DE69122186T2

DE69122186T2 - Laktobazillus acidophilus-f-133, herstellung von davon ausgehenden milchsäurebakterien und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69122186T2
Application number: DE69122186T
Authority: DE
Inventors: Umeyuki Doi; Tsuneo Hadeishi; Mitsugu Hayashi; Tomotari Mitsuoka; Kazumasa Suzuki
Original assignee: San Ei Sucrochemical Co Ltd
Current assignee: San Ei Sucrochemical Co Ltd
Priority date: 1990-01-31
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2011-01-31
Also published as: WO1991011510A1; EP0465677B1; CA2049313A1; DE69122186D1; EP0465677A1; EP0465677A4; AU630277B2; JP3052208B2; AU7186191A; DK0465677T3

Description

1. Titel der Erfindung

Lactobacillus Acidophilus F-133, damit hergestellte Milchsäurebakterien- Zubereitung und Verfahren zur Herstellung derselben

2. Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Lactobacillus acidophilus F-133, unter Verwendung desselben hergestellte Milchsäurebakterien-Zubereitungen und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

3. Technischer Hintergrund

Es ist wohlbekannt, daß Milchsäurebakterien als normale Bakterien-Floren (enterische Bazillen) in Gedärmen und Hohlräumen von Menschen oder Tieren vorkommen und nützlich sind zu deren Gesunderhaltung. Neuerdings hat ein bemerkenswerter Fortschritt beim Studium von Darm-Mikrofloren, hiernach als "Floren" bezeichnet, allmählich eine Rolle der Milchsäurebakterien aufgezeigt.
In dieser Hinsicht ist hinzuweisen auf die Wirkungen von Milchsäurebakterien-Zubereitungen und verschiedenen Arten von Lebensmitteln, die Milchsäurebakterien enthalten, wie fermentierte Milch und Sauermuchgetränke, bzw. Sauermilchspeisen.
Allgemein gesprochen umfassen solche Darmfloren (Intestinalforen) eine Gruppe von Milchsäurebakterien, eine anaerobe Gruppe und eine aerobe Gruppe.
Diese Darmfloren umfassen nützliche Bakterien, wie Milchsäurebakterien, welche für Menschen und Tiere nützlich sind, und schädliche Bakterien, die im Gegensatz dazu schädlich sind. Solche nützlichen und schädlichen Bakterien leben beide im Darm (in den Eingeweiden), wobei ein spezifisches Gleichgewicht zwischen ihnen besteht.
Der Ausdruck "nützliche Bakterien" bezeichnet hier diejenigen Bakterien, welche nützlich sind, um die Gesundheit eines Wirtes durch verschiedene Aktivitäten zu erhalten, beispielsweise Synthese von Vitamin und Protein, Förderung von Verdauung und Absorption, Unterdrückung der Vermehrung fremder Bakterien, Stimulierung von Immunfunktionen und dergleichen.
Andererseits bezeichnet der Ausdruck "schädliche Bakterien" diejenigen Bakterien, welche in den Eingeweiden verschiedene Stoffe produzieren, welche für den Wirt schädlich sind, und man nimmt daher an, daß sie Bezug haben zu den Ursachen verschiedener akuter oder chronischer Krankheiten, von Senilität und Krebs.
Demgemäß nimmt man an, daß menschliche Krankheiten, Senilität und Krebs vermieden werden können und ein Mensch gesund bleiben kann, wenn schädliche Bakterien in Eingeweiden unterdrückt und im Gegensatz dazu nützliche Bakterien vermehrt werden.
Hinsichtlich von Vieh ist wohlbekannt, daß die Gabe von nützlichen Bakterien, wie Milchsäurebakterien oder von deren fermentierten Produkten wirksam ist zur Förderung von Wachstum und Verhinderung und Heilung von Krankheiten, wie Diarrhoe. Neuerdings ist eine solche Anwendung weit verbreitet.
Diese Zubereitungen werden Probiotika genannt und finden weltweit Verwendung.
Während neugeborene Tiere von Haus aus keimfrei sind, beginnen sogleich nach ihrer Geburt verschiedene Bakterien in ihre Körper einzudringen.
Das Gleichgewicht zwischen nützlichen und schädlichen Bakterien in Darmfloren von Jungtieren stabilisiert sich allmählich im Verlauf von Tagen nach der Geburt. Jedoch wird das Gleichgewicht oft beeinflußt durch die Umgebung und Veränderung des Futters. Besonders besteht bei neugeborenen Tieren die Gefahr, daß nützliche Bakterien abnehmen, während sich das opportunistische Escherichia Coli rasch vermehrt.
Die Vermehrung des opportunistischen Escherichia Coli zerstört das Gleichgewicht in Darmfloren und verursacht oft Krankheiten.
