als auch das Adjuvans nichttoxisch ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf verbesserte Impfstoffzusammensetzungen, die ein homogenes immunogenes Polypeptid und ein nichttoxisches, langkettiges Alkylimmunoadjuvans umfassen. So wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung bereitgestellt, die ein homogenes, immunogenes Polypeptid (eine im wesentlichen reine, wie durch Gelelektrophoreseharze oder HPLC-Analyse bestimmt, immunogene Aminosäuresequenz) und ein Adjuvans umfaßt, das eine nichttoxische, langkettige Alkylverbindung umfaßt, die in einer zum Verstärken der Immunogenität des Polypeptids wirksamen Menge zugegen ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Hervorrufen einer Immunantwort bereitgestellt, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Impfstoffzusammensetzung der Erfindung an ein warmblütiges Tier einschließlich Menschen umfaßt.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird in den Ansprüchen 1-28 angegeben.
Überraschenderweise ist gefunden worden, daß gemäß der vorliegenden Erfindung nichttoxische, positiv geladene, langkettige Alkylverbindungen, insbesondere Ester von Aminosäuren oder Peptide homogene Polypeptide in selektiver Weise binden können. Dies ist ein spezifisches Phänomen, das sowohl vom Typ der in dem unlöslichen Ester vorliegenden Aminosäure als auch dem Typ des homogenen Polypeptids abhängt. Diese unerwartete Spezifität ist für die gemäß der Erfindung eingesetzten homogenen Polypeptide kennzeichnend und wird von Polysacchariden ähnlichen Molekulargewichts nicht gezeigt. Es ist ferner gefunden worden, daß wenn gemäß der vorliegenden Erfindung das aluminiumhaltige Standardadjuvans durch eine nichttoxische, langkettige Alkylverbindung als Adjuvans, typischerweise einen langkettigen Aminosäurealkylester ersetzt wird, eine oder mehr Wirkungen hinsichtlich des Isotyps des produzierten Antikörpers möglicherweise auftreten können. Eine Wirkung betrifft die IgE-Antikörperproduktion. Insbesondere wenn die Zusammensetzungen der Erfindung mit dem langkettigen Alkyladjuvans verwendet werden, sind die Werte des IgE-Antikörpers nicht wesentlich erhöht und verbleiben im wesentlichen bei den Werten, die beobachtet werden, wenn kein Adjuvans verwendet wird, verglichen mit dem erhöhten IgE-Wert, der beobachtet wird, wenn aluminiumhaltige Adjuvantien verwendet werden. IgE-Antikörper sind für das Vermitteln unmittelbarer Überempfindlichkeitsreaktionen verantwortlich. Es hat Berichte über anaphylaktische Reaktionen und sogar Tod als Ergebnis einer IgE-Produktion als Antwort auf die Immunisierung mit Aluminiumadjuvans- Impfstoffen gegeben; siehe Matuhasi et al., vorstehend erörtert. Die mit den langkettigen Alkyladjuvanszusammensetzungen der Erfindung beobachteten verringerten Werte der IgE-Bildung stellen einen vorteilhaften therapeutischen Effekt dar.
Ein weiterer Effekt ist, daß das Verhältnis von IgG2a- Antikörper zu IgG1 dadurch höher ist, daß sich beide Antikörperisotypwerte erhöhten, wenn die Adjuvantien mit langer Alkylkette in den Zusammensetzungen der Erfindung verwendet wurden, im Gegensatz zu dem Verhältnis, das beobachtet wird, wenn Aluminiumadjuvantien verwendet werden. Diese Zunahme des Ver hältnisses ist ebenfalls ein vorteilhafter Effekt, da der IgG2a-Antikörper hinsichtlich der Komplementaktivierung und Antikörper-abhängiger zellulärer Zytotoxizitätsmechanismen und des Schutzes gegen Tumore und Parasiten als der wirksamste Maus-Antikörper von Bedeutung ist.
Der hierin zum Definieren in den Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung eingesetzter Polypeptide verwendete Ausdruck "homogen" bedeutet eine immunogene Polypeptidart, die im wesentlichen aus einem oder mehreren Epitopen eines pathogenen Mittels besteht, das durch chemische oder biologische Synthese hergestellt wurde. In dem Fall, daß mehr als ein Epitop zugegen ist, umfaßt das homogene immunogene Polypeptid das/die immundominante(n) Epitop(e). Eine chemische Synthese wird im allgemeinen ausgeführt, wenn ein Epitop zugegen ist, wogegen entweder eine chemische oder biologische Synthese in dem Fall angewendet werden kann, wenn mehr als ein Epitop zugegen ist. Das homogene Polypeptid kann andere Teile des pathogenen Mittels umfassen, die nicht toxisch sind und die Immunogenität des homogenen Polypeptids nicht nachteilig beeinflussen.
Das nichttoxische Adjuvans ist vorzugsweise ein positiv geladener Ester einer Aminosäure oder eines Peptids, insbesondere ein Ester eines 14 bis 20 Kohlenstoffatome enthaltenden Alkylalkohols und einer Aminosäure, eines Dipeptids oder Tripeptids.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das in den Zusammensetzungen der Erfindung eingesetzte homogene immunogene Polypeptid ist nichttoxisch und kann bei dem Wirt eine Immunantwort auslösen. Das immunogene Polypeptid umfaßt im wesentlichen ein oder mehrere aus pathogenen Mitteln stammende Epitop(e), die zum Beispiel für AIDS, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Tetanus, Polio, Pertussis (Lymphozytose-fördernder-Faktor(LPF)-Toxin), Herpes simplex, respiratorisches synktiales Virus, Masern, Influenzavirus, Tollwut, Lassafieber, Rotavirus, Adenovirus, Rhinovirus, Maul- und Klauenseuche, Rinder- und Katzen-Leukämievirus, Rinderpestvirus, Denguefiebervirus, durch Zecken übertragene Enzephalitis, Malaria und Parainfluenzavirus verantwortlich sind.
