DE69128308T2

DE69128308T2 - Verfahren zur Herstellung von Hefe-Glucanen

Info

Publication number: DE69128308T2
Application number: DE69128308T
Authority: DE
Inventors: Jan Raa; Borre Robertson; Gunnar Rorstad
Original assignee: Biotec Mackzymal ASA
Current assignee: Arcticzymes Technologies ASA
Priority date: 1990-07-06
Filing date: 1991-07-04
Publication date: 1998-03-26
Anticipated expiration: 2011-07-05
Also published as: EP0466037A2; EP0466037A3; ES2109929T3; CA2040374C; NO912645L; JP2828799B2; AU628752B2; CA2040374A1; EP0466037B1; JPH04253703A; FI913275L; FI104537B; GR3026130T3; US5401727A; DE69128308D1; AU7933891A; NO305705B1; FI913275A0; DK0466037T3; ATE160787T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Hefe- Glucans.

Hintergrund der Erfindung

Impfstoffe und Antibiotika sind derzeit die einzigen beiden anerkannten Mittel zum Schutz von Wassertieren der Klassen Osteichthyes und Crustacea gegen Krankheiten in Wasser-Zuchtanlagen. Jedoch können verschiedene pathogene Krankheiten, die durch Bakterien, Viren, Pilze und Protozoen hervorgerufen werden, nicht in wirksamer Weise durch Impfung verhindert oder durch Antibiotika behandelt werden. Einige Arbeitskreise auf diesem Gebiet haben versucht, alternative prophylaktische Behandlungen für Wassertiere der Klassen Osteichthyes und Crustacea in Wasser- Zuchtanlagen zu entwickeln, insbesondere unter Verwendung von immunostimulatorischen Verbindungen.
Obgleich wenig über das Immunsystem von Fischen und Schalentieren bekannt ist, scheinen einige die Verbindungen die Fähigkeit von Fisch-Makrophagen zur Abtötung von Mikroorganismen zu verstärken. Es wurde berichtet, daß abgetötete Mycobakterien und Muramyl-Peptide die Widerstandsfähigkeit von Regenbogenforellen (Salmo gairdneri Richardson) gegen verschiedene Pathogene erhöhen. Ferner hat es den Anschein, daß Extrakte von Meeres-Manteltierchen die Resistenz von amerikanischen Aalen (Anguilla rostrata LeSeur) gegen Infektionen durch Aeromonas hydraphila erhöhen. Jedoch wurde für keine dieser Verbindungen gezeigt, daß sie geeignete Mittel zum Schutz von Fischen oder Schalentieren gegen Krankheiten in Wasser-Zuchtanlagen darstellen.
Es wurden auch immunostimulatorische Verbindungen identifiziert, die in Säugetiersystemen wirksam sind, beispielsweise Glucan. Der Ausdruck "Glucan" bezeichnet allgemein eine Vielzahl von Sacchariden, die Glucose als einzige Glycosyleinheit enthalten. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß bestimmte β-1,3-Glucane starke Aktivatoren der Makrophagen/Monozyten-Zellreihe und von Komplement sowie von Lymphozyten von warmolütigen Versuchstieren darstellen. Es gibt sogar einige Hinweise darauf, daß Glucan die Abwehrmechanismen von Gliederfüßer- und Pflanzenwirten aktivieren kann. Es wurden aber noch keine Untersuchungen veröffentlicht, die belegen, daß Hefe-Glucane tatsächlich als Immunostimulatoren bei Wassertieren der Klassen Osteichthyes (wie Lachs und Forelle) und Schalentieren (wie Hummer und Garnele) in Wasser-Zuchtanlagen wirken.
Manners et al. beschreibt in J. Microbiology, Bd. 80 (1974), S. 411- 417 ein unlösliches Glucan aus den Zellwänden der Hefen Kloeckera apiculata, Schizosaccharo myces pombe, Saccharomyces fragilis und Saccharomyces fermentati, die ähnliche heterogene Eigenschaften wie Saccharomyces cerevisiae zeigen.
Manners et al. beschreibt in Biochem. J., Bd. 135 (1973), S. 19-30 die Herstellung eines β-1,3-Glucans aus Bäckerhefe, wobei das Verfahren eine Behandlung mit β-1,6-Glucanase umfaßt.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Glucan-Präparats bereitzustellen, das sich zur Verabreichung an Wassertiere der Klassen Osteichthyes und Crustacea in Wasser-Zuchtanlagen eignet.
Erfindungsgemäß haben wir ein Verfahren zur Herstellung eines Hefe- Glucans aufgefunden, das aus Glucopyranose-Einheiten zusammengesetzt ist, die durch β-1,3-Glycosidbindungen verknüpft sind, und mindestens eine Verzweigung aus Glucopyranose-Einheiten, die durch β-1,6-Glycosidbindungen verknüpft sind, aufweist, wobei das Verfahren aus folgenden Stufen besteht:
(a) Alkaliextraktion von geeigneten, glucanhaltigen Hefezellen mit einer geeigneten wäßrigen Alkali-Extraktionslösung unter geeigneten Bedingungen zur Bereitstellung eines ersten unlöslichen Heferückstands;
(b) heiße Alkaliextraktion des ersten unlöslichen Heferückstands mit einer geeigneten wäßrigen Alkali-Extraktionslösung unter geeigneten Extraktionsbedingungen, wobei die heiße Alkaliextraktion mindestens 2 mal und vorzugsweise 2 bis 5 mal durchgeführt wird, um einen zweiten unlöslichen Heferückstand bereitzustellen, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach der heißen Alkaliextraktion; anschließend
(c) Waschen des zweiten unlöslichen Heferückstands unter geeigneten Bedingungen mit Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7, wodurch man einen dritten unlöslichen Heferückstand bereitstellt, und Gewinnen des dritten unlöslichen Heferückstands nach dem Waschen;
(d) Hydrolysieren des dritten unlöslichen Heferückstands mit einer geeigneten hydrolysierenden Säure unter geeigneten Hydrolysebedingungen, wobei die Säurehydrolyse mindestens 3 mal durchgeführt wird, wodurch ein fester unlöslicher Heferückstand bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jeder Säurehydrolyse; anschließend
(e) Sieden des vierten unlöslichen Heferückstands unter geeigneten Bedingungen in Wasser, wobei das Sieden des vierten unlöslichen Heferückstands mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch man einen fünften unlöslichen Heferückstand erhält, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Siedevorgang; und
(f) Sieden des fünften unlöslichen Heferückstands unter geeigneten Bedingungen in Ethanol, wobei das Sieden des fünften Heferückstands in Ethanol mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch ein sechster unlöslicher Heferückstand bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Siedevorgang; und anschließend
(g) Waschen des sechsten unlöslichen Heferückstands unter geeigneten Bedingungen mit Wasser, wobei das Waschen des sechsten unlöslichen Heferückstands mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch ein Hefe-Glucan bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Waschvorgang.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan oder einer Kontrolldiät gefüttert worden ist, nach Furunkulose- Exposition (Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida).
Fig. 2 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan oder einer Kontrolldiät gefüttert worden ist, nach Exposition mit Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Fig. 3 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan oder einer Kontrolldiät gefüttert worden ist, nach Exposition mit klassischer Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01).
Fig. 4 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist, nach Exposition mit klassischer Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01).