Wenn wirksame Zellzubereitungen wie Milchsäurebakterien-Zubereitungen vorsorglich Jungtieren gegeben werden, kann der Säuregrad ihrer Eingeweide aufrechterhalten werden. In diesem Fall wird die Vermehrung von Escherichia Coli unterdrückt, so daß verschiedene Krankheiten, die vom Ungleichgewicht in Darmfloren herrühren, wirksam verhindert werden.
Die Verabreichung von solchen wirksamen Zell-Zubereitungen hat im allgemeinen einen bemerkenswerten Effekt bei Jungtieren. Wenn sie gesunden erwachsenen Tieren verabreicht werden, wird ebenfalls eine erhebliche Wirkung beobachtet.
Die Darmfloren von erwachsenen Tieren halten ein empfindliches Gleichgewicht aufrecht, das nicht immer konstant ist. Das Gleichgewicht wird leicht gestört durch Stimulierung durch die Umgebung, wie Streß.
Besonders ist das Gleichgewicht in Darmfloren stark abhängig von einem pH in den Eingeweiden.
Wenn Milchsäurebakterien vorherrschen und genügend Milchsäure erzeugen, wird der Säuregrad in den Eingeweiden aufrechterhalten, so daß die Vermehrung von Escherichia Coli unterdrückt wird.
Wenn dagegen die Aktivität von Milchsäurebakterien verringert ist, wird organische Säure, wie Milchsäure, verringert. In diesem Fall vermehrt sich Escherichia Coli rasch und erzeugt dadurch Krankheiten, wie Diarrhoe.
Für wirksame Zell-Zubereitungen kann man Darmbakterien-Derivate von anderen Bakterien verwenden, die nicht zu den normalen Darmbakterien gehören. Darmbakterien-Derivate, die sich in Eingeweiden von damit dosierten Tieren vermehren können, sind erwünscht.
Jedoch können einige Darmbakterien wegen spezieller Eigenschaften keine Kolonien in Eingeweiden von Tieren verschiedener Spezies bilden.
Mit anderen Worten, selbst wenn bestimmte Darmbakterien einem bestimmten Tier inherent sind, können sie durch indigene Bakterien beseitigt werden, wenn sie von außen verabreicht werden. Es sei bemerkt, daß Kolonien-Bildung und Vermehrung in Eingeweiden nicht immer erwartet werden kann.
Wenn also die weitere Verabreichung von Bakterien unterbrochen wird, verschwinden die bereits verabreichten Bakterien in relativ kurzer Zeit aus den Eingeweiden.
Es wird berichtet, daß selbst in einem solchen Fall die kontinuierliche Verabreichung von mehr als einer vorbestimmten Menge von wirksamen Zellzubereitungen wirksam ist bei der Verhinderung und Heilung von Diarrhoe und zur Wachstumsförderung, unabhängig von Kolonienbildung. Das ist der Fall, da die verabreichten Bakterien selbst in den Eingeweiden wirken oder dazu beitragen nützliche Bakterien, die in den Eingeweiden indigen existiert haben, zu erhalten und zu vermehren.
Allgemein ist es zur Verbesserung der Wirksamkeit von wirksamen Zell- Zubereitungen erforderlich, daß eine notwendige Menge von wirksamen Zellen den Darm durch einen Magen erreichen muß.
Daher sind für die Bakterien wesentliche Eigenschaften erforderlich: sie sollen stabil sein in Zubereitungen, stabil sein in Futter oder Trinkwasser, dem die Zubereitungen beigemischt werden, sie sollen in einem Magen säureresistent sein, der unter den anderen Verdauungstrakten einen hohen Säuregrad zeigt, und sie sollen beständig sein gegen die sterilisierende Wirkung von Galle im Dünndarm.
Außerdem besteht neuerdings eine starke Nachfrage nach wirksamen Zellzubereitungen, worin wirksame Zellen eine hohe Aktivität haben, um im Darm eine Wirkung mit hohem Wirkungsgrad zu entfalten.
Es ist erwünscht, daß wirksame Zellen sich genügend vermehren, um in Därmen Kolonien zu bilden. Es ist wenigstens erforderlich, daß wirksame Zellen hochwirksam sind in der Förderung der Vermehrung von indigenen Milchsäure bakterien.
Solche wirksamen Zellzubereitungen müssen eine hohe Überlebens-Stabilität der Bakterien in den Zubereitungen haben. Zusätzlich müssen die wirksamen Zell-Zubereitungen in den Darm gelangen gegen schwere Bedingungen in den Verdauungstrakten.
Obwohl viele wirksame Zell-Zubeeitungen gegenwärtig im Handel verfügbar sind, erfüllt keine Zubereitung ausreichend diese Forderungen.
Es ist ein Zweck der vorliegenden Erfindung einen Milchsäurebakterien- Stamm zu finden, der die Forderungen für wirksame Zell-Zubeeitungen erfüllt und Milchsäurebakterien-Zubereitungen bereitzustellen, die eine genügende Überlebens-Stabilität haben uno verschiedene Anforderungen erfüllen, und ein Verfahren zur Herstellung der Zubereitungen anzugeben.

