DE69129042T2

DE69129042T2 - Wachstums-kontrolle von fadenformigen mikroorganismen.

Info

Publication number: DE69129042T2
Application number: DE69129042T
Authority: DE
Inventors: Thomas Naylor; Geoffrey Robson; Anthony Trinci; Marilyn Wiebe
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Marlow Foods Ltd
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1991-12-16
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2011-12-17
Also published as: GR3026278T3; AU9074091A; EP0620846B1; EP0620846A1; DE69129042D1; JPH07504560A; AU669651B2; CA2125648A1; ES2113937T3; DK0620846T3; CA2125648C

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur kontinuierlichen oder absatzweisen Kultivierung von fadenförmigen Mikroorganismen, das zur Verzögerung oder Vermeidung der Entwicklung von ungewünschten Varianten in der Kultur gesteuert wird. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts oder eines Metabolits.
Während der kontinuierlichen Kultivierung von fadenförmigen Mikroorganismen besteht die Tendenz, insbesondere nach lang anhaltender Kultivierung, daß hochverzweigte Kolonien von Varianten des Mikroorganismus auftreten. Manchmal treten diese Varianten nur in begrenztem Umfang auf und beeinträchtigen das Gesamtwachstum der Kultur nicht wesentlich. In anderen Fällen treten die Varianten jedoch in größerem Ausmaß auf und können schließlich die Hauptbestandteile der die Mikroorganismen enthaltenden Kulturen werden. Diese Tendenz hat unerwünschte Auswirkungen auf kommerzielle Fermentationen unter Verwendung von fadenförmigen Mikroorganismen, insbesondere Fermentationen für die Herstellung von proteinhaltigen Zusammensetzungen, wobei es oft gewünscht wird, fadenförmige Mikroorganismen mit einer lediglich eingeschränkten Verzweigung der Hyphen zu erzeugen.
Seit 1969 ist ein Verfahren entwickelt worden, bei dem ein Stamm von Fusarium graminearum (Schwabe) in einem Weizenstärke enthaltendem Medium kultiviert wird, um ein proteinhaltiges Produkt herzustellen, das zu einem proteinreichen Lebensmittel für die menschliche Ernährung zubereitet werden kann. Das Produkt dieses Verfahrens besitzt gute Ernährungseigenschaften und kann zu einem überzeugenden Analogon von faserartigen Lebensmitteln wie Fleisch und Geflügel verarbeitet werden. Dieses Verfahren ist u.a. in GB 1346061; GB 1346062; EP 123434 und von Trinci et al. in Kapitel 2 von "Microbial Growth Dynamics", herausgegeben von R.K. Poole et al. und veröffentlicht von der Society of General Microbiology beschrieben. Der Inhalt dieser Dokumente wird hier durchbezugnahme aufgenommen. Es ist erwünscht, die Kultivierungsbedingungen so zu steuern, daß das fadenförmige Produkt mit eingeschränkter Verzweigung hergestellt wird und daß das Ausmaß, mit dem sich ungewünschte Kolonien von Varianten des zu verarbeitenden Mikroorganismus in der Kultur entwickeln, eingeschränkt wird.
Erfindungsgemäß wurde nun eine Vorrichtung entwickelt, mit der eine kontinuierliche Kultivation von fadenförmigen Mikroorganismen zur Verzögerung oder Vermeidung der Entwicklung einer unerwünschten Variante in der Kultur gesteuert werden kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Kultivierung eines fadenförmigen Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Kulturmedium bereitgestellt, dem Quellen geeigneter Nährstoffe einschließlich Kohlenstoff zugeführt werden, wobei die Nährstoffquellen in einer das Wachstum der Kultur limitierenden Menge zugeführt werden und einen limitierenden Nährstoff für diese darstellen, wobei die Entwicklung einer unerwünschten Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, in dem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierenden Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoffzufuhr zur Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierenden Nährstoff ersetzt.