In vielen Fällen ist es erwünscht, die natürlich vorkommende Aminosäuresequenz des Polypeptid-Immunogens abzuändern, um das homogene Polypeptid in Impfstoffzusammensetzungen brauchbarer zu machen, während seine immunogenen Eigenschaften nicht geändert werden. Beispiele derartiger Änderungen schließen Abwandlungen der Aminosäureseitenketten ein, um Abwandlungen nach der Translation nachzuahmen oder die chemischen Eigenschaften des Immunogens zu ändern. Abwandlungen des Polypeptids zum Verbessern der Lebensdauer des Immunogens in vivo sind ebenfalls möglich. Weiterhin ist das Anfügen eines Cysteinrestes an den Amino- oder Carboxylrest des Polypeptids möglich, um das Kuppeln des Polypeptids an ein Trägerprotein zu erleichtern.
Diese Änderungen oder Abwandlungen können entweder konservative oder nicht-konservative Insertierungen, Deletionen oder Substitutionen sein. Derartige Änderungen schließen Kombinationen zur Proteinsynthese verwendeter, natürlich vorkommender Aminosäuren ein, wie etwa Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; Phe, Tyr; Ala, Ser; Ala Thr; Ala, Val; Ala, Pro; Ala, Glu; Leu, Gln; Gly, Phe; Ile, Ser und Ile, Met.
Das immunogene, homogene Polypeptid kann durch jedes herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Auf diese Weise kann das Polypeptid durch rekombinante oder synthetische Techniken oder Kombinationen davon hergestellt werden. Bekannte rekombinante Techniken werden in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982), T. Maniatis et al., beschrieben. Eine Zelle kann zum Beispiel zum Überexprimieren eines gewünschten Polypeptids durch Tranefizierung mit einem Gen ausgelegt sein, das für dieses Polypeptid kodiert.
Geeignete chemische Syntheseverfahren schließen die Fest- oder Lösungsphasen-Peptidsynthese oder die enzymatische Synthese ein. Geeignete Verfahren werden in Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984, M. Bodanszky; Solid Phase Peptide Synthesis, zweite Ausgabe, 1984, Pierce Chemical Company, John Morrow Stuart und Janis Dillaha Young, beschrieben.
Das Polypeptid kann entweder verkürzt, verlängert oder auf andere Weise durch bekannte Techniken abgewandelt sein. Weiterhin kann das Polypeptid entweder linear oder cyclisch sein.
Die Reinigung des immunogenen Polypeptids kann mittels jeder gemeinhin eingesetzten Technik durchgeführt werden. Jedes chemische oder biosynthetische Verfahren, das andere Biomoleküle und unerwünschtes Material zerstört oder entfernt und das gewünschte immunogene Polypeptid unbeeinflußt läßt, kann angewandt werden. Vorzugsweise wird das immunogene Polypeptid durch chromatographische Techniken gereinigt. Insbesondere können chromatographische Techniken wie etwa Größenausschluß-, Ionenaustausch-, Affinitäts- oder am bevorzugtesten Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie oder Mischungen davon eingesetzt werden. Die Reinheit des immunogenen Polypeptids kann durch Gelelektrophorese bestätigt werden.
Die immunogenen Polypeptide sollten von ausreichender Größe sein, um vom Wirt erkannt und als fremd identifiziert zu werden. Ein Immunogen weist üblicherweise ein Molekulargewicht von wenigstens 10 000 Dalton auf. Falls das Polypeptid unter der kritischen Größe liegt, die der betreffende Wirt erkennt, muß das Polypeptid an einen Träger gekuppelt werden, der das Polypeptid-Träger-Konjugat immunogen macht. Proteine sind bevorzugte Träger. Bevorzugte Träger zur Verwendung bei Tieren sind Rinderserumalbumin und Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Zur humanen Verwendung geeignete Träger schließen Tetanus- Toxoid, Diphtherie-Toxoid, azellulären Pertussis-Impfstoff (LPF), kreuzreagierende Materialien (CRM), die Bakterientoxinen antigen ähnlich, aber mittels Mutation nichttoxisch sind, vorzugsweise gemäß Pappenheimer et al., An Immunological Study of the Diphtheria Toxin Molecule, Immunochemistry 9, 891-906 (1972), erhaltenes CRM&sub1;&sub9;&sub7; und andere Bakterienproteinträger, zum Beispiel Meningokokken-Außenmembranprotein, ein. Vorzugsweise ist das Trägerprotein selbst ein Immunogen.
Das Polypeptid kann durch jedes geeignete, in der Technik bekannte Verfahren an den Träger gekoppelt sein. Obschon die Verwendung einer symmetrischen Verbindungsgruppe, wie etwa ein Alkyldialdehyd (z. B. Glutaraldehyd) oder ein Alkyldiimidat (z. B. Dimethylsuberimidat) innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt, ist das Verwenden einer heterobifunktionellen Verbindungsgruppe bevorzugt. Letztere stellt sicher, daß die Bindung des Polypeptids an den Träger in definierter und reproduzierbarer Weise erfolgt, wobei Nebenreaktionen wie etwa Vernetzung von Trägermolekülen, die zu unreinen, heterogenen Zubereitungen führt, vermieden werden. Beispiele der bevorzugten heterobifunktionellen Verbindungsgruppen schließen 3-(2-Pyridyldithio)-propionsäure-(N-succinimidyl)ester von J. Carlsson et al., Biochem. J. 173, 723-737 (1978), und durch J. D. Bangs et al., J. Cell Biology 103, 255-263 (1986), beschriebenen 4- (p-Maleimidophenyl)buttersäure-sulfosuccinimidylester ein. Am bevorzugtesten ist durch S. Hashida et al., J. Applied Biochem. 6, 56-63 (1984), beschriebener 4-(N-Maleimidomethyl)- cyclohexan-1-carbonsäure-sulfosuccinimidylester.