4. Offenbarung der Erfindung

Die Erfinder haben nach Milchsäurebakterien gesucht, welche die oben erwähnten Anforderungen erfüllen. Sie haben verschiedenen Milchsäurebakterien-Stämme aus den Eingeweiden verschiedener Tiere, wie Rinder, Schweine und Hühner isoliert und diese Stämme kultiviert, um die Charakteristika der Bakterien zu untersuchen. Als Ergebnis gelang es den Erfindern, einen ausgezeichneten Milchsäurebakterien-Stamm zu erhalten, der den Zweck der Erfindung erfüllt und durch reine Isolierung aus den Eingeweiden von Rindern in einer bekannten Weise erhalten wurde.
Die Erfindung umfaßt einen neuen Stamm von Lactobacillus acidophilus F- 133 (Internationale Hinterlegungsnummer FRI Nr. 2680), Milchsäurebakterien Zubereitung unter Verwendung von Lactobacillus acidophilus F-133 (Internationale Hinterlegungsnummer FRI Nr.2680) und ein Verfahren zur Herstellung der Milchsäurebakterien-Zubereitung, welches die Stufen der Impfung des Lactobacillus acidophilus F-133 (Internationale Hinterlegungsnummer FRI Nr.2680) in einem Medium umfaßt, das fermentierbaren Zucker als Hauptkohlenstoffquelle enthält, Kultivieren und Vermehren unter Kulturbedingungen, welche für fakultativ Anaerobe geeignet sind, und dann Isolieren der Bakterien zu Milchesäurebakterien-Zubereitungen.
Der erfindungsgemäße Lactobacillus acidophilus F-133 wurde im Fermentation Research Institute (in Ibaraki, Japan) der Agency of Industrial Science and Technology, welche zum Ministerium für internationalen Handel und Industrie (Ministry of International Trade and Industry MITI) gehört, am 20. Oktober 1989 als FRI Mikroorganismen-Hinterlegung no. P-11064 (FERM P-11064) hinterlegt. Danach wurde er in die Internationale Hinterlegung im gleichen Institut am 3. Dezember 1989 übertragen, und die Hinterlegungsnummer wurde geändert in FRI International Deposit no. 2680 (FERM BP-2680).
Der neue Lactobacillus acidophilus F-133 hat die folgenden mykologischen Charakteristika:
a) gram-positiv, nichtsporenbildend, fakultativ anaerobe Stäbchen
b) fermentiert Glukose und produziert Milchsäure (DL). Aus Glukose wird kein Gas erzeugt. Wächst bei 15ºC und unbeweglich. Die Säure wird aus Glukose, Mannose, Fructose, Galaktose, Sucrose, Maltose, Cellobiose, Lactose, Trehalose, Dextrin, Stärke, Esculin, Salicin und Amygdalin produziert. Im Gegensatz dazu wird keine Säure produziert aus Arabinose Xylose, Rhamnose, Ribose, Melibiose, Raffinose, Melezitose, Sorbit und Mannit. Ausgezeichnetes Wachstum in BL Agar Medium, LBS Agar Medium, MRS Agar Medium and Briggs Leberbrühe.
c) Die erfindungsgemäßen Bakterien werden identifiziert als Lactobacillus acidophilus im Phänotyp (die oben erwähten Eigenschaften). Jedoch werden die Bakterien in DNA-Homologie nicht als Lactobacillus acidophilus definiert, sondern als solche, die ähnlich Lactobacillus acidophilus sind und zur Lactobacillus acidophilus-Gruppe gehören.
Im Hinblick auf die oben erwähnten mykologischen Eigenschaften wird entschieden, daß die Bakterien ein neuer Mikroorganismus sind, der zur Lactobacillus acidophilus-Gruppe gehört und den Namen Lactobacillus acidophilus F-133 erhält.
Weiter wird nun beschrieben ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäurebakterien-Zubereitungen und zur Verwendung des oben erwähnten Lactobacillus acidophilus F-133.
Die Milchsäurebakterien-Zubereitungen werden hergestellt durch a) Impfen des Lactobacillus acidophilus F-133 in ein Medium, das enthält: fermentierbaren Zucker, wie Glukose, Fructose und Sucrose als eine Hauptkohlenstoffquelle; eine von Mikroorganismen vewendbare Stickstoffverbindung wie Pepton, Malzextrakt, Maisquellwasser und Hefeextrakt als eine Stickstoffquelle; anorganisches Salz, wie Ferro-Sulfat, Mangansufat, Natriumacetat und Kalium- Monohydrogenphosphat; und Tween 80, b) Kultivieren und Vermehren unter Kulturbedingungen, die für fakultativ Anaerobe geeignet sind; c) Waschen und Isolieren der Bakterien, d) Trocken mit einem Schutzmittel; und e) Zugabe eines Füllmittels zur Regelung der Zellkonzentration entsprechend der Verwendung.