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts bereitgestellt, indem ein fadenförmiger Mikroorganismus in einem Kulturmedium in kontinuierlicher Kultur kultiviert wird, dem Quellen weiterer geeigneter Nährstoffe einschließlich Kohlenstoff zugeführt werden. Eine Nährstoffquelle wird in einer das Wachstum der Kultur limitierenden Menge zugeführt und stellt einen limitierenden Nährstoff für diese dar. Der fadenförmige Mikroorganismus wird von der Kultur abgetrennt, wodurch die Entwicklung einer unerwünschten Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, indem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierender Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoffzufuhr zu der Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierender Nährstoff ersetzt.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Metabolits bereitgestellt, indem ein fadenförmiger Mikroorganismus in einem Kulturmedium in kontinuierlicher oder absatzweiser Kultur kultiviert wird, dem Kohlenstoffquellen und andere geeignete Nährstoffe zugeführt werden, wobei der Kohlenstoff oder eine andere Nährstoffquelle in einer das Wachstum der Kultur limitierenden Menge zugeführt werden und einen limitierenden Nährstoff für diese darstellen. Der Metabolit wird aus dem hergestellten fadenförmigen Mikroorganismus oder aus dem Kulturmedium wiedergewonnen, wobei die Entwicklung einer Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, indem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierenden Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoff zufuhr zu der Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierender Nährstoff ersetzt.
Das Verfahren der Erfindung findet weitreichende Anwendung und kann immer dann verwendet werden, wenn ein Fermentationsverfahren für die Kultivierung eines fadenförmigen Mikroorganismus verwendet wird, wobei ein limitierender Nährstoff eingesetzt wird. Insbesondere kann es zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts durch das in GB 1346061; GB 1346062 und EP 123434 beschriebene Fermentationsverfahren eingesetzt werden. Jeder geeignete fadenförmige Mikroorganismus kann zur Herstellung des proteinhaltigen Produktes kultiviert werden, beispielsweise Stämme des Genus Fusarium wie Fusarium graminearum (Schwabe), der beim Commonwealth Mycological Institute, Kew, unter den Nummern IMI 145425 und CMI CC Nr. 346,762 hinterlegt ist und die Stämme von Penicillium notatum chrysogenum IMI 138,291. Die Erfindung kann auch für ein Fermentationsverfahren unter Verwendung beispielsweise eines Streptomyceten eingesetzt werden, beispielsweise Streptomyces coelicolor zur Herstellung eines Metaboliten, beispielsweise eines antibiotischen Heilmittels, das Streptomycin sein kann.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die limitierenden Nährstoffe geeigneterweise entsprechend der Fermentation und den Bedingungen, bei der sie durchgeführt wird, ausgewählt. In dem Verfahren kann ein einziger Austausch des limitierenden Nährstoffs verwendet werden, aber vorzugsweise wird das Verfahren mit einer Vielzahl von Austauschvorgängen des limitierenden Nährstoffs in Intervallen während der gesamten Dauer des Betriebs durchgeführt. Die Austauschvorgänge können nur zwei Nährstoffquellen als limitierende Nährstoffe vorsehen, aber vorzugsweise wird das Verfahren mit drei oder mehreren verschiedenen Nährstoffquellen durchgeführt, die abwechselnd als limitierende Nährstoffe verwendet werden. Vorzugsweise wird das Verfahren mit einer Serie von drei oder mehreren Nährstoffquellen betrieben, die als limitierende Nährstoffe in einem regelmäßigen Zyklus verwendet werden.