Fig. 5 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist, nach Exposition mit Rotmaul-Krankheit (Yersinia ruckeri).
Fig. 6 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan, D,L-Glucan oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist, nach Exposition mit Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Fig. 7 zeigt die kumulative Mortalität von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan, einem Impfstoff gegen Furunkulose, M-Glucan und einem Impfstoff für Furunkulose oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist, nach Furunkulose-Exposition (Aeromonas salmonicidia subspecies salmonicida).
Fig. 8 zeigt den spezifischen Antikörper-Spiegel von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan, einem Impfstoff gegen klassische Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01), M-Glucan und einem Impfstoff gegen Vibriose oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist.
Fig. 9 zeigt den spezifischen Antikörper-Spiegel von Atlantik-Lachs, der mit M-Glucan, einem Impfstoff gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida), M-Glucan und einem Impfstoff gegen Kaltwasser-Vibriose oder einer Kontroll-Kochsalzlösung behandelt worden ist.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wir haben festgestellt, daß eine spezielle Klasse von Hefe-Glucanen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind, sehr wirksam als prophylaktisches Arzneimittel für Wassertiere der Klassen Osteichthyes und Crustacea ist.
Osteichthyes ist eine gewerblich wichtige Klasse von Fischen, die (ohne Einschränkung hierauf) Fische aus folgender Gruppe umfaßt: Lachse, Forellen, Weißfische, Katzenfische, Milchfische, Karpfen, Buntbarsche (wie Tilapia), Delphine (auch bekannt als Mahi-mahi), Störe, Löffelstöre, Flußbarsche (wie Glasaugenfische, Hechtbarsche und Gelbbarsche), Grashechte und Pompano-Makrelen (wie Gelbschwanzfische), Seebarsche (wie Grouper-Fische), Streifenbarrel, Goldbrassen (wie Meerbrassen), Kabeljau, Plattfische (wie Flunder, Heilbutt, Steinbutt und Scholle), Sonnenfische, Heringe, Sardellen, Stintfische, Hechte, Schnappbarsche (wie roter Trommelfisch oder Rotbarsch), Trommelfische, Seebarben, Rabbit-Fische, Makrelen, Thunfische, Kugelfische und Aale (wie amerikanische, europäische und asiatische Aale). Bei diesen Fischen handelt es sich im allgemeinen um Fische folgender Familien: Salmonidae (einschließlich der Unterfamilie Coregonidae), Ictaluridae, Chanidae, Cyprinidae, Cichlidae, Coryphaenidae, Acipenseridae, Polyodontidae, Percidae, Serranidae, Percichthyidae, Carangidae, Sparidae, Gadidae, Bothidae, Pleuronectidae, Soleidae, Clupeidae, Engraulidae, Osmeridae, Esocidae, Lutjanidae, Sciaenidae, Mugilidae, Siganidae, Scombridae, Centrarchidae, Tetraodontidae, Anguillidae, Muraenidae und Congridae. Dieses prophylaktische Arzneimittel wird als besonders wertvoll zum Schutz von Mitgliedern der Familie Salmonidae angesehen, die aus folgender Gruppe ausgewählt sind: Salmo salar, Salmo clarkii, Salmo gairdneri, Salmo trutta, Oncorhynchus keta, Oncorhynchus gorbuscha, Oncorhynchus tshawytscha, Oncorhynchus kisutch, Oncorhynchus nerka, Salvelinus alpinus, Salvelinus fontinalis, Salvelinus malma und Salvelinus namaycush. Ferner wird dieses prophylaktische Arzneimittel auch als geeignet zum Schutz von Aquanumfischen und/oder Zierfischen, die für eine Hobby-Haltung in Salzwasser oder Süßwasser-Aquarien als geeignet angesehen.
Crustacea ist eine gewerblich wichtige Unterabteilung von Schalentieren, zu denen (ohne Beschränkung hierauf) Schalentiere aus folgender Gruppe gehören: Garnelen, Krabben (wie Macrobrachium-Krabben) Hummer (wie Stachelhummer und spanischer oder Slipper-Hummer), Panzerkrebse und Krebse (wie Krebse aus der Gruppe Teufelskrabben, Steinkrebse, Felsenkrebse, Höhlenkrebse, Schneekrebse und Blaukrebse). Dieses prophylaktische Arzneimittel wird als besonders wertvoll zum Schutz von Mitgliedern der Familie Penaoidae aus folgender Gruppe angesehen: Penaeus monodon, Penaeus chinensis, Penaeus indicus, Penaeus stylirostris, Penaeus merguiensis, Penaeus vannamei, Metepeneus ensis, Penaeus setiferus, Penaeus japonis, Penaeus aztecus, Penaeus duorarum, Penaeus semisulcatus, Penaeus teraoi, Penaeus orientalis, Penaeus plebejus und Penaeus kerathurus.
Ferner wird dieses prophylaktische Arzneimittel als wirksam zur Behandlung von Hummern angesehen, wie Hummer der Familien Homoridae und Palinuridae, die aus folgener Gruppe ausgewählt sind: Homarus americanus, Homarus gammarus, Palinarus elephas, Palinarus interruptus, Palinarus argus und Nephrops norvegicus.
Glucan bezeichnet im allgemeinen verschiedene Polyglucane. Das hier beschriebene Glucan bezieht sich jedoch auf Polyglucosen, die aus Hefezellwänden erhalten worden sind und bei denen es sich um verzweigte oder unverzweigte Ketten von Glucopyranose-Molekülen (oder -Einheiten) handelt, die vorwiegend durch β-1,3- und β-1,6-Glycosidbindungen miteinander verknüpft sind. Aus unseren Versuchen mit Hefe-Glucanen ergibt sich, daß Glucane mit einer Kette von Glucopyranose-Einheiten, die durch β-1,3-Bindungen verknüpft sind, und mindestens eine Verzweigung von Glucopyranose- Einheiten, die durch β-1,6-Bindungen verknüpft sind, aufweisen, das wirksamste prophylaktische Arzneimittel für Wassertiere der Klassen Osteichthyes und Crustacea darstellen. Beim besonders bevorzugten Glucan handelt es sich um eine Kette mit etwa 400 bis etwa 1500 Glucopyranose-Einheiten, die vorwiegend β-1,3-Glycosidbindungen aufweisen, wobei mindestens eine damit verbundene Verzweigung von Glucopyranose-Einheiten daran vorwiegend über β-1,6-Glycosidbindungen gebunden ist. Jede der Verzweigungen, die aus vorwiegend über β-1,6-Glycosidbindungen gebundene Glucopyranose-Einheiten zusammengesetzt ist, soll vorzugsweise 1 bis etwa 10 Glucopyranose-Einheiten aufweisen. Insbesondere weist jede Verzweigung 1 bis 6 Glucopyranose-Einheiten auf.
Beim bevorzugten Glucan handelt es sich um ein Hefe-Glucanpräparat mit der Bezeichnung M-Glucan. M-Glucan ist ein stark verzweigtes Glucan, das aus einer Kette von durch β-1,3-Glycosidbindungen gebundenen Glucopyranose-Einheiten mit daran gebundenen Verzweigungen von etwa 1 bis 6 Glucopyranose-Einheiten, die durch β-1,6-Glycosidbindungen gebunden sind, besteht. Dieses Glucan ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es in verdünnten Alkali- und Säurelösungen sowie in Ethanol unlöslich ist.
Geeignete Glucane lassen sich aus verschiedenen mikrobiellen Quellen herstellen. Eine nicht-erschöpfende Liste für derartige Quellen ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle I Beispiele für Glucan-Quellen, die verwendet werden können:
Bei den bevorzugten mikrobiologischen Quellen für geeignete Glucane für die erfindungsgemäße Praxis handelt es sich um Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis und Pichia pastoris.