Vorzugsweise wird Lactobacillus acidophilus F-133 unter Verwendung eines flüssigen Mediums unter anaeroben Bedinungen kultiviert. Jedoch sind völlig anaerobe Bedingungen unnötig, da das Bakterium fakultativ anaerobisch ist.
Als eine Hauptkohlenstoffquelle des flüssigen Mediums wird ein Zucker wie Glucose, Fructose und Sucrose verwendet. Der Zucker ist im Medium mit einem Gehalt von 1 - 20% (Gewicht/Volumen) enthalten. Ein Bereich von 4 - 8 % (G/V) ist besonders bevorzugt.
Die Kultivierung wird bei einer Temperatur in dem Bereich durchgeführt welcher das Wachstum von Mikroorganismen zuläßt, nämlich zwischen 20ºC und 45ºC. Eine Temperatur zwischen 30ºC und 40ºC ist besonders bevorzugt.
Die Kultivierung wird mit einem pH durchgeführt, der im Bereich zwischen 3 und 8, vorzugsweise zwischen 5 und 7 eingestellt wird.
Die Kultivierungszeit ist verschieden, je nach der Art des verwendeten Kulturmediums und der Konzentration des Zuckers als der Hauptkohlenstoff quelle. Allgemein beträgt sie 10 bis 24 Stunden.
Hinsichtlich der Kultivierungszeit ist es erwünscht, die Kultivierung gemäß der Erfindung zu einem Zeitpunkt zu beenden, wo die Zellenzahl der Mikroorganismen den Höchstwert erreicht. Wenn die Kultivierung weiter fortgesetzt wird verringern sich die Mikroorganismen und die hergestellten Zubereitungen haben eine geringere Überlebensrate der Mikroorganismen.
Die Kultivierung kann auch durchgeführt werden durch Impfen einer zuvor kultivierten Impf-Kulturlösung in ein flüssiges Medium statt der direkten Impfung mit Lactobacillus acidophilus F-133.
Die Mikroorganismen in einer so erhaltenen Kulturlösung werden in einer bekannten Weise isoliert.
Insbesondere werden die Mikroorganismen nach einer bekannten Methode isoliert, die normalerweise in einem solchen Fall auf diesem technischen Gebiet verwendet wird, beispielsweise mittels Membran-Filtration oder Zentrifugal- Trennung.
Beispielsweise wird eine Kulturlösung, welche die Mikroorganismen enthält, durch Filtrieren unter Verwendung einer organischen Membran erhalten. Nach 10-facher Konzentration des Gehalts an Mikroorganismen wird Waschflüssigkeit in einer Menge gleich der der konzentrierten Mikroorganismenlösung zugesetzt. Filtrieren und Waschen werden unter Verwendung einer organischen Membran durchgeführt, bis das Volumen gleich 1/2 ist. Diese Maßnahme wird dreimal wiederholt. Die Waschflüssigkeit wird hier hergestellt aus Maisquellwasser (Konzentration 7ºBx) durch Zusatz von 2 % Glucose (G/V). Nach Verdünnung auf die Konzentration von 3ºBx wird die Flüssigkeit mit Natriumhydroxid neutralisiert und der erhaltene Niederschlag abgetrennt.
Ein Schutzmittel wird der konzentrierten Mikroorganismenlösung nach dem Waschen zugesetzt. Der pH wird eingestellt durch Natriumhydroxid und dergleichen. Unter Verwendung eines Gefriertrockners wird die Lösung getrocknet, bis der Wassergehalt 4 % oder weniger beträgt. So werden die Milchsäurebakterien-Zubereitungen erhalten.
Je nach der Verwendung wird ein Füllstoff, bestehend aus irgendeinem der folgenden Stoffe: Magermilch, Lactose, Stärke und dergleichen oder eine Kombination von diesen zugesetzt, um die Dichte der Mikroorganismen zu steuern und so einen gewünschten Typ von Milchsäurebakterien-Zubereitungen herzustellen.
Die Milchsäurebakterien-Zubereitungen können zu Körnern, Pellets und Tabletten statt Pulvern geformt werden.
Bestandteile des oben erwähnten Schutzmittels und die zugesetzten Mengen bezogen auf die gewaschene konzentrierte Mikroorganismen-Lösung sind unten als Beispiel angegeben.