Beispiele geeigneter homogener Polypeptide sind die, die im wesentlichen aus derselben Aminosäuresequenz bestehen, wie ein Oberflächenantigen eines Hepatitis-Virus, wie etwa das homogene Polypeptid, das im wesentlichen aus praktisch derselben Aminosäuresequenz wie ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen besteht. Ein weiteres Beispiel ist ein homogenes Polypeptid, das aus einem oder mehreren Epitopen eines Hepatitis-Oberflächenantigens besteht. Weitere Beispiele sind das homogene Polypeptid, das im wesentlichen aus praktisch derselben Aminosäuresequenz wie ein Oberflächenantigen der gD-Untereinheit eines Herpes-simplex-Virus besteht, das homogene Polypeptid, das im wesentlichen aus einem oder mehreren Epitopen von gp120 eines Humanimmunschwächevirus besteht, das homogene Polypeptid, das im wesentlichen aus einem oder mehreren Epitopen von gp41 eines Humanimmunschwächevirus besteht, oder das homogene Polypeptid, das im wesentlichen aus praktisch derselben Aminosäuresequenz wie der Lymphozytose-fördernde Faktor (LPF) besteht.
Sowohl das Adjuvans mit dem langkettigen Alkyl als auch alle Verbindungen, die aus seinem Metabolismus in dem Wirt entstehen, sollten nichttoxisch sein. Es ist wohlbekannt, daß langkettige Fettalkohole natürlich vorkommende, nichttoxische Substanzen sind. Als Beispiel wurde von Octadecanol gefunden, daß es beim Menschen völlig nichttoxisch ist, wie durch eine orale LD&sub5;&sub0; angezeigt wird, die, wie in Gosselins "Clinical Toxicology of Commercial Products", vierte Ausgabe, 1976, zu finden ist, größer als 15 g/kg ist. Von Octadecyltyrosin ist gefunden worden, daß es bei Tieren nichttoxisch ist und die Mehrzahl natürlich vorkommender Aminosäuren ist nichttoxisch; C. L. Pennet et al., Vaccine, 4, 99-10, 1986. Es ist daher zu erwarten, daß Octadecyltyrosin und Ester anderer Alkohole und Aminosäuren beim Menschen keine Toxizität zeigen.
Das Adjuvans sollte Mikroteilchen mit einer Größe zwischen etwa 150 um - 1 mM (18 mesh - 100 mesh, vorzugsweise etwa 250 um (60 mesh)) in einem wäßrigen Medium bilden können und dadurch eine Suspension mit gleichförmiger Konsistenz ergeben. Weiter hin sollten die Mikroteilchen des Adjuvans die Adsorption des Immunogens gestatten und dadurch die langsame Freisetzung des Immunogens in den Wirt erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Adjuvans eine Verbindung der Formel:
worin C ein Wasserstoffatom, ein Aminosäurerest oder Peptidrest ist, der bis zu zehn Aminosäurereste einschließt (d. h. bis zu einem Decapeptid); D ein Wasserstoffatom oder eine pharmazeutisch annehmbare Säure wie etwa Salz-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Schwefel-, Wein-, Milch- oder Essigsäure ist; E 4-Hydroxybenzyl, Benzyl, 4-Hydroxyphenyl, Phenyl, 4- Aminobutyl, Isopropyl, Methyl, Wasserstoff oder ein anderer Rest einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist; A (CH&sub2;)n, Sauerstoff oder CH&sub2;O ist und B (CH&sub2;)n oder Sauerstoff ist, wobei n 0 bis 4 ist, aber A ≠ B für (CH&sub2;)n oder Sauerstoff und R eine 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthaltende Alkylgruppe ist.
Vorzugsweise kann C entweder Wasserstoff, eine Aminosäure, ein Dipeptid oder Tripeptid sein. Falls C eine Aminosäure ist, kann die Aminosäuresequenz des Adjuvans aus zum Beispiel Tyrosylglycin, Glycylglycin, Glycyltyrosin oder Phenylalanylglycin ausgewählt sein. Falls C ein Dipeptid ist, kann die Aminosäuresequenz des Adjuvans aus zum Beispiel Tyrosylglycylglycin oder Tyrosylalanylglycin ausgewählt sein. Falls ein Aminosäurerest chiral ist, können das D-Enantiomer, das L-Enantiomer oder Gemische davon eingesetzt werden. Bei dem Adjuvans ist besonders bevorzugt, daß es eine α-Aminosäure umfaßt.
E ist besonders bevorzugt aus 4-Hydroxybenzyl, Benzyl, 4- Hydroxyphenyl, Phenyl und Wasserstoff ausgewählt. E ist am bevorzugtesten 4-Hydroxybenzyl.
Wenn A CH&sub2;O ist und B (CH&sub2;)n ist, sind die Verbindungen N- Aminoacylethanolamin-O-stearinsäureester. Wenn A CH&sub2;O ist und B Sauerstoff ist, sind die Verbindungen Carbonate.
Am bevorzugtesten ist das Adjuvans ein Aminosäureesterhydrochlorid, wobei C Wasserstoff ist, D Salzsäure ist, A (CH&sub2;)n ist, worin n 0-4 ist und B Sauerstoff ist.
Am bevorzugtesten ist das Adjuvans Octadecyltyrosinhydrochlorid, wobei C Wasserstoff ist, D Salzsäure ist, E 4- Hydroxybenzyl ist und R Octadecyl ist, A (CH&sub2;)n ist, worin n Null ist und B Sauerstoff ist.
Wenn C nicht Wasserstoff ist, umfaßt das Gerüst des Adjuvans im allgemeinen im wesentlichen Peptidbindungen, d. h. das Carboxylat eines Aminosäurerestes ist direkt mit dem Amino des benachbarten Restes in Kopf-Schwanz-Weise gebunden. Wahlweise kann die Peptidbindung ein Thioamid sein.
