DE69120253T2 - Apparat zur fluoreszenzanalyse - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft einen optischen Apparat für Fluoreszenzanalysen von chemischen und biochemischen Liganden, insbesondere ein System zum Trennen der gewünschten Analyseinformation in der Ausgangsfluoreszenz von unerwünschter Hintergrundfluoreszenz, die Teil des Ausgangs ist.
• Zu den verschiedenen chemischen und biochemischen Analysesystemen gehören optische Systeme, die die Prinzipien gedämpfter totaler Reflexionsspektroskopie (ATR) nutzen. Insbesondere für Immunanalysen verwenden derartige optische Systeme eine optische Faser oder einen optischen Stab, der einen Oberflächenabschnitt, d. h. eine empfindliche Zone mit z. B. einem Antikörper aufweist, der daran fest gebunden, absorbiert oder dergleichen ist. Der Antikörper wird so ausgewählt, daß er reaktiv ist mit einem Liganden wie einem Antigen, das in einer Lösung analysiert oder untersucht werden soll. Ein Lichtstrahl, der in ein Ende der optischen Faser eingeleitet wird, wird intern total im dichten Medium der Faser reflektiert und erzeugt im umgebenden dünneren Medium oder in der zu untersuchenden Lösung ein elektromagnetisches Wellenfeld, das auch als schwindende Wellenkomponente bekannt ist. Diese erstreckt sich für praktische Anwendungen charakteristischerweise nur über einen Bruchteil der Wellenlänge über die Grenzfläche zwischen der Faser und der zu untersuchenden Lösung. Diese Eindringtiefe reicht jedoch aus, um eine substanzielle optische Wechselwirkung in der empfindlichen Zone zwischen der schwindenden Wellenkomponente und dem festangeordneten Antikörper zu erlauben, der mit dem Antigen in der zu untersuchenden Lösung einen Komplex bildet, wobei eine nur minimale Wechselwirkung mit dem Hauptteil der Lösung, in dem sich das Antigen befindet, stattfindet. Diese optische Wechselwirkung ermöglicht dann eine Analyse des Antigens. Eine Vielzahl derartiger Systeme, die die totale interne Reflexionsspektroskopie für Analysezwecke nutzen, sind bekannt und wurden beschrieben. Z. B. offenbart das US-Patent 4,133,639 ein System, das auf der Absorption der schwindenden Welle durch den Analyten beruht. Die US-Patente 3,321,057 und 4,399,099 offenbaren Systeme, die Änderungen in der von der Faser übertragenen Strahlung erfassen. Das US-Patent 4,447,546 beschreibt ein Fluoreszen-Immunanalysesystem.
• Bei dem letzteren System tunnelt die in der empfindlichen Zone durch Erregung durch die schwindende Welle entstehende fluoreszierende Strahlung zurück in die Faser innerhalb des totalen Reflexionswinkels und ist dementsprechend in der Faser gefangen. Die Amplitude der Fluoreszenz wächst mit der Länge der empfindlichen Zone längs der Faser. Jedoch bleibt der optische Durchsatz des Systems, der bestimmt ist vom Durchmesser und der numerischen Apertur der Faser, konstant. Das totale Fluoreszenzsignal, welches von der gesamten Fläche der empfindlichen Zone längs der Faser ausgeht, wird verstärkt durch Erhöhung fluoreszierende Anteile, die in die Zone bei der Erregung eindringen und wird somit verfügbar in einem breiten Fleck mit Abmessungen, die durch den Querschnitt der Faser bestimmt sind, wobei die Faser am Eingangsende mit einem reduzierten Winkel erregt wird, der bestimmt ist durch den kritischen Reflexionswinkel innerhalb der Faser. Ein derartiges Signal kann einfach und mit hohem Wirkungsgrad gesammelt werden und der Durchsatz einem kleinen Detektor angepaßt werden.
• Beispielsweise offenbart das US-Patent 4,050,895 die Erregung einer Wellenfront am Eingangsende durch eine Maske mit einer ringförmigen Eingangsöffnung, die axiale Lichtstrahlen blockiert und den Bereich von Konuswinkeln für die sich verbreitenden Lichtstrahlen definiert. Diese Druckschrift offenbart auch eine zweite Maske, die am Wellenausgang an dem dem Welleneingang gegenüberliegenden Ende angeordnet ist und Licht direkt maskiert, welches keine Wechselwirkung mit irgendeiner Oberfläche unterworfen war.
• Wie allgemein bekannt, kann bei einer Erregerstrahlung, die sich unmittelbar durch eine optische Faser mit einem Brechungsindex n/&sub0;, fortpflanzt, wobei die Faser von einem Material mit einem Brechungsindex n/&sub1;, umgeben ist, der maximale Eingangswinkel B der Eingangsstrahlung in die Faser mit der folgenden Gleichung gefunden werden:
• (1) NA = n&sub2;sinb=(n&sub0;²-n&sub1;²)1/2
• wobei n&sub2; der Brechungsindex des Mediums, in typischer Weise Luft, ist, durch den die Strahlung sich zunächst fortpflanzt, bis sie auf ein Ende der Faser trifft, und wobei NA die sogenannte numerische Apertur der Faser ist. Der maximale Eingangswinkel B kann dann einfach wie folgt definiert werden:
• (2) B=sin&supmin;¹NA
• mit B=b wenn n&sub2;=1 ist (z. B. n&sub2; für trockene Luft). Dementsprechend ist die numerische Apertur an der empfindlichen Zone einer Faser am größten, wenn das Fasermaterial einen großen Brechungsindex und das die empfindliche Zone umgebende Medium einen sehr kleinen Index aufweist oder n&sub0;»n&sub1;. Beispielsweise erreicht man hinreichende Empfindlichkeiten, wenn eine transparente Faser (Glas, Silica, Polymer oder dergleichen) mit üblichem Brechungsindex umgeben ist von einer wässrigen Lösung, die in typischer Weise einen Brechungsindex im Bereich von 1,33 bis 1,35 besitzt.
• Obgleich bekannte Fluoreszenz-Immunanalyseapparate der oben erläuterten Ausführungen hinreichend funktionieren, ist es relativ teuer, Immunanalysen auszuführen, wenn bei derartigen bekannten Apparaten optische Fasern aus Quarz verwendet werden, weil optische Fasern aus Quarz relativ teuer sind und insbesondere dann, wenn die Faser nach jeder Analyse weggeworfen wird. Außerdem ist es relativ schwierig und dementsprechend kostenaufwendig, bei Quarzfasern eine hinreichende Grenzfläche zwischen Lösung und Faser zu erhalten.
• Eine naheliegende Lösung dieser Probleme besteht darin, anstelle von Quarzfasern spritzgeformte Fasern aus synthetischem Polymer zu verwenden. Unglücklicherweise werden Polymere, wie z. B. Polystyrole, die für optische Fasern verwendbar sind, im allgemeinen selbst zur Emission breitbandiger Strahlung angeregt, wenn sie einem geeigneten Erregerlicht ausgesetzt sind. Das erzeugt einen unerwünschten Hintergrund, von dem wenigstens ein Teil innerhalb des gleichen Strahlungsbandes liegt, wie die gewünschte Fluoreszenz, die erzeugt wird als Folge einer spezifischen Bindung der Bestandteile des Immunanalysekomplexes. Deshalb kann es extrem schwierig sein, denjenigen Anteil der Ausgangsstrahlung zu erfassen, der von Interesse ist, nämlich die Fluoreszenz, die auf die gewünschte spezifische Bindung zurückzuführen ist. Eine weitere Komplikation ergibt sich daraus, daß die interne Emission aus der Polymerfaser schnell und inkonsistent über den gleichen Zeitabschnitt der Analyse abnimmt. Der tatsächliche Mechanismus, mit dem das Polymer den unerwünschten Hintergrund erzeugt, ist ungewiß, es wird jedoch angenommen, daß es sich dabei um Fluoreszenz handelt, obgleich auch schon postuliert worden ist, daß es sich um Phosphoreszenze oder sogar um Raman-Emission handelt. Für Erklärungszwecke wird aber im allgemeinen Fluoeszenz angenommen.
• Das Problem ungewollter Fluoreszenz wurde in bestimmten Fluoreszenzsystemen überwunden, die spezielle Polymerkomponenten enthalten. Beispielsweise wird bei Mikrotest-Bohrungssystemen, bei denen fluoreszierende Teile in einem Bestandteil des zu untersuchenden immunochemischen Komplexes eingesetzt werden, das Problem ungewollter Fluoreszenz auf zwei unterschiedlichen Wegen vermieden. Wie z. B. in dem US-Patent 4,501,970 beschrieben, wird dem Kunststoff- Analysepaneel, welches die Testproben trägt, ein Pigment zugefügt, um die Paneele opak zu machen. Ferner ist im US- Patent 4,725,388 offenbart, daß die Probe durch das obere Ende der Kunststoff-Mikrotestbohrung ausgelesen werden kann, so daß im wesentlichen nur die zu untersuchende Probe und nicht die Bohrung im Blickfeld liegt.
• Diese zwei Lösungen des Problems ungewollter Fluoreszenz sind in der Praxis nicht anwendbar auf Fluoreszenzanalyseapparate mit optischen Fasern aus synthetischen Polymeren. Weil derartige Fluoreszenzanalysesysteme auf der Eigenschaft der Filter basieren, Licht zu übertragen, ist die Beigabe eines Pigmentes um die Faser opak zumachen, natürlich keine Lösung des Problems der Faserfluoreszenz. Weil der Detektor des Fluoreszenzanalyseapparates sowohl das Eingangs- als auch das Ausgangsende der Faser im Blickfeld haben muß, ist auch die im US-Patent 4,725,388 offenbarte Lösung des Polymer-Fluoreszenzproblems keine brauchbare Option.
• Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein faseroptisches Analysesystem anzugeben, bei dem optische Fasern aus synthetischem Polymeren als Substratelement eingesetzt werden, an deren Oberfläche ein Bestandteil des Analysekomplexes angebunden ist.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein System zum Bestimmen derjenigen Teile der Ausgangsfluoreszenz des optischen Elementes eines Fluoreszenz-Immunanalysesystems anzugeben, die auf die ungewollte Hintergrundfluoreszenz und die gewünschte Fluoreszenz der spezifisch an die Oberfläche des Elementes gebundenen Liganden zurückzuführen sind.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Durchführung einer Fluoreszenzanalyse unter Verwendung einer optischen Faser aus Polymer anzugeben, ungeachtet interner Erzeugung von unerwünschter Hintergrundfluoreszenz durch die Polymerfaser.