5. Beste Ausführungsform der Erfindung

(Ausführungsformen)

Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden beschrieben:

Beispiel 1:

Maisquellwasser (Konzentration 5ºBx), dem6 % (G/V) Glucose und 0,2 % (G/V) Tween zugesetzt wurden, wird durch ein 0,1 µm Sterilisier-Membranfilter (PXV303, Hersteller: Asahi Chemical Industry Co, Ltd.) flltriert, um als Medium verwendet zu werden.
200 Liter des oben erwähnten Mediums werden in einen 300 Liter Fermenter-Tank (Hersteller Komatsugawa Chemical Engineering Co., Ltd.) durch ein Sterilisier-Membranfilter eingefüllt, das mit einer organischen Membrar (PXV303, Hersteller: Asahi Chemical Industry Co, Ltd.) mit einer Porengröße von 0,1 µm versehen ist. Durch Zugabe von 12 N Natriumhydroxid wird der pH auf 5,5 eingestellt.
Dann wird die Temperatur auf 37ºC eingestellt. Das Impfmaterial (10&sup9;/ml) des Lactobacillus acidophilus F-133-Stamms wird zuvor in einem Medium ähnlich dem oben erwähnten Medium während 16 Stunden kultiviert. 2 Liter des Impfmaterials werden in das Medium geimpft. Kultivierung unter Rühren wird bei einer Temperatur von 37ºC durchgeführt, während das Impfmaterial so gehalten wird, daß der pH 16 Stunden lang bei 5,5 bleibt.
In diesem Fall wird der pH durch Zugabe von 12N Natriumhydroxid durch einen automatischen Regler eingestellt.
Die Zellzahl in der Kulturösung ist am Ende der Kultivierung gleich 3 x 10&sup9;/ml.
Die Kulturlösung wird durch ein Feinfilter filtriert, das mit einer organischen Membran (PSV313, Hersteller: Asahi Chemical lndustry Co, Ltd.) mit einer Porengröße von 0,1 µm versehen ist und auf 20 l konzentriert.
Anschließend werden 20 l zuvor hergestellter Waschflüssigkeit der konzentrierten Lösung zugesetzt. Eine ähnliche Filtrierung wird durchgeführt, bis das Volumen auf 20 l konzentriert ist.
Die Verfahrensmaßnahme wird dreimal wiederholt.
Die Waschflüssigkeit wird hergestellt durch Neutralisieren von 25 l Maisquellwasser mit der Konzentration 7ºBx mit 12N Natriumhydroxid, Ausfällen der Abscheidung, Abnehmen von 20 l der überstehenden Flüssigkeit, Zugabe von 2 % Glucose zu dieser und Verdünnen zu 60 l.
2kg Magermilch, 200g Natriumglutamat, 100g L-Ascorbinsäure und 10g L-Cystein wurden zugesetzt und in 20 l der konzentrierten Bakterienlösung nach dem Waschen gelöst. Durch Zusatz von 4N Natriumhydroxid wird der pH auf 77 eingestellt.
Die Bakterienlösung wird bei -40ºC gefroren. Unter Verwendung eines RLE-308 Gefriertrockners (Hersteller: Kyowa Vacuum Engineering Co., Ltd.) wird die Lösung einem Vortrocknen bei 50ºC während 60 Minuten , einem ersten Trocknen bei 70ºC während 150 Minuten und einem zweiten Trocknen bei 30 ºC während 14 Stunden unterworfen. Nach dem Trocknen beträgt der Wassergehalt 3,5 %, während die Zahl der wirksamen Zellen gleich 5x10¹&sup0;/g beträgt.

Beispiel 2:

Maisquellwasser (Konzentration 7ºBx), dem2 % (G/V) Glucose und 0,2 % (G/V) Tween 80 zugesetzt wurden, wird in einen Medium-Zufuhr-Tank eines kontinuierlichen Fermenters (Hersteller: Kansai Chemical Machinery Manufacturing Co., Ltd.) für Milchsäurebakterien durch ein 0,1 µm Sterilisier-Membranfilter (PSV 303, Hersteller: Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) eingefüllt.
Das dem Medium-Zufuhrtank gelieferte Medium wird einem Reaktor-Abschnitt mit 14 l/Std. zugeführt, um in einem Reaktor-System zu zirkulieren.
5 l des Impfmaterials des Lactobacillus acidophilus F-133-Stamms, das zuvor kultiviert wurde, wird zum Impfen in das Reaktor-Kreislaufsystem eingespritzt. Durch Zugabe von 12N Natriumhydroxid wird der pH auf 5,5 eingestellt.
Die Temperatur wird bei 37ºC gehalten. Dann wird die Kultivierung begonnen.
Das Reaktor-System ist mt einer organischen Membran (PSV313, Hersteller: Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.) mit einer Porengröße von 0,1 µm versehen. Ein neues Medium wird synchron mit aufeinanderfolgender Filtrierung des Kultivierungsmediums zugeführt.
Die Zellkonzentration in der Kulturlösung wird bei OD 660nm gemessen Wenn OD 660 nm der hundertfachen Verdünnung 1,0 erreicht, wird die Bakterienlösung mit einer Rate von 750 ml/Std. extrahiert.
Die Zahl der wirksamen Zellen beträgt in diesem Moment 2 x 10¹&sup0;/ml.
Die herausgepumpte Bakteriensung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gewaschen und getrocknet.
Nach dem Trocknen beträgt der Wassergehalt 3,7 % und die Zahl der wirksamen Zellen 3 x 10¹&sup0;/g.

Beispiel 3:

Die Kultivierung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt. Das Waschen der Bakterien wird unter Verwendung einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge durchgeführt.
Im einzelnen wird die Bakterienlösung, die von dem kontinuierlichen Milchsäurebakterien-Fermenter kontinuierlich abgepumpt wird, 10 Minuten mit 6000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt. Der Bakterien-Niederschlag wird in der in Beispiel 1 angegebenen Waschflüssigkeit suspendiert, um das vor dem Zentrifugieren vorhandene Volumen wiederherzustellen. Der Verfahrensschritt des Zentrifugierens wird wiederholt.
Danach wird ein solches Waschen wiederholt und das Trocknen wird wie in Beispiel 1 durchgeführt.
Nach dem Trocknen beträgt der Wassergehalt 3,1 % und die Zahl der wirksamen Zellen 4 x 10¹&sup0;/g.

(Test)

Es wird nun ein Test der Beständigkeit gegen Magensäure (Test 1), ein Test der Beständigkeit gegen Galle-Säure (Test 2) und ein Test der Wachstumsunterdrückung für pathogene Bakterien (Test 3) in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Lactobacillus addophilus F-133 beschrieben.
In diesen Tests wird der Lactobacillus acidophilus F-133 (Internationale Hinterlegung FRI Nr.2680) als der erfindungsgemäße Stamm verwendet. Die folgenden Stämme werden als Vergleichsstämme 1 bis 6 verwendet. Jeder Test wird mit insgesamt 7 Arten von Milchsäurebakterien-Stämmen durchgeführt.