Das Adjuvans kann durch jedes herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Der Aminoesterteil des Adjuvans kann zum Beispiel durch eines aus einer Anzahl eingeführter Verfahren synthetisiert werden, wie sie von M. Bodanszky et al., "Peptide Synthesis", zweite Ausgabe, Wiley, New York, 1976, und R. W. Roeske, Peptides (N. Y.) 3, 102 (1981), beschrieben werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist das von C. Penney et al., J. Organic Chemistry 50, 1457-1459 (1985), beschriebene Methansulfonsäure-katalysierte Veresterungsverfahren.
Wenn das Adjuvans ein Di- oder Tripeptid ist, können die Peptidbindungen durch jedes, vorstehend in "Peptide Synthesis" angeführte Verfahren gebildet werden. Außerdem können die Peptidbindungen gebildet werden, indem entweder den Fest- oder Lösungsphasenvorschriften gefolgt wird. Es gibt viele Vorschriften und Reagentien, die zum Bilden von Amid-, Thioamid- oder Thioesterbindungen brauchbar sind.
Während der Herstellung des Adjuvans kann es erwünscht sein, reaktionsfähige funktionelle Gruppen zeitweise zu schützen. Amine können zum Beispiel durch Gruppen vom Urethantyp, Alkohole durch t-Butyl- oder Benzylgruppen und Säuren durch Estergruppen geschützt werden. Geeignete Bedingungen zum Schützen/Entschützen und Vorschriften werden vorstehend in "Peptide Synthesis" beschrieben.
Das Adjuvans kann durch jede zuvor beschriebene Technik gereinigt werden. Die bevorzugte Reinigungstechnik ist die Kieselgelchromatographie, insbesondere die von W. Clark Still et al., J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978), beschriebene (rasche) "blitz"-chromatographische Technik. Andere chromatographische Verfahren einschließlich HPLC können jedoch zur Reinigung des Adjuvans verwendet werden. Die Kristallisation kann ebenfalls zum Reinigen des Adjuvans verwendet werden. In einigen Fällen ist keine Reinigung erforderlich, da aus der Synthese direkt ein analysenreines Produkt erhalten wird. Die Impfstoff-Zusammensetzungen der Erfindung werden durch physikalisches Mischen des Adjuvans mit dem homogenen immunogenen Polypeptid unter geeigneten sterilen Bedingungen gemäß bekannter Techniken unter Herstellen der Adjuvans- Zusammensetzung hergestellt. Wie aus der vorstehenden Erörterung deutlich ist, wird das immunogene Polypeptid entweder mit dem Adjuvans selbst oder an einen geeigneten Träger gekuppelt gemischt.
Die Mengen des Adjuvans und homogenen Polypeptid-Immunogens, entweder allein oder an einen Träger gekuppelt, die zum Auslösen einer Immunantwort beim Menschen benötigt werden, hängen miteinander zusammen, liegen aber innerhalb der in herkömmlichen Impfstoffen allgemein eingesetzten Bereiche. Die Verwendung zunehmender Mengen Adjuvans legt zum Beispiel nahe, daß abnehmende Mengen Immunogen verwendet werden können und umgekehrt. Die bevorzugte Adjuvansmenge ist 0,01 bis 5 mg/ml der Zusammensetzung, zum Beispiel 0,05 mg/ml bis 3 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 1,0 mg/ml. Die bevorzugte Immunogenmenge liegt zwischen etwa 1 und 100 ug/ml, vorzugsweise etwa 5 und 40 ug/ml. Die Dosierung hängt sowohl vom den Impfstoff erhaltenden Wirt als auch von Faktoren wie etwa Größe, Gewicht und Alter des Wirts ab.
Die Impfstoff-Zusammensetzungen dieser Erfindung können mittels Techniken formuliert werden, die den für andere pharmazeutische Polypeptid-Zusammensetzungen verwendeten ähnlich sind. So können das Adjuvans und das Immunogen in lyophilisierter Form gelagert und unter Bilden einer Suspension vor der Verabreichung in einem physiologisch annehmbaren Träger wiederhergestellt werden. Wahlweise können das Adjuvans und das Immunogen in dem Träger aufbewahrt werden. Bevorzugte Träger sind sterile Lösungen, insbesondere sterile Pufferlösungen wie etwa phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Jedes Verfahren des Kombinierens des Adjuvans und des Immunogens in dem Träger, das die Immunreaktivität des Gemisches aufrecht erhält, ist geeignet.
Der Träger kann Konservierungsmittel oder andere bekannte Additive enthalten, die zum Verbessern der Lagerstabilität oder der Wirksamkeit des Gemisches verwendet werden. Geeignete Konservierungsmittel schließen zum Beispiel Thimerosal ein.
Das Volumen einer Einzeldosis des Impfstoffes dieser Erfindung kann schwanken, liegt aber im allgemeinen innerhalb der in herkömmlichen Impfstoffen gemeinhin eingesetzten Bereiche. Das Volumen einer Einzeldosis liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,1 ml und etwa 1,5 ml, bevorzugter zwischen etwa 0,2 ml und etwa 0,5 ml bei den vorstehend angeführten Konzentrationen von Immunogen und Adjuvans.
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können durch jedes herkömmliche Mittel verabreicht werden. Bevorzugte Verabreichungsverfahren schließen das subkutane, intramuskuläre, intradermale oder das durch nasale Zuführung ein. Wahlweise kann das Gemisch aus einem biodiffundierbaren Implantat freigesetzt werden. Eine einzelne Verabreichung kann verwendet werden. Wahlweise kann im Laufe mehrerer Tage oder Wochen eine Reihe von Verabreichungen durchgeführt werden.