• Diese und andere Aufgaben werden gelöst durch ein Analysesystem mit einem langgestreckten optischen Element, das in der Lage ist, intern eine Erregerstrahlung durch totale interne Refexion zu verbreiten, mit einer Erregerstrahlungsquelle und mit einer Einrichtung zum Richten des Spitzenabschnitts eines Eingangskonus dieser Strahlung auf ein Eingangs- oder proximales Ende der Faser, wobei das Analysesystem eine Einrichtung zum Prüfen der Winkelverteilung der Fluoreszenzstrahlung aufweist, die durch Strahlungserregung erzeugt und von einem Ende der Faser emittiert wird, wobei die Hintergrundstrahlung der Fluoreszenz durch die Verteilung bestimmt wird. Insbesondere kann die Verteilung bestimmt werden durch eine Einrichtung zum Verändern der numerischen Apertur (NA), die in der Nähe einer empfindlichen Zone auf der Oberfläche der Faser angeordnet ist, wobei wechselweise der Eintritt der Erregerstrahlung in die Faser so gesteuert wird, daß nur ausgewählte kolineare konische Abschnitte des Eingangskonus sich längs der Faser fortsetzen, und der Ausgang der Fluoreszenz aus der Faser so gesteuert wird, daß nur ausgewählte kolineare konische Abschnitte der fluoreszierenden Emission geprüft werden. Die Einrichtung zum Verändern der numerischen Apertur weist Mittel zum Abtrennen erster und zweiter Abschnitte des Eingangskonus auf, wobei diese Abschnitte, wenn sie in die Faser eintreten, eine relativ hohe numerische Apertur bzw. eine relativ kleine numerische Apertur in der aktiven Zone oder dem aktiven Teil der Faser bilden, wobei die Einrichtung außerdem zum wechselweisen Einführen dieser konischen Abschnitte konzentrisch in das Eingangsende der Faser ausgebildet ist. In ähnlicher Weise wird die Ausgangsfluoreszenzstrahlung geteilt, entweder wechselweise oder gleichzeitig, in erste und zweite Abschnitte, die die Emissionen repräsentieren, die bei entsprechender Erregung in der empfindlichen Zone durch Teile der Erregerstrahlung entstehen. Es versteht sich, daß der Ausdruck "kolineare konische Abschnitte" hier zum Ausdruck bringen soll, daß ein Konusabschnitt, der die gleiche Konusachse wie ein anderer Konus hat, einen äußeren Mantel besitzt, der konisch, aber nicht notwendigerweise kongruent mit dem Mantel des anderen Konus ist, und ringförmige Bereiche davon einschließt.
• In typischer Weise besitzt das System ferner Mittel zum Erfassen entsprechender Teile der Fluoreszenz, die vorzugsweise vom Eingangsende der optischen Faser emittiert werden, und zum Erzeugen eines Ausgangssignals, welches eine Information enthält, die als Funktion der Intensität der erfaßten Fluoreszenz variiert. Das System weist ferner vorzugsweise einen Computer auf, der mit der Einrichtung zum Erfassen der vorhergehenden Informationen gekuppelt ist, deren Anteil totaler, von der Faser emittierter Fluoreszenz zurückzuführen ist auf die Fluoreszenz, die als Folge der Anbindung eines interessierenden Liganden an den Faserkomplex erzeugt ist.
• Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung weist die Einrichtung zum Variieren der numerischen Apertur eine opake Platte auf, die relativ zum Konus der Eingangsstrahlung zwischen einer ersten und einer zweiten Position beweglich ist, wobei die Platte in der ersten Position die Mittel zum Abtrennen eines ersten kolinearen konischen Teils (wie z. B. des äußeren Ringes) des Konus bildet und in der zweiten Position die Mittel zum Abtrennen eines zweiten kolinearen konischen Teils (wie z. B. des inneren Kerns oder des konischen Zentrums) des Konus bildet.
• Andere Merkmale der Erfindung sind teilweise offensichtlich und werden teilweise im folgenden beschrieben. Die Erfindung umfaßt dementsprechend den Apparat mit Konstruktion, Kombination der Elemente und Anordnung der Teile, die beispielhaft in der folgenden detaillierten Offenbarung wiedergegeben sind. Der Umfang der Anwendung wird durch die Patentansprüche bestimmt.
• Zum besseren Verständnis der Natur und des Zwecks der vorliegenden Erfindung wird bezug genommen auf die folgende detaillierte Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen. Es zeigen:
• Fig. 1 eine schematische Wiedergabe eines Fluoreszenzanalysesystems nach der Erfindung,
• Fig. 2 eine schematische Seitenansicht des proximalen Endes der optischen Faser, die Objektivlinse und eine Ausführung einer Einrichtung zum Verändern der NA,
• Fig. 3 eine grafische Darstellung einer idealisierten Wellenform am Ausgang des Detektors bei einer Ausführung der Erfindung,
• Fig. 4 eine schematische Stirnansicht mit zwei Positionen der Platte einer anderen Ausführung der Einrichtung zum Verändern der NA,
• Fig. 5 eine weitere schematische Stirnansicht mit zwei Positionen einer Platte einer weiteren Ausführung der Einrichtung zum Verändern der NA,
• Fig. 6 eine weitere schematische Stirnansicht ähnlich der Ausführung nach Fig. 5 mit einer anderen Einrichtung zum Verändern der NA, wobei diese Einrichtung vor und in der Nähe des proximalen Endes der Faser angeordnet ist,
• Fig. 7 einen ähnlichen Gegenstand wie Fig. 1, jedoch mit einer anderen Ausführung des Systems zum Erfassen der Ausgangsfluoreszenz von der optischen Faser,
• Fig. 8 eine ähnliche Ausführung wie Fig. 7, jedoch mit einer anderen Ausführung des Erfassungssysterns, und
• Fig. 9 eine Stirnansicht eines Detektors aus Fig. 8.
• Die Erfindung findet Anwendung insbesondere in einem faseroptischen Fluoreszenz-Immunanalysesystem zur Analyse einer Flüssigkeit. Ein beispielhaftes System ist in Fig. 1 mit dem Bezugszeichen 20 bezeichnet. Das System 20 weist eine Quelle 22 auf, die einen parallel gerichteten Strahl eines Erregerlichtes erzeugt, eine Einrichtung zum Aufteilen des Strahls, wie z. B. einen dichroitischen Spiegel 24, der unter einem Winkel von 45º zur Richtung des Erregerstrahls aus der Quelle 22 angeordnet ist. Das System 20 weist ferner eine Fokusiereinrichtung, wie eine Objektivlinse 26 auf, um das parallel gerichtete, vom dichroitschen Spiegel 24 reflektierte Licht zu sammeln und das Licht in Form eines Konus zu fokussieren, dessen spitzes Ende in das proximale Ende 28 einer optischen Faser 30 gerichtet ist. Das System 20 weist außerdem eine Trägereinrichtung 32 für die Faser 30 auf, so daß deren Ende 28 in einer vorbestimmten Anordnung darin fixiert ist, d. h. im wesentlichen auf den Fokus der Objektivlinse 26 gerichtet ist. Eine Umhüllung 34 ist vorgesehen, um die Faser 30 aufzunehmen und um als Behälter für eine zu untersuchende Lösung zu dienen. Zusätzlich weist das System 20 eine Detektor 36 zum Erfassen der Fluoreszenz auf, die vom proximalen Ende 28 der Faser 30 emittiert und durch die Objektivlinse 26 sowie den Spiegel 24 geleitet wird, um ein Ausgangssignal zu erzeugen, das als Funktion der Intensität der emittierten Fluoreszenz dient.
• Die Faser 30 besteht aus einem langgestreckten Körper, der sich vom proximalen Ende 28 oder der Eingangsstirnseite zum distalen oder unteren Ende 40 erstreckt. Die Faser 30 besitzt vorzugsweise einen im wesentlichen kreisförmigen Querschnitt, der wesentlich kleiner ist als die Länge der Faser, obgleich die Faser auch einen rechteckigen oder anderen geometrischen Querschnitt aufweisen kann. Die Oberfläche des proximalen Endes 28 ist in typischer Weise eben und normal zur Längsachse der Faser angeordnet. Sie ist vorzugsweise gut poliert, um Fehler oder andere Oberflächendefekte zu minimieren, die das einfallende und das emittierte Licht streuen würden. Alternativ kann das proximale Ende 28 der Faser auch mit anderen gewünschten optischen Formen ausgebildet werden, um z. B. als vergrößernde oder angepaßte optische Oberfläche zu dienen.
• Bei einer bevorzugten Ausführung, bei der die Fluoreszenz in der Faseroberfläche durch eine Erregerstrahlung induziert wird, die sich längs der Faser ausbreitet, und bei der die Fluoreszenz gesammelt oder beobachtet wird am gleichen proximalen Ende der Faser, an dem die Erregerstrahlung eingeführt wird, ist es wünschenswert, eine vom distalen Ende 40 zum proximalen Ende 28 ausgehende Streustrahlung zu vermeiden. Dazu kann das distale Ende 40 so geformt sein, das es darauf von der Innenseite einfallendes Licht durchläßt. Vorzugsweise ist das distale Ende 40 jedoch mit einem Material beschichtet, das an den Brechungsindex des das Ende 40 umgebenden Mediums angepaßt ist, wobei das Material im Hinblick auf die Erregerstrahlung weder fluoreszierend noch absorbierend ist. In typischer Weise erfüllt diese Funktion ein mit Ruß beladenes Epoxydharz.