Die zeitliche Steuerung des Austauschs einer Nährstoffquelle durch eine andere als limitierender Nährstoff kann auf verschiedene Weise gewählt werden. Das Kulturwachstum kann überwacht werden und eine Nährstoffquelle kann durch eine andere ersetzt werden, wenn die Variante, deren Entwicklung zu steuern ist, sich bis zu einem vorbestimmten Ausmaß entwickelt hat, z.B. wenn sie 1 % der in der Kultur vorhandenen Mikroorganismuszellen ausmacht. Alternativ kann das Kulturwachstum eines bestimmten Mikroorganismus genau untersucht werden, um Voraussagen hinsichtlich der Entwicklung der zu steuernden Variante zu ermöglichen. Wenn dies auf zufriedenstellende Weise getan wurde, können Austauschvorgänge von Nährstoffquellen als limitierende Nährstoffe in bestimmten Zeitabständen vorgenommen werden.
Geeignete Nährstoffquellen zur Verwendung als limitierender Nährstoff beinhalten Kohlenstoffquellen, beispielsweise Xylose, Maltose, Ribose, Fructose, Saccharose oder Glucose, Magnesium, Phosphat und Sulfat und insbesondere Stickstoff, wenn ein keinen Stickstoff enthaltender Metabolit hergestellt werden soll. Vorzugsweise ist die als limitierender Nährstoff verwendete Nährstoffquelle in jedem Austauschzyklus nicht ein Nährstoff, der für die Herstellung des Verfahrensprodukts primär wichtig ist, wie die Stickstoffquelle in einem Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts. Strategien zum Austausch der Kohlenstoffquelle als wachstumslimitierender Nährstoff können insbesondere mit Glucose und Fructose erfolgen.
In jedem erfindungsgemäßen Verfahren sind geeignete Strategien zur regelmäßigen Änderung des limitierenden Nährstoffs während des Verfahrens abhängig von dem Verfahren und insbesondere von dem fadenförmigen Mikroorganismus, der in diesem verwendet wird.
Geeignete Strategien zur Änderung des limitierenden Nährstoffs beinhaltenden folgende, insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts durch Kultivation eines Fusarium- Stammes vorgesehene Maßnahmen:
a) eine Strategie, bei der die Kultur regelmäßig überwacht und der limitierende Nährstoff geändert wird, wenn es ein Anzeichen dafür gibt, daß die Mikroorganismus-Population in der Kultur aufgrund der Bildung einer unerwünschten Variante begonnen hat, sich ungünstig zu ändern. In dieser Strategie können drei verschiedene Nährstoffquellen alternativ als limitierender Nährstoff wie folgt verwendet werden:
1. Kohlenstoffquelle, z.B. Glucose
2. Magnesiumquelle
3. Phosphatquelle.
Dieser Zyklus der limitierenden Nährstoffe wird während der Verfahrensführung wiederholt. In einem typischen Fall betragen bei Verwendung von Fusarium graminearum (Schwabe) als Mikroorganismus die Zeitabstände zwischen der Änderung des limitierenden Nährstoffs beispielsweise:
von Kohlenstoffquelle zur Magnesiumquelle: nach 20 Tagen von Magnesiumquelle zur Phosphatquelle: nach 14 Tagen.
b) eine bevorzugte Strategie für den allgemeinen Einsatz in dem Verfahren der Erfindung ist es, die Nährstofflimitierung in regelmäßigen Abständen von 7 Tagen beginnend mit einem Chemostaten, dessen Kohlenstoffgehalt anfänglich limitiert ist. Der Zyklus ist geeigneterweise folgender:
1. Kohlenstoffquelie
2. Magnesiumquelle
3. Phosphatquelle
4. Sulfatquelle
In vielen Fällen ist ein Zyklus der limitierenden Nährstoffe, der während des gesamten Verfahrens wiederholt wird, eine bevorzugte Strategie. Vorzugsweise sind die vorgeschlagenen limitierenden Nährstoffe nicht wichtig für die Herstellung des Verfahrensprodukts. Es wäre beispielsweise keine bevorzugte Strategie, Sulfat als limitierenden Nährstoff zur Herstellung eines antibiotischen Heilmittels zu verwenden, in das Sulfat während der Synthese eingebaut wird.
Während der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die verdünnungsrate geeigneterweise herabgesetzt, wenn der Austausch des limitierenden Nährstoffs bewirkt wird, z.B. in einer Menge im Bereich von 0,05 bis 0,10 h&supmin;¹, um jegliche ungewünschte Variante aus der Mikroorganismus-Population wirksam zu entfernen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiele

Problem

Die Erzeugung von hochverzweigten Varianten (Kolonien von Varianten) bei der Bereitstellung von "Fusarium graminearum" A 3/5 (Wildtyp) (IMI 145425, CMI CC Nr. 346, 762) während lang anhaltender kontinuierlicher Kultur.

Ziel

Entwicklung von Strategien, mit denen das Einsetzen der Übernahme von Kolonien der Variante in der Kultur verhindert oder verzögert werden kann.

Experimentelles

a) Ziel

Untersuchung der wirkungen verschiedener Nährstofflimitierungen in Bezug auf die Fähigkeit von Kolonien von Varianten, den Wildtyp-Stamm während der kontinuierlichen Kultivierung zu ersetzen. Es wurden zwei Kolonievarianten verwendet: -i) CCI-1 - eine Variante, die bei Kohlenstofflimitierung in einer Laborfermentationseinrichtung entstand.
ii) C106 - eine Variante, die während des Betriebs einer Herstellungsanlage entstand.

b) Strategie

Die Fermentationseinrichtung wurde sowohl mit Wildtyp- als auch mit Varianten-Stämmen beimpft und ergab etwa 5-40 % Varianten in der Population. Dann wurde die Mischkultur kontinuierlich bei einer Vielzahl von Nährstofflimitierungen, nämlich Kohlenstoff, Ammoniak, Magnesium und Sulfat gezüchtet.

c) Daten

Experimente mit CCI-I

Fig. 1 zeigt die CCI-1 Variante, die erstmalig nach ungefähr 100 Generationen entdeckt wurde, und spontan in einer kontinuierlichen Kultur von A 3/5 während einer Fermentation von A 3/5 unter Glucose-Limitierung entstand. Nach ungefähr weiteren 100 Generationen machte CCI-1 mehr als 90 % der Gesamtpopulation aus.
Fig. 2 zeigt, daß CCI-1 einen Selektions-Koeffizienten (S) von -0,039 Generationen &supmin;¹ bei Magnesium-Limitierung besaß.
Fig. 3 zeigt, daß CCI-1 bei Wachstum in einer Ammoniak-limitierten Kultur etwa konstant blieb.
Fig. 4 zeigt, daß CCI-1 bei Wachstum in einer Sulfatlimitierten Chemostat-Kultur ungefähr konstant blieb.
Auf ähnliche Weise konnte die CCI-1-Übernahme verhindert werden, wenn von Glucose-limitiertem Medium zu Fructose-limitiertem Medium übergegangen wurde. CCI-1 vermehrte sich von 10,6 ± 1,1 % der Population zu 42,1 ± 14,5 % der Population während des Glucose-limitierten Wachstums (Verdünnungsrate D 0,16 h&supmin;¹). Nach Übergang von Glucose- auf Fructose-limitiertes Medium blieb der Anteil von CCI-1 in der Population mit 40,6 ± 2,1 % konstant.
Es wurde festgestellt, daß CCI-1 sich nicht in einer Population in Xylose-limitiertem Medium (S = -0,06 Generationen&supmin;¹) vermehrte, obwohl er sich in Maltoselimitiertem Medium (S = 0,09 Generationen&supmin;¹ und Riboselimitiertem Medium (S = 0,09 Generationen&supmin;¹) vermehrte.
Fig. 5 zeigt durch CCI-1 verdrängten Wildtyp A 3/5, bei Wachstum in einer Glucose-limitierten Kultur (S = 0 + 0,145 Generationen&supmin;¹).
Fig. 6 zeigt, wie CCI-1 Übernahme verhindert werden kann.
Am Anfang steht die Kultur unter Glucose-Limitierung und CCI-1 beginnt den Wildtyp zu verdrängen. Nach etwa 40 Generationen wurde die Kultur auf Magnesium-Limitierung umgestellt und die Zunahme von CCI-1 wurde gestoppt. Die gepunktete Linie zeigt den vorhergesagten Anstieg von CCI-1 bei Beibehaltung der Glucose-Limitierung.

