DE69128109T2

DE69128109T2 - Nachweisreagens

Info

Publication number: DE69128109T2
Application number: DE69128109T
Authority: DE
Inventors: Haruma Kawaguchi; Takeshi Miyazaki
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2011-07-13
Also published as: EP0466170A3; US5656506A; EP0466170A2; ATE160019T1; EP0466170B1; DE69128109D1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Detektionsreagenz, welches feste Feinpartikel umfaßt, die eine gegenüber einer in einer Testprobe zu detektierenden Substanz immunologisch wirksame Substanz immobilisieren und für verschiedene immunologische Nachweise und Assays verwendet werden können.

Verwandter Stand der Technik

Das Latexagglutinier-Immunoassay-Verfahren (LAIA), welches die Gegenwart von Antigenen usw. testet, indem eine Substanz, welche spezifisch mit der wie unten bezeichneten immunologisch aktiven Substanz, wie einem Antigen etc., reagiert, mit einer Dispersion reagieren gelassen wird, die feste Feinpartikel, wie Polystyrol etc., mit einer darauf getragenen, immunologisch wirksamen Substanz, wie einem Antikörper etc., enthält und in einem flüssigen Medium, wie Wasser etc., dispergiert ist (Latex- Reagenz), und die dadurch auftretende Agglutination beobachtet wird, ist durch J. M. Singer et al, Am. J. Med., 21, 885 (1956) gefunden worden, und danach wurden verschiedene Untersuchungen durchgeführt.
Das Testverfahren unter Gebrauchmachung des LAIA, welches das Ausmaß der Agglutination mit der Sinnesausübung der Ansicht prüft, hat, obgleich ein quantitativer Test schwierig sein mag, den Vorteil, daß der Test einfach ist und ferner das Ergebnis in kurzer Zeit erhalten werden kann und deshalb in der Praxis angewandt worden ist und breit gebraucht wurde für verschiedentliche Nachweise.
Ferner ist es in den letzten Jahren möglich geworden, einen quantitativen Test durch den LAIA zu machen, indem das Ausmaß der der Reaktion entsprechenden Agglutination mittels der optischen Veränderungen ermittelt wird gemäß eines optischen Verfahrens unter Gebrauchmachung optischer Instrumente, und ein solcher quantitativer Assay wird nunmehr breit praktiziert.
Das für den LAIA zu verwendende Latex-Reagenz besitzt, wie oben beschrieben, in einem flüssigen Medium dispergierte, feste Feinteilchen, die einen Antikörper etc. darauf immobilisiert aufweisen.
Da jedoch eine Dispersion von festen Feinteilchen ein im wesentlichen instabiles System darstellt und deshalb, wenn z.B. für lange Zeit gelagert, leicht eine Agglutination von festen Feinteilchen auftritt, und wenn die Agglutination eingetreten ist, ergeben sich Probleme, wie die Verringerung der Testempfindlichkeit etc. Ferner kann im Falle des Auftauens nach der Lagerung in gefrorenem Zustand kein gut dispergierter Zustand an festen Feinteilchen wiederhergestellt werden, so daß es in den meisten Fällen unmöglich wird, als Reagenz eingesetzt zu werden.
Demgemäß erforderte das Latex-Reagenz spezielle Beachtung bezüglich dessen Lagerung.
Als ein Weg zur Lösung eines solchen Problems bezüglich der Lagerungsstabilität ist die Methode untersucht worden, die Lagerungsstabilität in Form eines trockenen Produktes zu erhöhen durch Trocknen des Latex-Reagenzes als Dispersion.
Zum Beispiel offenbart die Japanische Patentanmeldungs- Offenlegungsschrift Nr. 58-73866 eine Methode, in welcher ein agglutinierbares Immunoreagenz, wie das Latex-Reagenz etc., in einer Kapillare eingebracht wird und vor der Lagerung gefriergetrocknet wird.
Nebenbei erwähnt ist das in den trockenen Zustand gebrachte Latex-Reagenz zwar ausreichend anwendbar für einen qualitativen Assay, jedoch hat es sich als unzureichend zur Anwendung für einen quantitativen Assay unter Verwendung eines optischen Verfahrens erwiesen.
Speziell tritt, wenn das Latex-Reagenz getrocknet wird durch eine Methode wie der Verdampfung, der Sprühtrocknung, der Gefriertrocknung, der Vakuumtrocknung etc., eine Agglutination zwischen den festen Feinteilchen auf, wodurch ein gleichförmig dispergierter Zustand der festen Feinteilchen während der Resuspendierung nicht mehr erhalten werden kann und keine quantitative Analyse mit guter Reproduzierbarkeit vorgenommen werden kann.
Als ein Verfahren zum Verbessern der Redispergierbarkeit des trockenen Latex-Reagenzes offenbart z.B. die Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungsschrift Nr. 52-117420 ein Verfahren, bei dem ein Latex-Reagenz, dem wasserlöslicher Zucker, wie Lactose etc., zugegeben wurden, unter einem solchen Zustand gefriergetrocknet wird, um ein Trockenprodukt zu ergeben.
Obgleich die Redispergierbarkeit des trockenen Latex-Reagenzes beträchtlich verbessert wurde durch die Zugabe von wasserlöslichen Zuckern, bleibt gemäß diesem Verfahren noch das Problem, daß keine ausreichende Redispergierbarkeit erhalten werden kann, die in quantitativen Analysen unter Verwendung eines optischen Systems erforderlich ist.
Demgemäß gibt es das Verfahren der Erhöhung der zugegebenen Menge an Additiv, wie den Zuckern zur Verstärkung der Redispergierbarkeit, jedoch ruft die Verwendung einer großen Menge an Additiv einen schädlichen Einfluß hervor, z.B. daß die Sensitivität der immunologischen Reaktion verringert wird, und die Erhöhung der zugegebenen Menge ist begrenzt.
Ferner gibt es das Verfahren der Erhaltung eines gleichförmigeren redispergierten Zustandes durch Rühren der Dispersion für eine lange Zeit oder bei einer hohen Rührintensität, jedoch kann die Rührbehandlung unter strengen Bedingungen zu einer Zerstörung des Bindezustandes zwischen der immunologisch wirksamen Substanz und den festen Feinteilchen oder der Zerstörung der immunologisch wirksamen Substanz selbst führen, und deshalb können, je nach gebundenem Zustand zwischen der immunologisch wirksamen Substanz und den festen Feinteilchen bzw. der Art der immunologisch wirksamen Substanzen, diese Verfahren nicht angewandt werden.
Die GB-A-2 027 031 betrifft ein aktiviertes Latex, welches erhalten wurde durch Behandeln diskreter Teilchen eines Latex- Trägers, an welchen ein wasserlösliches proteinhaltiges Material mit einer aktivierenden Substanz kovalent gebunden wird, wobei der aktivierte. Latex als Reagenz zur Verwendung in einem Agglutinationstest zur Bestimmung von z.B. Myoglobin geeignet ist.
Die FR-A-2 34-5 723 offenbart ein stabiles und gefriergetrocknetes, wasserdispergierbares Pulver zum immunologischen Nachweis eines Antigens oder eines Antikörpers. In diesen Zusammenhang wird eine gefriergetrocknete Formulierung offenbart,-die die Latexteilchen, welche an ein serologisch determinantes Material chemisch gebunden sind, sowie ein Dispergiermittel umfaßt, welches das serologisch determinante Material physikalisch überdeckt. Ein carboxyliertes Polystyrol mit Aminogruppen ist in einer Liste von Beispielen an Latexträgern genannt.
Die EP-A-0 462 644, die einen Stand der Technik im Sinne von Art. 54(3) und (4) EPÜ darstellt, offenbart ein biologisches Reagenz, durch den ein immunologischer Reaktand an ein festes Substrat immobilisiert wird und welches für eine immunologische Nachweissubstanz verwendet wird, wobei das biologische Reagenz (I) ein wasserunlösliches Teilchen, das aus
(a) ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren oleophilen Monomeren,
(b) ethylenische ungesättigten, polymerisierbaren Nonomeren mit einer Carboxylgruppe oder deren Salz, und
(c) von den Kategorien (a) und (b) verschiedenen, ethylenisch polymerisierbaren Monomeren aufgebaut ist; sowie (II) eine biologisch aktive Substanz, die an das Teilchen über die reaktive Carboxylgruppe oder deren Salz kovalent gebunden ist, umfaßt.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Detektionsreagenz für den LAIA zur Verfügung zu stellen, welches ebenfalls geeigneterweise angewandt werden kann für quantitative Analysen unter Verwendung eines optischen Verfahrens.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Detektionsreagenz für den LAIA zu schaffen, welches stabil in trockenem Zustand gelagert werden kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Detektionsreagenz für den LAIA zur Verfügung zu stellen, welches in der Redispergierbarkeit aus dem trockenen Zustand in ein flüssiges Medium ausgezeichnet ist und ferner geeigneterweise angewandt werden kann für quantitative Analysen unter Verwendung eines optischen Verfahrens.
Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Trockenreagenz gemäß Anspruch 1 oder 5. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis einer immunologisch wirksamen (ersten) Substanz gemäß Anspruch 2 oder 6 zur Verfügung.
