DE69126668T2

DE69126668T2 - Mycobacterium als adjuvans für antigene

Info

Publication number: DE69126668T2
Application number: DE69126668T
Authority: DE
Inventors: Graham Arthur William Old Hall Haver Hill Suffolk Cb9 7Ej Rook; John Lawson Millhouse Marden Kent Tn12 9Te Stanford
Original assignee: University College London
Current assignee: Silence Therapeutics PLC
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1997-10-23
Anticipated expiration: 2011-11-09
Also published as: DK0556248T3; CA2095855A1; ES2104731T3; DE69126668D1; EP0556248B1; US5599545A; GR3024750T3; EP0556248A1; CA2095855C; AU660430B2; ATE154759T1; WO1992008488A1; JPH06501479A; AU8874191A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Träger, die insbesondere Adjuvantien, für Antigene (einschließlich Allergene), zur Verwendung in Impfstoffen, und andere Wege der Änderung der Immunantwort gegenüber einem Antigen auf günstige Weise.
Es ist bekannt, daß abgetötete Zellen von M. vaccae als immuntherapeutische Mittel bei mycobakteriellen Erkrankungen, wie z.B. Tuberkulose und Leprose, gut geeignet sind (siehe GB-A-2156673). Diese bekannte Verwendung von M. vaccae kann auf der Stimulierung der T-Zellen vermittelten Immunität gegenüber endogenen Antigenen von M. vaccae beruhen. Abgetötete Zellen von M. vaccae sind ungeeignet bei der Behandlung verschiedener Autoimmunkrankheiten einschließlich rheumatoider Arthritis, steifmachender Spondylitis und Reiter's Syndrom (sieh WO-A- 85/05034).
Die WO 90/07935 beschreibt eine Impfzusammensetzung für die intraperitoneale Verabreichung, um eine IGA-Antwort zu stimulieren, die eine Antigen-aktive Substanz in einem Träger aus pflanzuchem Öl umfaßt, und gegebenenfalls ein Adjuvans, z.B. M. bovis.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Beobachtung, daß abgetötete Zellen von M. vaccae verwendet werden können, um auf günstige Weise die Immunantwort gegenüber Antigenen, die gegenüber M. vaccae nicht endogen sind, zu stimulieren und/oder zu modifizieren.
Die Immunantwort gegenüber einem Antigen hat zwei unterschiedliche Aspekte: (1) die Auswahl eine Epitops (Antigenfragment) als Initiator der und Target für die Antwort; und (2) die Auswahl eines bestimmten Immunantwort-Mechanismus als gegen das bestimmte ausgewählte Epitop gerichtete Antwort. Gegenwertige Verfahren zur Stimulierung der Immunantwort, z.B. der Impfung, haben sich im allgemeinen auf den ersten Aspekt konzentriert, aber im Licht der neuesten Forschungsergebnisse wurde es klar, daß es wesentlich ist, die Immunantwort auf gunstige Weise zu stimulieren oder zu modifizieren, da es möglich ist, die Immunantwort ungunstig zu modifizieren, was z.B. zu einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber einer Infektion führt. Eine der überraschenden günstigen Eigenschaften abgetöteter Zellen von M. vaccae ist es, daß sie die Auswahl eines günstigen Immunantwortmechanismus fördern.
Es ist bekannt, daß, zumindest in der Maus (siehe z.B: Mosmann & Moore, Immunology Today, 1991, A49-A53), verschiedene T-Zeilen-Untereinheiten verschiedene Muster der Cytokin-Sekretion besitzen. TH2-Zellen exprimieren Interleukin(IL)-4, IL-5 und IL-10, während TH1-Zellen IL-2, γ-Interferon (IFN-γ) und Lyxophotoxin produzieren. Die TH2-Zellen sind in dem z.B. bei Asthma, Pollenallergien und Exzem beobachteten Muster von Immunantworten beteiligt, während TH1-Zellen in dem zur Verwendung zur Abtötung intrazellulärer Parasiten verwendeten Muster beteiligt sind. Es scheint, daß abgetötete Zellen von M. vaccae die Immunantwort- Charakteristik der TH1-Zellen fördern.
Eine Überführung der T-Zellenkomponente der Antwort gegenüber Allergenen aus dem TH2-Muster in das TH1-Muster verringert oder begrenzt Symptome der Erscheinungsformen wie z.B. Asthma, Heufieber, atopische Exzeme, indem die Produktion von IGE verringert wird, der Nachschub von Eosinophilen und Mastzellen an die entzündete Stelle verringert wird, und die Antigenkonzentration, die zur Auslösung einer Antwort erforderlich ist, stark erhöht wird (weil die THI-Antwort eine viel höhere Konzentration an auslösendem Antigen erfordert als die TH2-Antwort). Der Gehalt an Allergen in der Umgebung wird deshalb unzureichend, um Symptome auszulösen.