• Die Faser 30 ist eingerichtet, optische Erregerstrahlung über ihre Länge durch mehrfache totale interne Reflexion zu verbreiten, wobei die optische Erregerstrahlung am proximalen Ende 28 innerhalb eines konischen Übernahmewinkels eintritt, der im wesentlichen symmetrisch mit der Längsachse der Faser ist, wie oben beschrieben und im übrigen den Fachleuten der Fiberoptik bekannt ist. Die Faser 30 kann aus einer sehr großen Anzahl von im wesentlichen homogenen Materialien gebildet sein, welche für die Erregerstrahlung transparent sind, z. B. glasartige Materialien wie Glas, kristalline Materialien wie Quarz, Safir und dergleichen, synthetische Polymere wie Polyolefine, Polystyrole, Polypropylene und dergleichen. Die Faser 30 ist vorzugsweise relativ steif. Im Hinblick darauf, daß die vorliegende Erfindung insbesondere die Verwendung optischer Fasern aus relativ preiswerten systhetischen Polymeren eingerichtet ist, wird vorgezogen, daß die im Rahmen der Erfindung eingesetzten optischen Fasern aus synthetischen Polymeren mit hohem Molekulargewicht bestehen. Wenn die Faser 30 in Flüssigkeitsanalysen, wie weiter unten beschrieben, eingesetzt werden soll, muß der Brechungsindex (n&sub0;) des die Faser 30 bildenden Materials hinreichend größer sein als n&sub1;, dem Brechungsindex der zu analysierenden Flüssigkeit. Für den Einsatz in einem Immunanalysegerät besitzt die Faser 30 eine Länge zwischen 3 und 5 cm, vorzugsweise ungefähr 4 cm. Die Faser 30 hat in typischer Weise einen Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 2 mm, vorzugsweise ungefähr 1,5 mm. Es versteht sich jedoch, daß diese Längen und Durchmesser lediglich beispielhaft und nicht beschränkend sind.
• Bei einer beispielhaften Ausführung wird angestrebt, daß der wirksame Teil oder die empfindliche Zone der Faseroberfläche definiert wird durch die Abmessungen eines aktivierten Bereiches, in dem die Analyse durchzuführen ist. Zur Bildung eines solchen aktivierten Bereiches oder einer empfindlichen Zone wird der Oberflächenabschnitt der Faser in typischer Weise mit einer Beschichtung 44 versehen, wie sie im einzelnen im US-Patent 4,447,546 beschrieben ist. Die Beschichtung 44 enthält in typischer Weise Liganden, die auf der Oberfläche der Faser festgelegt sind und die Teil eines Komplexes sein können, der als Folge der Analyse fluoresziert, wie das aus dem Stand der Technik bekannt ist. Wie weiter beschrieben, ist das System 20 weitgehend identisch mit dem Immunanalysesystem, das im US- Patent 4,909,990 beschrieben ist.
• Im Rahmen der Erfindung schließt das Analysesystem 20 auch eine Einrichtung zum Verändern der numerischen Apertur ein, an der schwindenden Zone neben dem empfindlichen Abschnitt der Oberfläche der Faser 30, in dem wechselweise nur ausgewählten Teilen des Eingangskonus erlaubt wird, sich längs der Faser auszubreiten. In typischer Weise ist eine solche Einrichtung in Form eines Gerätes 50 ausgebildet, von dem mehrere Ausführungen weiter unten im einzelnen beschrieben werden.
• Der hier benutzte Ausdruck "oberflächengebundene Fluoreszenz" bezieht sich auf eine Fluoreszenz, die durch einen Immunanalysekomplex, erzeugt wird, der an den aktiven Oberflächenbereich oder die empfindliche Zone der Faser 30 gebunden ist. Eine derartige Fluoreszenz wird erzeugt, wenn ein Fluoreszenzanteil im Komplex durch die verschwindende Wellenkomponente der sich längs der Faser ausbreitenden Erregerstrahlung angeregt wird. Wie oben bemerkt, tunnelt die oberflächengebundene Fluoreszenz zurück in die Faser und wird am proximalen Ende der Faser emittiert. Diese emittierte Fluoreszenz wird hier unter anderem "Emissionslicht" oder "Emmissionsfluoreszenz" bezeichnet.
• Der hier verwendete Begriff "geringer NA-Anteil" des Erregerlichtes oder der Fluoreszenzemission, wenn solche vorhanden ist, bezieht sich auf diejenigen Lichtstrahlen, die sich senkrecht zur Hauptebene des proximalen Endes 28 der Faser 30 erstrecken oder damit einen relativ großen Winkel bilden, z. B. Strahlen, die sich im wesentlichen parallel zur Längsachse der Faser erstrecken. Der Ausdruck "außer NA-Anteil" des Erregerlichtes oder der Fluoreszenzemission, falls eine solche vorhanden ist, bezieht sich auf diejenigen Strahlen, die sich mit einem relativ kleineren Winkel zur Hauptebene des proximalen Endes der Faser erstrecken. Dementsprechend bildet der geringe NA-Anteil des Erregerlichtes in typischer Weise einen Konus mit kleinem Konuswinkel aus Lichtstrahlen, während der große NA-Anteil des Erregerlichtes einen konischen Ringkörper mit relativ großem Konuswinkel aus Lichtstrahlen bilden oder den gesamten Eingangskonus umfassen kann.
• Eine Breitbandfluoreszenz, die in einem Polymersubstrat erzeugt wird, ist eher ein Phänomen der Masse als der Oberfläche. Sie ist instabil und zeigt eine fotoinduzierte Drift. Diese intern erzeugte Fluoreszenz ist einheitlich im Winkel, weil die Fluorophoren innerhalb der Faser in zufälligen Richtungen abstrahlen, während die oberflächengebundene Fluoreszenz hochgradig nicht einheitlich im Winkel ist und hauptsächlich mit großen Winkeln auftritt als Folge davon, daß die Fluoreszenz zurück in die Faser tunnelt. Die von der schwindenden Welle erzeugten, gewünschten Fluoreszenzsignale, die wichtige Daten für die Analyse enthalten, sind deshalb näherungsweise proportional NA/&sup9;, während die ungewollte Hintergrundfluoreszenz ungefähr proportional NA/&sup4; ist (mit NA/² für die Erregung und NA/² für das Sammeln). Wenn die gesamte NA eingeschränkt wird, nimmt die oberflächengebundene Fluoreszenz schneller ab als das Signal aus der Polymerfluoreszenz. Die Größen der Signale der intern erzeugten Fluoreszenz bei verschiedenen Werten der numerischen Apertur an der empfindlichen Zone sind direkt miteinander korrelierbar. Man kann einfach die gemessenen Werte für die Fluoreszenz bei kleiner NA weglassen und die gemessene Fluoreszenz bei der NA in Betracht ziehen, die maßgebend ist für das gewünschte Fluoreszenzsignal, jedoch führt eine solche Nährung zu ungenauen Resultaten insofern, daß das letztere Meßergebnis noch einen unbekannten Betrag der massengebundenen Fluoreszenz enthält. Um ein genaues Meßergebnis des gewünschten oberflächengebundenen Fluoreszenzsignals zu erhalten, kann man deshalb die Fluoreszenz bei verschiedenen NA messen und vom Wert der Fluoreszenz bei der größeren NA eine Funktion der Messung der Fluoreszenz bei kleiner NA subtrahieren.
• Eine vereinfachte Nährung, bei der zum besseren Verständnis bestimmte konstante Größen, wie Hintergrundfluoreszenz in der Masse der zu analysierenden Lösung, Grad der Dunkelheit, reflektierte Erregung und dergleichen, vernachlässigt werden, kann wie folgt angegeben werden:
• Angenommen, es werden zwei gesonderte abwechselnde Reihen von Messungen vorgenommen, nämlich eine, bei der die Eingangserregerstrahlung zur Faser beschränkt oder begrenzt wird auf einen nur schmalen zentralen Kern des Eingangskonus und deshalb eine verhältnismäßig geringen NA auf die aktive Zone der Faser ausübt. Die breite Reihe von Messungen wird vorgenommen, wenn die Erregerstrahlung die Gesamtheit des Eingangskonus umfaßt und deshalb eine relativ hohe NA an der aktiven Zone errichtet.
• Die Spitzenamplituden des Gesamtsignals (T), die erfaßt wird, wenn die aktive Zone eine große NA (NAH) hat, ist die Summe aus dem gebundenen Fluoreszenzsignal (D), das gefunden werden soll, und der unerwünschten Hintergrundfluoreszenz (U), oder:
• (3) T=U+D
• Die Signale (TL), die erfaßt werden, wenn die empfindliche Zone mit geringer NA (NAL) erregt wird, sind proportional der vierten Potenz der NA für das unerwünschste Signal (U), während das gewünschte Signal proportional ungefähr der neunten Potenz der NA ist. Um TL mit den Ausdrücken U und D wiederzugeben, kann man einen geeigneten Proportionalitätsfaktor (K) wie folgt angeben:
• (4) K=(NAH/NAL)
• Dementsprechend kann TL wiedergegeben werden als:
• (5) TL=U/K&sup4;+D/K&sup9;
• Man kann zum leichteren Verständnis außerdem annehmen, daß die großen NA-Signale (T) etwa betragen NA = 0,88 und die kleinen NA-Signale (TL) etwa NA=0,4. Dann ist K (0,88/0,4) das in vierter Potenz ungefähr 23,4 sowie in neunter Potenz ungefähr 1.207 beträgt. Aus der Gleichung (5) wird dann :
• (6) TL=U/23,4+D/1207
• Durch Neuordnung der Gleichung (3) und Ersetzen von U durch T - D in Gleichung (6) erhält man:
• (7) TL=(T-D)/23,4+D/1207
• (8) D=1,02T-23,87TL
• nämlich im allgemeinen:
• (9) D=C&sub1;T-C&sub2;TL
• wobei C&sub1; und C&sub2; Konstanten sind, die weitgehend vom Scheibendurchmesser bestimmt sind. Wie sich aus der folgenden Beschreibung ergibt, sind sowohl T als auch TL direkt meßbar, wenn die Prinzipien der Erfindung genutzt werden. Die erforderlichen Rechenschritte zum Erhalt des gewünschten Signals (D) können in einem herkömmlichen Computer 86 erfolgen, der so angeschlossen ist, daß er die großen NA- und die kleineren NA-Ausgangssignale vom Schaltkreis 84 übernimmt. Die speziellen Programmschritte, die erforderlich sind, um die Prozeduren zum Berechnen des gewünschten Signals auszuführen, sind hier nicht beschrieben, denn sie können mit dem üblichen Fachwissen geschrieben werden.