Vergleichsstamm 1 (Kuh-Derivat)

Lactobacillus amylovorus F-81

Vergleichsstamm 2 (Schwein-Derivat)

Lactobacillus amylovorus F-100)

Vergleichsstamm 3 (Schwein-Derivat)

Lactobacillus amylovorus 1-80

Vergleichsstamm 4 (Huhn-Derivat)

Lactobacillus crispapus F-3

Vergleichsstamm 5 (im Handel verfügbar)

Bacillus coagulans

Vergleichsstamm 6 (im Handel verfügbar)

Lactobacillus acidophilus M-13

Test 1:

Der Magensäure-Beständigkeitstest wird in der folgenden Weise durchgeführt. Jeder Probestamm wird einzeln zugesetzt zu jeweils pH1, pH2 und pH3 Chlorwasserstoffsäurelösungen und der Wirkung der Säure in einem Bad unterworfen, das bei einer konstanten Temperatur von 37ºC gehalten wird. Die Anzahl der in jeder Chlorwasserstoffsäurelösung überlebenden Zellen von Milchsäurebakterien wird nach O Stunden (sofort nach Zugabe), 0,5 Stunden, 1 Stunde, 3 Stunden und 5 Stunden gezählt.
Tabelle 1 zeigt die Veränderung der Zahl von wirksamen Zellen jedes Probestamms in 1 ml pH1, pH2 und pH3 Chlorwasserstoffsäurelösungen im Verlauf der Zeit.
Test 1 wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

(a) Vorkulturmedium: MRS Agar Medium (OXOID)

(b) Zellzählmedium: MRS Agar Medium (OXOID)

(c) Herstellung der Bakterienlösung:

Nach anaerober Kultivierung jedes Stamms im Vorkulturmedium bei 35 ºC während 2 Tagen werden die Bakterien in einer sterilen physiologischen Salzlösung suspendiert, um eine Bakterienlösung zu bilden.

(d) Testlösung:

Jede der pH1, pH2 und pH3- Chlorwasserstoffsäurelösungen wird in einem Autoklaven bei 121ºC 15 Minuten lang sterilisiert und dann für den Test abgekühlt.

(e) Durchführung des Tests:

Die Bakterienlösung wird der Testlösung in einer Menge von 1ml:100ml zugesetzt, so daß die Zahl der wirksamen Zellen pro 1ml = 10&sup5; bis 10&sup6; ist. Die Einwirkung erfolgt in einem Bad, das bei einer konstanten Temperatur von 37ºC gehalten wird, während 0 Stunden (unmittelbar nach dem Zusatz), 0,5 Stunden, 1 Stunde, 3 Stunden und 5 Stunden.

(f) Kultur:

Die Anzahl überlebender Zellen der Probestämme in der Testlösung, nachdem sie der Säurewirkung unterworfen wurden, wird gezählt unter Verwendung einer Schichtplattenmethode (aerobe Kultur bei 35ºC während 2 Tagen, unter Verwendung des Zellzählmediums. Tabelle 1

Test 2:

Der Galle-Säure-Beständigkeitstest wurde durchgeführt durch Messen einer Mindest-Hemmkonzentration von Galle-Pulver für Plattenmedien mit dem pH 5, 6 und 7.
Genauer wurde das Gallenpulver jedem Plattenmedium (MRS Agar Medium) mit verschiedenen Konzentrationsstufen zugesetzt. Der Probenstamm (Milchsäure-Bakterium) wird auf das Medium gestrichen und kultiviert. Die Mindestkonzentration von Gallepulver von Rindern, welche das Wachstum verhindert, wird als Minimum-Hemmkonzentration von Gallepulver gegen das Probebakterium angesehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Test 2 wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.

(a) Anreicherungskulturmedium:

MRS -Bouillon (OXOID)

(b) Empfindlichkeitsmessungsmedium:

MRS Agar Medium (OXOID)

(c) Gallepulver:

Gallepulver von Rindern (Hersteller Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

(d) Herstellung des Plattenmediums zur Empfindlichkeitsmessung:

Eine 20.000 ppm Suspension von Gallepulver wird hergestellt unter Verwendung von sterilisiertem gereinigtem Wasser und wird auf das zweifache verdünnt. So werden Suspensionen von 10.000, 5.000, 2.500, 1.250, 625, 313, 156, 78 und 39 ppm hergestellt.
Dann wird das Empfindlichkeitsmeßmedium erhitzt und geschmolzen und mit jeder der oben erwähnten Suspensionen mit verschiedenen Verdünnungsstufen in einer Menge von 1/9 des Mediums versetzt. Dann wird der pH auf pH5, pH6 und pH7 eingestellt. Nach genügendem Mischen wird die Mischung jeweils auf verschiedene Petrischalen verteilt, um zu erstarren. Das Plattenmedium zur Empfindlichkeitsmessung wird so gebildet.
Wie oben beschrieben wurden drei Arten von Plattenreihen zur Empfindlichkeitsmessung mit pH5, pH6 und pH 7 hergestellt.