In der vorliegenden Erfindung wird das Styrol/Acrylamid- Copolymer, welches Aminogruppen und Carboxylgruppen (gemäß dem ersten Gegenstand der Erfindung) bzw. Carboxylgruppen und Amidgruppen (gemäß dem zweiten Gegenstand) aufweisen, als "modifiziertes Polystyrol" bezeichnet.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Detektionsreagenz zur Verfügung, welches feste Feinteilchen umfaßt, die eine gegenüber einer in einer Testprobe zu detektierenden Substanz immunologisch wirksame Substanz immobilisiert, wobei die festen Feinteilchen gemäß dem ersten Gegenstand der Erfindung ein modifiziertes Polystyrol mit Aminogruppen und Carboxylgruppen umfaßt.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Nachweisreagenz zur Verfügung, welches feste Feinteilchen umfaßt, die eine gegenüber einer in einer Testprobe nachzuweisenden Substanz immunologisch wirksame Substanz immobilisiert, wobei die festen Feinteilchen gemäß dem zweiten Gegenstand der Erfindung ein modifiziertes Polystyrol mit Amidgruppen und Carboxylgruppen umfaßt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungszeit und der Umwandlung der Amidgruppen in Carboxylgruppen bei der Behandlung eines Styrol/Acrylamid- Copolymers in einer alkalischen wäßrigen Lösung zeigt.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Zunächst beziehen sich die festen Feinteilchen, die ein modifiziertes Polystyrol in dem Nachweisreagenz der vorliegenden Erfindung umfassen, welches den ersten Gegenstand der Erfindung darstellt, auf ein Polymer, welches eine Stelle mit einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe und eine Stelle mit Styrol umfaßt, oder auf ein Polymer mit einer Stelle, die ein mit Aminogruppen und Carboxylgruppen substituiertes Styrol besitzt, oder auf ein Polymer, welches mit Aminogruppen und Carboxylgruppen substituiertes Styrol und eine Stelle mit einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe umfaßt. Die festen Feinteilchen können gemäß verschiedener bekannter Verfahren hergestellt werden, und zum Beispiel können die folgenden Verfahren angewandt werden.
a) Das Verfahren, in dem ein Monomer mit einer Carboxylgruppe, einem Monomer mit einer Aminogruppe und mindestens einem Monomer, welches aus Styrol und Styrolderivaten ausgewählt wird, einer ternären Polymerisation unterworfen werden, um Feinteilchen von modifiziertem Polystyrol zu erhalten.
b) Ein Monomer mit einer Carboxylgruppe und mindestens eines, welches aus Styrol und Styrolderivaten ausgewählt wird, werden einer binären Polymerisation unterworfen, und ein Teil der Carboxylgruppen auf der Oberfläche der Copolymer- Feinteilchen werden in Aminogruppen mit einem bifunktionalen Amin, z.B. Ethylendiamin, umgewandelt.
c) Die Komponente A, die mindestens ein aus Styrol und Styrolderivaten ausgewähltes Mitglied umfaßt, und die Komponente B, die ein Monomer mit einer Amidgruppe umfaßt, werden polymerisiert, und die Oberfläche der erhaltenen Copolymer-Feinteilchen werden durch die Hofmann-Reaktion modifiziert, um Aminogruppen und Carboxylgruppen einzuführen.
Unter diesen Methoden ist die Methode c) insofern besser geeignet, als stabilere Feinteilchen mit gleichförmigen Teilchengrößen erhalten werden können. Im Verfahren c) werden Amidgruppen in Aminogruppen unter der gleichzeitigen Bildung von Carboxylgruppen durch die Hydrolyse von Amidgruppen als Seitenreaktion überführt, und ein Vorteil besteht ebenso darin, daß das Verhältnis von Aminogruppen zu Carboxylgruppen durch geeignete Wahl der Bedingungen variiert werden kann.
Das Verhältnis von Aminogruppen und Carboxylgruppen in dem die festen Feinteilchen aufbauenden, modifizierten Polystyrol liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 100, weiter bevorzugt von 0,5 bis 20 Carboxylgruppen pro einer Aminogruppe.
Im folgenden wird der Fall gemäß des Verfahrens c) beschrieben.
Beispiele von für die Komponente A verwendbaren Styrolderivaten können α-Methylstyrol, 2,4-Dimethylstyrol, α-Ethylstyrol, p- Vinylstyrol, p-Isopropylstyrol, m-Phenylstyrol, α-Chlorstyrol, p-Methoxylstyrol, m-Aminostyrol, p-Cyanostyrol und dergleichen einschließen.
Als Komponente B können z.B. (Meth-)Acrylamid und dessen Derivate, wie N-Methyl(meth)acrylamid, N-Phenyl(meth)acrylamid, N,N-(Diethylaminoethyl)(meth)acrylamid, N,N- Dimethyl(meth)acrylamid oder dergleichen, Methylenbis(meth)acrylamid, etc., einzeln oder als Kombination von zwei oder mehr Arten davon verwendet werden.
Zur Copolymerisation der Komponente A und der Komponente B können verschiedentliche, bekannte Verfahren angewandt werden.
Zum Beispiel können verschiedentliche Polymerisationsverfahren angewandt werden, einschließlich der Emulsionspolymerisation unter Verwendung eines wasserlöslichen Initiators in einem wäßrigen flüssigen Medium in Gegenwart von anionischem oberflächenaktivem Mittel, nichtionischem oberflächenaktivem Mittel etc.; der seifenfreien Emulsionspolymerisation unter Verwendung eines wasserlöslichen Radikalinitiators in einem wäßrigen flüssigen Medium ohne Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels; der Suspensionspolymerisation in Gegenwart eines schützenden Kolloids, wie teilweise verseiftem Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, etc.; der Präzipitationspolymerisation, bei der die Polymerisation in einem flüssigen Medium, welches ein Vinylmonomer, jedoch nicht ein Polymer auflöst, durchgeführt wird; usw.
Das molare Verhältnis zwischen der Komponente A und der Komponente B in dem Copolymer kann in dem Bereich von z.B. 1:0,5 bis 1:0,001 eingestellt werden.
Die Reaktionsbedingungen bei der Polymerisation können geeigneterweise in Abhängigkeit von der zu erhaltenden Teilchengröße der festen Copolymer-Feinteilchen usw. eingestellt werden. Die Teilchengröße der festen Feinteuchen ist nicht speziell eingeschränkt, jedoch kann es im Hinblick auf die Dispergierbarkeit des Nachweisreagenzes in flüssigem Medium, insbesondere der Redispergierbarkeit des Trockenreagenzes beispielsweise bevorzugt in einem Bereich von 0,05 µm bis 5 µm, insbesondere von 0,1 µm bis 2 µm liegen. Speziell wird es, wenn die Teilchengröße weniger als 0,5 µm beträgt, schwierig, das Trockenreagenz zu redispergieren, während leicht eine Präzipitation der festen Feinteilchen in der Dispersion usw. auftritt, wenn sie 5 µm übersteigt, wodurch keine Stabilität des Reagenzes als Dispersion erhalten werden kann.
Die erhaltenen festen Feinteilchen werden dann durch die Hofmann-Reaktion behandelt, um Aminogruppen und Carboxylgruppen auf deren Oberfläche hervorzubringen. Die Hofmann-Reaktion ist, wie durch diefolgende Formel gezeigt, ein Verfahren, in dem ein primäres Carboxylamid mit Brom (oder Chlor) in einer wäßrigen Alkalilösung umgesetzt wird, um ein primäres Amin mit um eins verminderten Kohlenstoffatomen zu erhalten, wobei durch eine Seitenreaktion zum Teil eine Carboxylgruppe gebildet wird.
Die festen Feinteilchen, die ein modifiziertes Polystyrol in dem Nachweisreagenz der vorliegenden Erfindung umfassen, welches den zweiten Gegenstand der Erfindung darstellt, beziehen sich auf ein Polymer, welches eine Stelle mit einer Amidgruppe und einer Carboxylgruppe und eine Stelle mit Styrol umfaßt, oder auf ein Polymer, welches die Stelle mit Amidgruppen und Carboxylgruppen substituiertem Styrol besitzt, oder auf ein Polymer, welches eine Stelle mit Amidgruppen und Carboxylgruppen substitutiertem Styrol und eine Stelle mit Amidgruppen und Carboxylgruppen umfaßt. Zum Beispiel kann es erhalten werden durch ternäre Polymerisation eines Monomeren mit einer Amidgruppe, eines Monomeren mit einer Carboxylgruppe und mindestens einem Monomer, welches aus Styrol und Styrolderivaten ausgewählt ist. Ferner kann es erhalten werden durch binäre Polymerisation eines Styrolderivates mit einer Amidgruppe und eines Styrolderivates mit einer Carboxylgruppe.
Ebenso kann es erhalten werden durch das Verfahren, bei dem die Komponente A, die mindestens ein aus Styrol und Styrolderivaten ausgewähltes Mitglied umfaßt, und die Komponente B, die ein Monomer mit einer Amidgruppe umfaßt, copolymerisiert werdenkönnen, und ein Teil der Amidgruppen, die die erhaltenen Copolymer-Feinteilchen besitzen, werden hydrolisiert, um in Carboxylgruppen umgewandelt zu werden.
Unter diesen Verfahren ist das letztere Verfahren der Ausnutzung der Hydrolyse einer Amidgruppe insofern geeignet, als daß Feinteilchen mit gleichförmigen Größen erhalten werden.
Gemäß dieses Verfahrens werden Carboxylgruppen durch Hydrolyse von Amidgruppen gebildet, und desweiteren besteht der Vorteil, daß das Verhältnis von Amidgruppen zu Carboxylgruppen durch Wahl geeigneter Bedingungen variiert werden kann.