Das Glucan läßt sich aus mikrobiellen Quellen unter Anwendung geeigneter, dem Fachmann geläufiger Extraktionsmaßnahmen herstellen. Ein Verfahren zur Extraktion von Glucanen aus den Zellwänden von Saccharomyces cerevisiae bedient sich der aufeinanderfolgenden Extraktion mit heißem Alkali und Essigsäure unter anschließendem Waschen mit wäßrigen Waschflüssigkeiten, um lösliche Bestandteile der Zellwände zu entfernen. Das restliche unlösliche Material ist das in Frage stehende Glucan-Produkt.
Zum Extrahieren des bevorzugten M-Glucans sollte das nachstehende Extraktionsverfahren angewandt werden. Zunächst soll die Hefe mit Alkali mindestens 1 mal extrahiert werden, indem man die Hefe in einer wäßrigen Alkalilösung von etwa 50 g trockener Hefe/Liter einer wäßrigen Alkalilösung bis etwa 300 g trockener Hefe/Liter einer wäßrigen Alkalilösung suspendiert. Die wäßrige alkalische Extraktionslösung soll eine Alkalikonzentration von etwa 2 Gew.-%/Liter bis etwa 6 Gew.-%/Liter aufweisen. Die in der alkalischen Extraktionslösung verwendete Alkaliverbindung kann aus der Gruppe NaOH, KOH, Ca(OH)&sub2; und Na&sub2;CO&sub3; ausgewählt werden. Die Suspension, die die Hefe und die wäßrige Alkalilösung enthält, soll bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20ºC bis etwa 30ºC etwa 16 Stunden bis etwa 30 Stunden gelagert werden. Der durch die Alkaliextraktion bereitgestellte unlösliche Heferückstand kann vom Überstand durch beliebige geeignete, dem Fachmann geläufige Trennmaßnahmen abgetrennt werden, wozu (ohne Beschränkung hierauf) eine Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation gehören. Der durch die Trennmaßnahme gewonnene unlösliche Heferückstand soll anschließend mit einem heißen wäßrigen Alkaligemisch extrahiert werden.
Der unlösliche Heferückstand kann anschließend in einer zweiten wäβrigen-alkalischen Extraktionslösung suspendiert werden, und zwar in einer Menge von etwa 50 g trockener Hefe/Liter wäßriger alkalischer Extraktionslösung bis etwa 300 g trockener Hefe/Liter wäßriger alkalischer Extraktionslösung. Die Konzentration der vorstehend angegebenen Alkaliverbindung soll im Bereich von etwa 1 Gew.-%/Liter bis etwa 4 Gew.-%/Liter liegen. Die Temperatur, bei der der unlösliche Heferückstand in der wäβrigen alkalischen Extraktionslösung suspendiert wird, soll im Bereich von etwa 60 bis etwa 100ºC bei einer Extraktionszeit im Bereich von etwa 1 Stunde bis etwa 6 Stunden liegen. Die Suspension soll dann auf Raumtemperatur abgekühlt werden, vorzugsweise indem man die Suspension über Nacht bei Raumtemperatur beläßt.
Anschließend wird der durch die heiße wäßrige Alkaliextraktion erhaltene unlösliche Heferückstand durch beliebige geeignete, dem Fachmann geläufige Maßnahmen abgetrennt, wozu (ohne Beschränkung hierauf) eine Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation gehören. Nach dem Gewinnen des unlöslichen Heferückstands soll die heiße Extraktion mit der wäßrigen Alkalilösung vorzugsweise 2 mal und insbesondere etwa 2 bis etwa 5 mal durchgeführt werden, wonach der unlösliche Heferückstand am Ende einer jeden Extraktion gewonnen wird.
Im Anschluß an die Extraktion des unlöslichen Heferückstands mit der heißen wäßrigen Alkalilösung soll der pH-Wert des unlöslichen Heferückstands auf den Bereich von etwa 4 bis etwa 7 mit einer geeigneten wäßrigen Säure (Beispiele hierfür sind anorganische Säuren, wie Salzsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure, oder organische Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Oxalsäure und andere derartige Säuren) gebracht und mit Wasser gewaschen werden. Die Waschvorgänge werden durchgeführt, indem man den unlöslichen Heferückstand in Wasser suspendiert, sodann rührt und hierauf eine Abtrennung des unlöslichen Heferückstands vom Wasser durch beliebige geeignete Trennmaßnahmen, wie Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation, vornimmt.
Im Anschluß an die alkalische Extraktion und die Waschvorgänge soll der unlösliche Heferückstand einer milden Säurehydrolyse unterworfen werden. Der unlösliche Heferückstand soll mit einer wäßrigen Säure, die aus der Gruppe Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure ausgewählt ist, in Kontakt gebracht werden. Die hydrolysierende Säure soll in einer wäßrigen Konzentration von etwa 0,05 Mol/Liter bis etwa 1 Mol/Liter bereitgestellt werden. Der unlösliche Heferückstand soll in einer Menge von etwa 10 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter wäßriger hydrolysierender Säure bis etwa 50 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter wäßriger hydrolysierender Säure vermischt werden. Das Gemisch aus dem unlöslichen Heferückstand und der wäßrigen hydrolysierenden Säurelösung soll etwa 3 Stunden bis etwa 6 Stunden bei einer Temperatur von etwa 60ºC bis etwa 90ºC belassen werden. Der unlösliche Heferückstand wird sodann von der wäßrigen hydrolysierenden Säurelösung durch beliebige geeignete, dem Fachmann geläufige Trennmaßnahmen abgetrennt, wozu (ohne Beschränkung hierauf) eine Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation unter geeigneten Bedingungen gehören. Nachdem der unlösliche Heferückstand aus dem Gemisch gewonnen worden ist, soll die Säurehydrolyse mindestens 3 mal und vorzugsweise etwa 3 bis etwa 10 mal durchgeführt werden, wobei der erhaltene unlösliche Heferückstand am Ende einer jeden Extraktion gewonnen wird.
Nach der letzten Extraktion soll der erhaltene unlösliche Heferückstand in einer Konzentration von etwa 10 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter Wasser bis etwa 50 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter Wasser dispergiert und sodann etwa 0,5 bis etwa 2 Stunden einer Siedebehandlung unterzogen werden. Dieser Vorgang soll mindestens 2 mal und vorzugsweise etwa 2 bis etwa 6 mal durchgeführt werden. Zwischen den einzelnen Behandlungen mit siedendem Wasser kann der unlösliche Heferückstand aus der flüssigen Phase durch beliebige geeignete Trennmaßnahmen, wie eine Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation, gewonnen werden.
Der unlösliche Heferückstand soll ferner in einer Menge von etwa 20 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter Ethanol bis etwa 100 g (Trockengewicht) des unlöslichen Heferückstands/Liter Ethanol dispergiert und etwa 0,1 bis 2 Stunden einer Siedebehandlung unterworfen werden. Der unlösliche Heferückstand kann nach Abkühlung durch beliebige geeignete Trennmaßnahmen, wie eine Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation, gewonnen werden. Der Siedevorgang in Ethanol soll mindestens 2 mal und vorzugsweise etwa 2 bis etwa 6 mal durchgeführt werden.
Schließlich soll der unlösliche Heferückstand mindestens 2 mal und vorzugsweise etwa 2 bis etwa 6 mal mit Wasser bei Raumtemperatur gewaschen werden. Nach jedem Waschvorgang mit Wasser kann der unlösliche Heferückstand durch beliebige geeignete Trennmaßnahmen, einschließlich Filtration, Querstromfiltration oder Zentrifugation, gewonnen werden.
Geeignete Glucane lassen sich auch aus dem Nebenprodukt eines Hefeextrakts, der gebildet worden ist, indem man den nach Extraktion der Hefe erhaltenen unlöslichen Rückstand einer weiteren Alkaliextraktion und Säurebehandlung unterwirft, herstellen.