BEISPIELE

Die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des homogenen Hepatitis-B-Oberflächenantigens (HBsAg). Rekombinantes HBsAg wurde aus humanen 3T3-Zellen isoliert, die mit dem von der Mount Sinai School of Medicine (Sells et al., Production of Hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned Hepatitis B virus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1005 (1987)) gelieferten Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus transfiziert wurden. Zellen wurden in RPMI-Medium (Gibco) angezüchtet, das mit 10% FCS (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat und 0,5% Gentamycin ergänzt war. Zu diesem Zeitpunkt können zwei Reinigungsverfahren, und zwar die Dichtegradientenzentrifugation oder Immunaffinitätschromatographie eingesetzt werden.
Bei der Dichtegradientenzentrifugation wird der Zellüberstand 10 Minuten bei 2000 Upm unter Entfernen etwaiger ganzer 3T3- Zellen zentrifugiert und anschließend wird das Antigen unter Verwenden von Polyethylenglykol (MG 8000) bei einer Konzentration von 10% (Gew./Vol.) gereinigt. Das sich daraus ergebende Pellet wird in TNE-Puffer (10 mM Tris·HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8, 0)) erneut suspendiert und das Zentrifugieren wird in einem Gradienten aus 20% bis 50% (Gew./Vol.) Cesiumchlorid in TNE-Puffer in SW41-Polyallomerröhrchen ausgeführt. Die Gradienten werden 60 Stunden bei 4ºC mit 35 000 Upm zentrifugiert. Fraktionen werden vom Boden des Röhrchens gesammelt und die Dichte wird mittels eines Refraktometers bestimmt. Die Fraktionen mit einer Dichte (1,351 - 1,358) werden zusammengefaßt und gegen PBS dialysiert, eingeengt und mittels eines Abbot RIA-Kits unter Verwenden der positiven Kontrolle als Äquivalent zu 20 ng/ml Antigen auf die homogene HBsAg- Konzentration analysiert.
Das Verfahren der Immunaffinitätschromatographie wird im allgemeinen durch 10 min Zentrifugieren des Zellüberstandes bei 2000 Upm unter Entfernen etwaiger ganzer 3T3-Zellen durchgeführt. Eine Anti-HBsAg-Affinitätssäule, die durch kovalentes Binden eines monoklonalen Anti-HBsAg-Antikörpers an mit Bromcyan aktivierte Sepharose CLHB hergestellt wurde, wird mit PBS gewaschen. Die OD&sub2;&sub8;&sub0; nm des Eluats wird geprüft und sollte < 0,010 sein (OD&sub2;&sub8;&sub0; nm = optische Dichte (Absorption) bei 280 nm). Der Überstand wird zweimal durch die Säule laufen gelassen, um sicherzustellen, daß das Antigen auf der Säule absorbiert ist. Die Säule wird anschließend unter Entfernen einer etwaigen nichtspezifischen Bindung von Proteinen an die Säule 3 Mal (Prüfen von OD&sub2;&sub8;&sub0; nm < 0,01) gewaschen, gefolgt von der Elution mit Glycin/HCl (pH 2,8). Zehn Röhrchen werden mit genügend Tris-Puffer (pH 11) in jedem Röhrchen zum Neutralisieren der 2-ml-Fraktion Glycin/HCl vorbereitet. Die zehn Röhrchen werden durch die OD&sub2;&sub8;&sub0; nm oder durch Messen des HBsAg durch RIA analy siert. Das homogene Polypeptid enthaltende Fraktionen werden vereinigt und gegen PBS dialysiert. Die Säule wird 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Säule wird in PBS/Na-azid aufbewahrt.