Das Verhältnis von Amidgruppen und Carboxylgruppen in dem die festen Feinteilchen aufbauenden, modifizierten Polystyrol liegt vorzugsweise in Bereich von 0,01 bis 1000, weiter bevorzugt von 0,5 bis 100 Carboxylgruppen pro Amidgruppe.
Im folgenden wird das Verfahren unter Verwendung der Hydrolyse von Amidgruppen beschrieben.
Als für die Komponente A zu verwendende Styrolderivate können diejenigen eingeschlossen werden, die oben genannt wurden.
Als die Komponente B können ebenfalls die oben genannten verwendet werden.
Zur Polymerisation der Komponente A und der Komponente B können verschiedentliche, bekannte Verfahren angewandt werden. Die Polymerisationsverfahren sind ebenfalls die oben beschriebenen.
Das molare Verhältnis der Komponente A und der Komponente B in dem Copolymer kann zum Beispiel in dem Bereich von 1:0,5 bis 1:0,001 gewählt werden.
Die Reaktionsbedingungen bei der Polymerisation können geeigneterweise in Abhängigkeit von der zu erhaltenden Teilchengröße der festen Copolymer-Feinteilchen eingestellt werden.
Die Teilchengröße der festen Feinteilchen in dem zweiten Gegenstand der Erfindung ist nicht besonders beschränkt, jedoch liegt sie im Hinblick auf die Dispergierbarkeit des Detektionsreagenzes in flüssigem Medium, insbesondere der Redispergierbarkeit des Trockenreagenzes etc. - ähnlich wie der Teilchengröße der ersten Erfindung - bevorzugt in einem Bereich von 0,05 µm bis 5 µm, insbesondere im Bereich von 0,1 µm bis 2 um.
Im zweiten Gegenstand der Erfindung werden die erhaltenen festen Feinteilchen anschließend der Hydrolyse unterworfen, um ein Teil der Amidgruppen in Carboxylgruppen zu überführen.
Eine solche Hydrolyse kann z.B. in einer alkalischen wäßrigen Lösung, wie einer wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung, einer wäßrigen Kaliumhydroxid-Lösung etc., durchgeführt werden.
Die Reaktionsbedingungen bei der Hydrolyse, wie der Alkalikonzentration, die Reaktionszeit, die Reaktionstemperatur etc., können geeigneterweise in Abhängigkeit von der gewünschten Überführung der Amidgruppen in Carboxylgruppen und der Stabilität der festen Feinteilchen selbst etc. gewählt werden.
Zum Beispiel kann unter den in dem unten beschriebenen Bezugsbeispiel angewandten Bedingungen die Umwandlung der Amidgruppen in Carboxylgruppen variiert werden durch Variation der Hydrolysezeit, und durch Einstellen der Hydrolysezeit auf der Basis der Ergebnisse kann eine gewünschte Umwandlung der Amidgruppen in Carboxylgruppen erhalten werden.
Als die immunologisch wirksame Substanz, die auf der Oberfläche der festen Feinteilchen der ersten und zweiten Gegenstände der Erfindung zu immobilisieren ist, können verschiedenartige Substanzen angewandt werden, die für einen Immunoassay gegenüber zu detektierenden Substanzen notwendig sind.
Zum Beispiel können angewandt werden Immunglobuline, wie IgG, IgM, IgE, etc.; Plasmaproteine, wie Koplement, CRP, Ferritin, α&sub1;- Microglublin, β&sub2;-Microglobulin, etc. sowie Antikörper gegenüber diesen; Tumormarker wie α-Fötoprotein, carcinoembryonisches Antigen (CEA), Prostatische Saure Phosphatase (PAP), CA-19-9, CA-125 sowie Antikörper gegenüber diesen; Hormone, wie das luteinisierende Hormon (LH), das Follikel stimulierende Hormon (FSH), das humane chorionische Gonadotropin (hCG), östrogen, Insulin, etc. sowie Antikörper gegenüber diesen; zu viralen Infektionen verwandte Substanzen, wie HBV-bezogene Antigene (HBs, HBe, HBc), HIV, ALT, etc. sowie Antikörper gegenüber diesen; Bakterien, wie Cornebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Mycoplasma, Treponema pallidum, etc. sowie Antikörper gegenüber diesen; Protozoen, wie Toxoplasma, Trichomonas, Lieshmania, Tripanozoma, Malaria, sowie Antikörper gegenüber diesen; Arzneiwirkstoffe, einschließlich Antiplektika, wie Phenitom, Phonobarbital, etc., cardiovasculäre Wirkstoffe, wie Quinidin, Digoxinin, etc., Antiasthmatika, wie Theophyllin, etc., Antibiotika, wie Chloramphenicol, Gentamycin, etc., sowie Antikörper gegenüber diesen; Enzyme, extrazelluläre Toxine (Streridin O, etc.) sowie Antikörper gegenüber diesen; usw.
Als Verfahren zur Immobilisation der immunologisch wirksamen Substanzen auf die festen Feinteilchen können zum Beispiel die in "Immobilisierte Enzyme" (Kodansha, 1975, herausgegeben durch Ichiro Chihata) offenbarte, verschiedene chemische und/oder physikalische Bindeverfahren, die zur Immobilisation von Enzymen etc. verwendet wurden, angewandt werden.
Zum Beispiel kann das Verfahren, bei dem eine immunologisch wirksame Substanz an feste Feinteilchen durch kovalente Bindung unter Verwendung eines Polyaldehyds, wie Glutaraldehyd etc., gebunden wird, und das Verfahren, bei dem eine immunologisch wirksame Substanz an feste Feinteilchen unter Verwendung von Carbodiimid oder des Woodword-Reagenzes K als Kondensationsmittel, wie in der Japanischen Patentpublikation Nr. 53-12966 und der Japanischen Patentanmeldungs- Offenlegungsschrift Nr. 53-52620 offenbart, gebunden wird, angewandt werden.
Ebenso können an die festen Feinteilchen oder die immunologisch wirksame Substanz ein Farbstoff zur Erleichterung des Nachweises der Agglutination während des Immunoassays, oder ein Markierungsmittel, wie ein fluoreszenter Farbstoff, ebenso gebunden werden.
Die Immobilisation einer immunologisch wirksamen Substanz auf den festen Feinteilchen sollte vorzugsweise in einem wäßrigen flüssigen Medium ausgeführt werden. Als ein solches wäßriges flüssiges Medium können Wasser, eine Mischung aus Wasser mit einem organischen Lösungsmittel etc. angewandt werden. Als das organische Lösungsmittel können Alkohole oder mit Wasser kompatible Ketone angewandt werden.
Die Immobilisationsreaktion kann ebenso in einer Pufferlösung, wie Phosphat-gepufferter, physiologischer Sahne (PBS), Tris- Hydroxychlorid-Pufferlösung etc., gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Proteins, wie Rinderserumalbumin, oberflächenaktivem Mittel etc. zum Zweck der Stabilisierung der festen Feinteilchen oder der Verhinderung von nicht spezifischer Agglomeration in dem Reaktionssystem durchgeführt werden.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung in der Immobilisationsreaktion kann im allgemeinen auf 6 bis 10, vorzugsweise auf 7 bis 9 eingestellt werden. Die Konzentration der festen Feinteilchen in der Reaktionsmischung kann im allgemeinen auf 0,01 bis 5,0 Gew.- % eingestellt werden.
Die festen Feinteilchen mit einer darauf immobilisierten, immunologisch wirksamen Substanz können in einem flüssigen Medium für einen Immunoassay dispergiert werden, um ein Reagenz für den Assay in Form einer Dispersion zu erhalten.
Als dem wäßrigen flüssigem Medium, welches zur Herstellung der Dispersion des Reagenzes der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, können Wasser oder gemischte Solventien von Wasser und organischen Lösungsmitteln, die mit Wasser kompatibel sind, wie Alkoholen, Ketonen etc., angewandt werden. Zu den Dispersionsmedium können geeigneterweise Puffer, Proteine, oberflächenaktive Mittel, wasserlösliche, polymere Verbindungen etc. zugesetzt werden.
Der Puffer wird zugesetzt, um den pH auf den optimalen Wert einzustellen, da die Antigen-Antikörper-Reaktion im allgemeinen gegenüber dem Einfluß des pHs des Lösungsmittels empfindlich ist, und z.B. kann ein Phosphat- oder Tris-HCl-Puffermittel angewandt werden. Proteine werden zum Zweck der Verhinderung von nicht-spezifischen Reaktionen zugegeben, und es kann zum Beispiel Rinderserumalbumin, Gelatin etc. angewandt werden. Ferner kann zum Zweck der Einstellung der Nachweisempfindlichkeit ein oberflächenaktives Mittel oder eine wasserlösliche, polymere Verbindung, wie Polyethylenglykol etc. zugesetzt werden.
Ferner kann ein Trockenreagenz erhalten werden, indem eine geeignete Dispersion der festen Feinteilchen mit einer darauf immobilisierten, immunologisch wirksamen Substanz hergestellt wird, das flüssige Medium aus der Dispersion entfernt wird und die Teilchen getrocknet werden.
Als Trocknungsverfahren können solche Verfahren wie Verdampfung, Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung etc. angewandt werden, und es ist erwünscht, die Trocknung bei einer Temperatur von 60ºC oder weniger, vorzugsweise 30ºC oder weniger auszuführen. Unter diesem Verfahren ist das Gefriertrocknen bevorzugt, insofern, als die Empfindlichkeit des Reagenzes konstant beibehalten werden kann.
Das Trockenreagenz kann in einem flüssigen Medium für einen Immunoassay redispergiert werden, um für den Assay als ein Dispersionsreagenz verwendet zu werden.
Im folgenden wird die folgende Erfindung detaillierter unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