Verabreichungswege und -verfahren

Die Glucane lassen sich nach einer Anzahl von Verabreichungswegen verabreichen, wozu (ohne Beschränkung hierauf) folgende Wege gehören: enteral (oral), über eine wäßrige Einwirkung und parenteral (Injektion, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) intradermal, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär). Bei Verabreichung an Wassertiere der Klasse Osteichthyes oder der Unterabteilung Crustacea kann das Glucan in Form eines Gemisches mit einem herkömmlichen Exzipiens, d. h. geeigneten, pharmazeutisch verträglichen organischen und anorganischen Trägersubstanzen, die mit dem Glucan nicht in nachteiliger Weise reagieren, verwendet werden. Zu geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Trägern gehören (ohne Beschränkung hierauf) Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi arabicum, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Polyethylenglykole, Gelatine, Kohlenhydrate, wie Lactose, Amylose oder Stärke, und dergl. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsstoffen, z. B. Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern oder dergl., die mit dem Glucan nicht in nachteiliger Weise reagieren, vermischt werden. Sie können auch gegebenenfalls mit anderen Wirkstoffen, wie Vitaminen, vereinigt werden. Für eine parenterale Verabreichung eignen sich insbesondere injizierbare, sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen sowie Suspensionen oder Emulsionen. Für eine enterale (orale) Verabreichung können die Glucane auch oral in trockener oder feuchter Form oder gegebenenfalls im Gemisch mit Wasser-Futtermitteln gegeben werden. Ferner kann das Glucan gleichzeitig mit mindestens einem geeigneten, antimikrobiellen Mittel und/oder mindestens einem geeigneten Impfstoff verabreicht werden. Wenn ein Glucan und ein antimikrobielles Mittel und/oder ein Impfstoff verabreicht werden, können die einzelnen Mittel nacheinander verabreicht werden, oder das Glucan kann mit einem oder mehreren antimikrobiellen Mitteln oder Impfstoffen vereinigt und als eine einzige Zusammensetzung verabreicht werden.
Die Menge des pro kg Gewicht des Wassertiers bereitgestellten Glucans soll ausreichen, um eine immunostimulatorische Wirkung bei dem Wassertier, dem das Glucan gegeben wird, zu erzielen. Die wirksame Menge an injiziertem Glucan pro kg Körpergewicht des Wassertiers soll im Bereich von etwa 5 mg Glucan/kg Biomasse bis etwa 100 mg Glucan/kg Biomasse liegen. Wird das Glucan oral in trockener Form bereitgestellt, so soll die Menge des Glucans pro kg Körpergewicht im Bereich von etwa 5 mg Glucan/kg Biomasse bis etwa 100 mg Glucan/kg Biomasse bei täglicher Bereitstellung liegen. In trockener Form, beispielsweise in trockenen Futtermitteln für Wassertiere soll die Menge des Glucans im Futtermittel im Bereich von 1 g Glucan/kg Futtermittel bis 10 g Glucan/kg Futtermittel liegen. Futtermittel für Wassertiere der Klasse Osteichthyes und der Unterabteilung Crustacea sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die tatsächlichen bevorzugten Mengen an Glucan in einem speziellen Fall je nach den speziellen zubereiteten Zusammensetzungen, der Verabreichungsart, der speziellen Behandlungsstelle und dem speziellen zu behandelnden Organismus variieren. Die Dosierung für einen gegebenen Wirt kann unter Heranziehung üblicher Erwägungen festgelegt werden, beispielsweise aufgrund eines üblichen Vergleichs der Aktivitätsunterschiede zwischen dem Glucan und einem bekannten Mittel, indem man sich beispielsweise geeigneter, herkömmlicher pharmakologischer Vorgehensweisen bedient. Nach Verabreichung des Glucans kann eine Verzögerung eintreten, bevor erstmals eine immunostimulatorische Wirkung festgestellt wird. Dies bedeutet, daß die Widerstandsfähigkeit gegen Krankheiten nicht sofort verstärkt wird; es ist vielmehr anzunehmen, daß eine derartige immunostimulatorische Wirkung innerhalb von 14 Tagen nach der Verabreichung beobachtet wird. Wird das Glucan durch orale Fütterung verabreicht, so kann ebenfalls eine bestimmte Verzögerung festgestellt werden, wobei sich jedoch nach etwa 21-tägiger Fütterung eine verstärkte Krankheitsresistenz zeigen sollte. Sofern das Glucan auf einer täglichen oder haibtägigen Basis bereitgestellt wird, sollte die verstärkte Krankheitsresistenz anhalten. Auch dann, wenn die Verfütterung von Glucan beendet wird, soll die verstärkte Krankheitsresistenz anhalten, wobei die Dauer von der Dosierung/kg Biomasse und der Dauer der Glucan-Fütterung abhängt.
Die folgende Reihe von Beispielen dient der Erläuterung und soll den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.