Beispiel 2

Im folgenden wird das allgemeine Verfahren zur Komplexierung eines homogenen Polypeptidimmunogens mit einem langkettigen Aminosäurealkylester als Immunoadjuvans beschrieben.
Der langkettige Aminosäurealkylester als Immunoadjuvans (50 mg) wurde in einen 25-ml-Meßbecher oder Erlenmeyerkolben mit Rührstab eingebracht und mit einem Wattebausch oder einem anderen lockeren Dichtmaterial zugepfropft. Die Salzform des Immunoadjuvans wurde durch 20 Stunden Erhitzen in einem Ofen auf eine geeignete Temperatur, die durch den Schmelzpunkt bestimmt wurde, sterilisiert. Dem erkalteten Kolben wurde durch Filtration sterilisierte, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (25 ml), > 50 mM, pH = 6-7, zugesetzt. Die sich daraus ergebende Suspension wurde 3-20 Stunden gelinde gerührt, der Pfropfen wurde durch einen Glasstopfen ersetzt und das Ganze wurde bei 4ºC aufbewahrt, bis es zur Komplexierung benötigt wurde.
Zum Komplexieren des Immunoadjuvans mit dem homogenen Polypeptid wurde die Suspension auf Raumtemperatur gebracht und gründlich gerührt. Das benötigte Suspensionsvolumen wurde mit einer großkalibrigen Pipette zu einem gleichen Volumen Polypeptidlösung überführt, so daß die Endkonzentration des Immunoadjuvans 1 mg/ml war. Es können jedoch bei Bedarf Volumenanpassungen durchgeführt werden, um die gewünschte Immunoadjuvanskonzentration zu ergeben. Die Immunoadjuvans-Polypeptid- Suspension wurde über Nacht bei 4ºC gelinde gemischt. Am Ende der Komplexierungsreaktion ließ man die Suspension absetzen, zentrifugierte nötigenfalls und die Absorption des Überstandes bei 280 nm wurde zum Bestimmen der Menge an ungebundenem Poly peptid gemessen. Im allgemeinen stellen 30%-90% gebundenes Polypeptid einen guten Immunoadjuvans-Polypeptid-Immunogenkomplex dar.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Eignung als Adjuvans mehrerer Aminosäureoctadecylester mit einem homogenen Polypeptid, das ein Kandidat für einen Hepatitis-Impfstoff ist.
BALB/c-Mäuse wurden in Anwesenheit von Adjuvans für die Mäuse, die keine Kontrolle waren, und in Abwesenheit von Adjuvans für die Mäuse als Kontrolle mit 50 ng Hepaptitis-B-Oberflächenantigen immunisiert. Das Hepatitis-B-Oberflächenantigen wurde aus 3T3-Zellen erhalten, die mit dem Gen für das Oberflächenantigen transfiziert wurden. 100 ug Octadecylaminosäure wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit dem Polypeptid komplexiert. Dieses Gemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 0, 1 ml an Tag 1 unter Anwenden des intramuskulären Weges injiziert und man nahm den Mäusen an Tag 7, 14, 21, 2 8, 3 5, 4 2 und 61 Blut ab. Die Mäuse wurden an Tag 21 mit 35 ng Polypeptid gestärkt.
Die Antikörperkonzentration im Serum wurde durch einen Radioimmuntest bestimmt. Die Antikörperkonzentration wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve, die unter Verwenden eines monoklonalen Antikörpers erhalten wurde, abgeschätzt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1
* Anti-HBsAg-Antikörperkonzentration, ng/ml
Die Aminosäuresequenz des Hepatitis-B-Oberflächenantigens für Aminosäure 1 bis 226 (HBsAg - adw (S-Genprodukt)) wird bei Bhanagar P. K. et al. Proc. Natl. Aca. Science USA, Bd. 79, 4400- 4404 (1982), beschrieben, das durch Verweis besonders inbegriffen ist.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß der zwischen den langkettigen Aminosäurealkylestern und einem immunogenen Polypeptid, Hepatitis-B-Oberflächenantigen, beobachtete Adjuvanseffekt ein spezifisches Phänomen ist. Dies ist aus dem Vergleich von Octadecyltyrosin und Octadecyllysin und aus dem Vergleich von Octadecylforphenicinol und Octadecylforphenicin ersichtlich.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Eignung als Adjuvans von Octadecyltyrosin als Funktion der Dosis mit einem Polypeptid, das ein Kandidat für einen Hepatitis-Impfstoff ist.
Die Vorschrift war wie vorstehend beschrieben, ausgenommen, daß Mäuse mit 80 ng Hepatitis-B-Oberflächenantigen immunisiert, mit 50 ng gestärkt und ihnen an Tag 7, 14, 28 und 35 Blut abgenommen wurden. Die Immunisierungen wurden in Gegenwart von Adjuvans für die Mäuse, die keine Kontrolle waren, und in Abwesenheit von Adjuvans für die Mäuse als Kontrolle durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2
*CPM, der Wert vor der Blutentnahme war 11,5
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß der Adjuvanseffekt von der Konzentration des in der Zusammensetzung vorhandenen langkettigen Alkylesters Octadecyltyrosin abhängt. Wenn sich die Menge an verabreichtem Adjuvans erhöht, erfolgt eine proportionale Zunahme des Antikörpertiters bis ein optimaler Titerwert erreicht ist, über den hinaus sich der Antikörpertiter nicht erhöht.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Eignung als Adjuvans von Octadecyltyrosin als Funktion der Dosis und in verschiedenen Tieren mit einem Polypeptid, das einer fusiogenen Sequenz aus dem Hüllprotein des Humanimmunschwächevirus HIV-1 entspricht.