1 - 1. Synthese der festen Feinteilchen:

In einen Polymerisationsbehälter von 300 ml Volumen, der mit einem Rückfluß-Kondensator, einem Rührer und einem Thermometer ausgerüstet war, wurden 160 ml Wasser, 0,50 g Natriumtetraborat (Na&sub2;B&sub4;O&sub7; 10H&sub2;O) und 2,0 g Acrylamid zugegeben, und die Mischung wurde auf 70ºC erhitzt.
Nachdem die Luft in dem Behälter durch N&sub2; ersetzt wurde, in dem N&sub2;-Gas in den Polymerisationsbehälter für 30 Minuten eingeleitet wurde, wurden 1,7 g Natriumpersulfat als Polymerisationsinitiator zugegeben, und die Polymerisationsreaktion wurde bei 70ºC für eine Stunde unter Rühren durch einen Rührer bei 300 UPM durchgeführt.
Als nächstes wurden 40 g Styrol in den Polymerisationsbehälter zugegeben, die Mischung wurde unter denselben Bedingungen für 4 Stunden gerührt, und zusätzliches Rühren wurde fortgesetzt unter Zugabe von 2 g Acrylamid unter denselben Bedingungen für 5 Stunden, um Feinpartikel eines Styrol/Acrylamid-Copolymers zu erhalten.
Die Dispersion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und ein Teil der Styrol/Acrylamid-Copolymer-Feinteilchen, die synthetisiert wurden, wurden zurückgewonnen und getrocknet. Sphärische Teilchen mit gleichförmigen Teilchengrößen von 0,76 µm wurden mittels eines Transmissions-Elektronenmikroskops beobachtet.
Die Styrol/Acrylamid-Copolymer-Feinteilchen wurden durch Zentrifugation aus der obigen Dispersion zurückgewonnen, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, und dann wurde eine Dispersion, die Copolymer-Feinteilchen mit einem Festgehalt von 20 Gew.-% enthielt, erhalten.
Zu 5 ml dieser Dispersion wurden 5 ml 10-%ige wäßrige Natriumhypochlorit-Lösung und 10 ml 10-%ige, wäßrige Natriumhydroxyol-Lösung zugegeben, und die Reaktion wurde bei 4 ºC für 6 Stunden ausgeführt, dadurch die Behandlung der Oberfläche der festen Feinteilchen (gemäß der Hofmann-Reaktion) bewirkend, um modifizierte Polystyrol-Feinteuchen zu erhalten.
Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Salzsäure neutralisiert, die festen Feinteilchen, welche das erhaltene, modifizierte Polystyrol umfaßte, wurde viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von wiederholtem Zentrifugieren und Dekantieren, und dann wurde eine Dispersion von festen Feinteilchen mit einem Festgehalt von 10 Gew.-%, erhalten.
Eine Elektroleitfähigkeits-Titration der Dispersion der modifizierten Polystyrol-Teilchen wurde durchgeführt, und aus der erhaltenen Elektroleitfähigkeits-Titrationskurve wurden die Oberflächendichten der Aminogruppen und der Carboxylgruppen in den Feinteilchen des modifizierten Polystyrols bestimmt.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Oberflächendichte der Aminogruppen 2,0 Einheiten/nm² und diejenige der Carboxylgruppen 0,9 Einheiten/nm² betrug.
Zu 0,5 ml der Dispersion der festen Feinteilchen des modifizierten Polystyrols, welches bei der Durchführung des obigen Punktes 1-1. erhalten wurde, wurden 5 ml einer N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) und 0,12 g 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-Carbodiimid-Hydrochlorid (WSC) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt.
Als nächstes wurden die festen Feinteilchen zweimal mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen, um die festen Teilchen wiederzugewinnen.
Zu den rückgewonnenen festen Feinteilchen wurden 5 ml einer CRP- Antikörperlösung (erzeugt durch Verdünnen der IgG-Fraktion des Anti-Mensch-CRP-Schafserums, hergestellt durch Cooper Biomedical Inc., mit PBS zum Erreichen von 1 mg/ml an IgG) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um Antikörper-sensibilisierte, feste Feinteilchen zu erhalten.
Die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen, die aus der Reaktionsmischung erhalten wurden, wurden durch Zentrifugation zurückgewonnen, mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und in PBS (pH 7,2), welches Rinderserumalbumin in einer einprozentigen Konzentration enthielt, dispergiert, um eine Dispersion der Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.