Beispiel I

Dieses Beispiel zeigt die Vorgehensweise zur Herstellung eines immunostimulatorischen Glucans.
500 g trockene Saccharomyces cerevisiae wurden in 3 Liter einer 6 gew.-%igen, wäßrigen NaOH-Lösung suspendiert. Diese Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Rühren wurde die Suspension 25 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der unlösliche Rückstand wurde sodann in 3 Liter einer 3%igen NaOH resuspendiert und 3 Stunden bei 75ºC inkubiert, wonach die Suspension über Nacht abgekühlt wurde. Sodann wurde die Suspension 25 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der Rückstand wurde sodann gemäß den vorstehenden Angaben in 3%iger NaOH resuspendiert, erwärmt und zentrifugiert.
Der verbleibende unlösliche Rückstand wurde sodann mit Essigsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt. Der unlösliche Rückstand wurde anschließend 3 mal mit 2 Liter Wasser gewaschen und nach jedem Waschvorgang durch 25-minütige Zentrifugation bei 2000 x g gewonnen (der Überstand wurde jeweils abgegossen). Anschließend wurde der Rückstand in 3 Liter einer 0,5 M wäßrigen Essigsäure suspendiert. Die Suspension wurde 3 Stunden auf 90ºC erwärmt. Anschließend wurde die Suspension auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach dem Abkühlen wurde der unlösliche Rückstand durch 25-minütige Zentrifugation bei 2000 x g gewonnen. Diese Behandlung (nach Einstellung des pH-Werts auf 4,5 zur Gewinnung des abgekühlten Rückstands) wurde 7 mal wiederholt.
Anschließend wurde der unlösliche Rückstand in 3 Liter destilliertem Wasser suspendiert und 30 Minuten bei 100ºC gerührt. Sodann wurde er abgekühlt und 25 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Der unlösliche Rückstand wurde 4 mal auf diese Weise gewaschen. Anschließend wurde der Rückstand in 2 Liter Ethanol suspendiert und 2 Stunden auf 78ºC erwärmt. Dieser Waschvorgang mit Ethanol wurde 4 mal wiederholt. Sodann wurde der Rückstand 4 mal mit 3 Liter destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gewaschen, um etwaige Spuren von Ethanol zu entfernen.

Beispiel II

Dieses Beispiel erläutert die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Furunkulose (Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida).
Brutfische von Antlantik-Lachs mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in 200 Liter fassenden Durchflußtanks, die mit belüftetem Süβwasser (jeweils auf etwa 12ºC gehalten) versorgt wurden, gehalten. Eine erste Gruppe von 60 Lachsen erhielt Trockenfutter in einer Menge von 1% des Fischgewichts pro Tag. Das Lachsfutter enthielt 1 g M-Glucan pro kg Trockenmasse. Die Lachse wurden 12 Wochen auf diese Weise gefüttert, bevor sie einer Belastung mit Furunkulose ausgesetzt wurden. In ähnlicher Weise wurde eine Kontrollgruppe von 60 weiteren Lachsen mit dem Lachsfutter ohne M-Glucan 12 Wochen gefüttert. Am Ende der 12-wöchigen Periode wurden die beiden Lachsgruppen zusammen in den gleichen Tank gebracht und einer Belastung mit Furunkulose ausgesetzt, indem man eine Anzahl von Lachsen, die durch eine intraperitoneale Injektion von 0,1 ml Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 1 x 10³ Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida pro Fisch infiziert worden waren, zusetzte. Die Anzahl der zugesetzten infizierten Fische entsprach 10% (12 Fische) der Gesamtzahl der Fische im Tank. Nachdem die beiden Lachsgruppen vereinigt worden waren, erhielten sie eine Fütterung mit dem Kontrollfutter.
Fig. 1 gibt die prozentuale Mortalität während der gesamten Testperiode wieder. Der endgültige prozentuale Mortalitätswert der mit M-Glucan gefütterten Lachse war um etwa 33% geringer als bei den Kontrollachsen.
Die verringerten prozentualen Mortalitätswerte für die mit M-Glucan gefütterten Lachse zeigen, daß M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel für Fische der Klasse Osteichthyes gegen Funrunkulose (Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida) wirksam ist. Dieses Beispiel belegt ferner, daß M-Glucan in wirksamer Weise in einem Wasser-Futtermittel als prophylaktisches Arzneimittel gegen Krankheiten verwendet werden kann.

Beispiel III

Dieses Beispiel erläutert die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Kaitwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Antlantik-Lachse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurde von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen. Die Lachse wurden in 200 Liter fassenden Durchflußtanks, die mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 9-10ºC gehalten) versorgt wurden, gehalten. Nach 70 Tagen wurde das Wasser gegen belüftetes Meerwasser mit Umgebungstemperatur (etwa 9- 10ºC) ausgewechselt. Das Meerwasser wurde durch Zupumpen von Wasser aus einer nahegelegenen gewerblichen Lachszuchtanstalt, in der zu diesem Zeitpunkt Kaltwasser-Vibriose ausgebrochen war, erhalten. In einem ersten Dreifachversuch erhielten willkürlich eingeteilte Gruppen von 50 Lachsen handelsübliche Trockenpellets in einer Menge von 1% des Körpergewichts pro Tag. Das trockene Futter enthielt 1 g M-Glucan pro 1 kg Futter. In ähnlicher Weise wurde ein zweiter Dreifachversuch mit willkürlich eingeteilten Kontrollgruppen von 50 Lachsen durchgeführt, wobei das gleiche Lachsfutter ohne M-Glucan verfüttert wurde.
Fig. 2 stellt die prozentualen gesamten Mortalitätswerte für beide Fütterungsgruppen bei einer natürlichen Infektion mit Kaltwasser-Vibriose, die durch das Meerwasser am 70. Tag nach Versuchsbeginn eingeschleppt worden ist, dar. Die mit M-Glucan in ihrem Futter versorgten Lachse zeigten im Vergleich zu den Kontrollachsen ohne M-Glucan eine signifikant verringerte prozentuale Mortalität. Dieses Beispiel belegt, daß M-Glucan die Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida) verstärkt. Dieses Beispiel belegt auch, daß M-Glucan in wirksamer Weise in einem Wasser-Futtermittel als prophylaktisches Arzneimittel gegen diese Krankheit verwendet werden kann.