(e) Herstellung der Bakterien-Impflösung:

Probestämme, die in dem angereichterten Medium vorkultiviert werden, werden geimpft, kultiviert und verdünnt mit dem gleichen Medium, so daß die Zellzah gleich 10&sup6;/ml ist.

(f) Kultivierung:

Eine Bakterien-Impflösung wird auf das Plattenmedium zur Empfindlichkeitsmessung (jede Serie von pH5, pH6 und pH7) mit einem Strich in der Größenordnung von etwa 2 cm mit einem Nichrome-Draht (Innendurchmesser etwa 1mm) gestrichen. Die anaerobe Kultivierung wurde 18 bis 20 Stunden bei 35ºC durchgeführt.

(g) Bewertung:

Nach Kultivierung für eine bestimmte Zeitdauer wurde die Mindestkonzentration, bei welcher das Wachstum gehemmt wird, als die Mindest-Hemmkonzentration des Gallepulvers gegen die Probestämme betrachtet. Tabelle 2

Test 3:

Der Wachstums-Unterdrückungstest gegen pathogene Bakterien wird durchgeführt durch Auswahl von Escherichia Coli, Salmonella typhimunum und Pseudomonas aeruginosa als pathogene Darmbakterien und durch Messen der Wachstums-Unterdrückungswirkung von jedem Probestamm (Milchsäure-Bakterium) gegen diese pathogenen Bakterien.
Im einzelnen wurden Stämme der pathogenen Bakterien (Escherichia Coli Salmonella typhimunum und Pseudomonas aeruginosa) und die Probestämme (Milchsäurebakterien) einzeln oder in Kombination zu flüssigem Medium zugesetzt und in einer Schüttelkultur kultiviert. Nach 0 Stunden (theoretische Zahl der zugesetzten Bakterien), 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden, 24 Stunden wurde die Zahl der wirksamen Zellen in 1 ml jedes flüssigen Mediums und der pH jedes flüssigen Mediums gemessen.
Tabelle 3-1 und die Tabellen 3-2 bis 3-7 zeigen die Ergebnisse für den erfindungsgemäßen Stamm bzw. die Vergleichsstämme 1 bis 6.
Test 3 wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.

(a) Getestete pathogene Bakterien:

Escherichia Coli IFO 3301 (Escherichia Coli)
Salmonella typhimunum Laboratorimstamm (Salmonella)
Pseudomonas aeruginosa IID P-1 (Pseudomonas aeruginosa)

(b) Vorkulturmedium:

Getestete pathogene Bakterien: gewöhnliches Agar Schrägmedium Probenstamm: (Milchsäurebakterien) MRS Medium

(c) Herstellung der Bakterien-Impflösung

Für die getesteten pathogenen Bakterien wurde das Vorkultur-Medium nach Kultivierung bei 35ºC für eine Nacht im MRS Medium suspendiert, so daß die Zahl der wirksamen Zellen 10³ bis 10&sup5; pro 1 ml betrug. So wurde die Bakteriensung hergestellt.
Hinsichtlich des Milchsäurenbakteriums wurde das Vorkulturmedium nach Kultivierung bei 35ºC für eine Nacht mit dem gleichen Medium verdünnt, so daß die Zahl wirksamer Zellen 10³ bis 10&sup5; pro 1 ml betrug.

(d) Testmedium

Der pH des MRS-Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxid-Lösung auf 7,0 eingestellt.

(e) Zellzählmedium:

Escherichia Coli, Salmonella typhimunum: DHL Agar Medium Pseudomonas aeruginosa: 1/2 Cetrimide Medium Milchsäurebakterien: MRS Agar Medium mit Zusatz von 1 ppm Colistinsulfat

(f) Kultivierung:

Bakterium-Impflösung wird dem Testmedium in einer Menge von 1ml/100ml zugesetzt, so daß die Zellzahl 10 bis 10³ pro 1 ml des Testmediums für jeden Stamm beträgt. Nach genügendem Mischen wird in Schüttelkultur in einem konstanten Temperaturbad bei 37ºC für 0 Stunden (theoretische Zahl der zugesetzten Bakterien), 3 Stunden, 6 Stunden, 9 Stunden, 24 Stunden kultiviert.
Der Test wird sowohl für die Fälle durchgeführt, wo das getestete pathogene Bakterium und der Probenstamm (Milchsäure-Bakterium) in Kombination in das gleiche Testmedium geimpft werden und in den Fällen, wo das getestete pathogene Bakterium und die Probenstämme einzeln in die verschiedenen Testmedien geimpft werden.