1 - 3. Herstellung des Trockenreagenzes

Die Dispersion der in der Ausführung des oben beschriebenen Punktes 1-2. erhaltenen Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurde unter reduziertem Druck in flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet, um ein Trockenreagenz zu erhalten.

1 - 4. Beurteilung der Redispergierbarkeit:

2.0 mg des Trockenreagenzes, welches in der wie oben beschriebenen Bearbeitung 1.3 erhalten wurde, wurden in eine Glaszelle eingebracht, 1 ml an PBS wurden hinzugegeben, und ein Rühren unter Beschallung wurde durchgeführt bei einer Ausgabe von 25 W(20 kHz) für 30 Sekunden, um die Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen in PBS zu redispergieren, dadurch ein Reagenz für ein Assay in Form einer Dispersion erzeugend.
Die Redispergierbarkeit der Antikörper-sensibilisierten festen Feinteilchen im erhaltenen Reagenz zum Assay wurde durch einen Durchflußzytometer gemessen, und die Dispergierbarkeit (M%) wurde berechnet.
Die Dispergierbarkeit (M%) wurde aus der folgenden Gleichung berechnet:
Dispergierbarkeit (M%) = Zahl der nicht-agglutinierten Teilchen / Zahl der Gesamtteilchen
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.

1 - 5. Quantifizierung von Antigen:

Vorbestimmte Konzentrationsreihen des Standard-CRP-Serums (hergestellt durch Igaku Seibutsugaku Kenkyusho) wurden hergestellt, und jede Konzentrationsprobe (0,5 ml) und das Reagenz zum Assay (0,5 ml), welches durch Redispergierung des Trockenreagenzes gemäß der oben beschriebenen Durchführung erhalten wurde, wurden einzeln bei 37ºC miteinander umgesetzt, und der Agglomerationszustand durch die Antigen-Antikörper- Reaktion wurde durch spektrale Absorption bei 633 nm gemessen.
Als Ergebnis wurde bei einer CRP-Konzentration von 6 µg/ml oder mehr das CRP quantifiziert.

Beispiel 2

Zu 5 ml einer Dispersion (Festgehalt 20 Gew.-%) der im Punkt 1.1 des Beispiels 1 erhaltenen Styrol-Acrylamid-Copolymer- Feinteilchen wurden eine 10-%ige, wäßrige Natriumhypochlorit- Lösung (5 ml) und eine 10-%ige, wäßrige Natriumhydroxid-Lösung (10 ml) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 10ºC für 6 Stunden durchgeführt, dadurch die Behandlung der Oberfläche der festen Feinteilchen durch die Hofmann-Reaktion bewirkend, um modifizierte Polystyrol-Feinteilchen zu erhalten.
Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Salzsäure neutralisiert, viermal durch Zentrifugation mit destilliertem Wasser gewaschen, um eine Dispersion der modifizierten Polystyrol-Feinteilchen mit einem Festgehalt von 10 Gew.-% zu erhalten. Die Oberflächendichten der Aminogruppen und Carboxylgruppen der modifizierten Polystyrolfeinteilchen in der erhaltenen Dispersion wurde auf die gleiche Weise wie im Punkt 1-1. des Beispiels 1 gemessen, und als Ergebnis wurde gefunden, daß die Oberflächendichte der Aminogruppen 3,2 Einheiten/nm² und diejenige der Carboxylgruppen 0,2 Einheiten/nm² betrug.
Durch Verwendung der Dispersion der modifizierten Polystyrol- Feinteilchen wurde die Immobilisation des Antikörpers CRP, die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispersion in PBS und die Qualifizierung an CRP auf die gleiche Weise wie unter den Punkten 1-2 bis 1-5 des Beispiels 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispersion, die auf die gleiche Weise wie im 1-4 des Beispiels 1 berechnet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Im Reagenz für ein Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde CRP bei Konzentrationen von 6 µg/ml oder mehr quantifiziert.