Beispiel IV

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen klassische Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01).
Antlantik-Lachse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen. Die Lachse wurde in 200 Liter fassenden Durchflußtanks, die mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 12ºC gehalten) versorgt wurden, gehalten. Eine erste Gruppe von 40 Lachsen erhielt 5 Wochen eine Fütterung in einer Menge von 1% des Körpergewichts pro Tag mit einem Trockenfutter, das 1 g M-Glucan pro 1 kg Futter enthielt. Eine Kontrollgruppe von 40 Lachsen erhielt 5 Wochen eine Fütterung in der gleichen Menge mit einem Kontrolifutter ohne M-Glucan. Nach den 5 Wochen wurden die beiden Gruppen in einem einzigen Tank vereinigt. Sodann wurden sie 45 Minuten Meerwasser mit 1 x 10&sup6; Vibrio anguillarum 01 pro ml ausgesetzt. Nach dieser Einwirkung wurde das Wasser allmählich wieder gegen Süßwasser ausgetauscht. Die Fische erhielten das Kontrollfutter.
In Fig. 3 sind die prozentualen Mortalitätswerte während der gesamten Testdauer dargestellt. Der endgültige prozentuale Mortalitätswert für mit M-Glucan gefütterte Lachse betrug etwa 15%, während die Mortahtät bei der Kontrollgruppe etwa 85% betrug. Die verringerten prozentualen Mortalitätswerte für die mit M-Glucan gefütterten Lachse zeigen, daß M- Glucan ein wirksames prophylaktisches Arzneimittel für Fische der Klasse Osteichthyes gegen Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01) darstellt. Dieses Beispiel belegt auch, daß M-Glucan in wirksamer Weise in einem Wasser-Futtermittel als prophylaktisches Arzneimittel gegen diese Krankheit verwendet werden kann.

Beispiel V

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01).
Atlantik-Lachse mit einem durchschnittlichen Gewicht von 20 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutf ischerzeuger bezogen. Der Lachs wurde in 200 Liter fassenden Durchflußtanks, die mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 12ºC gehalten) versorgt wurden, gehalten. Eine erste Gruppe von 40 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 2 mg M-Glucan in einer isotonischen Kochsalzlösung. Eine Kontrollgruppe von 40 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung. Beide Lachsgruppen wurden während der gesamten Versuchsdauer mit handelsüblichen trockenen Pellets gefüttert.
3 Wochen nach der Injektion erhielten beide Gruppen eine intraperitoneale Injektion von 5 x 10&sup4; lebenden Bakterienzellen von Vibrio anguillarum Serotyp 01 pro Lachs. Fig. 4 zeigt einen Vergleich der prozentualen Mortalitätswerte der Kontrollgruppe und der ersten Gruppe (die M-Glucan erhielt). Wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, ergibt sich eine signifikante Verringerung (etwa 45º) der prozentualen Mortalitätswerte für die erste Gruppe, die M-Glucan durch intraperitoneale Injektion erhalten hatte. Die verringerten prozentualen Mortalitätswerte für den mit M-Glucan behandelten Lachs belegen, daß M-Glucan ein wirksames prophylaktisches Arzneimittel gegen klassische Vibriose darstellt. Diese Daten zeigen auch, daß M- Glucan in wirksamer Weise durch Injektion verabreicht werden kann.

Beispiel VI

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen die enterische Rotmaulkrankheit (Yersinia ruckeri).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 20 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 12ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine erste Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 2 mg M-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung Eine Lachs-Kontrollgruppe erhielt eine Injektion von 0,2 ml einer Lösung, die nur aus isotonischer Kochsalzlösung bestand. Beide Lachsgruppen wurden während der gesamten Versuchsdauer mit handelsüblichen trockenen Pellets gefüttert. Nach 3 Wochen erhielten beide Lachsgruppen eine intraperitoneale Injektion von 10&sup4; lebenden Bakterienzellen Yersinia rucken pro Lachs.
In Fig. 5 sind die prozentualen Mortalitätswerte für beide Lachsgruppen dargestellt. Aus den kumulativen prozentualen Mortalitätswerten für die Gruppe, die M-Glucan erhielt, ist ersichtlich, daß die Mortalität um etwa 20% geringer war als bei der Kontrollgruppe, die nur die isotonische Kochsalzlösung erhalten hatte. Diese Ergebnisse belegen, daß M-Glucan ein wirksames prophylaktisches Mittel gegen die enterische Rotmaulkrankheit darstellt. Diese Daten belegen auch, daß M-Glucan in wirksamer Weise durch Injektion verabreicht werden kann.

Beispiel VII

Dieses Beispiel vergleicht die Wirksamkeit von M-Glucan und D,L-Glucan als prophylaktische Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere von Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 20 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 9-10ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine erste Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 2 mg M-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung.
Eine zweite Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 2 mg D,L-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung Das D,L-Glucan war aus Saccharomyces cerevisiae-Zellen gemäß dem Verfahren von Diluzio (1979), Int. J. Cancer, Bd. 24, 5. 773-779, hergestellt worden. Eine Lachs-Kontrollgruppe erhielt eine Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung Sämtliche drei Gruppen wurden während der gesamten Versuchsdauer mit handelsüblichen trockenen Pellets gefüttert. Nach 3 Wochen erhielten alle drei Gruppen von Lachsen eine intraperitoneale Injektion von 5 x 10&sup5; lebenden Bakterienzellen von Vibrio salmonicida pro Fisch.
In Fig. 6 sind die prozentualen Mortalitätswerte für die einzelnen Gruppen dargestellt. Die Kontrollgruppe zeigte eine prozentuale endgültige Mortalität von etwa 96%. Die mit D,L-Glucan behandelte Gruppe von Lachsen zeigte eine endgültige prozentuale Mortalität von etwa 75%. Die mit M-Glucan behandelte Gruppe von Lachsen zeigte eine endgültige prozentuale Mortalität von etwa 30%. Wie aus Fig. 6 ersichtlich ist, bewirken Glucane eine erhöhte Resistenz von Atlantik-Lachs gegen die Krankheit im Vergleich zu unbehandeltem Lachs. Ferner ist auch ersichtlich, daß M-Glucan im Vergleich zu D,L-glucan eine signifikant höhere Resistenz gegen die Krankheit bewirkt.

Beispiel VIII

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als Adjuvans für einen Impfstoff zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Furunkulose (Aeromonas salmonicida subspecies salmonicida).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 9-10ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine erste Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 0,5 mg M-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung. Eine zweite Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion eines Furunkulose-Impfstoffs, die von der Fa. Apothekernes Laboratorium A.S., Tromsc, Norwegen, bezogen worden war. Eine dritte Gruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 0,5 mg M-Glucan und dem Furunkulose-Impfstoff. Eine Kontrollgruppe von 50 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung 3 Monate nach der Injektion wurde bei sämtlichen Gruppen eine Furunkulose-Reizung vorgenommen, indem man eine Gruppe von Lachsen, die eine Furunkulose-Injektion erhalten hatte, in einer Anzahl von Fischen, die 10% der Gesamtzahl der vorhandenen Lachse entsprach, zuführte. Die Fische erhielten während der gesamten Versuchsdauer handelsübliche Trockenpellets. Sämtliche Gruppen von Lachsen wurden nach der Reizung durch das Zusammenleben mit Furunkulose-infizierten Fischen im gleichen Tank gehalten.
In Fig. 7 sind die prozentualen Mortalitätswerte für die Testperiode angegeben. Die mit Kochsalzlösung behandelten Fische wiesen endgültige prozentuale Mortalitätswerte von etwa 42% auf. Die mit dem Impfstoff behandelten Fische zeigten einen endgültigen prozentualen Mortalitätswert von etwa 38%. Bei den mit M-Glucan behandelten Fischen betrug der endgültige prozentuale Mortalitätswert 28%. Die mit einer Kombination aus M- Glucan und dem Impfstoff behandelten Fische zeigten eine endgültige prozentuale Mortalität von 20%. Wie aus den Daten ersichtlich ist, stellt die Kombination von M-Glucan mit dem Furunkulose-Impfstoffe die wirksamste Maßnahme zur Verstärkung der Resistenz von Lachsen gegen Furunkulose dar. Diese Ergebnisse belegen, daß M-Glucan in wirksamer Weise als Adjuvans für handelsübliche Impfstoffe zur Verstärkung der Resistenz von Fischen gegen eine anschließende Infektion verwendet werden kann.