1) HIV-Peptidsequenz

Die Peptidsequenz des HIV war wie folgt.
Produkt: BC-101
503-
H-Val-Ala-Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg- Glu-Lys-Arg-Ala-Val-Gly-Ile-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe- Leu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser- 535
MG 3585,14 (Rückgrat)

2) Versuche an Mäusen

BALB/c-Mäuse wurden mit 100 ug chemisch synthetisiertem Polypeptid, das der Aminosäuresequenz der Reste 503-535 von HIV-1 entspricht und an Napfschneckenhämocyanin (KLH) gekuppelt war, immunisiert. Octadecyltyrosinhydrochlorid, 10 ug - 100 ug, wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit dem Polypeptid komplexiert. Dieses Gemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml an Tag 1 und erneut an Tag 21 injiziert. Man nahm den Mäuse an Tag 7, 14, 21, 28 und 35 Blut ab.
Die Antikörperkonzentration im Serum wurde durch einen Radioimmuntest bestimmt. Die Antikörperkonzentration wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve abgeschätzt, die durch Verwenden eines polyklonalen Antikörpers erhalten wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3
* Anti-Peptid-Antikörper-Konzentration, ug/ml
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß ein langkettiger Alkylester, Octadecyltyrosin, einen konzentrationsabhängigen Adjuvanseffekt mit einem weiteren immunogenen Polypeptid zeigt, und zwar im Polypeptid, das von den Aminosäuren 503 bis 535 des HIV-Proteins gp41 abgeleitet ist. Erneut wird ein optimaler Antikörpertiter erreicht, über den hinaus sich der Titer nicht erhöht.

3) Versuche bei Pavianen

Zwei Paviane wurden mit 300 ug chemisch synthetisiertem Polypeptid, das der Aminosäuresequenz der Reste 503-535 von HIV-1 entspricht und an Napfschneckenhämocyanin gekoppelt war, immunisiert. 500 ug Octadecyltyrosinhydrochlorid wurden wie in Beispiel 2 beschrieben mit dem Polypeptid komplexiert. Dieses Gemisch wurde in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml an Tag 1 und erneut an Tag 35 injiziert. Man entnahm den Tieren 3 Tage vor der ersten Immunisierung und an Tag 14, 32 und 49 Blut. Derselbe Versuch wurde mit zwei weiteren Pavianen, aber mit einem Polypeptid, das der Aminosäuresequenz 526-535 von HIV-1 entsprach, unternommen.
Die Antikörperkonzentration in den Seren wurde durch einen Radioimmuntest indirekt gemessen. Die Titration wurde durch Inkubation von Proben auf Platten, die mit Peptid-Albumin- Konjugat überzogen waren, und Reaktion mit Iod-125-markiertem Kaninchen-anti-Affe-Immunglobulin ausgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt. TABELLE 4
*CPM nach Subtraktion des Hintergrundes auf mit Rinderserumalbumin überzogenen Platten
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß der Adjuvanseffekt zwischen einem langkettigen Alkylester, Octadecyltyrosin, und einem immunogenen HIV-Polypeptid bei höheren Tieren, z. B. Pavianen, beobachtet wird.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Änderung beim Isotyp, die stattfindet, wenn man von einem Aluminiumadjuvans zu Octadecyltyrosin als Adjuvans für einen Hepatitis-Impfstoffkandidaten wechselt.
Die Vorschrift war wie in Beispiel 5, Abschnitt 2 (Mäuse), beschrieben, außer daß 50 ug Octadecyltyrosin sowohl für die primäre als auch sekundäre (Tag 21) Immunisierung verwendet wurden. Der Isotyp der Antikörperantwort wurde durch einen Radioimmuntest bestimmt. Es wurde von tritiummarkiertem Anti- Maus-Isotyp-Antikörper Gebrauch gemacht. Die Titration wurde durch Inkubation von Proben auf Platten durchgeführt, die mit imminoaffinitätsgereinigtem Hepatitis-B-Oberflächenantigen überzogen waren. Die als Radioaktivität (cpm) des gebundenen Isotyp-Antikörpers mitgeteilten Ergebnisse werden in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen die Änderung beim Isotyp der Antikörperreaktion, die stattfindet, wenn man von einem Aluminiumadjuvans zu einem langkettigen Alkylester (Octadecyltyrosin - OT) als Adjuvans für ein immunogenes Polypeptid, Hepatitis-B-Oberflächenantigen, wechselt. Insbesondere ist anzumerken, daß die IgE-Antikörperspiegel erhöht sind, wenn Aluminium verwendet wird, wogegen verglichen mit den mit der Kontrolle erhaltenen keine bedeutende Zunahme beim IgE- Spiegel erfolgt, wenn Octadecyltyrosin (OT) verwendet wird.