Beispiel 3

Zu 0,5 ml der im Beispiel 2 erhaltenen modifizierten Polystyrol- Feinteilchen wurden 5 ml an N/15 Phosphatpufferlösung (pH 8,0) und 0,5 ml an einer CRP-Antikörper-Lösung (10 mg/ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gespült, um Antikörper-sensibilisierte, feste Feinteilchen zu erhalten.
Die erhaltenen Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation zusätzlich gewaschen mit N/15-%iger Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), gefolgt von der Dispergierung in PBS (pH 7,2), um eine Dispersion der Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Durch die Verwendung der Dispersion wurde die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispergierung in PBS und die Quantifizierung von CRP auf die gleiche Weise in den Punkten 1-3 bis 1-5 des Beispiels 1 ausgeführt. Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispergierung, die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1-4 des Beispiels 1 berechnet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
In den Reagenz für ein Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde CRP bei Konzentrationen von 6 µg/ml oder mehr quantifiziert.

Beispiel 4

Aus einem Anti-Mensch-α-Fetoprotein (Pferd) (AFP) -Serum (hergestellt durch Midorin Juji Co.) wurde die IgG-Fraktion gemäß der Säulenchromotographie unter Verwendung von Sepharose (hergestellt durch Pharmacia Co.) mit darauf immobilisiertem Protein A fraktioniert, welche mit einer 0,1 M-Phosphat- Pufferlösung (pH 7,2) auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnt wurde, um eine Antikörperlösung der IgG-Fraktion herzustellen.
Zu 0,5 ml einer Dispersion der im Punkt 1-1 des Beispiels 1 erhaltenen, modifizierten Polystyrol-Feinteilchen wurden 5 ml einer 0,05 M Natriumborat-Pufferlösung (pH 8,0), die 10 % Glutalaldehyd enthielt, zugegeben, und die Mischung wurde bei 0ºC für 10 Minuten geschüttelt.
Nach Beendigung des Schütteins wurde eine Waschung über Zentrifugation mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) dreimal durchgeführt, um die festen Teilchen zurückzugewinnen. Zu den zurückgewonnenen festen Teilchen wurden 1 ml der zuvor hergestellten Antikörperlösung und 4 ml von N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um die Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, mit N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und dann in PBS dispergiert, um eine Dispersion zu erhalten.
Durch Verwendung der Dispersion wurden die Herstellung des Trockenreagenzes und die Redispergierung in PBS auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1-3 bis 1-4 des Beispiels 1 durchgeführt.
Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispergierung, die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1-4 des Beispiels 1 berechnet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
Ferner wurde durch Verwendung des Standard-AFP-Serums (hergestellt durch Kyowa Yukakagaku Co.) anstelle des Standard- CRP-Serums AFP auf die gleiche Weise wie im Punkt 1-5 des Beispiels 1 quantifiziert.
In dem Reagenz für den Test (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde AFP bei Konzentrationen von 2 µg/ml oder mehr quantifiziert.

Vergleichsbeispiel 1

Zu 0,5 ml einer Dispersion eines Polystyrollatex (hergestellt durch Nippon Synthetic Rubber Co.) in destilliertem Wasser (Festgehalt 10%) mit einer Teilchengröße von 0,721 µm wurden 5 ml von N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) und eine CRP- Antikörperlösung (10 mg/ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um die Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Die erhaltenen Antikörper-sensibilisierten festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, ferner mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und dann in PBS (pH 7,2), das Rinderserumalbumin bei 1% Konzentration enthielt, dispergiert, um eine Dispersion der Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Durch Verwendung der Dispersion wurde die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispersion in PBS und die Quantifizierung von CRP auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1-3 bis 1-5 des Beispiels 1 durchgeführt.
Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispersion, die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1-4 des Beispiels 1 berechnet wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
In dem Reagenz für den Test (Dispersion) des Vergleichsbeispiels wurde CRP bei einer Konzentration von 15 µg/ml quantifiziert. TABELLE 1

Bezugsbeispiel 1

(Synthese der festen Feinteilchen)

In einen Polymerisationsbehälter von 300 ml Volumen, der mit einem Rückfluß-Kondensator, einem Rührer und einem Thermometer ausgerüstet war, wurden 160 ml Wasser, 0,50 g Natriumtetraborat (Na&sub2;B&sub4;O&sub7; 10H&sub2;O) und 2,0 g Acrylamid zugegeben, und die Mischung wurde auf 70ºC erhitzt.
Nachdem die Luft in dem Behälter durch N&sub2; ersetzt wurde durch Einführen von N&sub2;-Gas in den Polymerisations-Behälter für 30 Minuten, wurden 1,7 g Kalium-Persulfat als Polymerisationsinitiator zugegeben, und die Polymerisationsreaktion wurde bei 70ºC für eine Stunde unter Rührern durch einen Rührer bei 100 UPM durchgeführt.
Als nächstes wurden 40 g Styrol zu dem Polymerisationsbehälter gegeben, die Mischung wurde unter denselben Bedingungen für 4 Stunden gerührt, und weiteres Rühren wurde unter Zugabe von 2 g Acrylamid unter den gleichen Bedingungen für 5 Stunden fortgesetzt, um eine Dispersion von Feinteilchen an Styrol/Acrylamid-Copolymer zu erhalten, die nicht agglutiniert waren. Die Dispersion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und ein Teil davon wurde herausgenommen, um die synthetisierten Styrol/Acrylamid-Copolymer-Feinteilchen zu trocknen. Sphärische Teilchen mit gleichförmiger Teilchengröße von 0,76 um wurden mittels eines Transmissions-Elekronenmikroskops beobachtet.
Die Styrol/Acrylamid-Copolymer-Feinteilchen wurden durch Zentrifugation aus der obigen Dispersion zurückgewonnen, ferner dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, und dann wurde eine Dispersion, die die Copolymer-Feinteilchen mit einem Festgehalt Gew.-% enthielt, erhalten.
Zu 25 ml der Dispersion wurden 100 ml an 20%-iger, wäßriger Natriumhydroxid-Lösung zugegeben, um die Behandlung bei 30ºC durchzuführen, und die Hydrolyse zur Umwandlung von Amidgruppen in Carboxylgruppen wurde durchgeführt.
Bei angemessenen Zeitabständen der Reaktionszeit von 0 bis 24 Stunden wurde eine Probe der Reaktionsmischung genommen, und die Mengen der gebildeten Carboxylgruppen wurden aus der Elektroleitfähigkeits-Titrationskurve berechnet, um die Umwandlung der Amidgruppen in Carboxylgruppen zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
Aus den Ergebnissen der Fig. 1 ergibt sich, daß etwa 99 % der Amidgruppen mit der Reaktionszeit der Hydrolysezeit von 24 Stunden in Carboxylgruppen umgewandelt wurden. Deshalb kann durch geeignetes Festlegen der Reaktionszeit der Hydrolyse das Verhältnis der Amidgruppen zu den Carboxylgruppen eingestellt werden.

