DE69112207T2

DE69112207T2 - "walk-through"-mutagenese.

Info

Publication number: DE69112207T2
Application number: DE69112207T
Authority: DE
Inventors: Roberto Chestnut Hill Mass. Crea
Original assignee: Individual
Current assignee: Bioren LLC
Priority date: 1990-04-05
Filing date: 1991-04-05
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2011-04-06
Also published as: US5798208A; JP4251406B2; EP0527809B1; AU653152B2; DE69112207D1; AU7741891A; ES2078518T3; WO1991015581A1; US5830650A; CA2079802A1; US6649340B1; EP0527809A1; ATE126535T1; CA2079802C; JP2003135084A; JPH05506580A; JP4275922B2

Description

Grundlagen der Erfindung

Die Mutagenese besitzt eine große Bedeutung für die Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion. Mutationen können in der Nucleotidsequenz eines geklonten Gens, das ein interessierendes Protein codiert, erzeugt werden, und das modifizierte Gen kann zur Herstellung von Mutanten des Proteins exprimiert werden. Durch Vergleich der Eigenschaften eines Wildtyp-Proteins mit der gebildeten Mutante ist eine Identifizierung von einzelnen Aminosäuren oder Aminosäurendomänen möglich, die essentiell für die strukturelle Integrität und/oder biochemische Funktion des Proteins sind, wie beispielsweise seine Bindungsaktivität und/oder katalytische Aktivität.
Der Mutagenese sind jedoch auch Grenzen gesetzt. Unter anderem ist wegen der großen Anzahl herstellbarer Mutanten praktisch unmöglich, daraus die Mutanten zu selektieren, die informativ sind oder eine gewünschte Eigenschaft besitzen. Zum Beispiel gibt es kein zuverlässiges Vorhersageverfahren, ob die Substitution, Deletion oder Insertion einer bestimmten Aminosäure in einem Protein einen lokalen oder globalen Effekt auf das Protein haben wird, und folglich, ob man voraussichtlich eine zweckdienliche Information oder Funktion erhalten wird.
TEXT FEHLT Untersuchung kleiner Stellen, die bekanntermaßen oder vermutlich an bestimmten Proteinfunktionen beteiligt sind, sehr zweckdienlich. In diesem Verfahren werden Nucleotid-Substitutionen (Punktmutationen) an definierten Orten in einer DNS-Sequenz gemacht, um eine gewünschte Substitution einer Aminosäure durch eine andere in der codierten Aminosäuresequenz zu bewerkstelligen. Das Verfahren ist Oligonucleotid vermittelt. Ein synthetisches Oligonucleotid wird konstruiert, das komplementär zu der diesen Proteinbereich codierenden DNS ist, wo die Mutation hergestellt werden soll, aber das Oligonucleotid enthält eine ungepaarte Base(n) an der/den gewünschten Position(en) der Basen-Substitution(en). Das veränderte Oligonucleotid wird verwendet, um die Synthese eines neuen DNS-Strangs zu starten, der die Änderung(en) einbaut und folglich zur Synthese des mutierten Gens führt. Siehe Zoller, M.J. und Smith, M., Meth. Enzymol. 100, 468 (1983).
Es sind Variationen der ortsgerichteten Mutagenese entwickelt worden, um Teile des Verfahrens zu optimieren. Hauptsächlich basieren sie auf der Orginalmethode von Hutchinson, C.A. et al., J. Biol. Chem. 253:6551 (1978) und Razin, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4268 (1978). Für eine eingehende Beschreibung der ortsspezifischen Mutagenese siehe Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, New York, Kapitel 15.
Ein Mutageneseverfahren, das zur Herstellung einer großen Anzahl an Mutationen entwickelt wurde, ist die "Sättigungs"-Mutagenese Dieses Verfahren ist ebenfalls Oligonucleotid vermittelt. In diesem Verfahren werden alle möglichen Punktmutationen (Nucleotid-Substitutionen) an einer oder mehreren Positionen innerhalb einer DNS hergestellt, die einen gegebenen Bereich eines Proteins codiert. Diese Mutationen werden durch Synthese einer einzigen Oligonucleotidmischung hergestellt, die anstelle des den Bereich codierenden natürlichen DNS-Abschnitts inseriert wird. Bei jedem Schritt der Synthese werden drei Nicht-Wildtyp-Nucleotide zusammen mit dem Wildtyp- Nucleotid in die Oligonukleotide eingebaut. Die eingebauten Nicht-Wildtyp-Nucleotide werden mit einem zuvor bestimmten Anteil eingebaut, so daß alle möglichen Sequenzvariationen mit der erwarteten Häufigkeit hergestellt werden. Auf diese Weise werden alle möglichen Nucleotid- Substitutionen innerhalb eines definierten Bereichs eines Gens hergestellt, was zur Bildung vieler mutierter Proteine führt, in denen die Aminosäuren eines definierten Bereichs zufällig variieren (Oliphant, A.R. et al., Meth. Enzymol. 155:568 (1987)).
Verfahren der zufälligen Mutagenese, wie beispielweise die Sättigungs-Mutagenese werden entwickelt, um die nicht mögliche Voraussage, wo Mutationen gemacht werden sollen, um zweckdienliche Informationen oder funktionelle Mutantenen zu gewinnen, kompensiert wird. Prinzipiell basieren die Verfahren darauf, daß durch Bildung aller oder einer großen Anzahl der möglichen Varianten von relevanten Proteindomänen, die korrekte Anordnung der Aminosäuren ebenso wahrscheinlich wie eine der zufällig gebildeten Mutanten hergestellt wird. Jedoch kann für völlig zufällige Kombinationen der Mutationen die Anzahl der gebildeten Mutanten die Kapazität der Auswahl wesentlich übersteigen. In der Praxis muß die Anzahl der zufällig gebildeten Mutationen groß genug sein, um die gewünschte Mutation wahrscheinlich zu erhalten, aber klein genug, damit die Kapazität des Selektionssystems nicht überschritten wird. Dies ist anbetracht der Größe und Komplexität der meisten Proteine nicht immer möglich.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Mutageneseverfahren zur Bildung neuer oder verbesserter Proteine (oder Polypeptide) und Proteinmutanten-Bibliotheken und mit dem Verfahren hergestellte spezifische Proteinmutanten. Das zur Mutagenese ausgewählte Protein, Peptid oder Polypeptid kann ein natürliches, synthetisches oder konstruiertes Protein, Peptid oder Polypeptid oder eine Variante (z. B. eine Mutante) sein. In einer Anwendung umfaßt das Verfahren das Einführen einer zuvor bestimmten Aminosäure in alle und jeder Position eines zuvor bestimmten Bereichs (oder mehreren verschiedenen Bereichen) der Aminosäuresequenz eines Proteins. Eine Protein- Bibliothtek wird hergestellt, die Proteinmutanten mit der zuvor bestimmten Aminosäure in einer oder mehreren Positionen in dem Bereich und insgesamt in allen Position in dem Bereich besitzt. Das Verfahren kann als "Walk- through"-Mutagenese bezeichnet werden, weil im Ergebnis eine einzige, zuvor bestimmte Aminosäure Position für Position über einen definierten Bereich eines Proteins substituiert wird. Dies erlaubt eine systematische Bewertung der Bedeutung einer bestimmten Aminosäure für die Struktur oder Funktion eines Proteins.
Die Bibliothek der mutierten Proteine kann durch Synthese einer einzigen Oligonucleotidmischung gebildet werden, die alle entwickelten Variationen der Aminosäuresequenz für den Bereich codiert, der die zuvor bestimmte Aminosäure enthält. Synthetisiert wird diese Oligonucleotidmischung durch Einbau sowohl der Nucleotide der zu mutagenisiereden Sequenz (zum Beispiel der Wildtyp-Sequenz) als auch des Nucleotids, das für das Codon der zuvor bestimmten Aminosäure benötigt wird, bei jedem Kondensationsschritt der Synthese. Wo ein Nucleotid der zu mutagenisierenden Sequenz identisch mit einem Nucleotid für die zuvor bestimmte Aminosäure ist, wird kein zusätzliches Nucleotid eingefügt. In der resultierenden Mischung bilden Oligonucleotide, die mindestens ein Codon für die zuvor bestimmte Aminosäure enthalten, ca. 12,5% bis 100% der Komponenten. Zusätzlich codiert die Oligonucleotidmischung eine statistische (in einigen Fällen Gaußsche) Verteilung der Aminosäuresequenzen, die die zuvor bestimmte Aminosäure in keiner Position bishin zu allen Positionen in der Sequenz enthält.
Die Oligonucleotidmischung wird in ein Gen inseriert, das das zu mutagenisierende Protein (beispielsweise ein Wildtyp-Protein) codiert anstatt der den Bereich codierenden DNS. Die rekombinanten mutierten Gene werden in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert, um eine Expressionsbibliothek mutierter Proteine bereitzustellen, die auf Proteine mit den gewünschten Eigenschaften durchmustert werden kann. Die Proteinmutanten- Bibliothek, die durch dieses Oligonucleotid vermittelte Verfahren hergestellt wird, enthält einen größeren Anteil an informativen Mutanten (die die zuvor bestimmte Aminosäure in dem definierten Bereich enthalten) bezogen auf nicht-informative Mutanten als mit Sättigungsmutagenese- Verfahren hergestellte Bibliotheken. Zum Beispiel bestehen bevozugte Bibliotheken aus Mutanten, die die zuvor festgelegte Aminosäure im wesentlichen in allen und jeder Position in dem Bereich mit einer Häufigkeit von ca. 12,5% bis 100% enthalten.
Dieses Mutageneseverfahren kann zur Herstellung von Proteinmutanten-Bibliotheken eingesetzt werden, die eine praktikable Größe für eine Durchmusterung besitzen. Das Verfahren kann verwendet werden, um die Bedeutung bestimmter Aminosäuren für Proteinstruktur und -funktion zu untersuchen und um neue oder verbesserte Proteine und Polypeptide, wie beispielsweise Enzyme, Antikörper, bindende Fragmente oder Analoga davon, Single-Chain- Antikörper und katalytische Antikörper zu entwickeln.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung einer "Walk-through"-Mutagenese der Fv Region vom Immunoglobulin MCPC 603, durchgeführt für den CDR1 (Asp) und CDR3 (Ser) der schweren (H) Ketten und CDR2 (His) der leichten Kette (L).
Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung einer "Walk-through"-Mutagenese eines aktiven Zentrums eines Enzyms; drei Aminosäurebereiche des aktiven Zentrums sind in allen und jeder Position mit Aminosäuren einer Serin- Protease katalytischen Triade substituiert.
Abbildung 3 illustriert die Konstruktion eines degenerierten Oligonucleotids für die "Walk-through"- Mutagenese des CDR1 (Abbildung 3a) und CDR3 (Abbildung 3b) der schweren Kette und CDR2 (Abbildung 3c) der leichten Kette von MCPC 603.
Abbildung 4 illustriert die Konstruktion eines Mutagenese-"Fensters", und zeigt die Sequenzen der degenerierten Oligonucleotide für die Mutation vom CDR3 der schweren Kette (Abbildung 4a) und CDR2 der leichten Kette von MCPC603 (Abbildung 4b).
Abbildung 5a und 5b zeigen die Konstruktion der Mutagenese-"Fenster" und zeigen die Sequenzen der degenerierten Oligonucleotide für zwei verschiedene "Walk- through"-Mutageneseverfahren mit His im CDR2 der schweren Kette von MCPC 603.
Abbildung 6 zeigt die Konstruktion und Sequenzen der degenerierten Oligonucleotide für die "Walk-through"- Mutagenese vom CDR2 der schweren Kette von MCPC 603.
Abbildung 7 zeigt ein Mutagenese-"Fenster" in der HIV Protease, das aus drei aufeinanderfolgenden Aminosäureresten im katalytischen Zentrum besteht. Die Konstruktion und die Sequenzen der degenerierten Oligonucleotide für drei Durchläufe der "Walk-through"-Mutagenese des Bereichs mit Asp, Ser und His wird gezeigt.