Beispiel IX

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als Adjuvans für einen Impfstoff zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 8-10ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine Gruppe von 150 Fischen erhielt 4 Wochen lang handelsübliche Trockenpellets, die mit Glucan (1 g/kg Futter) angereichert waren. Zwei weitere Gruppen von jeweils 150 Lachsen erhielten die handelsüblichen Trockenpellets ohne Glucan. Nach der 4-wöchigen Fütterung erhielten die mit Glucan gefütterte Gruppe und eine der ohne Glucanzusatz gefütterten Gruppen eine Tauchimpfung mit einem Impfstoff gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida). Beim Impfstoff handelte es sich um ein Handelsprodukt der Fa. Norbio A/S, Bergen, Norwegen. Die dritte Gruppe von Fischen verblieb ohne Impfung. Nach weiteren 6 Wochen erhielten alle drei Gruppen von Fischen eine intraperitoneale Reizinjektion von 1 x 10&sup6; Bakterienzellen von Vibrio salmonicida. Die Fütterung wurde jeweils bis zur Sättigung vorgenommen.
Die Gruppe von 150 Fischen, die vor der Impfung 4 Wochen eine Glucanfütterung erhalten hatte, wies nach der Reizeinwirkung eine endgültige Mortalität von 10% auf. Die ohne Glucanzusatz gefütterte, geimpfte Gruppe wies einen endgültigen Mortalitätswert von 44% auf. Die ohne Glucanzusatz gefütterte, ungeimpfte Gruppe wies einen endgültigen Mortalitätswert von 83% auf. Diese Daten zeigen die Wirksamkeit von Glucan als Adjuvans für handelsübliche Impfstoffe für Wassertiere, insbesondere Lachs, auch bei Verabreichung im Futtermittel.

Beispiel X

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als Adjuvans für einen Impfstoff zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen klassische Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 12ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine erste Gruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 1,0 mg M-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung. Eine zweite Gruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion mit einem Impfstoff gegen klassische Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01), und zwar mit einem Handelsprodukt der Fa. Norbio A.S. Bergen, Norwegen. Eine dritte Gruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 1,0 mg M- Glucan und Vibriose-Impfstoff. Eine Kontrollgruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung Die Fische wurden während der gesamten Versuchsdauer mit handelsüblichen Trockenpellets gefüttert. Sämtliche Gruppen von Lachsen wurden im gleichen Tank gehalten. 6 Wochen nach der Injektion wurden sämtliche Fische durch einen Schlag auf den Kopf getötet. Blut wurde aus der Schwanzvene entnommen. Die Konzentrationen an spezifischen Serum-Antikörpern gegen Vibrio anguillarum Serotyp 01 wurden durch ELISA-Technik gemessen.
In Fig. 8 sind die spezifischen Antikörper-Konzentrationen von Seren von Atlantik-Lachs, die mit M-Glucan, Impfstoff gegen klassische Vibriose (Vibrio anguillarum Serotyp 01), M-Glucan und Impfstoff gegen Vibriose oder einer Kochsalzlösung-Kontrolle behandelt wurden, dargestellt. Die Daten zeigen, daß Glucan in hoch signifikanter Weise (p = 0,0015) die Konzentrationen an spezifischen Antikörpern gegen den Impfstoff erhöht.
Diese Ergebnisse belegen, daß M-Glucan in wirksamer weise als Adjuvans mit handelsüblichen Impfstoffen zur Erhöhung der Resistenz von Fischen gegen eine anschließende Infektion verwendet werden kann.

Beispiel XI

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als Adjuvans für einen Impfstoff zur Verstärkung der Resistenz von Fischen der Klasse Osteichthyes, insbesondere Atlantik-Lachs (Salmo salar), gegen Kaltwasser-Vibriose (Vibrio salmonicida).
Atlantik-Lachs-Brutfische mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30 g pro Fisch wurden von einem lokalen Brutfischerzeuger bezogen und in einem 200 Liter fassenden Durchflußtank, der mit belüftetem Süßwasser (auf etwa 8-10ºC gehalten) versorgt wurde, gehalten. Eine erste Gruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 1,0 mg M-Glucan in isotonischer Kochsalzlösung. Eine zweite Gruppe von 10 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion mit einem Kaltwasser-Vibriose-Impfstoff (Vibrio salmonicida) der von der Fa. Norbio A/S, Bergen, Norwegen, bezogen worden war. Eine dritte Gruppe von 8 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml einer Suspension mit einem Gehalt an 1,0 mg M-Glucan und dem Vibriose-Impfstoff. Eine Kontrollgruppe von 10 Lachsen erhielt eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml isotonischer Kochsalzlösung Die Fische wurden während der gesamten Versuchsdauer mit handelsüblichen Trockenpellets gefüttert.
Sämtliche Gruppen von Lachsen wurden im gleichen Tank gehalten. 10 Wochen nach der Injektion wurden sämtliche Fische durch einen Schlag auf den Kopf getötet. Blut wurde aus der Schwanzvene entnommen. Die Konzentrationen an spezifischem Serum-Antikörper gegen Vibrio salmonicida wurden durch ELISA-Technik gemessen.
In Fig. 9 sind die spezifischen Antikörper-Konzentrationen von Seren von Atlantik-Lachs, die mit M-Glucan, Impfstoff gegen Kaltwasser- Vibriose (Vibrio salmonicida), M-Glucan und Impfstoff gegen Kaltwasser-Vibriose oder einer Kochsalzlösung-Kontrolle behandelt wurden, dargestellt. Die Daten zeigen, daß Glucan eine signifikante (p = 0,04) Erhöhung der spezifischen Antikörper-Konzentrationen gegen den Impfstoff hervorruft.
Diese Ergebnisse belegen, daß M-Glucan in wirksamer Weise als Adjuvans mit handelsüblichen Impfstoffen zur Erhöhung der Resistenz von Fischen gegen eine anschließende Infektion verwendet werden kann.