Es scheint auch, daß abgetötete Zellen von M. vaccae die Immunantwort- Charakteristika von TH1-Zellen fördern können, und im Falle von Autoantigenen die Verringerung der Antwort via immunregulatorischem Netzwerk erhöhen.
Der günstige Effekt der Verwendung abgetöteter M. vaccae als Adjuvans kann auch im Verbindung gebracht werden mit dem 65 kDa-mycobakteriellem Hitzeschockprotein (hsp 65), das von Young et al. "Stress proteins are immune targets in leprosy and tuberculosis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 4267-4270, in einer von M. bovis erhaltenen Form beschrieben wird. Es wird angenommen, daß die erfindungsgemaß verwendeten bevorzugten autoklavisierten M. vaccae-Zellen, wie sie nachfolgend beschrieben werden, ein wirksames Teil für ein Adjuvans, hsp 65 und andere Substanzen darstellen.
Das von M. vaccae oder anderen Mycobakterien aus M. tuberculosis abgeleitete immunregulatorische Material kann zusammen mit oder getrennt von exogenem Antigen dem Mycobakterium verabreicht werden, um eine verbesserte Antwort gegenüber dem Antigen zu erzielen.
M. tuberculosis ist das verursachende Mittel für Tuberculose und eine avirulente Variante davon wird bei der Herstellung des verwendeten BCG- Impfstoffes gegen Tuberkulose in Immunisierungsprogrammen weltweit verwendet.
Immunregulatorisches Material aus M. tuberculosis sollte erfindungsgemäß nicht verwendet werden, um eine Gefährdung der Verwendung von BCG- Impfstoff durch Induzierung der Tuberculintest-Positivität oder Verringerung der nachfolgenden Effizienz von BCG zu vermeiden. Aus diesen Gründen wird die Verwendung von immunoregulatorischem Material aus M. tuberculosis erfindungsgemaß ausgeschlossen.
Es wird angenommen, daß das Material aus mycobakteriellen Spezien, die von M. tuberculosis verschieden sind, erfindungsgemäß gut geeignet sein könnte. Insbesondere weil es bereits ein bekanntes immuntherapeutisches Mittel ist, wird ]edoch immunregulatorisches Material aus M. vaccae zur Zeit bevorzugt.
Erfindungsgemäß wird deshalb ein Produkt bereitgestellt, daß ein von Mycobakterium vaccae abgeleitetes immunregulatorisches Material und ein gegenüber dem Mycobakterium exogenes Antigen als kombinierte Zubereitung zur gleichzeitigen, getrennten oder hintereinanderfolgenden Verwendung umfaßt zur Verwendung zur Förderung der T-Zellen-vermittelten Antwort gegenüber diesem Antigen in einem Patienten.
Das erfindungsgemaße Produkt umfaßt zweckmäßigerweise, und deshalb bevorzugt abgetötete Zellen von M. vaccae, und insbesondere Zellen, die durch Autoklavisierung oder durch Bestrahlung abgetötet wurden. Das Produkt umfaßt normalerweise mehr als 10&sup8; Mikroorganismen pro ml Verdünnungsmittel, und vorzugsweise 10&sup8; bis 10¹¹ abgetötete M. vaccae Mikroorganismen pro ml Verdünnungsmittel.
Das Verdünnungsmittel kann nur eine pyrogenfreie Kochsalzlösung zur Injektion sein, oder ein Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,0. Das Verdünnungsmittel sollte steril sein. Ein geeigneter Boratpuffer ist:
Na&sub2;B&sub4;O&sub7;.10H&sub2;O 3,63 g
H&sub3;BO&sub3; 5,25 g
NaCl 6,19 g
Tween 80 0,0005 %
Destilliertes Wasser auf 1 l
Erfindungsgemaß wird außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die ein von Mycobakterium vaccae abgeleitetes immunregulatorisches Material und ein gegenüber dem Mycobakterium exogenes Antigen enthält, und ein oder mehrere Verdünnungsmittel oder Träger dafür.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines von einem Mycobakterium, das von M. tuberculosis verschieden ist, abgeleiteten immunregulatorischen Materials und eines gegenüber dem Mycobakterium exogenen Antigens zur Herstellung eines immuntherapeutischen Produktes zur gleichzeitigen, getrennten oder aufeinanderfolgenden Verwendung zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Föderung der T-Zellen-vermittelten Antwort gegenüber dem exogenen Antigen.