Beispiel 5

1 - 1. Herstellung der modifizierten Polystyrol-Feinteilchen:

Zu 25 ml einer Dispersion der im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Styrollacrylamid-Copolymer-Feinteilchen in destilliertem Wasser (Festgehalt 20 Gew.-%) wurden 100 ml 20%-ige, wäßrige Natriumhydroxid-Lösung zugegeben, und die Hydrolysebehandlung wurde bei 30ºC für 24 Stunden durchgeführt, um modifizierte Polystyrol-Feinteilchen zu erhalten.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Salzsäure neutralisiert, die das modifizierte Styrol umfassenden, festen Feinteilchen durch Zentrifugation wiedergewonnen und viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, um eine Distorsion mit einem Festgehalt von 10 % herzustellen.
Die Umwandlung der Amidgruppen in Carboxylgruppen in den festen Feinteilchen der erhaltenen Dispersion wurde aus der Elektroleitfähigkeits-Titrationskurve auf 99 % berechnet. Es wurde gefunden, daß die Oberflächendichte der Carboxylgruppen 5,0 Einheiten/nm² betrug.

1 - 2. Immobilisierung des Antikörpers:

Zu 0,5 ml der Dispersion der festen Feinteilchen des modifizierten Polystyrols, welche in der obigen Durchführung von 1-1 erhalten wurde, wurden 5 ml von N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) und 0,12 g von 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (WSC) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt.
Als nächstes wurden die festen Feinteilchen dreimal mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen, um die festen Teilchen wiederzugewinnen.
Zu den wiedergewonnenen festen Feinteilchen wurden 5 ml einer CRP-Antikörperlösung (hergestellt durch Verdünnen der IgG- Fraktion des durch Cooper Biomedical Inc. produzierten Anti- Mensch-CRP-Schafserums mit PES zur Erlangung von 1 mglml an IgG) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um Antikörper-sensibilisierte, feste Feinteilchen zu erhalten.
Die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, mit N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und in PBS (pH 7,2), welches Rinderserumalbumin bei einer Konzentration von 1% enthielt, dispergiert, um eine Dispersion der Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.

1 - 3. Herstellung des Trockenreagenzes:

Die in der wie oben beschriebenen Durchführung 1 - 2 erhaltenen Dispersion der Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteuchen wurde unter einem verminderten Druck in flüssigem Stickstoff gefriergetrocknet, um ein Trockenreagenz zu erhalten.

1 - 4. Beurteilung der Redispergierbarkeit:

2,0 mg des in der wie oben beschriebenen Durchführung 1-3 erhaltenen Trockenreagenzes wurde in einer Glaszelle eingebracht, 1 ml PBS wurde hinzugegeben, und Rühren unter Beschallung wurde bei einer Ausgabe von 25 W (20 kHz) für 30 Sekunden durchgeführt, um die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen in PBS zu redispergieren, dadurch ein Reagenz für den Assay (Dispersion) herstellend.
Die Redispergierbarkeit der erhaltenen Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen in dem Reagenz für den Assay wurde durch einen Durchflußzytometer gemessen und die Dispergierbarkeit (M%) wurde berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

1 - 5. Quantifizierung von Antigen:

Vorbestimmte Konzentrationsreihen des Standard-CRP-Serums (hergestellt durch Igaku Seibutsugaku Kenkyusho) wurden hergestellt, und jede Konzentrationsprobe (0,5 ml) und das Reagenz für den Assay (0,5 ml), welches durch die Redispergierung des Trockenreagenzes gemäß der oben beschriebenen Arbeitsweise erhalten wurde, wurden einzeln miteinander bei 37ºC umgesetzt, und der Agglomerierzustand durch die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde durch spektrale Absorption bei 633 nm gemessen. Als Ergebnis wurde CRP bei der CRP- Konzentration von 8 µg/ml oder mehr quantifiziert.

Beispiel 6

Zu 25 ml einer Dispersion der im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Styrollacrylamid-Copolymer-Feinteilchen in destilliertem Wasser (20 Gew.-%) wurden 100 ml einer 20%-igen, wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung zugegeben, und die Hydrolysebehandlung wurde bei 30ºC für 7 Stunden durchgeführt, um ein modifiziertes Polystyrol zu erhalten.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Salzsäure neutralisiert, die das modifizierte Polystyrol umfassenden festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, um eine Dispersion mit einem Festgehalt von 10% herzustellen.
Die Umwandlung von Amidgruppen in Carboxylgruppen in den festen Feinteilchen in der erhaltenen Dispersion wurde aus der Elektroleitfähigkeits-Titrationskurve berechnet und auf 67% bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Oberflächendichte der Carboxylgruppen 3,4 Einheiten/nm² betrug.
Durch Verwendung der Dispersion der erhaltenen modifizierten Polystyrol-Feinteilchen wurde auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1 - 2 bis 1 - 5 im Beispiel 5 die Immobilisierung des Antikörpers (CRP), die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispersion in PBS und die Quantifizierung von CRP ausgeführt.
Das Ergebnis der Dispersierbarkeit (M%), die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1 - 4 des Beispiels 5 berechnet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt.
In dem Reagenz für den Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde CRP bei einer Konzentration von 8 µg/ml quantifiziert.

Beispiel 7

Zu 25 ml einer Dispersion der im Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Styrollacrylamid-Copolymer-Feinteilchen in destilliertem Wasser (Feststäffgehalt 20 Gew.-%) wurden 100 ml einer 20%-igen, wäßrigen Natriumhydroxidlösung zugegeben, und die Hydrolysebehandlung wurde bei 30ºC für 10 Minuten durchgeführt, um modifizierte Polystyrol-Feinteilchen zu erhalten.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung mit Salzsäure neutralisiert, die das modifizierte Polystyrol umfassenden, festen Feinteilchen durch Zentrifugation wiedergewonnen, viermal mit destilliertem Wasser gewaschen, um eine Dispersion mit einem Festgehalt von 10% herzustellen.
Die Überführung von Amidgruppen in Carboxylgruppen in den festen Feinteilchen in der erhaltenen Dispersion wurde aus der Elektroleitfähigkeits-Titrationskurve berechnet und auf 2% bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Oberflächendichte der Carboxylgruppen 0,1 Einheiten/nm² betrug.
Durch Verwendung der erhaltenen Dispersion der modifizierten Polystyrol-Feinteilchen wurde auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1 - 2 bis 1 - 5 des Beispiels 5 die Immobilisation des Antikörpers (CRP), die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispergierung in PBS und die Quantifizierung der CRP- Konzentration ausgeführt.
Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%), die auf die gleiche Weise wie in Punkt 1 - 4 des Beispiels 5 berechnet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt.
In dem Reagenz für den Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde CRP quantifiziert auf eine Konzentration von 8 µg/ml.

Beispiel 8

Aus einem Anti-Mensch-α-Fötoprotein (Pferd) (AFP)-Serum (hergestellt durch Midori Juji Co.) wurde die IgG-Fraktion durch die Säulenchromatographie unter Verwendung von Sepharose (hergestellt durch Pharmacia) mit darauf immobilisiertem Protein A fraktioniert, welche dann mit 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) auf eine Konzentration von 10 mg/ml verdünnt wurde, um eine Antikörperlösung der IgG-Fraktion herzustellen.
Zu 0,5 ml einer in dem Punkt 1 - 1 des Beispiels 5 erhaltenen Dispersion der modifizierten Polystyrol-Feinteilchen wurden 5 ml von N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) und 0,12 g WSC zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt.
Nach Beendigung des Schüttelns wurden 1 ml der zuvor hergestellten Antikörperlösung und 4 ml N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) zu der Reaktionsmischung zugegeben und die Mischung Wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Die Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, mit N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und dann in PBS dispergiert, um eine Dispersion zu erhalten.
Durch Verwendung der Dispersion wurde die Herstellung des Trqckenreagenzes und die Redispersion in PBS auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1 - 3 bis 1 - 4 des Beispiels 5 aufgeführt.
Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispersion, die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1 - 4 des Beispiels 5 berechnet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt.
Ferner wurden durch Verwendung des Standard-AFP-Serums (hergestellt durch Kyowa Yukakagaku Co.) anstelle des Standard- CRP-Serums AFP auf die gleiche Weise wie im Punkt 1 - 5 des Beispiels 5 quantifiziert.
In dem Reagenz fir den Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde AFP bei Konzentrationen von 1 µg/ml oder mehr quantifiziert.