Experimente mit C106

Fig. 7 zeigt, daß bei Glucose-Limitierung (S = -0,02 Generationen&supmin;¹) C106 abnahm und A 3/5 sich vermehrte. Nach ungefähr 40 Generationen wurde die Kultur auf Sulfat- Limitierung umgestellt. Während des Sulfat-limitierten Wachstums verblieb C106 bei einem etwa konstanten Stand (S ungefähr 0).
Fig. 8 zeigt, daß C106 bei Ammoniak-Limitierung (S = -0,03 Generationen&supmin;¹) abnahm und A 3/5 sich vermehrte. Nach ungefähr 35 Generationen wurde die Kultur auf Magnesium-Limitierung umgestellt. Während des Magnesiumlimitierten Wachstums verdrängte C106 den Wildtyp (S = 0,15 Generationen&supmin;¹) schnell. Nach ungefähr 55 Generationen wurde die Kultur auf Kohlenstoff-Limitierung umgestellt. Nach der Umstellung nahm C106 in der Population ab (S = -0,02 Generationen&supmin;¹, siehe Fig. 7). Während dieses Zeitraums wurden in der Population neue Kolonievarianten entdeckt (ungefähr 75 Generationen vom Beginn des Experiments und 20 Generationen nach der Umstellung von Magnesium- auf Kohlenstoff-Limitierung). Diese Mutanten vermehrten sich in der Population schnell. Nach ungefähr 95 Generationen wurde die Kultur auf Ammoniak-Limitierung umgestellt. Zu diesem Zeitpunkt erreichte(n) die neuen Kolonievariante(n) einen Anteil von etwa 40 %. Während des Ammoniak-limitierten Wachstums wurde die Vermehrung der neuen Kolonievariante(n) gestoppt. Bei Phosphat-Limitierung (S = -0,04 Generationen&supmin;¹) nahm C106 ab und A 3/5 vermehrte sich.
Fig. 9 zeigt, daß bei Magnesium-Limitierung mit einer Verdünnungsrate D von 0,06 h&supmin;¹ C106 den Wildtyp verdrängte (S = 1,1 Generationen&supmin;¹, verglichen mit S = 0,15 Generationen&supmin;¹ bei D = 0,19 h&supmin;¹). In Fig. 10 verdrängte der Wildtyp C106 bei Glucose-Limitierung und einer Verdünnungsrate D von 0,06 h&supmin;¹. Nach ungefähr 15 Generationen wurde die Kultur auf Magnesium-Limitierung umgestellt. Während dieses Zeitraums (siehe Fig. 10) wuchs C106 schnell an (S = 1,2 Generationen&supmin;¹). Bei Rückumstellung auf Glucose-Limitierung fielen die C106- Gehalte wieder ab (ungefähr 25 Generationen).
Die Zusammensetzungen der verwendeten relevanten Vogels-Medien sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt.
Diese Daten zeigen, daß Bedingungen mit Kohlenstoff- Limitierung die Population von C106 unterdrücken und während langer Zeitraume in Abwesenheit von CCI-1 tolerierbar sind. CCI-1 kann kontrolliert und in einigen Fällen reduziert werden bei Sulfat- oder Magnesium- Limitierungsbedingungen und kann bei Stickstoff- Limitierungsbedingungen stabilisiert werden. Dies zeigt, daß es durch Überwachung der vorhandenen Varianten und geeigneter Änderung der Bedingungen der Wachstums- Limitierung bei geringer Population möglich ist, den Zeitpunkt hinauszuschieben, zu dem ein Herstellungsverfahren beendet werden muß, da die unerwünschten Organismen die gewünschten Organismen verdrängt bzw. überwachsen haben. Tabelle - Zusammensetzung des modifizierten Vogels-Mediums