Der bevorzugte Stamm von M. vaccae ist ein solcher, der mit R877R bezeichnet wird und aus Schlammproben des Lango-Distriktes von Zentraluganda isoliert wurde (J.L. Stanford und R.D. Paul, Ann. Soc. Belge Med, Trop. 53 (1973) 141-389). Der Stamm ist eine stabile rohe Variante und gehört zur Aurum Sub-species. Durch biochemische und antigene Kriterien kann er als zu M. vaccae gehörig identifiziert werden (R. Bonicke, S.E. Juhasz., Zentr albl. Bakteriol. Parasitenkd. Infection skr. Hyg. Abt. 1, Orig., 192 (1964) 133).
Der mit R877R bezeichnete Stamm wurde gemäß dem Budapester Vertrag beim National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London, NW9 5HT, United Kingdom, am 13. Februar 1984 unter der Nummer NCTC 11659 hinterlegt.
Zur Herstellung des erfindungsgemaßen Produktes kann der Mikroorganismus M. vaccae an einem geeigneten festen Medium gezüchtet werden. Bevorzugt ist das flüssige modifizierte Sauton's Medium (S.V. Boyden und E. Sorkin., J. immunol, 75 (1955) 15), das mit Agar verfestigt ist. Vorzugsweise enthält das feste Medium 1,3 % Agar. Das mit dem Mikroorganismus beimpfte Medium wird aerob, im allgemeinen bei 32 ºC während 10 Tagen, inkubiert, um ein Mikroorganismen-wachstum zu ermöglichen. Die Organismen werden geerntet, dann gewogen und in einem Verdünnungsmittel suspendiert. Das Verdünnungsmittel kann ungepufferte Salzlösung sein, ist aber vorzugsweise Borat-gepuffert und enthält, wie vorstehend beschrieben, ein oberflächenaktives Mittel, wie z.B. Tween 80. Die Suspension wird verdünnt, um 200 mg Mikroorganismus/ml zu ergeben. Zur weiteren Verdünnung wird vorzugsweise die Borat-gepufferte Salzlösung verwendet, damit die Suspension 10 mg Naßgewicht an Mikroorganismus/ml Verdünnungsmittel enthält. Die Suspension kann dann in geeignete Multidosis-Glasfläschchen (z.B. 1 ml) verteilt werden. Obwohl die Mikrorganismen in den Fläschchen unter Verwendung von Bestrahlung, z.B. aus &sup6;&sup0;Kobalt mit einer Dosis von 2,5 Megarad, oder durch ein anderes Mittel, z.B. chemisch, abgetötet werden können, ist es bevorzugt, die Mikroorganismen durch Autoklavisierung, z.B. bei 10-15 psig (69-104 kPa) während 10-15 Minuten (115-125 ºC) abzutöten. Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Autoklavisierung ein wirksameres Präparat als die Bestrahlung liefert.
Extrakte oder fraktionierte Anteile der Mikroorganismen können ebenfalls verwendet werden, natürlich unter der Voraussetzung, daß sie die erforderliche Adjuvans-Wirkung besitzen.
Das wie vorstehend beschrieben hergestellte immuntherapeutische Produkt umfaßt eine Kombination einer wirksamen nicht-toxischen immunmodifizierenden Menge eines immmregulatorischen Materials aus einem von M. tuberculosis verschiedenen Mycobakterium, insbesondere von M. vaccae, und einer wirksamen, nicht-toxischen, die Immunität stabilisierenden Menge eines gegenüber dem Mycobakterium exogenen Antigens.
Das exogene Antigen kann irgendein Antigen sein, gegenüber dem es gewünscht ist, eine T-Zellen-vermittelte Immunität zu stimulieren, oder die Natur der T-Zellen-Antwort zu ändern, um eine Linderung oder Heilung der Infektion oder anderer zu behandelnder Krankheitszustände zu erreichen. Beispiele umfassen Antigene, die mit Erkrankungen assoziert sind, die zur Zeit als eine Autoimmun-Ätiologie ausweisend angesehen werden, z.B. Multiple Sklerose, Antigene, die mit chronischen Virusinfektionen assoziert sind, wie z.B. Hepatitis, schwammförmiger Rinderencephalopathie (BSE), und Myoencephalitis (ME), Antigene, die mit verborgenen Parasitinfektionen assoziert sind, wie z.B. Leishmania und Trypanosomiasis, und Allergene (z.B. solche, die in Pollen, Tierschuppen, und Hausstaubmilben vorhanden sind), die für solche Krankheitserscheinungen wie z.B. Heufieber, Asthma, Nahrungsmittelallergien und Exzeme verantwortlich sind. Das erfindungsgemäße immuntherapeutische Produkt, das das geeignete exogene Antigen umfaßt, kann prophylaktisch oder therapeutisch verwendet werden.