Abbildung 8 zeigt die Konstruktion und Sequenz der degenerierten Oligonucleotide für die "Walk-through"- Mutagenese von fünf CDRS von MCPC 603. Die degenerierten Oligonucleotide für die "Walk-through"-Mutagenese vom CDR1 (Abbildung 8a) und CDR3 (Abbildung 8b) der leichten Kette und vom CDR1 (Abbildung 8c), CDR2 (Abbildung 8d) und CDR3 (Abbildung 8e) der schweren Kette werden gezeigt.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Untersuchung der Proteine hat gezeigt, daß bestimmte Aminosäuren eine entscheidende Bedeutung für die Struktur und Funktion der Proteine besitzen. Zum Beispiel scheint nur eine diskrete Anzahl der Aminosäuren am katalytischen Ereignis des Enzyms teilzunehmen. Serin-Proteasen sind eine Proteinfamilie, die faktisch in allen Organismen vorkommen, die ein strukturell ähnliches katalytisches Zentrum entwickelt haben, das durch das gemeinsame Vorkommen von Serin, Histidin und Asparaginsäure gekennzeichnet ist. Diese Aminosäuren bilden eine katalytische Triade, die möglicherweise neben anderen Determinanten den Übergangszustand des Substrats stabilisiert. Die funktionelle Rolle dieser katalytischen Triade wurde durch Einzel- und Mehrfachsubstitutionen von Serin, Histidin und Asparaginsäure durch ortsspezifische Mutagenese der Serin-Proteasen bestätigt, und die Bedeutung der Wechselwirkung dieser Aminosäurereste untereinander während der Katalyse ist gesichert. Diese Aminosäuren sind ebenfalls beim enzymatischen Mechanismus bestimmter Lipasen beteiligt. Entsprechend ist eine große Anzahl anderer Enzymtypen durch die besondere Konformation ihrer katalytischen Zentren und der Anwesenheit bestimmter Aminosäurearten an dieser Stelle gekennzeichnet, die in erster Linie für das katalytische Ereignis verantwortlich sind. Für einen ausführlichen Überblick siehe Enzyme Structure and Mechanism&sub1; 1985, von A. Fersht, Freeman Ed., New York.
Obwohl es offensichtlich ist, daß bestimmte Aminosäuren entscheidend für den Katalysemechanismus sind, ist es schwierig, wenn gar unmöglich, vorherzusagen welche Position (oder Positionen) eine Aminosäure einehmen muß, um eine funktionelle Stelle, wie beispielsweise ein katalytisches Zentrum, zu bilden.
Leider ist die komplexe räumliche Konfiguration von Aminosäureseitenketten in Proteinen und die Wechselbeziehung verschiedener Seitenketten in der katalytischen Tasche von Enzymen nicht ausreichend verstanden, um solche Vorhersagen zu erlauben. Wie oben ausgeführt, sind die selektive (ortsspezifische) Mutagenese und Sättigungsmutagenese nur bedingt zur Untersuchung der Proteinstruktur und -funktion angesichts der riesigen Anzahl möglicher Variationen in komplexen Proteinen verwendbar.
Das Verfahren dieser Erfindung liefert eine systematische und praktikable Möglichkeit zur Bewertung der Bedeutung einer bestimmten Aminosäure und ihrer Position innerhalb eines definierten Bereichs eines Proteins für die Struktur oder Funktion eines Proteins und zur Herstellung zweckdienlicher Proteine. Das Verfahren beginnt mit der Annahme, daß eine bestimmte, zuvor festgelegte Aminosäure für eine bestimmte Struktur oder Funktion von Bedeutung ist. Diese Annahme kann ausschließlich vermutet werden. Eher basiert die Annahme aber darauf, was über die Aminosäure aus Untersuchungen anderer Proteine bekannt ist. Es kann beispielsweise eine Aminosäure sein, die eine Rolle in der Katalyse, Bindung oder einer anderen Funktion spielt.
Mit der Auswahl der zuvor bestimmten Aminosäure wird eine Mutanten-Bibliothek des zu untersuchenden Proteins durch Einbau der zuvor bestimmten Aminosäure in alle und jeder Position des Proteinbereichs gebildet. Wie in Abbildung 1 und 2 schematisch dargestellt, wird die Aminosäure in allen (oder im wesentlichen allen) Positionen des Bereichs substituiert oder durchwandert diese Positionen.
Die Bibliothek der Proteinmutanten enthält einzelne Proteine, die die zuvor bestimmte Aminosäure in allen und jeder Position des Bereichs besitzen. Die Protein- Bibliothek wird einen höheren Anteil an Mutanten besitzen, die die zuvor bestimmte Aminosäure in dem Bereich (relativ zu Mutanten, die es nicht tun) enthalten, im Vergleich zu Bibliotheken, die durch vollständig zufällige Mutation, wie beispielsweise Sättigungsmutagenese, gebildet werden. Folglich kommen die gewünschten mutantentypen in der Bibliothek gehäuft vor. Dies ist wichtig, weil dadurch mehrere und größere Bereiche der Proteine mittels des "Walk-through"-Verfahrens mutagenisiert werden können und dennoch Bibliotheken mit einer Größe erhalten werden, die durchmustert werden können. Wenn die Ausgangsannahme korrekt ist und die Aminosäure wichtig für die Struktur oder Funktion des Proteins ist, dann wird ferner die Bibliothek einen höheren Anteil an informativen Mutanten besitzen als eine durch Zufallsmutation gebildete Bibliothek.
In einer weiteren Anwendung wird eine zuvor bestimmte Aminosäure in jeder bestimmten ausgewählten Position innerhalb eines zuvor definierten Bereichs oder Bereichen eingeführt. Bestimmte ausgewählte Positionen können bekannt oder aufgrund struktureller Bedingungen vermutlich vielversprechend sein. Solche Überlegungen, die auf Strukturinformation oder Modellen des mutagenisierten Moleküls und/oder der gewünschten Struktur beruhen, können verwendet werden, um ein mehrere Positionen innerhalb eines Bereichs oder Bereiche zur Mutagenese auszuwählen. Folglich müssen die mutagenisierten Aminosäuren innerhalb eines Bereichs nicht benachbart liegen. Wandert eine Aminosäure durch bestimmte ausgewählte Positionen in einem Bereich, kann die Anzahl der hergestellten Varianten minimiert werden. Die Größe einer Bibliothek wird in Abhängigkeit von der Länge und Anzahl der Bereiche und Aminosäuren variieren, die innerhalb eines Bereichs mutagenisiert werden. Vorzugsweise wird die bibliothek so geplant, daß sie weniger als 10¹&sup0; Mutanten und noch besser weniger als 10&sup9; Mutanten enthält.
In einer bevorzugten Anwendung wird die Bibliothek der mutierten Proteine durch Synthese einer Mischung von Oligonucleotiden (ein degeneriertes Oligonucleotid) hergestellt, die ausgewählte Permutationen der Aminosäuresequenzen für den definierten Bereich des Proteins codieren. Einfacherweise kann die Oligonucleotidmischung in einer einzigen Synthese hergestellt werden. Dies wird durch Einbau sowohl eines Nucleotids, das für die Synthese des Wildtyp-Proteins (oder eines anderen zu mutagenisierenden Proteins) benötigt wird, als auch eines einzelnen geeigneten Nucleotids, das für ein Codon der zuvor bestimmten Aminosäure benötigt wird, an jeder Position innerhalb des Oligonukleotids ausgeführt (Darin unterscheidet sie sich von den Oligonucleotiden, die für die Sättigungsmutagenese hergestellt werden, denn für jede mutagenisierte DNS-Position wird nur ein einziges zusätzliches Nucleotid im Gegensatz zu den dreien bei "Sättigung" zugefügt.) Die beiden Nucleotide werden typischerweise, aber nicht notwendigerweise, in annähernd gleichen Konzentrationen für die Reaktion eingesetzt, so daß die Einbauwahrscheinlichkeit eines von beiden Nucleotiden in die Sequenz an der Position gleich ist. Wenn das Nucleotid der Wildtyp-Sequenz und das Nucleotid für das Codon der zuvor festgelegten Aminosäure identisch ist, wird kein zusätzliches Nukleotid eingebaut.
In Abhängigkeit von der Anzahl der Nucleotide, die mutiert werden, um ein Codon für eine zuvor bestimmte Aminosäure zu liefern, wird die Oligonucleotidmischung eine begrenzte Anzahl neuer Codons bilden. Falls beispielsweise nur ein Nucleotid mutiert wird, wird die resultierende DNS-Mischung entweder das Orginalcodon oder das Codon der zuvor bestimmten Aminosäure codieren. In diesem Fall werden 50% aller Oligonucleotide in der resultierenden Mischung das Codon für die zuvor festgelegte Aminosäure an dieser Position enthalten. Falls zwei Nucleotide in beliebiger Kombination mutiert werden (das erste und zweite, das erste und dritte oder das zweite und dritte) sind vier verschiedene Codons möglich und mindestens eines wird die zuvor festgelegte Aminosäure mit einer Häufigkeit von 25% codieren. Wenn alle drei Basen mutiert werden, dann wird die Mischung acht verschiedene Codons liefern und eines davon wird die zuvor bestimmte Aminosäure codieren. Folglich wird das Codon in der Position mit einer Mindesthäufigkeit von 12,5% vorkommen. Allerdings ist es wahrscheinlich, daß zusätzlich eines der acht Codons die gleiche Aminosäure und/oder ein Stopcodon codiert, und folglich die Häufigkeit der zuvor festgelegten Aminosäure größer als 12,5% sein wird.
Mit diesem Verfahren wird eine Oligonucleotidmischung mit einem hohen Anteil an Sequenzen hergestellt, die ein Codon für die zuvor festgelegte Aminosäure enthalten. Die Synthesebedingungen können noch enger gefaßt werden, um diesen Anteil (durch Verminderung der Anzahl der Nucleotide in der Mischung, die nicht mindestens ein Codon für die zuvor festgelegte Aminosäure enthalten) zu steigern. Zum Beispiel wenn ein voll ständiges Codon (drei Nucleotide) substituiert werden muß, um das Codon für die zuvor festgelegte Aminosäure zu erhalten, könnte nur das substituierte Nucleotid eingeführt werden (so daß das Codon für die zuvor festgelegte Aminosäure mit einer 100% Häufigkeit in der Position vorkommt). Das Verhältnis von Wildtyp-Nucleotid und das Nucleotid, das die vorgewählte Aminosäure codiert, könnte sich an beliebigen oder allen Positionen einstellen, um das Verhältnis der codierten Aminosäuren zu beeinflussen.
In einer mit diesem Verfahren hergestellten Protein-Bibliothek liegt der Anteil an Mutanten, die mindestens eine der zuvor bestimmten Aminosäure in einem definierten Bereich besitzen, im Bereich von ca. 12,5% bis 100% aller Mutanten der Bibliothek. (Es wird angenommen, daß annähernd gleiche Anteile an Wildtyp-Basen und zuvor ausgewählten Aminosäure-Basen bei der Synthese verwendet werden). Typischerweise liegt der Anteil zwischen 25% und 50%.
Die Proteinmutanten-Bibliothek enthält eine Anzahl kleiner gleich 2n, worin n die Anzahl der mutierten Nucleotide innerhalb der DNS ist, die den Proteinbereich codiert. Weil es nur eine begrenzte Anzahl an Änderungen für jedes Codon geben kann (eine, zwei oder drei) wird die Anzahl an Proteinmutanten von 2m bis 8m reichen, wo m die Anzahl an Aminosäuren ist, die innerhalb dieses Bereichs mutiert werden. Dies stellt eine wesentliche Reduktion verglichen mit den 19m Mutanten dar, die durch eine Sättigungs-Mutagenese gebildet werden. Zum Beispiel bei einem Proteinbereich von sieben Aminosäuren, wird die Mutantenanzahl, die durch Walk-through-Mutagenese (von einer Aminosäure) gebildet wird, nur 0,000014% bis 0,24% der Mutantenanzahl ausmachen, die durch Sättigungs- Mutagenese dieses Bereichs gebildet werden, was eine erhebliche Reduktion darstellt.