Experimentelle Verfahren

Vorrichtung: Ein kommerziell verfügbarer kontinuierlicher Fermentationsapparat mit Vorrichtungen für Luft- und Nährstoff zufuhr, verkauft von Braun unter dem Handelsnamen Biostat M (2 Liter) wurde verwendet.
Kulturvolumen: 2000 ml
Medium: modifiziertes Vogels-Medium (siehe Tabelle)
Antischaummittel: 0,25 % (v/v) Polypropylenglykol (gemischtes Molekulargewicht)
pH: gehalten bei 5,8 ± 0,1 (durch Zugabe von 2M NaOH- Lösung)
Luftdruck: 1,6 l x min&supmin;¹
Rührgeschwindigkeit: 1400 U/min.
Temperatur: 25ºC
Verdünnungsrate: 0,19 h&supmin;¹ (wenn nicht anders angegeben)
Biomasse: etwa 2 g Trockengewicht pro Liter Kulturmedium (für alle Limitierungen)
Feststellung der Zusammensetzung der Population: Die Zusammensetzung der Population wurde festgestellt, indem Zählungen von lebensfähigem Material auf mit Agar verfestigtem Vogels-Medium durchgeführt wurden. Proben aus dem Fermenter wurden in sterilem destillierten Wasser verdünnt und 0,1 ml der Suspension wurde auf 10 bis 15 Agarplatten ausgestrichen, was 20 bis 60 Kolonien pro Platte ergab. Die Kolonie bildenden Einheiten (abgeleitet von entweder Mycel-Fragmenten oder Sporen) wurden nach 72 Stunden Inkubation bei 25ºC gezählt. Kolonien der Mutanten konnten von Wildtyp-Kolonien unterschieden werden, da jene dichte Kolonien bildeten, deren Durchmesser sich langsam vergrößerte und sie wurden getrennt von den Wildtyp- Kolonien gezählt. In etwa 24-stündigen oder 48-stündigen Abständen wurden Zählungen von lebensfähigem Material durchgeführt.
Limitierender Nährstoff: Stammlösungen wurden, wie in der Tabelle gezeigt, hergestellt. Diese waren hinsichtlich eines bestimmten Nährstoffes limitiert. Bei Übergang auf einen anderen limitierenden Nährstoff war ein Zeitraum von 1 bis 48 Stunden erforderlich, damit der Gehalt des bestimmten Nährstoffs in dem Fermentergefäß wie gewünscht reduziert wurde, da der Nährstoff bei den vorherigen Bedingungen im Überschuß vorlag.

Strategien

Beispielsweise aus Fig. 6 und Fig. 8 ist ersichtlich, daß die folgende Strategie vorteilhaft ist. Änderung der Nährstofflimitierung beim ersten Anzeichen, daß die Zusammensetzung der Population ungünstig wird, wobei die folgenden Limitierungen verwendet werden:
a) Glucose-Limitierung für 20 Tage, wonach Kolonien von Mutanten in 1% der Population erscheinen
b) Wechsel auf Mg²&spplus;-Limitierung für 14 Tage, wobei die Kolonien der Mutanten nun 1,5% der Population einnehmen
c) Wechsel auf PO&sub4;³&supmin;-Limitierung
Dieses Verfahren hält die Population der Kolonien der Mutanten während eines langen Zeitraums unterhalb der kritischen Bereiche.
Der Wechsel der Limitierung kann verbunden werden mit einer zeitweisen Abnahme der Verdünnungsrate, um die kontaminierende Mutante aus der Population wirksamer zu entfernen (siehe beispielsweise Fig. 9 und 10, verglichen mit der höheren Verdünnungsrate in Fig. 8).
Eine alternative Strategie ist es, die Nährstoff- Limitierung in regelmäßigen Abständen von sieben Tagen zu ändern, wie aus Fig. 8 ersichtlich ist.
Die Sequenz kann wie folgt sein:
Glucose-Limitierung bis Tag 7
Mg²&spplus;-Limitierung bis Tag 14
PO&sub4;³&supmin;-Limitierung bis Tag 21
SO&sub4;²&supmin;-Limitierung bis Tag 28
Glucose-Limitierung bis Tag 35
Mg²&spplus;-Limitierung
und so weiter
oder
Glucose-Limitierung bis Tag 7
Mg²&spplus;-Limitierung bis Tag 14
Glucose-Limitierung
und so weiter.
a) ist die bevorzugte Strategie, aber wenn das Verfahren verschiedene Arten der Limitierung ausschließt (beispielsweise wenn die Stickstoffquelle in einem Verfahren zur Herstellung von Protein nicht limitiert wird, wenn Sulfat bei der Herstellung eines Antibiotikums, das Sulfat zur Synthese erfordert, nicht limitiert wird), dann kann es erforderlich sein, die unter b) vorgeschlagene Strategie zu verfolgen.