• Die in Fig. 2 dargestellte vorzugsweise Ausführung einer Einrichtung zum Verändern der NA des Gerätes so ist für den Einsatz einer Faser 30 mit einem kreisförmigen proximalen Ende 28 bestimmt und weist eine kreisförmige, dünne flache Scheibe 70 auf, die aus einem Material gebildet ist, das relativ opak für die Erregerstrahlung aus der Quelle 22 ist. Zusätzlich weist das Gerät 50 eine langgestreckte Welle 72 auf, die an eine Seite der Scheibe 70 längs eines Radius der Scheibe gekuppelt ist, und einen Motor 74, der die Welle 72 um ihre Längsachse und die Scheibe 70 um ihren Durchmesser dreht. Der Motor 74 ist vorzugsweise neben der Opjektivlinse 26 so angeordnet, daß die Welle 72 sich senkrecht zur optischen Achse der Objektivlinse 26 sowie zur kolinearen Längsachse der Faser 30 erstreckt. Die Länge der Welle 72 und die Anordnung des Motors 74 sind darüber hinaus so gewählt, daß die Scheibe 74 daneben sowie parallel und zentriert im Hinblick auf die Vorderseite 46 der Objektivlinse 26 zentriert ist. Der Motor 74 ist vorzugsweise auf einem XYZ-Tisch 76 angeordnet, der so ausgebildet ist, daß er den Motor und dementsprechend die daran angeschlossene Scheibe 70 in drei einstellbaren Richtungen relativ zum proximalen Ende 28 der Faser 30 bewegen kann. Wichtig ist, daß durch geeignete Einstellung des Tisches 76 die Scheibe 70 so konzentrisch wie möglich zur optischen Achse der Objektivlinse 26 eingestellt werden sollte, damit bei dieser Ausführung die Scheibe 70 parallel zum proximalen Ende 28 den Durchgang nur eines regelmäßigen Kreisrings ermöglicht, d. h. eines Kreisrings, der bestimmte innere und äußere Radien sowie eine bestimmte Breite aufweist und der gebildet ist vom äußeren Teil des Konus der eingangsseitigen Erregerstrahlung oder der ausgangsseitigen Fluoreszenzemission, falls diese vorhanden ist.
• Der Motor 74 dient dazu, die Welle 72 und die daran angeschlossene Scheibe 70 zwischen einer ersten oder parallen Position zu drehen, bei der die parallele ebene Oberfläche der Scheibe 70 sich parallel zur Hauptebene des proximalen Endes 28 der Faser 30 erstreckt, und einer zweiten oder dazu senkrechten Position, bei der die ebene Oberfläche der Scheibe 70 sich senkrecht zur Hauptebene des proximalen Endes 28 erstreckt. Diese Drehung kann kontinuierlich in einer Richtung, z. B. im Uhrzeigersinn, sein oder sie kann intermittierend in wechselnden Richtungen, d. h. im Uhrzeigersinn und im Gegenuhrzeigersinn, zwischen der parallelen Position und der senkrechten Position sein. Vorzugsweise ist der Motor 74 so positioniert, daß die Scheibe 70 so dicht wie möglich an der Aperturebene der Objektivlinse 26 angeordnet ist, mit der Einschränkung, daß die Scheibe bei senkrechter Position die Objektivlinse nicht berührt. Bei einer Ausführung der Erfindung besteht der Motor 74 aus einem kleinen Gleichstrommotor, der so an die Welle 72 angeschlossen ist, daß er die Welle kontinuierlich bei einer vorgegebenen Drehzahl, (z. B. im Bereich zwischen 32 und 200 U/min.) um ihre Längsachse dreht. Bei einer anderen Ausführung wird die Welle 72 von einem Schrittschaltmotor oder einem Relais angetrieben, das reversibel und intermittierend die Scheibe 70 zwischen ihrer ersten und ihrer zweiten Position bewegt.
• Der Durchmesser der Scheibe 70 ist so gewählt, daß, wenn die Scheibe parallel zum proximalen Ende 28 positioniert ist, die Scheibe längs ihres Umfanges einen kreisringförmigen konischen Teil mit NA-Erregerlicht passieren läßt und lediglich den kleinen NA-Teil des Erregerlichtes (z. B. den inneren konischen Teil vom Konus des Erregerlichtes), vor dem Erreichen der Faser 30 blockiert, sowie außerdem den kleinen NA-Teil der Fluoreszenzemissionen (z. B. den inneren konischen Teil der Fluoreszenzemissionen) vor dem Erreichen des Detektors 36, blockiert oder abschirmt, im übrigen aber den großen NA-Teil der Fluoreszenzemissionen passieren läßt. Es versteht sich, daß bei dieser Ausführung, wenn die Scheibe sich senkrecht auf die Hauptebene des proximalen Endes 28 erstreckt, im wesentlichen der gesamte Eingangskonus (und die gesamte Ausgangsfluoreszenzemission) durchgelassen werden. Der spezifische Durchmesser der Scheibe 70 ist eine Funktion der Größe der Objektivlinse 26, der Größe des Konus des Erregerlichtes, gemessen an der Scheibe 70, in relativen Anteilen von kleinen und großen NA-Teilen, die abgeschirmt oder durchgelassen werden sollen, und anderen Faktoren. Die Dicke der Scheibe 70 ist vorzugsweise so gewählt, daß der davon blockierte Betrag des Erregerlichtes minimiert wird, wenn die Scheibe sich senkrecht zum proximalen Ende 28 erstreckt, wie in Fig. 5 dargestellt. In typischer Weise hat die Scheibe 70 eine Dicke von ungefähr 0,1 mm.
• Die folgende Beschreibung der Arbeitsweise der Erfindung bezieht sich auf die bevorzugte Ausführung der Einrichtung zum Variieren der NA, wie sie oben in Verbindung mit Fig. 2 erläutert ist. Ferner wird für die folgende Beschreibung angenommen, daß die Faser 30 aus einem Polymer besteht, das eine intern erzeugte Hintergrundfluoreszenz erzeugt, wenn es einem Erregerlicht ausgesetzt ist.
• Derjenige Teil, der vom proximalen Ende 28 der Faser 30 emittiert wird und zurückzuführen ist auf die gewünschte Fluoreszenz, die als Folge der Oberflächenbindung von Bestandteilen des Irnmunanalysekomplexes erzeugt wird, wird bestimmt auf der Basis von Information im Ausgangssignal des Detektors 36. Wenn die Scheibe 70 kontinuierlich zwischen senkrechten und parallelen Positionen rotiert, verändert sich das Ausgangssignal vom Detektor 36, wie in Fig. 3 in idealisierter Form wiedergegeben, periodisch zwischen unterschiedlichen Werten als Funktion der Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe 70. Wenn die Scheibe 70 parallel zum proximalen Ende 28 positioniert ist, ist die Größe (Spannung) des Ausgangssignals des Detektors 36 relativ klein, weil lediglich der kreisringförmige Teil der Ernissionsfluoreszenz um die Scheibe herum beobachtet werden kann, während ein wesentlicher Teil des Erregerlichtes blockiert wird und die Faser 30 nicht erreicht. Dieser blockierte Teil von kleinem NA-Licht würde sonst eine Fluoreszenz induzieren, die vom Komplex an der Faseroberfläche ausgeht und würde außerdem die Faser 30 dazu anregen, Fluoreszenz mit einer verhältnismäßig signifikanten Intensität zu emittieren. Wenn die Scheibe 70 sich in ihrer senkrechten Position befindet, schirmt sie verhältnismäßig wenig vom Erregerlicht oder der resultierenden Fluoreszenzemission ab. In Folge dessen ist die Größe des Ausgangssignals des Detektors 36 verhältnismäßig hoch.
• Das Ausgangssignal des Detektors 36 ist deshalb im wesentlichen ein moduliertes Gleichstromsignal mit einer ersten Komponente, die in erster Linie die Fluoreszenz repräsentiert, welche aufgrund einer Erregung durch den größeren NA-Anteil des Erregerlichtes entsteht, und einer zweiten Komponente, die in erster Linie die Fluoreszenz repräsentiert, für die der kleinere NA-Teil des Erregerlichtes verantwortlich ist. Die Spitze-Zu-Spitze-Modulation repäsentiert den kleinen NA-Teil und die Hüllkurve der oberen Spitzen reprasentlert den gesamten NA-Teil. Der auf den hohen NA-Teil des Erregerlichtes zurückzuführende Teil des Ausgangssignals ist nicht beständig, weil er sich mit regulären und unvorhersehbaren Veränderungen der intern in der Faser erzeugten Fluoreszenz ändert. Die periodische Modulation der Komponente ist selbstverständlich zweimal so groß wie die Frequenz, mit der die Scheibe 70 durch den Motor 74 gedreht wird.
• Die Differenz zwischen dem RMS-Wert und dem Spitze-Zu- Spitze-Wert des Modulationswertes ist im wesentlichen ein konstanter Faktor und kann zum Ausdruck gebracht werden im Wert des Maßstabsfaktors, der in Gleichung (9) benutzt wird. Da es viel einfacher ist, den RMS-Wert der Modulationskomponente und den Mittelwert des Gleichspannungssignals zu bestimmen als die Spitzen, umfaßt die Erfindung auch eine Anzahl von im Handel erhältlichen Trennungs- Schaltkreisen 84, die mit dem Detektor 36 gekuppelt sind, um den Ausgang des Detektors in einen Mittelwert und einen dem RMS-äquivalenten Wert zu trennen. In manchen Fällen kann sich ein signifikanter Durchsatz des modulierten Signals in den Übertragungskanälen sowohl für die große NA als auch für die kleine NA ergeben. Der Durchsatz kann durch Einsatz geeigneter Tiefpaßfilter am Ausgang der Übertragungskanäle für die große NA und die kleine NA reduziert werden.
• Deshalb ist der Ausgang des Schaltkreises 84 an einen Computer 86 angekoppelt, in welchem elektronisch Rechnungen ausgeführt werden, indem der Ausgang des Detektors genommen und die mittleren Gleichspannungskomponente von der Modulationskomponente getrennt werden, der RMS-Wert von der letzteren getrennt und mit einer Konstanten (z. B. einem vorbestimmten Verstärkungsfaktor für das spezielle System) multipliziert wird sowie das Resultat von der mittleren Gleichspannungskomponente subtrahiert wird, um den gewünschten Ausgang zu erhalten.
• Als Einrichtung zum Verändern der NA können verschiedene zusätzliche Ausführungen eingesetzt werden, von denen eine in Fig. 4 wiedergeben ist. Diese zweite Ausführung des Gerätes 50 ist ähnlich der in Fig. 2 wiedergegebenen Ausführung und weist eine an die Oberfläche der Scheibe 70 angeschlossene Welle 72 auf. Diese zweite Ausführung der Erfindung unterscheidet sich jedoch von der in Fig. 2 wiedergegebenen dadurch, daß anstelle des Motors 74 ein Schrittschaltmotor 90 eingesetzt ist und die Scheibe 70 so auf der Welle 72 befestigt ist, daß ihre Ebene immer parallel zum proximalen Ende 28 befindet. Der Schrittschaltmotor 90 ist an einem Träger 92 befestigt und mit der Welle 72 gekoppelt. Der Schrittschaltmotor 90 ist so ausgebildet und angeordnet, daß er die Welle 72 und die Scheibe 73 in deren Ebene senkrecht zur Längsachse der Faser zwischen einer ersten Position, bei der die Scheibe nicht im Pfad der Erregung und des Emissionslichtes liegt, wie mit gestrichelten Linien in Fig. 4 wiedergegeben, sowie einer zweiten Position bewegt, bei der die Scheibe zentral im Pfad der Erregung und des Emissionslichtes vor der Frontseite 46 der Objektivlinse 26 liegt, wie dies mit durchgezogenen Linien in Fig. 4 wiedergegeben ist. Es sei bemerkt, daß der Schrittschaltmotor 90 so ausgelegt sein kann, daß er die Scheibe 70 vor und zurück in ihrer Ebene bewegt oder als alternative die Scheibe in eine Richtung innerhalb ihrer Ebene bewegt. Auf jeden Fall versteht es sich, daß die Bewegung der Welle und der Scheibe den erforderlichen periodischen Wechsel in der NA der empfindlichen Zone eines zugeordneten optischen Stabes oder der Faser erzeugt.