Ein zusätzliches vorteilhaftes Merkmal der mit diesem Verfahren gebildeten Bibliothek ist, daß die Proteine, die die zuvor festgelegte Aminosäure enthalten, mit einer statistischen Verteilung hinsichtlich der Anzahl der Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz übereinstimmen. Demgemäß umfassen die Sequenzen solche, in denen die zuvor festgelegte Aminosäure an keiner Position in dem Bereich erscheint, bis zu solchen, in denen die zuvor festgelegte Aminosäure in jeder Position in dem Bereich erscheint. Um zusätzlich ein Mittel zur systematischen Insertion einer Aminosäure in einem Bereich eines Proteins bereitzustellen, ermöglicht folglich das Verfahren in einem Bereich eines Proteins eine bestimmte Aminosäure anzuhäufen. Diese Anhäufung könnte zu einer Aktivitätsteigerung, die auf die Aminosäure zurückzuführen ist, oder zu einer gänzlich neuen Aktivität führen.
Die Oligonucleotidmischung zur Herstellung der Bibliothek kann ohne weiteres mit bekannten DNS- Syntheseverfahren synthetisiert werden. Das bevorzugte Verfahren umfaßt die Verwendung einer festen Phasen bei der beta-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Methode. Siehe U.S. Patent Nr. 4.725.677. Vorteilhafterweise kann ein Gerät für die automatisierte DNS-Synthese eingesetzt werden, das zehn Reagenzgefäße mit Nucleotidbausteinen (Reagenzien zur DNS Synthese) enthält, wobei vier Gefäße je einen Baustein (A, T, C und G) und sechs Gefäße eine Mischung zweier Bausteine (A+T, A+C, A+G, T+C, T+G und C+G) enthalten.
Die Wildtyp-Nucleotidsequenz kann während der Synthese reguliert werden, um die Oligonucleotidmischung zu vereinfachen und die Anzahl der codierten Aminosäuren zu minimieren. Falls beispielweise Threonin die Wildtyp- Aminosäure ist (ACT) und die vorselektierte Aminosäure Arginin (AGA oder AGG) ist, sind zwei Basenänderungen für die Arginin-Codierung erforderlich, und drei Aminosäuren werden produziert (z. B. AGA, Arg; AGT, Ser; ACA, ACT, Thr). Bei Änderung der Wildtyp-Nucleotidsequenz zu ACA oder ACG ist zur Codierung von Arginin nur ein einziger Basenaustausch erforderlich. Falls ACG anstatt ACT zur Codierung von Wildtyp-Threonin gewählt wird, muß folglich nur die zentrale Base zu G abgeändert werden, um Arginin zu erhalten, und nur Arginin und Threonin würden an dieser Stelle produziert werden. Ahnliche Einstellungen an beliebigen Positionen des Wildtyp-Codons können die Anzahl der gebildeten Varianten reduzieren, was aber vom speziellen Codon und der Identität der vorgewählten Aminosäure abhängt.
Die Oligonucleotidmischung wird in ein kloniertes Gen des zu mutagenisierenden Proteins eingeführt anstatt der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz des Bereichs codiert, um rekombinante Genmutanten herzustellen, die das mutierte Proteine codieren. Um dies zu vereinfachen, kann die Oligonucleotidmischung so hergestellt werden, daß sie flankierende Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthält. Siehe Crea, R., U.S. Patent, Nr. 4.888.286. Die Erkennungsstellen sind so konstruiert, daß sie mit den Erkennungsstelle übereinstimmen, die entweder natürlichweise vorhanden sind oder in das Gen, das unmittelbar neben der die Region codierenden DNS liegt, eingeführt werden. Nach Herstellung der doppelsträngigen Form werden die Oligonucleotide mittels Standardtechniken in das Gen ligiert. Mit Hilfe eines geeigneten Vektors werden die Gene in eine für die Expression des mutierten Proteins geeignete Wirtszelle eingeführt. Siehe z. B. Huse, W.D. et al., Science 246:1275 (1989); Viera, J. et al., Meth. Enzymol. 153:3 (1987).
Die degenerierten Oligonucleotide können tatsächlich mit einem beliebigen, geeigneten Verfahren unter Verwendung dem Fachmann bekannter Techniken in das Gen eingeführt werden. In Fällen, in denen die Aminosäuresequenz des zu mutagenisierenden Proteins bekannt ist oder wo die DNS-Sequenz bekannt ist, ist die Gensynthese ein anwendbares Verfahren (siehe z. B. Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem. Cell. Biol. 64:548-555 (1986); Jones et al., Nature 321:522 (1986)). Beispielsweise können partiell überlappende Oligonucleotide, typischerweise etwa 20-60 Nucleotide lang, konstruiert werden. Die internen Oligonucleotide (B durch G und I durch O) werden mit Hilfe der T4 Polynucleotid-Kinase phosphoryliert, um eine 5' Phosphatgruppe zu erhalten. Jedes der Oligonucleotide kann an seinem komplementären Partner hybridisiert werden, um ein doppelsträngiges DNS-Molekül mit einer einzelsträngigen Verlängerung zu ergeben, die für eine weitere Hybridisierung verwendbar ist. Die hybridisierten Paare können dann miteinander gemischt und ligiert werden, um ein voll ständiges doppelsträngiges Molekül zu bilden:
Geeignete Restriktionsstellen können nahe den Enden des synthetischen Gens zur Klonierung in einen geeigneten Vektor konstruiert werden. Die vollständigen Moleküle können mit diesen Restriktionsenzymen geschnitten, im Gel aufgetrennt, elektroeluiert und in einen geeigneten Vektor ligiert werden. Geeignete Restriktionsstellen können auch in die Sequenz des synthetischen Gens eingebaut werden, um die Einführung mutagener Kassetten zu erleichtern.
Als Alternative zur Synthese der Oligonucleotide, die das vollständige doppelsträngige Gen darstellen, können Oligonucleotide, die sich partiell an ihren 3' Enden überlappen (z. B. mit komplementären 3' Enden) zu einer Struktur mit Lücken zusammengefügt werden und dann mit dem Klenow Fragment der DNS-Polymerase und Deoxynucleotidtriphosphaten aufgefüllt werden, um ein doppelsträngiges Gen herzustellen. Typischerweise sind die überlappenden Oligonucleotide 40-90 Nucleotide lang. Die verlängerten Oligonucleotide werden dann mit Hilfe der T4 Ligase ligiert. Geeignete Restriktionsstellen können dann an den Enden und/oder intern für Klonierungszwecke eingeführt werden. Im Anschluß an den Restriktionsverdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym oder -enzymen wird das Genfragment im Gel aufgetrennt und in einen passenden Vektor ligiert. Alternativ kann das Genfragment mit seinen stumpfen Enden in einen geeigneten Vektor ligiert werden.
Falls geeignete Restriktionsstellen (natürliche oder konstruierte) nach der Genzusammenfügung verfügbar sind, können in diesem Verfahren die degenerierten Oligonucleotide im Anschluß an die Klonierung der Kassette in einen geeigneten Vektor eingeführt werden. Alternativ können die degenerierten Oligonucleotide bei der Genzusammenfügung eingebaut werden. Wenn beispielsweise beide Stränge des Gens vollständig chemisch synthetisiert sind, können überlappende und komplementäre degenerierte Oligonucleotide hergestellt werden. Komplementäre Basenpaare werden miteinander hybridisieren. Ein Verfahrensbeispiel ist in Beispiel 1 erläutert.
Wenn partiell überlappende Oligos bei der Genzusammenfügung verwendet werden, können eine Reihe degenerierter Nucleotide anstelle eines der Oligos direkt eingebaut werden. Der geeignete Komplementärstrang wird während der Verlängerungsreaktion, beispielsweise von einem partiell komplementären Oligo des anderen Strangs ausgehend, durch eine enzymatische Verlängerung mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase synthetisiert. Der Einbau der degenerierten Oligonucleotide zum Zeitpunkt der Synthese vereinfacht auch das Klonieren, wenn mehr als eine Domäne mutagenisiert wird.
In einem weiteren Versuch ist das interessierende Gen auf einem einzelsträngigen Plasmid vorhanden. Das Gen kann beispielsweise in einen M13 Phagenvektor oder in einen Vektor mit einem Replikationsursprung eines filamentösen Phagen kloniert werden, der eine Vermehrung einzelsträngiger Moleküle unter Verwendung eines Helferphagens erlaubt. Das einzelsträngige Template kann mit einer Reihe degenerierter Sonden hybridisiert werden. Die Sonden können verlängert und ligiert werden, folglich wird jeder verschiedene Strang in eine Population Moleküle eingebaut, die in einen geeigneten Wirt eingeführt werden können (Sayers, J.R. et al., Nucleic Acids Res. 16: 791-802 (1988)). Dieser Versuch kann Mehrfach- Klonierungsschritte umgehen, wo multiple Domänen für die Mutagenese selektiert werden.
Die Polymerasekettenreaktionsmethodik (PCR) kann auch zum Einführen degenerierter Oligonucleotide in das Gen eingesetzt werden. Beispielsweise können die degenerierten Oligonucleotide selbst als Primer für die Verlängerung verwendet werden.
In dieser Anwendung sind A und B Populationen degenerierter Oligonucleotide, die die mutagenen Kassetten oder "Fenster" codieren, und die Fenster sind zueinander komplementär (der Zickzack-Teil der Oligos stellt den degenerierten Teil dar). A und B enthalten zur Amplifikation auch Wildtyp-Sequenzen, die komplementär zum Template am 3' Ende sind, und folglich Primer für die Amplifikation sind und Fragmente zum Einbau in ein Fenster bilden können. C und D sind Oligonucleotide, die das gesamte Gen oder die gesamte interessierende Region auch mit eingebauten Fenstern, amplifizieren können (Steffan, N.H. et al., Gene 77: 51-59 (1989)). Die von A und B gestarteten Verlängerungsprodukte können über ihre komplementäre Fenster hybridisieren und liefern ein Template zur Herstellung vollständiger Moleküle mit Hilfe von C und D als Primer. Die Konstrukte C und D können für die Klonierung geeignete Stellen enthalten. Die amplifizierten Fragmente können dann kloniert werden.
Bibliotheken von Mutanten, die mit Hilfe einer oben erwähnten Technik oder anderen geeigneten Techniken gebildet wurden, können durchmustert werden, um Mutanten mit gewunschter Struktur oder Aktivität zu identifizieren. Die Durchmusterung kann mit beliebigen geeigneten Mitteln geschehen. Beispielsweise kann die katalytische Aktivität mit geeigneten Tests auf Substratumsetzung ermittelt werden, und die Bindungsaktivität kann mit Standardimmunoassays und/oder Affinitätschromatographie bewertet werden.
Das Verfahren dieser Erfindung kann zur Mutagenisierung einer beliebigen Region eines Proteins, einer Proteinuntereinheit oder eines Polypeptids verwendet werden. Die Beschreibung bezog sich bis jetzt hauptsächlich auf Proteine, aber dieses Verfahren kann selbstverständlich für Polypeptide und Proteine mit mehreren Untereinheiten angewendet werden. Die mit Hilfe des Verfahrens dieser Erfindung mutagenisierten Regionen können kontinuierlich oder diskontinuierlich sein und haben im allgemeinen eine Länge von etwa 3 bis 30 Aminosäuren, typischerweise 5 bis 20 Aminosäuren.
Die untersuchte Region ist normalerweise eine funktionelle Domäne des Proteins, beispielsweise eine Bindungsdomäne oder katalytische Domäne. Beispielsweise kann die Region eine hypervariable Region (Komplementaritätsbestimmender Abschnitt oder CDR) eines Immunoglobulins, das katalytische Zentrum eines Enzyms oder eine Bindungsdomäne sein.
Wie schon erwähnt, ist die für die "Walk Through"- Mutagenese gewählte Aminosäure normalerweise an der interessierenden Struktur oder Funktion bekanntermaßen oder vermutlich beteiligt. Die zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren unterscheiden sich nur hinsichtlich ihrer Seitenkette. Jede Seitenkette prägt die chemischen Eigenschaften, durch die die Aminosäuren sich unterscheiden. Für einen Überblick, siehe Principles of Protein Structure, 1988, von G.E. Schulz und R.M. Schirner, Springer-Verlag.