Claims

1. Verfahren zur Kultivierung Kultur eines fadenförmigen Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur eines fadenförmigen Mikroorganismus in einem Kulturmedium, dem Kohlenstoffquellen und weitere zweckmäßige Nährstoffe zugeführt werden, und Kohlenstoff oder eine weitere Nährstoffquelle der Kultur in einer wachstumslimitierenden Menge zugeführt wird, und einen limitierenden Nährstoff für diese darstellt, wobei die Entwicklung einer Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, indem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierender Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoffzufuhr zu der Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierender Nährstoff ersetzt.

2. Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Produkts durch Kultivierung eines fadenformigen Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Kulturmedium, dem Kohlenstoffquellen und weitere zweckmäßige Nährstoffe zugeführt werden und Kohlenstoff oder eine weitere Nährstoffquelle der Kultur in einer wachstumsbegrenzenden Menge zugeführt wird und einen limitierenden Nährstoff für diese darstellt und der fadenförmige Mikroorganismus von der Kultur abgetrennt wird, wobei die Entwicklung einer Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, indem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierender Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoff zufuhr zu der Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierender Nährstoff ersetzt.

3. Verfahren zur Herstellung eines Metabolits durch Kultivierung eines fadenförmigen Mikroorganismus in kontinuierlicher Kultur in einem Kulturmedium, dem Kohlenstoffquellen und weitere zweckmäßige Nährstoffe zugeführt werden, wobei der Kohlenstoff oder eine weitere Nährstoffquelle der Kultur in einer wachstumslimitierenden Menge zugeführt wird und einen limitierenden Nährstoff für diese darstellt und Wiedergewinnung des Metabolits aus dem hergestellten fadenförmigen Mikroorganismus oder aus dem Kulturmedium, wobei die Entwicklung einer Variante des fadenförmigen Mikroorganismus eingeschränkt und/oder verzögert wird, indem eine erste Nährstoffquelle der Kultur als limitierender Nährstoff zugeführt wird und dann die Nährstoff zufuhr zu der Kultur so geändert wird, daß eine zweite Nährstoffquelle die erste Nährstoffquelle als limitierenden Nährstoff ersetzt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der fadenförmige Mikroorganismus ein Stamm des Genus Fusarium ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei drei oder mehr unterschiedliche Nährstoffquellen abwechselnd als limitierender Nährstoff verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Nährstoffquellen als limitierender Nährstoff entsprechend eines regelmäßigen Zyklus verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Ersatz der Nährstoffquellen als limitierende Nährstoffe in bestimmten Zeitabständen durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die als limitierender Nährstoff verwendeten Nährstoffquellen ausgewählt werden aus Kohlenstoff, Magnesium, Phosphat, Sulfat und Stickstoff.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Änderung des limitierenden Nährstoffs die Verdünnungsrate verringert wird.