• Fig. 5 zeigt eine dritte Ausführung des Gerätes 50 zum Verändern der NA mit einer opaken Scheibe 100, die wenigstens eine große und eine relativ kleine kreisförmige Öffnung aufweist, vorzugsweise aber eine Mehrzahl von großen kreisförmigen Öffnungen 102 und kleinen kreisförmigen Öffnungen 104, die wechselweise längs eines kreisförmigen Pfades neben dem Umfangsrand der Scheibe 100 angeordnet sind, so daß die Zentren jeder der großen und der kleinen Öffnungen in einem vorbestimmten radialen Abstand vom Zentrum der Scheibe positioniert sind. Der Durchmesser der großen Öffnungen 102 ist so gewählt, daß, wenn die Scheibe neben der Objektivlinse 26 mit einer zur optischen Achse der Objektivlinse 26 konzentrischen großen Öffnung positioniert ist, sowohl die großen NA-Teile als auch die kleinen NA-Teile der Erregung und des Emissionslichtes die große Öffnung passieren können. Der Durchmesser der keinen Öffnung 104 ist so gewählt, daß, wenn die letztere in ähnlicher Weise relativ zur Objektivlinse 26 positioniert ist, die großen NA-Teile der Erregung und des Emissionslichtes durch die Scheibe 100 blockiert sind und nur Licht mit kleiner NA die Öffnung passiert.
• Die Ausführung in Fig. 5 weist zusätzlich einen Motor 106 auf, der die Scheibe 100 neben der Objektivlinse 26 trägt und die Scheibe um ihr Zentrum rotiert. Der Motor 106 ist an ein Bauteil 108 angeschlossen und so bemessen und ausgelegt, daß er die Scheibe 100 neben der Vorderseite 46 der Objektivlinse 26 trägt, wobei die Frontseite und die Rückseite der Scheibe sich senkrecht zur optischen Achse der Objektivlinse 26 erstrecken, so daß bei Drehung der Scheibe die Öffnungen 102 und 104 aufeinanderfolgend in eine zentrierte Position zum proximalen Ende 28 bewegt werden. Es versteht sich wiederum, daß die Bewegung der Scheibe 100 mit ihren zugeordneten Öffnungen den erforderlichen periodischen Wechsel in der NA an der empfindlichen Zone des zugeordneten optischen Stabes oder der Faser erzeugt.
• Fig. 5 weist ferner ein Positionserfassungssystem auf, das mit dem Computer 86 gekoppelt ist, um festzustellen, wann die Öffnungen 102 und 104 im Hinblick auf das proximale Ende 28 der Faser 30 zentriert sind und um immer dann ein Ausgangssignal an den Computer zu liefern, wenn die Zentrierung eintritt. Eine Vielzahl verschiedener Apparate kann eingesetzt werden, um dem Computer 86 diese Ausrichtung zu melden. Eine bevorzugte Ausführung eines solchen Erfassungssystems weist jedoch einen Hilfsdetektor 110 auf, der an einem festen Träger neben dem Umfangsrand der Scheibe 100 befestigt ist. Der Detektor 110 weist in typischer Weise eine Einrichtung auf, wie z. B. eine Fotodiode und zugeordnete (nicht dargestellte) optische Einrichtungen, um ein infrarotes Strahlungssignal an den Umfangsrand der Scheibe 100 abzugeben, und eine Mehrzahl von Reflektoren 112, die am Umfangsrand der Scheibe 100 so befestigt sind, daß neben jeder Öffnung 102 und 104 ein Reflektor angeordnet ist. Der Detektor 110 ist so ausgelegt, daß er die von den Refektoren 112 refektierte infrarote Strahlung aufnimmt und ein Ausgangssignal an den Computer 86 immer dann liefert, wenn eine Reflexion erhalten wurde.
• Das gewünschte Signal (D) wird bei der Ausführung nach Fig. 5 in ähnlicher Weise wie oben beschrieben erhalten mit Ausnahme von zwei Punkten. Erstens muß das Ausgangssignal vom Detektor 36 so gesteuert werden, daß es nur dann dem Computer 86 übergeben wird, wenn der Detektor 110 ein Signal an den Computer 86 liefert, welches anzeigt, daß eine der Öffnungen 102 oder 104 relativ zum proximalen Ende 28 der Faser 30 zentriert ist. Diese Steuerung kann mit herkömmlichen Schaltkreisen verwirklicht werden, wie sie der Fachwelt zur Verfügung stehen. Dementsprechend wird die Prozedur zum Bestimmen des gewünschten Signals, wie oben beschrieben, ausgeführt unter Nutzung der Information von Detektor 36, die in dem Moment erzeugt wird, wenn eine der Öffnungen 102 oder 104 relativ zum proximalen Ende 28 der Faser 30 zentriert ist. Zweitens ist der Proportionalitätsfaktor zum Berechnen des gewünschten Signals bei der dritten Ausführung der Erfindung unterschiedlich von dem bei anderen Ausführungen des Gerätes 50 zum Einstellen der NA. Ein unterschiedlicher Proportionalitatsfaktor ist deshalb erforderlich, weil die kleinen Öffnungen 104 nur kleines NA-Licht durchlassen, während Licht mit großem NA und kleinem NA die Scheibe 70 passieren kann, wenn sie in der "kombinierten NA"-Position ist (d. h., wenn die Scheibe 70 in senkrechter Position bei der Ausführung nach Fig. 2 ist, oder wenn die Scheibe 70 sich neben einer Seite der Faser 30 bei der Auführung nach Fig. 4 befindet).
• Die in Fig. 6 dargestellte Ausführung des Gerätes 50 zum Einstellen der NA weist eine durchsichtige Scheibe 114 mit einer Mehrzahl von kreisförmigen opaken Stellen 115 auf, die mit gegenseitigem Abstand längs einer kreisförmigen konzentrischen Linie neben dem Umfangsrand der Scheibe angeordnet sind. Die Ausführung nach Fig. 6 weist einen Motor 106 auf, der an einem Bauteil 108 angebracht ist und mit einer Scheibe 114 gekoppelt ist, die er auch trägt und neben der Objektivlinse 26 so hält, daß bei Rotation der Scheibe die Stellen 115 nacheinander in konzentrische Beziehung mit dem proximalen Ende 28 gebracht werden. Jede der Mehrzahl der Stellen 115 besitzt eine derartige Größe, daß wenn eine dieser Stellen in konzentrische Beziehung zum proximalen Ende 28 gebracht ist, die Stelle den kleinen NA-Teil der Erregung und des Emissionslichtes blokkiert. Die Gesamtheit des Erregerlichtes erreicht das proximale Ende 28 und die Gesamtheit des Emissionslichtes passiert die Scheibe 114, wenn durchsichtige Teile der Scheibe 114 zwischen den Stellen 115 sich zwischen der Quelle des Erregerlichtes und dem proximalen Ende 28 befinden.
• Damit auf einen Schaltkreis 84 zum Trennen des Ausgangs am Detektor 36 in ein mittleres Gleichspannungssignal und ein der RMS äquivalentes Signal verzichtet werden kann, kann das in Fig. 1 wiedergegebene System so modifiziert werden, wie in Fig. 7 wiedergegeben. Dazu weist das System einen langgestreckten Spiegel 120 auf, der angeordnet ist unter einem Winkel von 45º zum Pfad des Lichtstrahls, welcher durch den Spiegel 24 in Richtung auf den Detektor 36 übertragen wird. Der Spiegel 120 hat einen Grundriß (z. B. in typischer Weise einen ovalen Grundriß) und ist so dimensioniert, daß er nur den kleineren NA-Teil des Lichtes abschirmt, während der größere NA-Teil als Kreisring um die Ränder des Spiegels zum Detektor 36 übertragen wird. Ein zweiter Detektor 122 zum Erfassen der Fluoreszenzemission aus der Faser 30 ist neben dem Spiegel 120 im Pfad des vom letzteren reflektierten Lichtes angeordnet und kann identisch aufgebaut sein wie der Detektor 36.
• Durch Anordnung des Spiegels 120 und des Detektors 122 zu dem in Fig. 1 wiedergegebenen System kann die Intensität des kleineren NA-Teils der von der Faser 30 emittierten Fluoreszenz bestimmt werden auf der Basis der Größe des Ausgangssignals des Detektors 122 und die Intensität des großen NA-Teils der von der Faser 30 emittierten Fluoreszenz kann bestimmt werden auf der Basis der Größe des Ausgangssignals des Detektors 36. Das gewünschte Signal (D) wird dann leicht bestimmt, wobei die Relation des letzteren zur NA annäherungsweise quadratisch ist und nicht der vierten Potenz folgt, wie oben beschrieben.
• Um die Vorteile des in Fig. 7 wiedergegebenen Systems zu erhalten, ohne daß zwei Detektoren angeordnet werden müssen, kann das in Fig. 1 wiedergegebene System modifiziert werden durch Weglassen des Schaltkreises 84 und Ersatz des Detektors 36 durch einen Detektor 130, wie in den Fig. 8 und 9 wiedergegeben. Der Detektor 130 weist zunächst einen empfindlichen Bereich 134 zum Erfassen von Licht mit kleiner NA auf, welches längs eines konischen Pfades durch eine optische Anordnung 132 abgebildet wird, und einen zweiten empfindlichen Bereich 136 zum Erfassen von Licht mit großer NA, das durch die optische Anordnung 132 übertragen wird. Die empfindlichen Bereiche 134 und 136 liegen in einer gemeinsamen Ebene. Der Detektor 130 weist zwei Ausgangskanäle auf, jeweils einen für die empfindlichen Bereiche 134 und 136.
• Die optische Anordnung 132 weist in typischer Weise ein Linsensystem zum Sammeln der Emissionsfluoreszenz an der Öffnungsebene auf (d. h. diese Ebene erstreckt sich parallel zum proximalen Ende 28 der Faser 30 und ist positioniert neben der Vorderseite 46 der Objektivlinse 26) und fokussiert gesonderte Abbildungen davon auf den Detektor 130. Der Detektor 130 ist so positioniert, daß die Ebene, in der die empfindlichen Bereiche 134 und 136 liegen, koplanar ist zur Fokalebene, auf welche das Bild der Öffnungsebene durch die optische Anordnung 132 fokussiert wird.