Aufgrund der chemischen Eigenschaften der Seitenketten nehmen scheinbar nur bestimmte natürliche Aminosäuren am katalytischen Ereignis vorzugsweise teil. Diese Aminosäuren gehören zu der Gruppe der polaren und neutralen Aminosäuren wie Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr und Cys, und der Gruppe der Ladung tragenden Aminosäuren, Asp, und Glu, Lys und Arg und besonders die Aminosäure His.
Typische polare und neutrale Seitenketten sind die von Cys, Ser, Thr, Asn, Gln und Tyr. Gly wird auch als ein Grenzfall dieser Gruppe betrachtet. Ser und Thr spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen. Thr hat eine zusätzliche Asymmetrie am beta-C-Atom, weshalb nur eines der Stereoisomere verwendet wird. Die Säureamide Gln und Asn können ebenfalls Wasserstoffbrücken-Bindungen bilden, die Amido-Gruppen dienen als Wasserstoff-Donor und die Carbonylgruppen als Akzeptor. Gln hat eine CH&sub2;-Gruppe mehr als Asn, was die polare Gruppe flexibler macht und die Wechselwirkung mit der Hauptkette mindert. Tyr hat eine sehr polare Hydroxylgruppe (phenolisches OH), die bei hohen pH-Werten dissozieren kann. Tyr verhält sich in etwa wie eine Ladung tragende Seitenkette; seine Wasserstoffbrücken-Bindungen sind ziemlich stark.
Neutrale polare Säuren befinden sich an der Oberfläche als auch im Innern von Proteinmolekülen. Als innere Reste bilden sie normalerweise Wasserstoffbrücken- Bindungen untereinander oder mit dem Polypeptid-Rückgrat. Cys kann Disulfidbrücken bilden.
Histidin (His) hat eine heterocyclische aromatische Seitenkette mit einem pK-Wert von 6,0. Im physiologischen pH Bereich kann sein Imidazolring entweder ohne Ladung oder nach Aufnahme eines Protons aus der Lösung eine Ladung tragen. Da diese beiden Zustände ohne weiteres verfügbar sind, eignet sich His sehr für die Katalyse chemischer Reaktionen. Es wird in den meisten aktiven Zentren der Enzyme gefunden.
Asp und Glu sind bei physiologischen pH-Werten negativ geladen. Auf Grund ihrer kurzen Seitenkette ist die Carboxyl-Gruppe von Asp bezüglich der Hauptkette fast unbeweglich. Dies kann der Grund sein, warum die Carboxylgruppe in vielen katalytischen Zentren von Asp und nicht Glu zur Verfügung gestellt wird. Geladene Säuren werden im allgemeinen an der Oberfläche eines Proteins gefunden.
Zudem befinden sich Lys und Arg an der Oberfläche. Sie besitzen lange und flexible Seitenketten. Da diese in der umgebenden Lösung frei beweglich sind, steigern sie die Löslichkeit des Proteinteilchens. In mehreren Fällen sind Lys und Arg an der Bildung interner Salzbrücken beteiligt oder unterstützen die Katalyse. Aufgrund ihrer exponierten Lage auf der Oberfläche des Proteins ist Lys ein Rest, der häufiger durch Enzyme angegriffen wird, die entweder die Seitenkette modifizieren oder die Peptidkette am Carbonylende des Lys Rests schneiden.
Zur Einführung katalytisch wichtiger Aminosäuren in einen Bereich, betrifft die Erfindung vorzugsweise eine Mutagenese, in der die zuvor festgelegte Aminosäure ein Vertreter aus der folgenden Aminosäuregruppe ist: Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys und Arg. Zur Änderung der Bindung oder Herstellung neuer Bindungsaffinitäten kann allerdings eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren ausgewählt werden.
Es ist wichtig, daß mehrere verschiedene Bereiche oder Domänen eines Proteins gleichzeitig mutagenisiert werden können. Die gleiche oder eine andere Aminosäure kann jeden Bereich "durchwandern". Dies ermöglicht die Beurteilung von Aminosäure-Substitutionen in konformativ wirkenden Bereichen, wie beispielweise Bereiche, die nach Faltung des Proteins assoziert werden, um eine funktionelle Stelle, wie das katalytische Zentrum eines Enzyms oder die Bindungsstelle eines Antikörpers, zu bilden. Dieses Verfahren liefert eine Möglichkeit zur Herstellung modifizierter oder völlig neuer katalytischen Zentren. Wie in Abbildung 1 dargestellt, können die sechs hypervariablen Bereiche eines Immunoglobulins, die die einzigartige Gestalt einer Antigen-Bindungsstelle (Fv-Bereich) bilden, gleichzeitig oder seperat innerhalb der VH oder VL Ketten mutagenisiert werden, um die dreidimensionale Wechselbeziehung der ausgewählten Aminosäuren an dieser Stelle zu untersuchen.
Das Verfahren dieser Erfindung eröffnet neue Möglichkeiten der Entwicklung vieler verschiedener Proteintypen. Das Verfahren kann zur Verbesserung einer bestehenden Struktur oder Funktion eines Proteins eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Einführung von zusätzlichen "katalytisch wichtigen" Aminosäuren in eine katalytische Domäne eines Enzyms zu einer verstärkten katalytischen Aktivität für das gleiche Substrat führen. Alternativ können gänzlich neue Strukturen, Spezifitäten oder Aktivitäten in ein Protein eingeführt werden. Eine de novo Synthese einer enzymatischen Aktivität kann ebenso erreicht werden. Die neue Struktur kann auf dem "Gerüst" eines bestehenden Proteins durch Mutation ausschließlich relevanter Bereiche mit Hilfe des Verfahrens dieser Erfindung gebildet werden.
Das Verfahren dieser Erfindung ist besonders zweckdienlich für die Modifikation von Antikörper-Molekülen. Als Antikörper-Moleküle oder Antikörper, werden hier Antikörper oder Teile davon, wie vollständige Antikörper, Fv Moleküle oder andere Antikörperfragmente, individuelle Ketten oder Fragmente davon (z. B. eine einzelne Fv- Kette), Single-Chain Antikörper und schimäre Antikörper bezeichnet. Änderungen können in die variable Region und/oder Rahmen (konstante) Region eines Antikörpers eingeführt werden. Die Modifikation der variablen Region kann Antikörper mit besseren Antigenbindungseigenschaften und katalytischen Eigenschaften bilden. Modifikation der Rahmenregion kann zur Verbesserung der physikalisch-chemischen Eigenschaften führen, wie Löslichkeit oder Stabilität, was beispielsweise für die kommerzielle Produktion zweckdienlich ist. Typischerweise zielt die Mutagenese auf die Fv Region des Immunoglobulin Moleküls, die für die Antigenbindungsaktivität verantwortliche Struktur, die aus den variablen Regionen zweier Ketten, einer schweren Kette (VH) und einer leichten Kette (VL) aufgebaut ist.
Das Verfahren dieser Erfindung ist für die Entwicklung katalytischer Proteine, insbesondere katalytischer Antikörper geeignet. Heute können katalytische Antikörper durch eine Modifikation der Standardtechniken der Fusionierung somatischer Zellen hergestellt werden. Bei dieser Technik wird ein Tier mit einem Antigen immunisiert, das dem Übergangszustand des gewünschten Substrats ähnelt, um eine Produktion eines Antikörpers zu induzieren, der den Übergangszustand bindet und die Reaktion katalysiert. Antikörper produzierende Zellen werden vom Tier gewonnen und mit immortalisierten Zellen zur Produktion von Hybridzellen fusioniert. Diese Zellen werden dann auf Sekretion eines die Reaktion katalysierenden Antikörpers durchmustert. Diese Technik hängt von der Verfügbarkeit von Analoga des Übergangszustands eines Substrats ab. Diese Technik ist aufgrund der in den meisten Fällen schwierigen Identifizierung und Synthese derartiger Analoga begrenzt.
Das Verfahren dieser Erfindung ermöglicht eine unterschiedliche Anwendung bei der ein Analogon des Übergangszustands nicht benötigt wird. Mit Hilfe des Verfahrens dieser Erfindung kann ein Antikörper durch die Einführung geeigneter Aminosäuren in die Bindungsstelle eines Immunoglobulins (Fv Region) katalytische Eigenschaften erhalten. Die Antigenbindungsstelle (Fv) Region besteht aus sechs hypervariablen (CDR) Schleifen, wobei drei von der schweren Kette (H) des Immunoglobulins und drei von der leichten Kette (L) stammen, die die beta- Stränge innerhalb jeder Untereinheit verbinden. Die Aminosäurereste der CDR Schleifen tragen nahezu ganz zu den Bindungsmerkmalen eines jeden spezifischen monoklonalen Antikörpers bei. Zum Beispiel den Serin-Proteasen nachgebildete katalytische Triaden können in den hypervariablen Abschnitten der Fv Region eines Antikörpers erzeugt werden und auf proteolytische Aktivität durchmustert werden.
Das Verfahren dieser Erfindung kann für die Herstellung vieler verschiedener Enzyme oder katalytischer Antikörper, einschließlich Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und Ligasen, eingesetzt werden. Eine besondere Bedeutung besitzt die Produktion verbesserter Proteasen, Carboxyhydrasen, Lipasen, Dioxigeasen, und Peroxidasen. Diese und andere mit dem Verfahren dieser Erfindung herstellbaren Enzyme erfahren wichtige kommerzielle Anwendungen bei enzymatischen Umsetzungen in der Medizin, bei Kosmetika, Nahrungsmitteln, im Braugewrbe, bei Detergentien, Umwelt (z. B. Abwasserbehandlung), in der Landwirtschaft, Gerberei, Textilien und anderen chemischen Verfahren. Dies umfaßt, ist aber nicht hierauf beschränkt, diagnostische und therapeutische Anwendungen, Umsetzungen von Fetten, Kohlenhydraten und Proteinen, Abbau organischer Schadstoffe und Synthese von Chemikalien. Zum Beispiel können therapeutisch wirksame Proteasen mit fibrinolytischer Aktivität oder Aktivität gegen virale Strukturen, die bei einer Infektion notwendig sind, wie beispielsweise virale Hüllproteine, konstruiert werden. Solche Proteasen können zweckdienliche antithrombische Agentien oder antivirale Agentien gegen Viren, wie beispielsweise AIDS, Rhinoviren, Influenza oder Hepatitis, sein. Bei Oxigenasen (z.B. Dioxigenasen), einer Enzymklasse, die einen Co-Faktor zur Oxidation aromatischer Ringe und anderer Doppelbindungen benötigt, sind industrielle Nutzungen bei biologischen Aufschlußverfahren, Umwandlung von Biomasse in Brennstoffe oder andere Chemikalien, Umwandlung von Abwasserinhaltsstoffen, biologische Kohleveredlung und Entgiftung von gefährlichen organischen Verbindungen mögliche Anwendungsgebiete für neue Proteine.
Tests auf diese Aktivitäten können entwickelt werden, wo eine Zelle die gewünschte Aktivität zum Wachsen benötigt. Beim Durchmustern auf Aktivitäten, die toxische Verbindungen abbauen, erlaubt die Zugabe lethaler Mengen der toxischen Verbindung in Nährmediumplatten das Wachstum nur der Zellen, die eine die die toxische Verbindung abbauende Aktivität exprimieren. (Wasserfallen, A., Rekik, M. und Harayama, S., Biotechnology 9:296-298 (1991)). Beim Durchmustern auf ein Enzym mit einem nicht toxischen Substrat kann möglicherweise das Substrat als einzige Kohlenstoffquelle oder einzige Quelle eines anderen geeigneten Nährstoffs verwendet werden. Auch in diesem Fall werden nur die Enzymaktivität exprimierenden Zellen auf den Platten wachsen. Bei diesen Verfahren ist es nicht notwendig, daß die Enzymaktivität sezerniert wird, wenn das Substrat oder ein Produkt des Substrats (durch eine andere Aktivität extrazellular umgesetzt) von der Zelle aufgenommen werden kann. Zusätzlich kann man durch Einbau eines Substrats in das Medium, was im Erfolgsfall zu einem erkennbaren Zeichen auf Aktivität führt, direkt auf eine neue Funktion testen.