Claims

1. Immunogene Zusammensetzung, umfassend eine gemäß Gelelektrophorese oder HPLC-Analyse im wesentlichen reine, immunogene Aminosäuresequenz und eine wirksame Menge wenigstens eines Adjuvans der Formel

wobei C aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem Aminosäurerest und einem Peptidrest besteht, D aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff und einer pharmazeutisch annehmbaren Säure besteht,

E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 4-Hydroxybenzyl, Benzyl, 4-Hydroxyphenyl, Phenyl, 4-Aminobutyl, Isopropyl, Methyl, Wasserstoff und einem Rest einer natürlich vorkommenden Aminosäure besteht,

A (CH&sub2;)n, Sauerstoff oder CH&sub2;O ist und B (CH&sub2;)n oder Sauerstoff ist, wobei n 0 bis 4 ist, mit der Maßgabe, daß A und B für(CH&sub2;)n, und Sauerstoff nicht gleich sind, und

R Alkyl mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Adjuvans eine Aminosäure mit einer L-Konfiguration umfaßt.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Adjuvans eine Aminosäure mit einer D-Konfiguration umfaßt.

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Adjuvans ein Aminosäuregemisch mit D- und L-Konfigurationen umfaßt.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei E aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 4-Hydroxybenzyl, Benzyl, 4- Hydroxyphenyl, Phenyl und Wasserstoff besteht.

6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei E 4-Hydroxybenzyl ist.

7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei C aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Wasserstoff, einem Aminosäurerest und einem Peptidrest mit bis zu zehn Aminosäureresten besteht.

8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei der Peptidrest aus einem Dipeptid und einem Tripeptid ausgewählt ist.

9. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei C ein Aminosäurerest ist, der so ausgewählt ist, daß er ein Adjuvans bildet, das ein Dipeptid umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tyrosylglycin, Glycylglycin, Glycyltyrosin und Phenylalanylglycin besteht.

10. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei C ein Dipeptid ist, das so ausgewählt ist, daß es ein Adjuvans bildet, das ein Tripeptid umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tyrosylglycylglycin und Tyrosylalanylglycin besteht.

11. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die pharmazeutisch annehmbare Säure aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Phosphor-, Schwefel-, Wein-, Milch- und Essigsäure besteht.

12. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Adjuvansmolekül eine α-Aminosäure umfaßt.

13. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem linearen und einem cyclischen Polypeptid besteht.

14. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die im wesentlichen reine, immunogene Aminosäuresequenz an ein Trägerprotein gekoppelt ist.

15. Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, acellulärem Pertussis-Impfstoff (LPS), einem kreuzreagierenden Material (CRM) und einem bakteriellen Proteinträger besteht.

16. Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei es sich bei dem CRM um CRM&sub1;&sub9;&sub7; handelt.

17. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz von einem pathogenen Mittel abgeleitet ist, das für eine Krankheit verantwortlich ist, die aus AIDS, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Tetanus, Polio, Pertussis (Lymphocytose-fördernder-Faktor-Toxin), Herpes simplex, respiratorischem syncytialem Virus, Masern, Influenzavirus, Tollwut, Lassafieber, Rotavirus, Adenovirus, Rhinovirus, Maul- und Klauenseuche, Rinder- und Katzen- Leukämievirus, Rinderpestvirus, Denguefiebervirus, durch Zecken übertragener Encephalitis, Malaria und Parainfluenzavirus ausgewählt ist.

18. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz ein Oberflächenantigen eines Hepatitisvirus ist.

19. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens ein Epitop eines Oberflächenantigens eines Hepatitisvirus umfaßt.

20. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz ein Hepatitis-B-Oberflächenantigen ist.

21. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz ein Oberflächenantigen der gD-Untereinheit eines Herpes-simplex-Virus ist.

22. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens ein Epitop von gp120 eines humanen Immunschwächevirus (HIV) umfaßt.

23. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz wenigstens ein Epitop von gp41 eines humanen Immunschwächevirus (HIV) umfaßt.

24. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der Aminosäuresequenz um Lymphocytose-fördernden Faktor handelt.

25. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Adjuvans ein Ester eines Alkylalkohols mit 14 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer Aminosäure, eines Dipeptids oder eines Tripeptids ist.

26. Zusammensetzung gemäß Anspruch 25, wobei es sich bei dem Adjuvans um Octadecyltyrosin handelt.

27. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 für intramuskuläre, intradermale, subcutane oder nasale Verabreichung.

28. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 zur Herstellung eines Impfstoffs zum Hervorrufen einer Immunreaktion gegen einen Krankheitserreger.