Beispiel XII

Dieses Beispiel zeigt den relativen prozentualen Schutz, den Fische der Klasse Osteichthyes, insbesondere Atlantik-Lachse, durch M-Glucan erhalten. Die Daten in Tabelle 2 wurden auf ähnliche Weise wie in den Beispielen II-VIII unter den in Tabelle II angegebenen Modifikationen erhalten.
Wie aus Tabelle II ersichtlich ist, bietet M-Glucan einen signifikanten Schutz für Fische der Klasse Osteichthyes, insbesondere Lachs, gegen verschiedene Krankheiten.

Erläuterungen zu Tabelle II

a) Die angegebenen Mengen an M-Glucan, die in 0,2 ml Kochsalzlösung suspendiert waren, wurden intraperitoneal (i.p.) den einzelnen Fischen injiziert. Die Kontrolifische erhielten eine intraperitoneale Injektion von 0,2 ml Kochsalzlösung. Die Fische wurden 1 bis 8 Wochen später durch eine intraperitoneale Injektion des bakteriellen Pathogens gereizt. Die Dosis pro Fisch ist in Klammern angegeben. Bei den einzelnen Versuchen wurde die gesamte Mortalität addiert, nachdem sich die Mortalität eingependelt hatte, d. h. 40 Tage nach der Impfung in Versuch 1; 20 Tage nach der Impfung in den Versuchen 2, 3, 4, 5, 6 und 12; 25 Tage nach der Impfung in den Versuchen 7 und 8; und 13 Tage nach der Impfung in den Versuchen 9, 10, 11 und 12. Der relative prozentuale Schutz (RPP) ist durch die folgende Formel definiert:
RPP = 100% (1 - % Mortalität in der Glucan-Gruppe/ % Mortalität in der Kontrollgruppe)
b) In den Versuchen 7 und 8 erhielten die Fische 4 Wochen nach der Injektion von Glucan eine Reizdosis von 8 x 10³ bzw. 7 x 10&sup4; Vibrio anguillarum Serotyp 01. Da keine Mortalität festgestellt wurde, erhielten die Fische 8 Wochen nach der Glucan-Injektion eine weitere Reizdosis.

Beispiel XIII

Dieses Beispiel belegt die Wirksamkeit von M-Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Verstärkung der Resistenz von Schalentieren der Unterabteilung Crustacea und speziell der großen Tigerkrabbe (Penaeus monodon), gegen Krankheiten.
Juvenile große Tigerkrabben (Penaeus monodon) wurden in einer Dichte von 200 PL50 jeweils in 6 Glasfasertanks, die in einem Durchflußsystem mit sterilisiertem Meerwasser versorgt wurden, gehalten. Die Krabben erhielten während der Tageslichtstunden kontinuierlich Futter mit einer automatischen Fütterungsvorrichtung, und zwar entweder handelsübliches Krabbenfutter (3 Tanks) oder handelsübliches Futter, das pro kg Futter mit 5 g Glucan aus Saccharomyces cerevisiae angereichert war. Die Krabben wurden 5 Wochen gefüttert, bevor in jeden Tank ein Meerwasser-Homogenisat einer moribunden Krabbe aus einer gewerblichen Krabbenfarm gegeben wurde. Diese Krabben waren Träger eines Virus und einer gemischten Flora von sekundären infektiösen Organismen (z. B. Vibrio harengii und Vibrio parahemolytiens). Die Anzahl der Krabben in jedem Tank wurde nach 7 Wochen ermittelt. Die Daten zeigen innerhalb der 7 Wochen bei der Kontrollgruppe eine Gesamtmortalität von 80% und von 50% bei der Gruppe, die mit dem mit Glucan angereicherten Futter gefüttert worden war.
Diese Daten belegen die Wirksamkeit von oral verabreichtem Glucan als prophylaktisches Arzneimittel zur Erhöhung der Überlebensrate von Krabben in wäßrigen Kulturen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Hefe-Glucans, das aus Glucopyranose-Einheiten zusammengesetzt ist, die durch β-1,3-Glycosidbindungen verknüpft sind, und mindestens eine Verzweigung aus Glucopyranose-Einheiten, die durch β-1,6-Glycosidbindungen verknüpft sind, aufweist, wobei das Verfahren aus folgenden Stufen besteht:

(a) Alkaliextraktion von glucanhaltigen Hefezellen mit einer wäßrigen Alkali-Extraktionslösung zur Bereitstellung eines ersten unlöslichen Heferückstands;

(b) heiße Alkaliextraktion des ersten unlöslichen Heferückstands mit einer wäßrigen Alkali-Extraktionslösung, wobei die heiße Alkaliextraktion mindestens 2 mal und vorzugsweise 2 bis 5 mal durchgeführt wird, um einen zweiten unlöslichen Heferückstand bereitzustellen, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach der heißen Alkaliextraktion; anschließend

(c) Waschen des zweiten unlöslichen Heferückstands mit Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7, wodurch man einen dritten unlöslichen Heferückstand bereitstellt, und Gewinnen des dritten unlöslichen Heferückstands nach dem Waschen;

(d) Hydrolysieren des dritten unlöslichen Heferückstands mit einer hydrolysierenden Säure, wobei die Säurehydrolyse mindestens 3 mal durchgeführt wird, wodurch ein fester unlöslicher Heferückstand bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jeder Säurehydrolyse; anschließend

(e) Sieden des vierten unlöslichen Heferückstands in Wasser, wobei das Sieden des vierten unlöslichen Heferückstands mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch man einen fünften unlöslichen Heferückstand erhält, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Siedevorgang; und

(f) Sieden des fünften unlöslichen Heferückstands in Ethanol, wobei das Sieden des fünften Heferückstands in Ethanol mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch ein sechster unlöslicher Heferückstand bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Siedevorgang; und anschließend

(g) Waschen des sechsten unlöslichen Heferückstands mit Wasser, wobei das Waschen des sechsten unlöslichen Heferückstands mindestens 2 mal durchgeführt wird, wodurch ein Hefe-Glucan bereitgestellt wird, und Gewinnen des unlöslichen Heferückstands nach jedem Waschvorgang.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Glucan enthaltende Hefe ausgewählt wird unter Candida utilis, Candida tropicalis, Geotrichum candidum, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kloeckera brevis, Kloeckera apiculata, Kluyveromyces bulgaricus, Kluyveromyces fragilis, Phaffia rhodozyma, Pichia fermentans, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Glucan enthaltende Hefe ausgewählt wird unter Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis und Pichia pastoris.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei der Glucan enthaltenden Hefe um Saccharomyces cerevisiae handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die in den Stufen (a) und (b) verwendete wäßrige alkalische Extraktionslösung unter NaOH, KOH, Ca(OH)&sub2; und Na&sub2;CO&sub3; ausgewählt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die hydrolysierende Säure von Stufe (d) unter Essigsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure ausgewählt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die saure Hydrolyse 3 bis 10 Minuten durchgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Siedebehandlung des vierten unlöslichen Heferückstands 2 bis 6 Minuten durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der fünfte unlösliche Heferückstand 2 bis 6 mal einer Siedebehandlung in Ethanol unterzogen wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der sechste unlösliche Heferückstand 2 bis 6 mal mit Wasser gewaschen wird.