Beispiele für die Walk-through-Mutagenese

Modell 1

Um die Erfindung näher zu erläutern, wird eine "Walk-through"-Mutagenese von drei hypervariablen Regionen oder Komplementaritäts-bestimmenden Abschnitten (CDRs) des monoklonalen Antikörpers MCPC 603 beschrieben. CDR1 und CDR3 der schweren Kette (VH) und CDR2 der leichten Kette (VL) waren die für eine Walk-through-Mutagenese ausgewählten Domänen. Bei dieser Anwendung sind die ausgewählten Aminosäuren die drei Reste der katalytischen Triade der Serin-Proteasen, Asp, His und Ser. Asp wurde für VH CDR1 ausgewählt, Ser wurde für VH CDR3 ausgewählt und His wurde für VL CDR2 ausgewählt.
MCPC 603 ist ein Phosphorylcholin bindender monoklonaler Antikörper. Dieses Immunoglobulin ist als ein ausgezeichnetes Modell zur Erforschung von Bindung und Katalyse erkannt worden, weil das Protein und seine Bindungsregion strukturell gut charakterisiert worden sind. Die CDRs für die MCPC 603 Antikörper sind identifiziert worden. In der schweren Kette umfaßt CDR1 die Aminosäuren 31-35, CDR2 umfaßt 50-69 und CDR3 umfaßt 101- 111. In der leichten Kette sind die Aminosäuren von CDR1 24-40, CDR2 umfaßt die Aminosäuren 55-62 und CDR3 umfaßt die Amionosäuren 95-103. Die Ziffern der Aminosäuren der Abbildung stimmen mit den Ziffern der Aminosäuren im ursprünglichen MCPC Molekül überein.
Die mit der variablen Region eines Immunoglobulins übereinstimmende cDNS kann ohne Konstruktion von cDNS- Bibliotheken direkt geklont und sequenziert werden. Weil die variable Region-Gene des Immunoglobulins von konservierten Sequenzen flankiert werden, kann eine Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR) verwendet werden, um Klon und Sequenz sowohl der leichten als auch der schweren Ketten- Gene aus einer kleinen Anzahl an Hybridomzellen unter Verwendung von 5' und 3' Konsensus-Primern zu amplifizieren. Siehe Chiang, Y. L. et al., BioTechniques 7:360 (1989). Außerdem kann die DNS, die die CDR Regionen flankierenden Aminosäuren codiert, durch ortsspezifische Mutagenese mutagenisiert werden, um für eine weitere "kassetten"-Mutagenese zweckdienliche Restriktionsenzymschnittstellen zu bilden. Siehe U.S. Patent Nr. 4.888.286, supra. Um die Insertion der degenerierten Oligonukleotide zu erleichtern, wird die Mischung so synthetisiert, daß sie flankierende Erkennungsstellen für die gleichen Restiktionsenzyme enthält. Die degenerierte Mischung kann zuerst in doppelsträngige DNS durch enzymatische Verfahren umgewandelt werden (Oliphant, A. R. et al., Gene 44:177 (1986) und dann in das Gen der zu mutagenisierenden Region anstelle der die natürlich vorkommmende (Wildtyp) Aminosäuresequenz codierenden CDR Nucleotidsequenz inseriert wird.
Wahlweise kann eine der anderen oben beschriebenen Anwendungen, wie beispielsweise eine Gen-Synthese-Anwendung, zur Herstellung einer Plasmid-Bibliothek, die Varianten in den gewünschten Regionen codiert, eingesetzt werden. Die publizierte Aminosäuresequenz von den MCPC 603 VH und VL Regionen kann in eine DNS Sequenz umgesetzt werden. (Rudikoff, S. und Potter, M., Biochemistry 13:4033 (1974)). Man beachte, daß die Wildtyp DNS-Sequenz von MCPC 603 ebenfalls publiziert wurde (Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. LII:105- 112 (1987)). Restriktionsstellen können zwecks leichterer Einführung der degenerierten Oligonucleotide in die Sequenz eingebaut werden, oder die degenerierten Sequenzen können zum Zeitpunkt der Genzusammenfügung eingefügt werden.
Die Konstruktion der Oligonucleotide für die Walkthrough-Mutagenese in die CDRs von MCPC 603 wird in Abbildung 3 gezeigt. In jedem Fall werden die zu mutagenisierenden Positionen oder "Fenster" gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die synthetisierten Oligonucleotide länger als das gezeigt Fenster sein können, um die Insertion in das Zielkonstrukt zu erleichtern. Die mit dem VH CDR1 übereinstimmende Oligonucleotidmischung wird so konstruiert, daß jede Aminosäure der Wildtyp-Sequenz durch Asp ersetzt wird (Abbildung 3a). Zwei Codons spezifizieren Asp (GAC und GAT). Das erste CDR1 Codon benötigt keine Substitution. Das zweite Codon (TTC, Phe) benötigt eine Substitution an der ersten (T zu G) und zweiten Position (T zu A), um es in ein Codon für Asp zu ändern. Das dritte Codon (TAC, Tyr) benötigt nur eine Substitution an der ersten Position (T zu G). Das vierte Codon (ATG, Met) benötigt drei Substitutionen, wobei die erste A zu G, die zweite T zu A und die dritte G zu T ist. Das fünfte Codon (GAG, Glu) benötigt nur eine Substitution an der dritten Position (G zu T). Die daraus resultierende Oligonucleotidmischung wird unten gezeigt.
Dies stellt eine Mischung von 2&sup7; = 128 verschiedener Oligonucleotidsequenzen dar.
Über den genetischen Code ist es möglich, alle Aminosäuren herzuleiten, die die ursprünglichen Aminosäuren in jeder Position substituieren. In diesem Fall ist die erste Aminosäure immer Asp (100%), die zweite ist Phe (25%), Asp (25%), Tyr (25%) oder Val (25%); die dritte Aminosäure ist Tyr (50%) oder Asp (50%); die vierte ist Met (12,5%), Asp (12,5%), Val (25%), Glu (12,5%), Asn (12,5%), Ile (12,5%) oder Lys (12,5%); und das fünfte Codon ist entweder Glu (50%) oder Asp (50%). Insgesamt werden 128 Oligonucleotide gebildet, die 112 verschiedene Proteinsequenzen codieren (1 x 4 x 2 x 7 x 2 = 112). Unter den 112 gebildeten verschiedenen Aminosäuresequenzen ist die Wildtyp-Sequenz (die ein Asp Rest an Position 31 besitzt) und Sequenzen, die sich vom Wildtyp dadurch unterscheiden, daß sie ein bis vier Asp Reste in den Positionen 32-35 in allen möglichen Permutationen (siehe Abbildung 3a) enthalten. Zusätzlich enthalten einige Sequenzen, entweder mit oder ohne Asp Substitutionen, eine Aminosäure - weder Wildtyp noch Asp - an den Positionen 32, 34 oder an beiden. Diese Aminosäuren werden durch Permutationen der Nucleotide eingeführt, die die Wildtyp-Aminosäure und die vorgewählte Aminosäure codieren. Zum Beispiel in Abbildung 3a an Position 32 werden Tyrosin (Tyr) und Valin (Val) zusätzlich zu dem Wildtyp Phenylalaninrest (Phe) und des vorgewählten Asp Rests gebildet.
Der CDR3 der VH Region von MCPC603 besteht aus 11 Aminosäuren, wie in Abbildung 3b gezeigt. Eine Oligonucleotidmischung wird konstruiert, in der jede nicht Serin Aminosäure der Wildtyp-Sequenz durch Serin (Ser) ersetzt wird, wie oben für CDR1 beschrieben. Sechs Codons (TCX und AGC, AGT) spezifizieren Ser. Es werden 12 Substitutionen über die gesamte Wildtyp-Sequenz benötigt. Als Ergebnis, enthält die hergestellte Oligonucleotidmischung 2¹² = 4096 verschiedene Oligonucleotide, die in diesem Fall 4096 Proteinsequenzen codieren. Unter diesen Sequenzen sind einige, die einen einzigen Serinrest (zusätzlich zum Serin 105) in einer beliebigen anderen Position (101-104, 106-111) enthalten, ebenso wie Varianten mit mehr als einem Serin in beliebiger Kombination (siehe Abbildung 3b).
Der CDR2 der VL Region von MCPC603 enthält acht Aminosäuren (56-63). Sieben dieser Aminosäuren (56-62) wurden für eine Walk-through-Mutagenese, wie in Abbildung 3c dargestellt, ausgewählt. Die Oligonucleotidmischung wird so konstruiert daß jede Aminosäure der Wildtyp- Sequenz durch Histidin (His) ersetzt wird. Zwei Codons (CAT und CAC) spezifizieren His. Es werden 13 Substitutionen über die gesamte Wildtyp-Sequenz benötigt. Folglich enthält die hergestellte Oligonucleotidmischung 2¹³ = 8192 Oligonucleotide, die 8192 verschiedene Peptidsequenzen (siehe Abbildung 3c) spezifizieren.
Als Ergebnis dieses Mutageneseverfahrens mit Synthese und Verwendung dreier Oligonucleotidmischungen, kann eine Bibliothek von Fv Sequenzen hergestellt werden, die 112 x 4096 x 8192 = 3,76 x 10&sup9; verschiedene Proteinsequenzen enthält. Ein wesentlicher Teil dieser Sequenzen codiert die Aminosäure-Triade His, Ser, Asp, die typisch für Serin-Proteasen innerhalb der hypervariablen Region sind.
Die Synthese der degenerierten Oligonucleotidmischung kann bequemerweise mit einem automatischen DNS- Synthesizer durchgeführt werden, der entsprechend programmiert ist, daß er entweder ein Nucleotid in die Reaktionskammer gibt oder eine Mischung zweier Nucleotide im Verhältnis 1:1, die vor der Zugabe in die Reaktionskammer gemischt werden. Ein alternatives Syntheseverfahren kann das vorherige Mischen zweier verschiedener Nukleotide in einem Reaktionsgefäß umfassen. Insgesamt 10 Reaktionsgefäße, wobei vier die einzelnen Basen enthalten und die restlichen 6 alle möglichen Mischungen zweier Basen der 4 Basen enthalten, können zur Synthese einer beliebigen Oligonucleotidmischung für dieses Mutageneseverfahren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann der DNS- Synthesizer so installiert werden, daß er die folgenden 10 Kammern enthält: Kammer Baustein
Mit dieser Anordnug kann ein beliebiges Nucleotid durch eine Kombination zweier Nucleotide an einer beliebigen Position der Sequenz ersetzt werden.
Die folgende Reaktionssequenz ist erforderlich, um die gewünschte Mischung der degenerierten Oligonucleotide herzustellen für:
VH CDR1: 4, 1, 3, 9, 5, 3, 9, 1, 3, 7, 5, 9, 4, 1, 9
VH CDR3: 1, 7, 3, 2, 6, 3, 2, 6, 3, 7, 4, 3, 1, 4, 3, 1, 10, 2, 2, 10, 4, 2, 6, 3, 2, 8, 3, 9, 6, 3, 9, 8, 2
VL CDR2: 10, 7, 2, 10, 6, 2, 6, 7, 3, 6, 6, 3, 3, 7, 2, 10, 1, 5, 8, 6, 2
Falls das Mischen der einzelnen Basen in den zuleitungen des Oligonucleotid-Synthesizers möglich ist, kann das Gerät alternativ programmiert werden, daß es von zwei oder mehreren Gefäßen mit nur einer Base entnimmt, um das gewünschte Nucleotidverhältnis zu bilden.
Jede Mischung der synthetischen Oligonucleotide kann in das Gen für die entsprechende variable Region von MCPC 603 inseriert werden. Die Oligonucleotide können in Doppelstrangform mittels enzymatischer Techniken umgewandelt werden (siehe Oliphant, A. R. et al., 1986, supra) und dann in ein restringiertes Plasmid ligiert werden, das das Gen für das zu mutagenisierende Protein enthält. Die Restriktionsschnittstelle kann eine natürlich vorkommende Stelle oder eine konstruierte Restriktionsschnittstelle sein.
Die mutierten MCPC 603 Gene, die mit diesem oder anderen geeigneten oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden, können in einem geeigneten E. coli Expressionssystem, wie das von Pluckthun und Skerra beschriebene, exprimiert werden. (Pluckthun, A. und Skerra, A., Meth. Enzymol. 178:476-515 (1989); Skerra, A. et al., Biotechnology 9:273-278 (1991)). Die mutierten Proteine können exprimiert werden und in das Medium und/oder in das Cytoplasma von Bakterien abgegeben werden, wie von M. Better und A. Horwitz, Meth. Enzymol. 178:476 (1989) beschrieben.
Diese und andere Fv Varianten oder Antikörpervarianten, die durch das vorliegende Verfahren hergestellt werden, können ebenfalls in anderen Mikroorganismen, wie beispielsweise Hefe, oder in Säugetierzellen, wie Myelom- oder Hybridomzellen, hergestellt werden. Die Fv-Varianten können als einzelne VH und VL Fragmente, als einzelne Ketten (siehe Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988), als Teile größerer Moleküle wie Fab oder als vollständige Antikörpermoleküle hergestellt werden.
In einer bevorzugten Anwendung sind die einzelnen Domänen, die VH und VL codieren, jeweils an das 3' Ende einer Sequenz geknüpft, die eine Signalsequenz codiert, wie beispielsweise die ompA, phoA oder pelB Signalsequenz (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. 169:4379 (1987)). Diese Genfusionen werden zu einem dicistronischen Konstrukt zusammengefügt, so daß sie von einem einzigen Vektor exprimiert werden können und in den periplasmatischen Raum von E. coli sezerniert werden, wo sie wieder gefaltet werden und die aktive Form wieder erlangen können. (Skerra, A. et al., Biotechnology 9:273-278 (1991). Die mutierten VH- Gene können gleichzeitig mit dem Wildtyp VL exprimiert werden, um Ev-Varianten herzustellen, oder wie beschrieben, zu einer weiteren Erhöhung der Anzahl und der strukturellen Varietäten der Proteinmutanten mit VL mutagenisiert werden.
Die Durchmusterung auf Varianten, die eine protolytischen Funktion erworben haben, kann mit einem Test, wie unten für die HIV Protease Varianten (siehe ebenfalls Beispiel 4) beschrieben, durchgeführt werden. Man beachte ferner, daß Varianten mit Lipasefunktion ebenfalls gebildet werden können, weil die katalytische Asp-His-Ser Triade ebenfalls an dem Mechanismus bestimmter Lipasen beteiligt ist.

Modell II

In einem zweiten entwickelten Modell zu Herstellung einer Serin-Protease in der MCPC 603 Ev Struktur wird Asp für VH CDR1, His für CDR3 und Ser für VL CDR2 gewählt. In diesem Fall kann das degenerierte Oligonucleotid, das für die VH CDR1 Asp Durchwanderung von Modell 1 konstruiert wurde, wieder verwendet werden, was die Austauschbarkeit der Walk-through Kassetten verdeutlicht (Abbildung 3a).
Für die His Durchwanderung von VH CDR3 werden die benötigten Nucleotide für die Spezifizierung von Histidin in die Positionen 101-111 der VH-Region eingeführt. Abbildung 4 stellt dieses Walk-through Verfahren dar. Man beachte, daß in diesem und anderen Beispielen der Prozentsatz der hergestellten His für den Fall berechnet wird, wo annähernd gleiche Anteile an Wildtyp oder His Nucleotiden eingeführt werden. Diese Anteile können zur Beeinflussung der Häufigkeit, mit der verschiedene Aminosäuren hergestellt werden, eingestellt werden.
Abbildung 4b stellt die Ser Durchwanderung von VL CDR2 in jeder Position (55-62) dar. Hier ist die Sequenz an den Positionen 58 und 62 unverändert, da Serin in der Wildtyp-Sequenz vorliegt. Man beachte, daß an Position 61, obwohl vier verschiedene Nucleotidsequenzen gebildet werden, nur drei verschiedene Proteinsequenzen hergestellt werden. Dieses Resultat ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß TAA für ein Stopcodon codiert.
Eine Anwendung des Verfahren ermöglicht in diesem Fall die Herstellung einer Bibliothek von FV-Sequenzen mit 112 x 196.608 x 96 = 2,11 X 10&sup9; verschiedenen Proteinsequenzen. Wieder wird ein wesentlicher Anteil dieser Sequenzen die katalytische Triade Asp-His-Ser in den hypervariablen Regionen codieren.
Man beachte, daß eine Reihe von Kassetten für eine Anzahl an Regionen konstruiert wird, wobei diese Kassetten in einer beliebig gewünschten Permutation verwendet werden können. Zum Beispiel können degenerierte Oligonucleotide für die CDRs konstruiert werden, und diese können zusammen in beliebiger Kombination von Bereichen und gewünschten Ketten, sowie ebenso in verschiedenen Strukturen (z.B. in einzelnen VL oder VH Ketten, Fv Molekülen, Single-Chain-Antikörpern, vollständigen oder schimären Antikörpern) verwendet werden.

Modell III

In einer weiteren Anwendung wird zur Konstruktion einer Serin-Protease nur die schwere Kette des Fv Moleküls verwendet. Monomere VH-Domänen wurden hergestellt, die als als Single-Domain-Antikörper mit guten Antigen- Bindungsaffinitäten bekannt sind. (Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)). Folglich kann eine einzelne VH Kette ein Gerüst für die Walk-through-Mutagenese liefern. Für dieses Modell wurde Asp für VH CDR3 (Abbildung 3b), His für VH CDR2 und Ser für VH CDR3 (Abbildung 3b) ausgewählt. Wieder können zwei der in Modell I beschriebenen degenerierten Nucleotidsequenzen verwendet werden (Abbildungen 3a und 3b). Abbildung 5a zeigt die His Durchwanderung in einem Teil von VH CDR2.
Es sind die Oligonuleotide hergestellt worden, die die in den Abbildungen 3a, 3b und 5a gezeigten Fenster und zu diesen Fenstern komplementäre degenerierte Oligonucleotide umfassen. Durch Verwendung komplementärer Oligonucleotide und ihren zusätzlich komplementären Strängen wurde eine vollständige doppelsträngige VH Genvariante zusammengesetzt. Die zusammengesetzte Genvariante wurde in den Vektor pBR500 geklont (Beispiel 2), der die pelB Leader-Sequenz zur Sekretion enthält. Diese Experimente werden in Beispiel 1 beschrieben.
Bei Synthese dieser Oligonucleotide und den Einbau in allen möglichen Kombinationen in das VH-Gen, wie beschrieben, können theoretisch 112 x 2²&sup5; x 4096 = 1,54 x 10¹³ verschiedene Peptidsequenzen gebilden werden. Aufgrund der hänge der in VH CDR2 gewählten Region wird eine große Anzahl an Varianten gebildet; allerdings besitzt ein große Teil der Varianten die gewählte Aminosäure.
Als Alternative zur Verwendung des in Abbildung 5a gezeigten VH CDR2 Fensters wurde ein anderes Fenster konstruiert, das einen anderen Teil der VH CDR2 umfaßt (Abbildung 5b). In diesem Fenster wurden bestimmte Positionen in dem Bereich ausgewählt (zur weiteren Erklärung siehe Modell VI unten) und der Walk-through-Mutagenese unter Verwendung von His als gewählte Aminosäure unterzogen. Wenn konstruierte Oligonucleotide, wie in Abbildung 5b gezeigt, anstelle der Oligonucleotide in Abbildung 5a verwendet werden, können 112 x 128 x 4096 = 5,87 x 10&sup7; verschiedene Peptidsequenzen gebildet werden.