Das exogene Antigen kann nach irgendeinem konventionellen Verfahren hergestellt werden, wie z.B. durch Kultivierung und Abtötung oder Attenuieren des Krankheitserregers, um eine abgetötete oder attenuierte Vakzine bereitzustellen, durch Abtrennung und Reinigung des Antigens, gegebenenfalls unter seiner chemischen Modifizierung, aus Krankheitserregern oder, im Fall von Protein-Antigenen, durch Expression eines Gens, das das antigene Protein kodiert, in einem geeigneten rekombinanten Organismus.
Das exogene Antigen kann mit dem immunregulatorischen mycobakteriellen Material durch Mischen, chemische Konjugierung oder Adsorption unter Verwendung konventioneller Verfahren kombiniert werden. Alternativ kann das exogene Antigen durch Expression eines exogenen Gens (das z.B. in einem Plasmid, Cosmid, viralen oder anderen Expressionsvektor enthalten, oder in das Genom des Mycobakteriums eingeführt ist) in dem Mycobakterium, aus dem das immunregulatorische Material auch produziert wird. So kann z.B. rekombinantes M. vaccae so kultiviert werden, um eine Expression des exogenen Antigens zu erzielen, und dann wie vorstehend beschrieben abgetötet und verarbeitet werden, oder unter solchen Bedingungen, die auf geeignete Weise modifiziert sind, um die biologische Aktivität des exogenen Antigens zu erhalten, um ein immunregulatorisches Material, das das exogene Antigen enthält, bereitzustellen. Verfahren zum Erhalt und zur Expression solcher exogener Gene sind konventionelle Verfahren.
Das therapeutische Agens wird im allgemeinen durch Injektion in einem Volumen im Bereich von 0,1 bis 0,2 ml, und vorzugsweise von 0,1 ml, intradermal verabreicht. Eine Einzeldosis enthält im allgemeinen 10&sup7; bis 10¹&sup0; abgetötete M. vaccae Mikroorganismen. Bevorzugt ist es, den Patienten eine Einzeldosis zu verabreichen, die 10&sup8; bis 2 x 10&sup9; abgetötete M. vaccae enthält. Die Dosis kann jedoch, abhängig vom Zustand des Patienten, wiederholt werden.
Die Menge des in Assoziation mit dem M. vaccae verabreichten exogenen Antigens ist im allgemeinen die gleiche Menge, wie sie vorher zur Verabreichung eines Antigens zum Hervorrufen einer Immunantwort verwendet wurde. Im Fall von Antigenen, die mit Heufiber oder Asthma verbunden sind, hängt die erforderliche Dosis von der Art ab, mit der das Antigen extrahiert wird, und spezifische Dosen, die allgemeinen anwendbar sind, können nicht verabreicht werden, obgleich die therapeutischen Zusammensetzungen, die solche Antigene erhalten, allgemein bekannt sind: siehe den Artikel über "Desensitising vaccines", Brit. Med. J. 293 (1986) 948. Für andere, nicht mit Heufieber oder Asthma verbundene Antigenarten liegt die übliche Dosis im Bereich von 0,1 bis 5 µg.
Das therapeutische Mittel kann mit dem Antigen, typischerweise in Mischung, verabreicht werden, es liegt aber innerhalb des Rahmens der Erfindung, zuerst, z.B. durch Injektion, das therapeutische Mittel zu verabreichen, z.B. abgetötete Zellen von M. vaccae, und dann an die gleiche Stelle das exogene Antigen.
Obwohl das therapeutische Mittel im allgemeinen durch intradermale Injektion verabreicht wird, können auch andere Verabreichungswege, z.B. eine orale Verabreichung, verwendet werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung kann weitere Bestandteile enthalten, wie z.B. zusätzliche Adjuvantien, Konservierungsmittel, Stabilisatoren usw. Sie kann in einer injizierbaren sterilen flussigen Form oder in einer sterilen gefriergetrockneten Form, die vor der Verwendung rekonstituiert wird, bereitgestellt werden.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Erfindung.