Claims (23)

1. Analysesystem mit einem langgestreckten optischen Element, das in der Lage ist, darin eine eingangsseitige Erregerstrahlung durch totale interne Reflexion zu verbreiten und das einen anliegenden Oberflächenabschnitt und eine empfindliche Zone aufweist, an der fluoreszierende Komponenten zu einer fluoreszierenden Ausgangsstrahlung anregbar sind durch eine schwindende Welle, die von der sich ausbreitenden eingangsseitigen Erregerstrahlung erzeugt ist, wobei das Analysesystem eine erste Einrichtung zum Richten des Spitzenabschnitts eines Konus der eingangsseitigen Erregerstrahlung in ein erstes Ende des Elementes aufweist, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zum Prüfen der Winkelverteilung der fluorisierenden Ausgangsstrahlung, die von der schwindenden Welle der eingangsseitigen Erregerstrahlung angeregt wurde, sowie anderer fluoreszierende Ausgangsstrahlung, die vom ersten Ende des Elementes emittiert wird, so daß der Betrag der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung, die von der schwindenden Welle angeregt wurde, von anderer Strahlung, die im Körper des Elementes erzeugt wurde, getrennt werden kann, wobei die Einrichtung zum Prüfen auch Mittel zum Überwachen des Austritts der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung aus dem ersten Ende des Elementes einschließt, so daß nur ausgewählte Differenzanteile der Konen der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung geprüft werden, die die gleiche Konusachse wie andere Konen der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung sowie äußere Mäntel, die konisch, aber nicht kongruent mit den Mänteln der anderen Konen der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung, einschließlich deren Ringe, haben.

2. Analysesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Prüfen der Winkelverteilung der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung, die durch eingangsseitige Erregerstrahlung erzeugt wurde, Mittel zum Verändern der numerischen Apertur am ersten Ende des Elementes aufweist.

3. Analysesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Prüfen der Winkelverteilung der fluoreszierenden Ausgangsstrahlung Mittel zum Erfassen der Ausgangsfluoreszenz durch wechselweises Steuern der numerischen Aperturen des Eintritts der eingangsseitigen Erregerstrahlung in das erste Ende des Elementes aufweist, so daß nur ausgewählte konische, kolineare Differenzbereiche der Konen der eingangsseitigen Erregerstrahlung sich längs des Elementes verbreiten.

4. Analysesystem nach Anspruch 3, wobei die Mittel zum Verändern der numerischen Apertur gekennzeichnet sind durch:

Mittel zum Abtrennen eines ersten Abschnitts vom Konus der eingangsseitigen Erregerstrahlung, wobei dieser abgetrennte Abschnitt, wenn er in das erste Ende des Elementes eintritt, eine relativ hohe numerische Apertur am ersten Ende des Elementes besitzt;

Mittel zum Abtrennen eines zweiten Abschnitts der eingangsseitigen Erregerstrahlung, wobei dieser zweite Abschnitt, wenn er in das erste Ende des Elementes eintritt, eine relativ niedrige numeriche Apertur am ersten Ende des Elementes aufweist; und

Mittel zum wechselweisen Einführen der Abschnitte der Konen der eingangsseitigen Erregerstrahlung in das erste Ende des Elementes für die Verbreitung längs des Elementes.

5. Analysesystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Abschnitt ein konisches Ringrohr ist und daß der zweite Abschnitt ein Konus mit einem festen Konuswinkel ist, der etwa den gleichen Wert wie der Mantel des Ringrohrs aufweist.

6. Analysesystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Abschnitt ein konisches Ringrohr ist und der zweite Abschnitt ein Konus mit einem festen Konuswinkel, der etwa den gleichen Wert besitzt wie der innere Winkel des Ringrohrs.

7. Analysesystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Verändern der numerischen Apertur am ersten Ende des Elementes eine opake Platte aufweisen, die relativ zum Konus zwischen wenigstens zwei Positionen beweglich ist, wobei die Platte in einer ersten Position die Mittel zum Abtrennen eines ersten Teils des Konus und in der zweiten Position zum Abtrennen eines zweiten Teils des Konus bildet.

8. Analysesystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte zwischen der Quelle des Konus und dem ersten Ende des optischen Elementes konzentrisch zum Element positioniert ist sowie drehbar zwischen der ersten Position, bei der die Platte wenigstens einen wesentlichen Abschnitt des Konus abdeckt, und der zweiten Position, bei der die Platte einen verhältnismäßig kleinen Teil des Konus abdeckt, auf einer Welle angeordnet ist.

9. Analysesystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte im wesentlichen eben ist und im wesentlichen in ihrer eigenen Ebene zwischen der ersten und der zweiten Position bewegbar ist.

10. Analysesystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte in ihrer eigenen Ebene drehbar angeordnet ist.

11. Analysesystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte im wesentlichen eben und verhältnismäßig dünn ist sowie im wesentlichen normal zu ihrer Ebene zwischen der ersten und der zweiten Position beweglich ist.

12. Analysesystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte im wesentlichen normal zu ihrer Ebene drehbar ist.

13. Analysesystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte wenigstens erste und zweite Öffnungen aufweist, die sich durch die Platte erstrecken, wobei die erste Öffnung so dimensioniert ist, daß sie die Mittel zum Abtrennen des ersten Abschnitts des Konus bildet, und die zweite Öffnung so dimensioniert ist, daß sie die Mittel zum Abtrennen des zweiten Teils des Konus bildet.

14. Analysesystem zur Durchführung einer Fluoreszenzanalyse auf der Grundlage einer Reaktion zwischen ersten und zweiten Bestandteilen eines chemischen Komplexes, wobei der erste Bestandteil auf einem Oberflächenbereich eines langgestreckten optischen Elementes befestigt ist, welches in der Lage ist, eine eingangsseitige Erregerstrahlung durch totale interne Reflexion darin zu verbreiten, und wobei Mittel vorgesehen sind, um eine Ausgangsfluoreszenz zu erregen durch eine schwindende Welle, die durch Verbreitung der eingangsseitigen Erregerstrahlung erzeugt wurde, wobei die Fluoreszenz zum Identifizieren des Komplexes genutzt wird, gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Merkmale:

Mittel zum Richten der eingangsseitigen Eingangsstrahlung im wesentlichen als Eingangskonus in ein erstes Ende des Elementes;

Mittel zum Erfassen der Ausgangsfluoreszenz, die durch die längs des Elementes verbreitete, eingangsseitige Erregerstrahlung angeregt ist, und zum Erzeugen eines Ausgangssignals, das als Funktion der Intensität der Ausgangsfluoreszenz variiert; und

Mittel zum Steuern des Austritts der Ausgangsfluoreszenz aus dem ersten Ende des Elementes, so daß nur ausgewählte Differenzabschnitte der Konen der Ausgangsfluoreszenz geprüft werden, die die gleiche Konusachse wie andere Ausgangskonen sowie äußere Mäntel haben, die konisch, aber nicht kongruent mit den Mänteln der anderen Ausgangskonen, insbesondere deren Ringe, haben.

15. Analysesystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Richten der eingangsseitigen Erregerstrahlung Mittel zum Verändern der numerischen Apertur der Eingangsfluoreszenz aufweisen.

16. Analysesystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Variieren der numerischen Apertur Mittel aufweisen, die wechselweise nur ausgewählte konische kolineare Differenzabschnitte des Eingangskonus zur Verbreitung längs des Elementes und zur Erregung einer Ausgangsfluoreszenz durchlassen.

17. Analysesystem nach Anspruch 16, wobei die Mittel zum Variieren der numerischen Apertur bestehen aus:

Mittel zum Auswählen eines ersten konischen kolinearen Abschnitts aus dem Eingangskonus, wobei dieser Abschnitt beim Eintritt in das erste Ende des Elementes eine relativ hohe numerische Apertur am Oberflächenabschnitt besitzt;

Mittel zum Auswählen eines zweiten konischen kolinearen Abschnitts aus dem Eingangskonus, wobei dieser Abschnitt beim Eintritt in das erste Ende des Elementes eine relativ geringe numerische Apertur am Oberflächenabschnitt besitzt; und

Mittel zum wechselweisen Einführen dieser Abschnitte des Eingangskonus in das erste Ende des Elementes zur Verbreitung längs des Elementes.

18. Analysesystem nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner eine Computereinrichtung enthält, die mit der Einrichtung zum Erfassen gekuppelt ist, um auf der Basis der Eingangssignale den vom ersten Ende des Elementes emittierten Anteil der Ausgangsfluoreszenz, der auf die Erregung des Elementes durch Verbreitung der eingangsseitigen Erregerstrahlung zurückzuführen ist, von dem Anteil der Ausgangsfluoreszenz zu trennen, der auf die Erreger durch die schwindende Welle zurückzuführen ist.

19. Analysesystem nach Anspruch 17, ferner gekennzeichnet durch Mittel zum Richten der Ausgangsfluoreszenz im wesentlichen als Ausgangskonus der Ausgangsfluoreszenz auf den Detektor; Mittel zum Trennen des Ausgangskonus der Ausgangsfluoreszenz in zwei konische kolineare Abschnitte und Mittel zum gegenseitigen Vergleich der konischen Abschnitte der Fluoreszenz miteinander.

20. Analysesystem nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Erfassen bestehen aus:

einer Spiegeleinrichtung zum Reflektieren einer der beiden Konusabschnitte der Fluoreszenz längs einer Achse, die sich quer zur Rotationsachse des Fluoreszenzkonus erstreckt; eine erste Detektoreinrichtung zum Erfassen einer der Abschnitte des Fluoreszenzkonus und zum Erzeugen eines ersten Ausgangssignals, das als Funktion der Intensität dadurch erfaßten Fluoreszenz variiert; und

eine zweite Detektoreinrichtung zum Erfassen des anderen Abschnitts des Fluoreszenzkonus und zum Erzeugen eines zweiten Ausgangssignals, das als Funktion der Intensität der dadurch erfaßten Fluoreszenz variiert.

21. Analysesystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die vom ersten Ende des Elementes erzeugte Ausgangsfluoreszenz sich längs einer ersten Achse erstreckt und daß die Einrichtung zum Erfassen besteht aus:

optischen Mitteln zum Abbilden der emittierten Ausgangsfluoreszenz, die an einer Aperturebene in der Nähe des ersten Endes des Elementes erscheint, auf eine Fokalebene; und eine Detektoreinrichtung mit ersten und zweiten empfindlichen Bereichen, die sich an der Fokalebene befinden, wobei der erste empfindliche Bereich so angeordnet ist, daß er einen Abschnitt der emittierten Ausgangsfluoreszenz erfaßt, wenn der Wert der numerischen Apertur verhältnismäßig hoch ist, und wobei der zweite empfindliche Bereich so positioniert ist, daß er einen Abschnitt der emittierten Ausgangsfluoreszenz erfaßt, wenn der Wert der numerischen Apertur an der Oberfläche des Elementes verhältnismäßig gering ist.

22. Analysesystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Ende des optischen Elementes eine ebene Eingangsseite aufweist und aus synthetischem Polymer besteht.

23. Analysesystem nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Element einen ersten Bestandteil eines Immunprobenkomplexes aufweist, der mit einem aktiven Oberflächenbereich des Elementes verbunden ist.