Modell IV

In einer weiteren Anwendung wird bei Verwendung der schweren Kette des Fv Moleküls eine unterschiedliche Kombination der Fenster verwendet. Das Asp Fenster, vorher für CDR1 (Abbildung 3b; Modelle I, III) beschrieben, und das His Fenster, vorher für CDR3 (Abbildung 4a; Modell II) beschrieben, werden mit einem neuen Fenster verwendet, in dem Ser den amino-terminalen Teil von VH CDR2 der Aminosäuren 50-60 durchwandert hat. Diese Walk- through-Mutagenese ist in Abbildung 6 dargestellt.
Die Synthese dieser Oligonucleotide und deren einbau in das VH-Gen in allen möglichen Kombinationen kann 112 x 4096 x 196.608 = 9,02 x 1010 verschiedene Peptidsequenzen bilden.

Model IV

In einer weiteren Anwendung wird ein Protein mit einer bestehenden katalytischen Aktivität verändet, um unterschiedliche Katalysemechanismen zu entwickeln. In dem Verfahren kann ebenfalls die Spezifität und/oder die Aktivität des Enzyms verändert werden. Die HIV-Protease wurde als ein Enzym zur Mutagenese ausgewählt. Die HIV- Protease ist eine Aspartat-Protease und besitzt eine für Aspartat-Proteasen typische Asp-Thr-Gly Sequenz, die eine konservierte Asp-Thr(Ser)-Gly Sequenz im aktiven Zentrum enthalten (Toh et al., EMBO J. 4: 1267-1272 (1985)). Für eine Walk-through-Mutagenese wurde die Asp-Thr-Gly Sequenz in der Protease als Ziel für die Mutagenese ausgewählt. Die Walk-through-Mutagenese wurde dreimal mit den drei verschiedenen zuvor ausgewählten Aminosäuren Asp, His und Ser wiederholt. Mit diesem Versuch möchte man die Umwandlung einer Aspartat-Protease in eine Serin- Protease und eine Änderung des Katalysemechanismus erreichen. Zusätzlich werden Mutanten der HIV Aspartat- Protease mit veränderter Aktivität, Spezifität oder veränderten Katalysemechanismen erwartet.
Abbildung 7 zeigt die drei zu ändernden Reste oder Fenster und zeigt drei sequentielle Walk-through Verfahren mit Asp, His und Ser. In der ersten Position, ein Asp Rest, werden nur His und Ser eingeführt. In den zwei verbliebenen Positionen werden jeweils Asp, His und Ser eingeführt. Man beachte, daß in der zweiten Position des zweiten Codons und in der zweiten Position des dritten Codons das bei der His Durchwanderung benötigte A bereits bei der Asp Durchwanderung eingeführt worden ist (Abbildung 7). Die Sequenz der gemischten Sonde, die 324 verschiedene Sequenzen umfaßt, und die codierten Aminosäuren werden ebenfalls in Abbildung 7 gezeigt. Dieses Mutagenese-Protokoll bildet 324 verschiedene Peptidsequenzen in dem Fenster des aktiven Zentrums.
Für die Mutagenese und Expression der HIV-Protease wurde Plasmid pBR505, wie in Beispiel 2 beschrieben, konstruiert. Dieses Plasmid steuert die Expression der HIV- Protease durch einen induzierbaren TAC-Promotor (de Boer, H.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 (1983)). In pBR505 wird die Protease-Gensequenz im Leserahmen an das 3' Ende der Sequenz fusioniert, die die pelB Leader- Sequenz der Pectat-Lyase codiert, so daß die Protease in den periplasmatischen Raum von E. coli sezerniert werden kann. Das Konstrukt ist so konstruiert, daß die Leader- Sequenz geschnitten wird und die natürlich vorkommende N- terminale Sequenz der Protease gebildet wird. Die Sekretion der HIV-Protease vereinfacht das Testen und die Reinigung der durch Mutagenese gebildeten Varianten.
Der Komplementärstrang der in Abbildung 7 gezeigten gemischten Sonde wurde synthetisiert, und ein partiell komplementäres Oligonucleotid wurde ebenfalls synthetisiert. Diese Oligonucleotide werden zur Herstellung einer doppelsträngigen Sequenz konstruiert, die geeignete XhoI (CTCGAG) und BstEII (GGTNACC) Restriktionsschittstellen (unterstrichen) enthalten und das Fenster des aktiven Zentrums flankieren. (Man beachte, daß die komplementäre Sequenz der Sequenz, die das Fenster des aktiven Zentrums codiert, synthetisiert wurde. Folglich ist die Nucleotidsequenz für den Wildtyp für das Fenster des aktiven Zentrums (5'-ACC AGT GTC-3'), unten wird der Komplementärstrang von 5'-GAC ACT GGT-3' gezeigt, wobei das letztere Asp-Thr-Gly codiert). Fenster
Die Oligonucleotide wurden hybridisiert und in einer Reaktion unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNS-Polymerase verlängert. Die Verlängerung der kurzen komplementären Oligonucleotide bildet den Komplementärstrang von jeder Oligonucleotid-Variante. Der Reaktionsansatz wurde mit BstEII und XhoI restringiert, und die Produkte wurden auf einem 8% Polyacrylamidgel aufgetrennt. Eine 106 bp Bande wurde aus dem Gel durch Elektroelution wiedergewonnen. Diese Bande, die die Fragmente des Fensters des aktiven Zentrums enthielt, wurde zwischen die BstEII und XhoI Schnitt stelle von pRB505 kloniert, und die ligierten Plasmide wurden in einen TG1/pACYC177 lacIq Stamm eingeführt. Die resultierenden Transformanten wurden auf LB amp Platten ausgestrichen und ca. 1000 Kolonien geerntet.
Die Kolonien werden unter Verwendung des Protease- Durchmusterungstests&sub1; in Beispiel 4 beschrieben, durchmustert. Ampicillin resistente Kolonien wurden auf proteolytische Aktivität mittels Replika-Plattierung auf Nähragarplatten durchmustert, die 2 mM IPTG für Induktion der Expression und entweder Trockenmilchpulver (3%) oder Hämoglobin als Protease-Substrat, wie in Beispiel 4 beschrieben, enthielten. Bei diesem Test erscheint eine klare Zone gegen den trüben Plattenhintergrund, wenn eine Kolonie protolytische Aktivität sezerniert, die zu einem Abbau des Substrat in der Platte (z. B. Trockenmilch) führt. Weil die Wildtyp HIV-Protease keine Aktivität in dem Test (aufgrund ihrer Substratspezifität) zeigt, können neue Aktivitäten von der ursprünglichen Aktivität unterschieden werden. Vorläufige Daten zeigen, daß Transformanten mit neuer Aktivität mit dem beschriebenen Verfahren hergestellt werden können. Die neu gebildeten Varianten können ferner auf Erwerb eines andersartigen Funktionsmechanismus mittels differentieller Hemmung mit Proteaseinhibitoren durchmustert werden. Beispielsweise werden Serin-Proteasen durch PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), DFP (Diisopropylfluorophosphat), TLCK (L-1- Chlor-3-(-9-tosylamid)-7-amino-2-heptanonhydrochlorid) inhibiert. Transformanten, die einen Hof auf Platten entwickeln, kann man in Flüssigmedium wachsen lassen, und die Extrakte aus den Kulturen können in Gegenwart geeigneter Inhibitoren getestet werden. Eine verminderte Aktivität in Gegenwart eines Serin-Proteasen Inhibitors, verglichen mit der Aktivität in Abwesenheit eines derartigen Inhibitors, deutet darauf, daß eine Variante mit einem katalytischen Mechanismus der Serin-Protease arbeitet. Unter den mit dem Walk-through-Mutagenese-Verfahren gebildeten Varianten befinden sich Varianten mit veränderter Aktivität, veränderter Spezifität, einem Serin- Protease-Mechanismus oder eine Kombination dieser Merkmale. Diese Varianten können unter Verwendung bekannter Techniken genauer charakerisiert werden.

Model VI

In dieser Anwendung wird die Walk-through Mutagenese von fünf der sechs CDRs des MCPC 603 Fv Moleküls durchgeführt, und Asp, His und Ser sind die gewählten Aminosäuren. In diesem Modell wird die Walk-through Mutagenese zwei- bis dreimal mit einer unterschiedlichen Aminosäure in einer gegebenen Region der Domäne ausgeführt. Beispielsweise haben Ser und His sequentiell VL CDR1 (Abbildung 8a) durchwandert, und Asp und Ser haben sequentiell VL CDR3 (Abbildung 8b) durchwandert. VL CDR2 wurde nicht für eine Mutagenese gewählt, weil Strukturuntersuchungen aufzeigten, daß diese Region nur wenig zur Bindungsstelle in MCPC 603 beiträgt.
Im CDR1 der VH Kette von Fv sind Asp und His durchwandert (Abbildung 8c). Ser kann in zwei Positionen im CDR1 mit einem einzigen Basentausch (Abbildung 8c, Positionen 32 und 33) eingeführt werden. Im VH CDR2 werden die gewählten Aminosäuren His und Ser verwendet (Abbildung 8d) und in VH CDR3 haben Asp, His und Ser die fünf aminoterminalen Positionen vom CDR3 (Abbildung 8e) durchwandert.
Ferner werden in dieser Anwendung nicht alle Aminosäuren in einer gegebenen Region mutagenisiert, obwohl sie nicht die vorgewählte Aminosäure als Wildtyp-Rest enthalten. Beispielsweise werden in Abbildung 8d nur die Positionen 50, 52, 56, 58, und 60 mutagenisiert. Entsprechend kann man aus den Abbildungen 8a-d ersehen, daß ein oder mehrere Reste in der Region nicht mutagenisiert werden. Die Mutagenese der nicht benachbarten Reste innerhalb der Region kann ebenfalls erwünscht sein, falls diese bekannt sind, oder falls man vermutet, daß bestimmte Reste in der Region an der gewünschten Funktion nicht beteiligt sind. Zusätzlich kann die Anzahl der Varianten minimiert werden.
Ein Faktor der Konstruktion ist beispielsweise im Falle einer Serin-Protease die Distanz zwischen den vorgewählten Aminosäuren. Um eine katalytische Triade zu bilden, muß der Rest in der rage sein, Wasserstoffbindung mit einem anderen einzugehen. Diese Umstand kann zu einer unmittelbaren Beschränkungen der gebildeten Varianten führen. Folglich können nur bestimmte Positionen innerhalb der CDRs den Aminosäuren der katalytischen Triade eine korrekte Wechselwirkung erlauben. Folglich können Moleküldesign oder andere Strukturinformationen zur Vermehrung funktioneller Varianten verwendet werden.
In diesem Fall wurde eine bekannte Strukturinformation benutzt, um nah genug benachbarte Reste, die eine Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asp, His und Ser erlauben, und ebenso den Umfang der zu mutagenisierenden Reste in der Region zu identifizieren.
Roberts et al. haben Regionen mit einem engen Kontakt zwischen den Bereichen der CDRs identifiziert (Roberts, V.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6654-6658 (1990)). Diese Information wurde zusammen mit Daten der Röntgenstruktur von MCPC 603 verwendet, um vielversprechende Bereiche mit engem Kontakt unter den ausgewählten CDRS für die Mutagenese zu wählen.
Falls die Mutagenese, wie erläutert, ausgeführt wird und die Bereiche zufällig kombiniert werden, können 17.280 x 27.648 x 432 x 2304 x 7776 = 5,2 x 10¹&sup8; verschiedene Peptidsequenzen gebildet werden.

Modell VII

In allen oben beschriebenen Anwendungen wird die Mutagenese konstruiert, um eine Anhäufung katalytisch aktiver Reste zu bilden. Bei der Anwendung von Modell VII wird die Mutagenese zur Bildung einer neuen Bindungsfunktion entwickelt. In dieser Anwendung werden die bei Bindung oder Komplexierung eines Co-Faktors (z. B. Fe&spplus;&spplus;&spplus;) beteiligten Reste in Bereiche eines Moleküls, hier MCPC, eingeführt. Viele Enzyme brauchen Metallionen als Co- Faktoren, deshalb ist die Bildung derartiger Bindungsstellen als erster Schritt zur Konstruktion solcher Enzyme wünschenswert.
In dieser Anwendung werden zwei Histidin- und zwei Tyrosinreste in die CDRs von MCPC 603 eingeführt. Dioxigenasen, Vetreter der Oxidoreduktasen, die das oxidative Spalten von Doppelbindungen in Catecholen katalysieren, enthalten gebundenes Eisen in ihren aktiven Zentren. Die spektroskopische Analyse und Röntgenkristallographie deuten daraufhin, daß das Eisenion im aktiven Zentrum der Dioxigenasen über zwei Tyrosin- und zwei Histidinreste gebunden ist.
Die für MCPC 603 konstruierten Histidin-Fenster (siehe z. B. Abbildung 3c, VL CDR2; Abbildung 4a, VH CDR3 und Abbildung 5a, VH CDR2) können zur Einführung von Histidinresten in eine oder mehrere Domänen von MCPC 603 eingesetzt werden, oder zusätzliche Fenster können konstruiert werden. Gleichermaßen können ein oder mehrere CDRs von MCPC 603 für die Walk-through Mutagenese mit Tyrosin gewählt werden. Unter Verwendung dieser Kassetten können Varianten mit 2 Histidin- und 2 Tyrosinresten in sehr vielfältigen Kombinationen und in verschiedenen Bereichen hergestellt werden.
Diese Varianten können auf Erwerb einer Metallbindung durchmustert werden. Beispielsweise kann man Pools von Kolonien wachsen lassen und eine Periplasmafraktion herstellen. Die Proteine in einer Periplasmafraktion eines gegebenen Pools können mit einem geeigneten radioaktiven Metallion (z. B. &sup5;&sup5;Fe) markiert werden, und das Vorkommen einer Metall bindenden Variante kann mittels hochempfindlicher Gelfiltration bestimmt werden. Das Vorhandensein von Radioaktivität in der Proteinfraktion aus der Gelfiltration deutet auf eine Metallbindung. Pools kann man aufteilen und das Verfahren so lange wiederholen, bis eine Mutante isoliert wird.
Alternativ kann man auch einen Nitrocellulosefilter-Test verwenden. Kolonien eines Stammes, die die mutierten Proteine sezernieren und diese ins Medium abgeben, läßt man auf Nitrocellulosefilter wachsen. Die von den Kolonien abgegebenen mutierten Proteine können an die Nitrocellulose binden, und die Anwesenheit von Metall bindenden Proteinen kann man durch Bindung der radioaktiv markierten Metallionen ermitteln.
Die Bildung einer Metallbindung in der VL Kette kann eine Metallbindungsstelle für eine katalytische VH Kette bereitstellen. Die Herstellung von Fv aus diesen Kettenbestandteilen kann eine Verstärkung der Katalyse ermöglichen, die durch eine Kette mittels Co-Faktor- Bindung in einer anderen Kette vermittelt wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Konstruktion einer VH Variante

Oligonucleotidsynthese

β-Cyanoethylphosphoramidite und polymere Trägersäulen (CPG) wurden von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) bezogen. Wasserfreies Acetonitril wurde von Burdick und Jackson (Part Nr. 015-4) bezogen. Oligonucleotide wurden mit einem Applied Biosystems Model 392 unter Verwendung vom Hersteller gelieferter Programme synthetisiert (Sinha, N.D., et al., Nucleic Acids Res., 12: 4539 (1984)). Nach abgeschlossener Synthese wurden die Oligonucleotide vom Träger abgespalten und die Cyanoethylschutzgruppen wurden durch Inkubation in konzentrierter NH&sub4;OH-Lösung entfernt. Im Anschluß an die Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel wurden die Oligomere aus dem Gel geschnitten, elektroeluiert, auf C18 Säulen gereinigt, gefriergetrocknet und in dem geeigneten Puffer in einer Endkonzentration von 1 ug/ml gelöst.