Beispiel 9

Zu 0,5 ml der in Beispiel 6 erhaltenen Dispersion der modifizierten Polystyrol-Feinteilchen wurden 5 ml N/15 Phosphat- Pufferlösung (pH 8,0) und 0,5 ml einer CRP-Antikörperlösung (10 mg/ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt, um Antikörper-sensibilisierte, feste Feinteilchen zu erhalten.
Die erhaltenen Antikörper-sensibilisierten, festen Feinteilchen wurden durch Zentrifugation wiedergewonnen, ferner mit N/15 Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) gewaschen und dann in PBS dispergiert, welches Rinderserumalbumin bei einer Konzentration von 1% enthielt, dispergiert, um eine Dispersion der Antikörpersensibilisierten, festen Feinteilchen zu erhalten.
Durch Verwendung der Dispersion wurden auf die gleiche Weise wie in den Punkten 1 - 3 bis 1 - 5 des Beispiels 5 die Herstellung des Trockenreagenzes, die Redispersion von PBS und die Quantifizierung der Antigen-Konzentration ausgeführt.
Das Ergebnis der Dispergierbarkeit (M%) während der Redispergierung, die auf die gleiche Weise wie im Punkt 1 - 4 des Beispiels 5 berechnet wurde, ist in Tabelle 2 gezeigt.
Im Reagenz für den Assay (Dispersion) des vorliegenden Beispiels wurde CRP bei einer Konzentration von 9 µg/ml quantifiziert. TABELLE 2
Die modifizierten Polystyrol-Feinteilchen mit Aminogruppen und Carboxylgruppen als Carrier, die als Nachweisreagenz der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, sind ausgezeichnet bezüglich der Dispergierbarkeit in ein flüssiges Medium, welches hauptsächlich aus Wasser besteht, und durch deren Überführung in eine Dispersion und deren Verwendung als Nachweisreagenz für den LAIA kann nicht nur eine qualitative, sondern ebenso eine quantitative Analyse unter Verwendung eines optischen Verfahrens ausgeführt werden.
Ferner ist das Nachweisreagenz der vorliegenden Erfindung nicht nur ausgezeichnet hinsichtlich der Lagerungsstabilität als Trockenprodukt, sondern ferner ausgezeichnet bezüglich der Redispergierbarkeit, und die durch die Redispergierung hergestellte Dispersion kann geeigneterweise als eine solche verwendet werden, die Ergebnisse mit guter Reproduzierbarkeit hinsichtlich der qualitativen Analyse und der unter Verwendung des optischen Verfahrens durchgeführten quantitativen Analyse.
Bei der Herstellung der Dispersion durch Redispergierung des Trockenproduktes ist kein Rühren unter speziellen starken Rührbedingungen erforderlich, vielmehr kann ein Reagenz für den Assay (Dispersion) innerhalb einer kurzen Zeit hergestellt werden, ohne daß eine Verringerung in der Nachweisempfindlichkeit herbeigeführt wird, wodurch eine Verkürzung der Meßzeit bewirkt werden kann.

Claims

1. Trockenreagenz zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis einer immunologisch wirksamen, ersten Substanz, die in einer Probe vorliegt, umfassend:

Polymerteilchen aus einem Copolymer von Styrol und Acrylamid, und

eine zweite Substanz, die gegenüber der ersten Substanz immunologisch wirksam ist, wobei die zweite Substanz an die Teilchen angeheftet ist,

dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer Aminogruppen und Carboxylgruppen besitzt, wobei die Carboxylgruppen des Copolymers in das Copolymer eingebaut wurden durch Hydrolisieren der aus dem Acrylamid stammenden Amidgruppen, und wobei die Aminogruppen des Copolymers in das Copolymer eingebaut wurden durch Überführung der aus den Acrylamid stammenden Amidgruppen durch die Hofmann-Reaktion.

2. Verfahren zum Nachweis einer ersten, immunologisch wirksamen Substanz, die in einer Probe vorliegt, unter Verwendung eines diagnostischen Reagenzes, umfassend die Schritte:

Bereitstellung eines diagnostischen Trockenreagenzes gemäß Anspruch 1;

Redispergierung des Trockenreagenzes in ein flüssiges Medium;

Umsetzen des redispergierten Trockenreagenzes in dem flüssigen Medium mit der ersten Substanz in der Probe; und

Detektieren des redispergierten Trockenreagenzes, welches in agglomeriertem Zustand vorliegt, um die Konzentration der ersten Substanz in der Probe zu quantifizieren;

dadurch gekennzeichnet, daß die Carboxylgruppen des Copolymeren in das Copolymer eingebaut wurden durch Hydrolisieren der aus dem Acrylamid stammenden Amidgruppen, und daß die Aminogruppen des Copolymeren in das Copolymer eingebaut wurden durch Überführung der aus dem Acrylamid stammenden Amidgruppen durch die Hofmann-Reaktion.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verhältnis von Aminogruppen zu Carboxylgruppen 0,01 zu 100 Carboxylgruppen pro einer Aminogruppe ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Verhältnis der Aminogruppe zur Carboxylgruppe 0,5 bis 20 Carboxylgruppen pro einer Aminogruppe beträgt.

5. Trockenreagenz zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis einer ersten, immunologisch wirksamen Substanz, die in einer Probe vorliegt, umfassend:

Teilchen aus einem Copolymeren von Styrol und Acrylamid, und eine zweite Substanz, die gegenüber der ersten Substanz immunologisch wirksam ist, wobei die zweite Substanz an die Teilchen angeheftet ist,

dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymer Carboxylgruppen und Amidgruppen umfaßt, wobei die Carboxylgruppen des Copolymeren in das Copolymer durch Hydrolisieren der aus dem Acrylamid stammenden Amidgruppen eingebaut worden sind

6. Verfahren zum Nachweis einer ersten, immunologisch wirksamen Substanz, die in einer Probe vorliegt, unter Verwendung eines diagnostischen Reagenzes, umfassend die Schritte:

Bereitstellung eines diagnostischen Trockenreagenzes gemäß Anspruch 5,

Redispergierung des Trockenreagenzes in ein flüssiges Medium;

Detektieren des redispergierten Trockenreagenzes, die in agglomeriertem Zustand vorliegt, um die Konzentration der ersten Substanz in der Probe zu quantifizieren;

dadurch gekennzeichnet, daß die Carboxylgruppen in den Copolymeren in das Copolymer durch Hydrolisieren der aus dem Acrylamid stammenden Amidgruppen eingebaut worden sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Verhältnis der Amidgruppe zur Carboxylgruppe 0,01 bis 1000 Carboxylgruppen pro einer Amidgruppe beträgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Verhältnis der Amidgruppe zur Carboxylgruppe 0,5 bis 100 Carboxylgruppen pro einer Amidgruppe beträgt.