(g) Zählung wirksamer Zellen

Die Zahl wirksamer Zellen im Testmedium, die wie oben beschrieben kultiviert wurden, wird unter Verwendung des Zellzählmediums gezählt.
Um die Zahl der Milchsäurebakterien zu zählen, wird die Kultivierung in einer Schichtplattenmethode (bei 35ºC für 2 Tage) durchgeführt. Andererseits wird zum Zählen der Zahl der pathogenen Bakterien (Escherichia Coli, Salmonelle typhimunum, Pseudomonas aeruginosa) die Kultivierung in einer Gießplattenmethode bei 35ºC für zwei Tage durchgeführt. Tabelle 3-1
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-2
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-3
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-4
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-5
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-6
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an Tabelle 3-7
Die Zahl in Klammern gibt den pH des Mediums an

Bewertung des Testergebnisses

Die Angaben in der Tabelle 1 bestätigen, daß Lactobacillus addophilus F- 133 gemäß der Erfindung eine höhere Beständigkeit gegen Magensäure hat im Vergleich mit den Milchsäurebakterien irgendeines der Vergleichsstämme.
Die Angaben in Tabelle 2 bestätigen ferner, daß der erfindungsgemäße Lactobacillus acidophilus F-133 eine gleiche oder höhere Beständigkeit gegen Galle-Säure hat im Vergleich mit den Milchsäurebakterien eines der Vergleichsstämme.
Ferner wird bestätigt, wie in den Tabellen 3-1 bis 3-7 gezeigt, daß der erfindungsgemäße Lactobacillus addophilus F-133 bemerkenswert wirksam ist in der Unterdrückung des Wachstums der oben erwähnten pathogenen Bakterien im Vergleich mit den Milchsäurebakterien irgendeines der Vergleichsstämme und daß er damit eine starke Beständigkeit gegen die pathogenen Bakterien hat.

(Anwendungsbeispiel)

Es wird nun der Fall beschrieben, wo der erfindungsgemäße Stamm Milchersatz zugesetzt wird, der an Jungtiere verfüttert wird.
Beispielsweise wird im Fall eines Kalbes das Futter in einem frühen Stadium von Muttermilch auf Milchersatz umgestellt, um Kuhmilch zu gewinnen. Im allgemeinen werden die Darmfloren von Jungtieren durch die Umgebung und Futterveränderung stark beeinflußt. Nützliche Bakterien können abnehmen und schädliche Bakterien, wie Escherichia Coli können zunehmen. Infolgedessen verursacht Diarrhoe viele Todesfälle von Jungtieren.
Neuerdings werden Antibiotika dem Milchersatz zugesetzt, um das oben erwähnte Problem zu vermeiden. In diesem Fall entsteht ein neues Problem durch ungünstige Wirkung von Antibiotika-Rückständen. Es ist daher notwendig eine andere Vorbeugungsmaßnahme zu finden, welche Antibiotika ersetzt.
15 Kälber im Alter von 5 Tagen wurden in 3 Gruppen aufgeteilt. Die Gruppen A, B und C wurden mit Milchersatz ohne Zusatz, Milchersatz mit erfindungsgemäßer Milchsäurebakterien-Zubereitung (10&sup9;/270g Milchersatz) und Milchersatz mit Antibiotika (mit 100 ppm Virginiamycin) gefüttert. Der Milchersatz wird in warmem Wasser mit einer Konzentration von 9% aufgelöst und die gelöste Milch mit 3 l pro Tag gefüttert. Es wurde gefunden, daß im Vergleich mit der Gruppe A die Gruppen B und C weniger medizinische Behandlung benötigen und stärkeren Gewichtszuwachs zeigen. So werden wichtige Unterschiede beobachtet. Es wird bestätigt, daß die Verabreichtung von erfindungsgemäßen Milchsäurebakterien-Zubereitung wirksam ist, ebenso wie die Zugabe von Antibiotika.

6. Gebiet der industriellen Anwendung

Der Lactobacillus addophilus F-133 gemäß der Erfindung hat eine hohe Beständigkeit gegen Magensäure und Galle. Demgemäß können wirksame Zellen den Darm durch den Magen erreichen. Die Überlebensstabilität ist also ausreichend.
Der erfindungsgemäße Lactobacillus acidophilus F-133 zeigt eine hohe Beständigkeit gegen pathogene Bakterien, so daß er das Wachstum von pathogenen Bakterien unterdrückt.
Wenn Milchsäurebakterien-Zubereitungen unter Verwendung des Lactobacillus acidophilus F-133 Menschen oder Tieren oral verabreicht werden, kann man schädliche Bakterien im Darm unterdrücken und nützliche Bakterien einschließlich Lactobacillus acidophilus F-133 steigern.
Demgemäß erfüllen Milchsäurebakterien-Zubereitungen unter Verwendung des Lactobacillus acidophilus F-133 die verschiedenen Anforderungen für wirksame Zelzubereitungen. Ausgezeichnete Wirkungen werden erwartet in der Verhütung und Heilung von Krankheiten, wie Diarrhoe. Infolgedessen sind die Zubereitungen nützlich für die Wachstumsförderung und Gesunderhatung.

Claims

1. Lactobacillus acidophilus F-133 (FRI International Deposit no. 2680).

2. Eine Milchsäurebakterien-Zubereitung, welchen den Lactobacillus acidophilus F-133 (FRI International Deposit no. 2680) enthält.

3. Verfahren zur Herstellung einer Milchsäurebakterien-Zubereitung, welches folgende Stufen aufweist:

- Impfen des Lactobacillus acidophilus F-133 (FRI International Deposit no. 2680) in ein Medium, das als eine Haupt-Kohlenstoffquelle fermentierbaren Zucker enthält;

- Kultivieren und Vermehren desselben unter für fakultativ anaerobe Mikroorganismen geeigneten Kulturbedingungen und dann

- Isolieren der Bakterien und Einbringen derselben in eine Milchsäurebakterien- Zubereitung.