Oligonucleotide

Für die Konstruktion der in Modell III beschriebenen VH Variante wurden die folgenden Oligonucleotide und deren Komplementärstränge (ebenfalls gezeigt) mit einer Länge von 30-54 Basen konstruiert und, wie beschrieben, synthetisiert. Die Codonverwendung wurde auf die am häufigsten verwendeten E. coli Codons abgestimmt. A/a: 910372/910373 B/b: 910374/910375 C/c: 910376/910377 D/d: 910378/910379 E/e: 910380/910381 F/f: 910382/910383 G/g: 910384/910385 H/h: 910386/910387 I/i: 910388/910389 oder 9104103/9104104 J/j : 910390/910391

Genzusammenfügung

Diese Oligonucleotidpaare können in einem VH Gen, wie unten beschrieben, zusammengefügt werden:
Die Paare D/d, F/f und I/i sind degenerierte und komplementäre Oliginucleotide, die die in Abbildung 3a, Abbildung 5a und beziehungsweise Abbildung 3b aufgeführten "Fenster" umgeben. Die Konstruktion der anderen Oligonucleotide erfolgte nach der Beschreibung von Pluckthun et al., und umfaßte die Einführung einer Reihe von Restriktionsstellen (EcoRI, NcoI, BamHI, SauI, XmaI, XhoI, NheI, AccI, HaeII, SpeI, ClaI, PstI, NsiI, BssHII, KpnI und HindIII, die für weitere Manipulationen zweckdienlich waren (siehe Pluckthun, A. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., Vol. LII, 105-112 (1987)). Zur Genzusammenfügung (Alvarado-Urbina, G. et al., Biochem. Cell. Biol. 64: 548-555 (1986)), wurden achtzehn der Oligonucleotide (B-I, b-i) mit Hilfe der T4 Polynucleotidpolymerase phosphoryliert. Jedes der zehn komplementären Paare wurde seperat hybridisiert. Dann wurden die hybridisierten Paare gemischt und miteinander mit Hilfe der T4 DNS Ligase ligiert. Das Produkt wird unten schematisch gezeigt:
Das synthetische Gen wurde so konstruiert, daß es Restriktionsstellen zum Klonieren enthält. Im Anschluß an die Ligation wurden die vollständig zusammengefügten Moleküle mit NcoI und HindIII geschnitten, im Gel aufgetrennt und in den Vektor pRB500 (siehe Beispiel 2) an der NcoI und HindIII Stelle inseriert. Uber 1500 Transformanten wurden gegenüber dem Background erhalten. Die resultierenden Konstrukte sollten die im Leserahmen an das pelB Signalpeptid fusionierten VH Gen-Varianten enthalten.

Beispiel 2

Konstruktion von pBR505

Zwei komplementäre Oligonucleotide, die für die pelB Leader-Sequenz codieren (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. 169: 4379 (1987)) wurden chemisch synthetisiert. Die konstruierten Oligonucleotide mit zu NcoI und HindIII komplementären 5' und 3' überhängen wurden hybridisiert und in die PstI und NcoI Schnittstellen des Vektors pKK233.2 (Pharmacia) kloniert. Die Oligonucleotide sind unten aufgeführt:
Das resultierende Plasmid pRB500 besitzt einen induzierbaren tac Promotor upstream des ATG Startcodons der pelB Sequenz. Es gibt eine einzige NcoI Schnittstelle (unterstrichen) am 3' Ende der Sequenz, die für die pelB Leader-Sequenz codiert, in die ein Gen inseriert werden kann, das ein zu sezernierendes Produkt codiert, wie beispielsweise HIV Protease, die VH oder VL Bereiche eines Antikörpers. (Die am 5' Überhang des Fragments ligierte NcoI Schnittstelle wird nicht wiederhergestellt.)

Konstruktion von pRB503

Das HIV Proteasegen wurde aus pUC18.HIV (Beckman&sub1; Katalog-Nr.267438) erhalten. Das Gen kann aus diesem Plasmid als ein HindIII-EcoRI oder HindIII-BamHI Fragment herausgeschnitten werden. Die HindIII Schnittstelle in der HIV Protease kann allerderdings nicht direkt im Leserahmen an die im Plasmid pRB5000 vorhandene Leader- Sequenz kloniert werden. Deshalb wurde ein doppelsträngiger Oligonucleotid-Linker konstruiert, so daß die das aminoterminale Methionin der HIV Protease codierende Sequenz im Leserahmen an die codierende Sequenz des pelB Leader-Peptids im pRB505 eingefügt werden kann. Die folgende Sequenz wurde synthetisiert:
Dieser Linker hat einen 5' -HindIII Überhang und 3' einen DraIII Uberhang. Das Oligonucleotid wurde in die einzigen HindIII und DraIII Schnittstellen des pUC18.HIV kloniert. Das resultierende Plasmid wird als pRB503 bezeichnet. Der Linker führt eine NcoI Schnittstelle in den Vektor am Initiationsmethionin der HIV Protease ein und rekonstruiert die Sequenz, wie in pUC18.HIV gefunden.

Konstruktion von pRB505

Das HIV Proteasegen wurde aus pRB503 als ein NcoI- EcoRI Fragment isoliert und in die einzigen NcoI und EcoRI Schnittstellen von pRB500 kloniert. Im Endkonstrukt wird die HIV Protease im Leserahmen an die pelB Leader-Sequenz fusioniert und die Expression wird von dem induzierbaren tac Promotor gesteuert. Man erwartet, daß die Leader-Peptidase das Fusionsprotein zwischen Ala und Pro (Reste 2 und 3 oben) der HIV Sequenz schneidet und dadurch ein N-terminales Prolin genau wie bei der Wildtyp HIV Protease gebildet wird.

Beispiel 3

Walk-Through-Mutagenese des aktiven Zentrums der HIV Protease

Ein degeneriertes Oligonucleotid, das die Asp-Thr- Gly Reste des aktiven Zentrums der HIV Protease umfaßt, wurde konstruiert und synthetisiert. Dieses Oligonucleotid besitzt eine komplementäre Sequenz zu der in Abbildung 7 gezeigten Sequenz.
Ein zweites, zu der obigen Sequenz partiell komplementäres Oligonucleotid wurde synthetisiert, um eine Umsetzung des obigen degenerierten Oligonucleotids in die doppelsträngige Form zu ermöglichen. Das komplementäre Oligonucleotid besitzt die folgende Sequenz:
Die degenerierten Oligonucleotide und komplementären Sequenzen wurden hybridisiert.
Die Oligos wurden mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNS-Polymerase verlängert. (Oliphant, A.R. und Struhl, K., Methods Enzymol., 155: 568-582 (1987)). Die resultierende Mischung wurde mit BstEII und XhoI geschnitten und auf einem 8% Polyacrylamidgel getrennt. Eine 106 bp große Bande, die das Fenster des aktiven Zentrums enthielt, wurde durch Elektroelution aus einem Gelstück isoliert, mit Phenol:Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Der Vektor pRB505 wurde mit BstEII und XhoI geschnitten, und mit Kälber-Alkalischer-Phosphatase behandelt, um eine zur Religation zu verhindern. Die Vektorbande wurde aus einem Gel niedrig schmelzender Agarose gereinigt. Die gereinigten BstEII-Xhol Fenster des aktiven Zentrums (100 ng) wurden in die BstEII und XhoI Schnittstellen von pRBsos kloniert (500 ng). Der Ligationsansatz wurde verwendet, um einen TG1/pACYC177 lacIq Stamm zu transformieren und ampicillinresistente Transformanten wurden auf LB amp Platten (LB plus 50 g/ml Ampicillin; Miller, J.H., (1972), in: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY), Seite 433, selektioniert. Ungefähr 100 Transformanten wurden auf eine neue Aktivität mit Hilfe des Protease-Plattentests, wie unten in Beispiel 4 beschrieben, getestet.

Beispiel 4

Proteaseaktivität-Plattentests

Empfindlichkeit des Plattentests

Falls die zu untersuchende Aktivität eine proteolytische Aktivität ist, können substrathaltige Nährmedien-Platten zur Durchmusterung auf Protease freisetzende Kolonien verwendet werden. Substrate für Proteasen, wie beispielsweise denaturiertes Hämoglobin, können dem Plattenmedium zugesetzt werden (Schumacher, G.F.B. und Schill, W.B., Anal. Biochem., 48: 9-26 (1972); Benyon und Bond, Proteolytic Enzymes, 1989 (IRL Press, Oxford) S. 50). Wenn man Bakterienkolonien, die eine Protease freisetzen können, auf diesen Platten wachsen läßt, sind die Kolonien von einer klaren Zone umgeben, was auf einen Abbau des im Medium vorhandenen Proteinsubstrats deutet.
Eine Protease muß mehrere Kriterien erfüllen, wenn sie in dem Test erkannt werden soll. Einmal muß die Protease in das Medium sezerniert werden, wo sie dann mit dem Substrat interagieren kann. Zweitens muß die Protease mehrere Peptidbindungen in dem Substrat spalten, so daß die daraus entstehenden Produkte löslich sind, und man eine klare Zone erhält. Drittens muß die Zelle genügend Protease-Aktivität freisetzen, um über der Detektionsschwelle des Tests zu liegen. Wenn die spezifische Aktivität der Protease sinkt, erhöht sich der für die Detektion notwendige Schwellenwert.
Man kann ein oder mehrere Substrate verwenden. Zum Beispiel kann man Hämoglobin (0,05 - 0,1%), Kasein (0,2%) oder Trockenmilchpulver (3%) den geeigneten Nährmedien- Platten zusetzen. Kolonien können von einer Masterplatte mittels Vielfachüberimpfung, Replika-Plattierung oder anderer geeigneten Methoden auf eine oder mehrere Testplatten mit Proteasesubstrat überimpft werden. Nach Wachstum bei 37 ºC (oder der geeigneten Temperatur) können klare Zonen rund um die Kolonien beobachtet werden, die eine das Substrat abbauende Protease freisetzen.
Es wurden vier Proteasen unterschiedlicher Spezifitäten und Reaktionsmechanismen für die Bestimmung des im Plattentest detektierbaren Aktivitätsbereichs getestet. Die Enzyme umfaßten Elastase, Subtilisin, Trypsin und Chymotripsin. Spezifische Aktivitäten (Elastase 81 E/mg Pulver; Subtilisin 7,8 E/mg Pulver; Trypsin 8600 E/mg Pulver; Chymotrypsin 53 E/mg Pulver) wurden vom Hersteller bestimmt. Eine Verdünnung von jedem Enzym, Elastase, Subtilisin, Trypsin und Chymotrypsin, wurde hergestellt und 5 ul Aliquote wurden in separaten Löcher in allen drei unterschiedlichen Testplatten pipettiert.
Kasein, Trockenmilchpulver oder Hämoglobin in einer 1% Difco Bacto Agar Matrix (10 ml pro Platte) in 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM CaCl&sub2; Puffer enthaltende Platten wurden hergestellt. Auf Kaseinplatten (0,2%), mit der geringsten getesteten Aktivität (0,75 ng Protein), ergaben alle vier Enzyme detektierbare klare Zonen unter den Versuchsbedingungen. Auf Platten mit Milchpulver (3%) waren Elastase und Trypsin bis zu einem Minimalwert von 3 ng Protein, Chymotrypsin bis zu einem Minimalwert von 1,5 ng und Subtilisin bis zu einem Gehalt von 25 ng Protein detektierbar. Auf Hämoglobinplatten mit Hämoglobinkonzentrationen zwischen 0,05 und 0,1 Prozent, erhielt man mit 1,5 ng Elastase, Trypsin und Chymotrypsin detektierbare klare Zonen. Unter den Versuchsbedingungen erhielt man auf Hämoglobinplatten mit Subtilisin unter 6 ng keine erkennbaren klaren Zonen.