Beispiel

M. vaccae NCTC 11659 wird an einem festen Medium, das modifiziertes Sauton's Medium, verfestigt mit 1,3 % Agar, umfaßt, gezuchtet. Das Medium wird mit dem Mikroorganismus beimpft und 10 Tage lang bei 32 ºC inkubiert, um das Wachstum des Mikroorganismus zu ermöglichen. Die Mikroorganismen werden dann durch sanftes Abschaben der Oberfläche des Agars geerntet und gewogen (ohne Trocknung) und in M/15-Borat-gepufferter Kochsalzlösung bei pH = 8 suspendiert, um 10 mg Mikroorganismen/ml Salzlösung zu ergeben. Die Suspension wird in 5 ml Glasfläschchen aufgeteilt, und dann 15 Minuten bei 15 psi (104 kPa) und ca. 120 ºC zur Abtötung der Mikroorgänismen autoklavisiert. Sie wird dann in geeignete Multidosis-Glasfläschchen verteilt. Nach dem Abkühlen wird 1/10 des Volumens an exogenem Antigen (bei einer Standardkonzentration von 2 µg/ml) zugegeben. Das so hergestellte therapeutische Mittel wird vor seiner Verwendung bei 4 ºC gelagert. Eine Einzeldosis besteht aus 0,1 ml der Suspension, die kurz vor der Verwendung kräftig geschüttelt werden sollte, und die 1 mg (Naßgewicht) M. vaccae und 0,02 µg des exogenen Antigens enthält. Die Dosis wird normalerweise über den linken Deltoidmuskel durch intradermale Injektion verabreicht.
Normalerweise ist nur eine Dosis erforderlich. Der Patient sollte keine hohe Steroiddosis oder andere immunsuppressive Therapie erhalten. Bevor die günstige Wirkung ersichtlich ist, können bis zu 6 Monate verstreichen.

Claims

1. Produkt, umfassend ein von Mycobakterium vaccae abgeleitetes immunregulatorisches Material und ein gegenüber dem Mycobakterium exogenes Antigen als Kombinationspräparat zur gleichzeitigen, getrennten oder hintereinanderfolgenden Verwendung zur Verwendung zur Förderung einer T-Zellen-vermittelten Antwort gegenüber diesem Antigen.

2. Produkt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das von einem Mycobakterium abgeleitete immunregulatorische Material abgetötete Zellen von M. vaccae umfaßt.

3. Produkt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von M. vaccae durch Autoklavisierung abgetötet wurden.

4. Produkt nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das von M. vaccae abgeleitete immunregulatorische Material das 65 kDa Wärmeschockprotein umfaßt.

5. Produkt nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das von M. vaccae abgeleitete Material von dem beim National Collection of Type Cultures (NCTC) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London NW9 5HT, United Kingdom, am 13. Februar 1984 unter der Nummer NCTC 11659, hinterlegten Stamm abgeleitet ist.

6. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es pro Dosis ein immunregulatorisches Material aus 10&sup7; bis 10¹&sup0; M. vaccae Mikroorganismen umfaßt.

7. Produkt nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das exogene Antigen mit dem immunregulatorischen Material chemisch konjugiert ist.

8. Produkt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das exogene Antigen durch Expression eines exogenen Gens in rekombinantem M. vaccae hergestellt wird, der kultiviert wird, um eine Expression des exogenen Antigens zu erzielen, und dann abgetötet wird, um das immunregulatorische Material, das das exogene Antigen enthält, zu liefern.

9. Verwendung des von einem von M. tuberculosis verschiedenen Mycobakterium abgeleiteten immunoregulatorischen Materials und eines gegenüber dem Mycobakterium exogenen Antigens bei der Herstellung eines immuntherapeutischen Produktes zur gleichzeitigen, getrennten oder hinteranderfolgenden Verwendung zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, um eine T-Zellen-vermittelte Antwort gegenüber dem exogenen Antigen zu fördern.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das immunregulatorische Material ein wie in einem der Anspruche 2 bis 6 definiertes Material. ist.

11. Verwendung nach einem der Anspruche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das exogene Antigen mit dem immunregulatorischen Material chemisch konjugiert ist.

12. Verwendung nach einem der Anspruche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das exogene Antigen durch Expression eines exogenen Gens in einem rekombinanten Mikroorganismus hergestellt wird, der kultiviert wird, um eine Expression des exogenen Antigens zu erzielen, und dann abgetötet wird, um das das exogene Antigen enthaltende immunregulatorische Material zu liefern.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Kombination eines von Mycobakterium vaccae abgeleiteten immunregulatorischen Materials und eines gegenüber dem Mycobakterium exogenen Antigens, und ein oder mehrere Verdünner oder Träger dafur, umfaßt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein wie in einem der Anspruche 2 bis 6 definiertes immunregulatorisches Material umfaßt.