Test auf HIV Protease Varianten

Von den ungefähr 1000 Ampicillin resistenten Transformanten, die mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhalten wurden, wurden mit Hilfe des Proteasen-Plattentests durchmustert. Die Ampicillin resistenten Kolonien wurden auf proteolytische Aktivität mit Replika-Plattierung auf Nähragar-Platten (LB plus Ampicillin) mit einer Oberschicht, die IPTG (Isopropylthiogalaktopyranosid) zur Expressionsinduktion und entweder Trockenmilchpulver (3%) oder Hämoglobin als Proteasesubstrat enthielt, durchmustert.
Proteasesubstrat-Stammlösungen wurden durch Suspendieren von 60 mg Hämoglobin oder 1,8 g Milchpulver in 10 ml deionisiertem Wasser angesetzt und 20 Minuten bei 60 ºC inkubiert. Die Oberschicht wurde durch Zugabe von Ampicillin und IPTG in 50 ml gelöstem LB Agar (15 g/l) bei 60 ºC in einer Endkonzentration von 50 ug/ml und beziehungsweise 2 mM und 10 ml Protease-Stammlösung hergestellt. 10 ml Oberschicht wurde auf die LB amp Platten geschichtet.
Kolonien, die eine hinreichende proteolytische Aktivität freisetzen, die das Substrat in der Platte (z. B. Trockenmilch) abbaut, haben eine klare Zone um sich herum, die vom trüben Plattenhintergrund unterscheidbar ist. Während Transformanten keine klare Zone auf Hämoglobin-Platten ergaben, bildete ein großer Teil der Transformanten eine klare Zone auf Trockenmilchpulver- Platten. Man beachte, daß die Trockenmilchpulver-Platten 1,5 Tage bei 37 ºC inkubiert worden sind und dann gekühlt wurden. Obwohl keine Höfe nach 1,5 Tagen Inkubation bei 37 ºC sich bildeten, hatten mehr als 90% der Kolonien auf den untersuchten Platten Höfe nach 3 Tagen Kühlung. Drei Kolonieproben, die Höfe auf den Testplatten bildeten, wurden auf Trockenmilchpulver-Platten ausgestrichen, die 2 mM IPTG enthielten. Zwei der drei ausgestrichenen Kolonien wuchsen. Verschieden klare Zonen wurden wieder bei zwei der drei isolierten unter den gleichen Bedingungen (Wachstum über Nacht, bei 37 ºC, anschließende dreitägige Kühlung) beobachtet. Als Kontrolle wurden Transformanten von TG1/pACYC177 lacIq, die entweder prbsoo enthielten, das die pelB Signalsequenz aber keine HIV Protease codiert, oder pRB505, das die mit der "Wildtyp" HIV Protease fusionierte pelB Signalsequenz enthielt, auch auf Trockenmilchpulver-Platten mit 2 mM IPTG ausgestrichen. Im Gegensatz zu den aus der Mutagenese erhaltenen Transformanten ergaben diese Tranformanten keine klaren Zonen auf Trockenmilchpulver- Platten. Diese Beobachtung stimmt mit den vorherigen Resultaten überein, was darauf hindeutet, daß die retroviralen Proteasen selektiv für virale Zielproteine sind (Skalka, A.M., Cell 56: 911-913 (1984)). Bei Verwendung dieses Tests können neue Protease-Aktivitäten, die durch das Walk-through-Mutageneseverfahren gebildet wurden, von der Wildtyp HIV Protease durch veränderte Substratspezifitäten unterschieden werden.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt kann unter zu Hilfenahme einfacher Experimente viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen. Diese Entsprechungen sind beabsichtigt und werden von den folgenden Ansprüche umfaßt.

Claims

1. Ein Verfahren zur Bildung einer Protein-Bibliothek, die eine heterogene Mischung mutierter Proteine umfaßt, wobei besagtes Verfahren den Schritt der spezifischen Substitution jeder Aminosäure in einer oder mehreren zuvor bestimmten Regionen eines Proteins mit einer oder mehreren beliebigen, zuvor bestimmten Aminosäuren ohne Sättigung aufweist, wobei die Substitution jeder zuvor bestimmten Aminosäure im wesentlichen in allen und jeder Sequenzposition von jeder zuvor bestimmten Region des Proteins der Reihe nach bewerkstelligt wird.

2. Ein Verfahren zur Bildung einer Protein-Bibliothek, die eine heterogene Mischung mutierter Proteine umfaßt, wobei besagtes Verfahren den Schritt der spezifischen Substitution jeder Aminosäure in einer oder mehreren zuvor bestimmten Regionen eines Proteins mit einer beliebigen von zwei zuvor bestimmten Aminosäuren aufweist, wobei die Substitution jeder zuvor bestimmten Aminosäure im wesentlichen in allen und jeder Sequenzposition von jeder zuvor bestimmten Region des Proteins der Reihe nach bewerkstelligt wird.

3. Ein Verfahren zur Bildung einer Protein-Bibliothek, die eine heterogene Mischung mutierter Proteine umfaßt, wobei besagtes Verfahren den Schritt der spezifischen Substitution jeder Aminosäure in einer zuvor bestimmten Proteinregion mit einer einzigen, zuvor bestimmten Aminosäuren aufweist, wobei die Substitution im wesentlichen in allen und jeder Sequenzposition der zuvor bestimmten Proteinregion der Reihe nach bewerkstelligt wird.

4. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 31 worin (a) eine zuvor bestimmte Aminosäure in zwei oder mehrere zuvor bestimmte Proteinregionen eingefügt wird; oder (b) die zuvor bestimmte Aminosäure Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys, oder Arg ist; oder (c) der Anteil der mutierten Proteine, die mindestens einen Rest der zuvor bestimmten Aminosäure in der zuvor bestimmten Region enthalten, im Bereich von etwa 12,5% bis 100% aller mutierten Proteine der Bibliothek liegt, und worin zum Beispiel die Bibliothek mutierte Proteine umf aßt, welche die zuvor bestimmte Aminosäure in einer bis zu allen Positionen in der zuvor bestimmten Region enthalten.

5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Substitution der zuvor bestimmten Aminosäure in allen und jeder Sequenzposition der zuvor bestimmten Region oder wenigstens einer zuvor bestimmten Region des Proteins bewerkstelligt wird.

6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die zuvor bestimmte Region oder wenigstens eine zuvor bestimmte Region eine funktionelle Domäne des Proteins aufweist.

7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, worin (a) die zuvor bestimmte Region eine Domäne an oder nahe des katalytischen Zentrums eines Enzyms oder eine Bindungsdomäne aufweist; oder (b) die zuvor bestimmte Region eine hypervariable Region eines Antikörpers aufweist.

8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das des weiteren ein Screening der Bibliothek mutlerter Proteine zur Selektion von mutierten Proteinen mit einer gewünschten Struktur oder Funktion umfaßt.

9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eine oder mehrere der zuvor bestimmten Aminosäuren Asp, His, Tyr, oder Ser ist.

10. Eine Bibliothek mutierter Proteine, die nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 gebildet ist.

11. Ein Verfahren zur Mutagenese eines Gens, das ein Protein codiert, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Auswählen einer bestimmten Region der Aminosäuresequenz des Proteins, das von dem zu mutagenisierenden Gen codiert wird;

b) Bestimmen eines einzigen Aminosäurerests zur Insertion in Aminosäurepositionen in der bestimmten Region;

c) Herstellen einer Oligonucleotidmischung, die eine Nucleotidsequenz für die bestimmte Region umfaßt, worin jedes Oligonucleotid in jeder Sequenzposition in der bestimmten Region entweder ein Nucleotid, das für die Synthese des zu mutagenisierenden Proteins erforderlich ist, oder ein Nucleotid, das für ein Codon der zuvor bestimmten Aminosäure erforderlich ist, enthält, wobei die Mischung alle möglichen verschiedenen Oligonucleotide diesem Kriterium gemäß enthält; und

d) Bilden einer Expressionsbibliothek geklonter Gene, die besagte Oligonucleotide enthalten.

12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, worin (a) die bestimmte Region eine funktionelle Domäne des Proteins aufweist; oder (b) die bestimmte Region eine Domäne an oder nahe des katalytischen Zentrums eines Antikörpers aufweist; oder (c) die bestimmte Region eine hypervariable Region eines Antikörpers aufweist; oder (d) die zuvor bestimmte Aminosäure Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys oder Arg ist.

13. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, das des weiteren einen oder mehrere der folgenden Schritte umfaßt:

a) Expression besagter Bibliothek geklonter Gene, um mutierte Proteine herzustellen; und/oder

b) Screening besagter Bibliothek geklonter Gene oder codierter Proteine, um eine gewünschte Struktur oder Funktion zu selektieren.

14. Eine Bibliothek geklonter Gene, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11 hergestellt werden.

15. Ein Verfahren zur Herstellung eines mutierten Proteins mit einer gewünschten Struktur oder Funktion mittels walkthrough Mutagenese, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) Auswählen einer oder mehrerer bestimmten Regionen der Aminosäuresequenz des Proteins, das ohne Sättigung mutagenisiert werden soll;

b) Bestimmen eines oder mehrerer Aminosäurereste, die in Aminosäurepositionen in besagten bestimmten Regionen inseriert werden sollen;

c) Herstellen einer Oligonucleotidmischung, die eine Nucleotidsequenz für besagte bestimmte Regionen umfaßt, worin jedes Oligonucleotid in jeder Sequenzposition in besagten bestimmten Regionen entweder ein Nucleotid, das zur Synthese des zu mutagenisierenden Proteins erforderlich ist, oder ein Nucleotid, das für ein Codon besagter zuvor bestimmten Aminosäuren erforderlich ist, enthält, wobei die Mischung alle möglichen verschiedenen Oligonucleotide diesem Kriterium gemäß enthält;

d) Bilden einer Expressionsbibliothek von Klonen, die besagte Oligonucleotide enthalten;

e) Screening der Bibliothek zur Detektion eines Klons, der ein mutiertes Protein mit der gewünschten Struktur oder Funktion codiert; und

f) Struktur oder Funktion codiert; und Expression eines mutierten Proteins, das aufgrund der Anwesenheit des Oligonucleotids, das in dem in Schritt (e) detektierten Klon vorhanden ist, die gewünschte Struktur oder Funktion besitzt.

16. Ein Verfahren gemäß Anspruch 15, worin (a) für wenigstens eine bestimmte Region zwei zuvor bestimmte Aminosäuren ausgewählt werden, die in Aminosäurepositionen in besagter oder in besagten bestimmten Region(en) inseriert werden sollen; oder (b) für wenigstens eine bestimmte Region, eine einzige zuvor bestimmte Aminosäure ausgewählt wird, die in eine Aminosäureposition in besagter bestimmten Region inseriert werden soll.

17. Eine Bibliothek von Mutanten eines Proteins, die mutierte Proteine umfaßt, in denen insgesamt eine zuvor bestimmte Aminosäure mindestens einmal im wesentlichen in jeder Position in einer Region des Proteins vorkommt, worin Mutanten, die mindestens einen Rest der zuvor bestimmten Aminosäure in einer Region des Proteins enthalten, einen Anteil im Bereich von etwa 12,5% bis 100% der Gesamtzahl der verschiedenen Mutanten in der Bibliothek aufweisen.

18. Eine Bibliothek gemäß Anspruch 17, worin (a) die mutierten Proteine die zuvor bestimmte Aminosäure in einer bis zu allen Positionen der Region gemäß einer statistischen Verteilung gleichzeitig enthalten; oder (b) das Protein ein Enzym ist, und die Region am oder nahe des katalytischen Zentrums ist; oder (c) das Protein ein Antikörper oder ein Teil dessen ist, und die Region eine hypervariable Region der Antigen-Bindungsstelle ist; oder (d) die zuvor bestimmte Aminosäure Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys, His, Glu, Asp, Lys oder Arg ist.

19. Eine Bibliothek von HIV-Protease-Mutanten, die mutierte Proteine umfassen, in denen gemeinsam drei zuvor bestimmte Aminosäuren wenigstens einmal in allen Positionen im Bereich des aktiven Zentrums der Protease vorkommen.

20. Die Bibliothek gemäß Anspruch 19, worin die drei zuvor bestimmten Aminosäuren Asp, His und Ser sind.

21. Ein mutiertes Protein der Bibliothek gemäß Anspruch 20, worin Asp, His und Ser im Bereich des aktiven Zentrums vorkommen.

22. Ein Verfahren zur Herstellung einer Oligonucleotidmischung zur Mutagenese ohne Sättigung einer Nucleotidsequenz, die eine ausgewählte Region eines Proteins zum Einfügen einer zuvor bestimmten Aminosäure in jeder Position in der Region codiert, und die Herstellung der Oligonucleotidmischung umfaßt, die eine Nucleotidsequenz für die zuvor ausgewählte Region umfaßt, worin jedes Oligonucleotid an jeder Sequenzposition in der ausgewählten Region entweder ein für die Synthese der Aminosäure der Region erforderliches Nucleotid oder ein für ein Codon der zuvor bestimmten Aminosäure erforderliches Nucleotid enthält, und die resultierende Mischung alle möglichen verschiedenen Oligonucleotide enthält, die jedes der beiden Nucleotide an jeder Position enthalten.

23. Eine Oligonucleotidmischung, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 22 hergestellt wird, worin etwa 12,50% bis 1000% der Oligonucleotide wenigstens ein Codon für eine einzige, zuvor bestimmte Aminosäure enthalten.

24. Eine Vorrichtung zur DNA-Synthese mit zehn Reagenzgefäßen, wobei jedes von vier Gefäßen ein unterschiedliches der vier Nucleotidsynthone enthält, die mit den vier Nucleotiden der DNA übereinstimmen, und jedes von sechs Gefäßen eine der sechs unterschiedlichen Mischungen zweier Synthone enthält.