DE69101802T2

DE69101802T2 - Antihypercholesterolemika.

Info

Publication number: DE69101802T2
Application number: DE69101802T
Authority: DE
Inventors: Kenneth F Bartizal; James D Bergstrom; Maria T Diez; Otto D Hensens; Leeyuan Huang; Jerrold M Liesch; Mary Nallin; Janet C Onishi; Fernando Pelaez Perez; Walter Rozdilsky; Frank L Vanmiddlesworth
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1990-03-21
Filing date: 1991-03-21
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2011-03-22
Also published as: EP0450812A1; DE450812T1; NO911121D0; AU640755B2; CA2038517A1; IL97535A0; HU910930D0; DK0450812T3; GR920300106T1; ES2052463T1; NO911121L; AU7368391A; ATE104982T1; JPH04279589A; HUT61555A; NZ237448A; KR910016931A; IE910924A1; DE69101802D1; EP0450812B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist bekannt, daß Hypercholesterinämie einer der Hauptrisikofaktoren für ischämische Herzgefäßerkrankungen wie Arteriosklerose ist. Gallensäureabscheidemittel wurden angewandt, um diesen Zustand zu behandeln; sie scheinen mäßig wirksam zu sein, aber sie müssen in großen Mengen, d.h. jeweils einigen Gramm, eingenommen werden und sie schmecken nicht sehr gut.
MEVACOR (Lovastatin), das zur Zeit im Handel erhältlich ist, ist eines einer Gruppe von sehr wirksamen antihypercholesterinämischen Mitteln, die wirken, indem sie die Biosynthese von Cholesterin durch Hemmung des Enzyms, HMG-CoA-Reduktase begrenzen.
Squalen-synthetase ist das Enzym, das an der ersten Stufe der de-novo Biosynthese von Cholesterin beteiligt ist. Dieses Enzym katalysiert die reduktive Dimerisation von 2 Molekülen Farnesyl-pyrophosphat zur Bildung von Squalen. Die Hemmung dieses Schritts zu Cholesterin sollte die Biosynthese zu Ubichinon, Dolichol und Isopentenyl-t-RNA nicht behindern.
Bei früheren Bemühungen, Squalen-synthetase zu hemmen, wurden Pyrophosphat oder Pyrophosphat-Analoge, enthaltend Verbindugen, wie sie angegeben sind von P.Ortiz de Montellano et. al, J.Med. Chem. 20, 243 (1977) und E.J.Corey und R.Volante, J.Am.Chem.Soc., 98, 1291 (1976), angewandt. S.Biller (US-PS 4 871 721) beschreibt Isoprenoid(phosphinylmethyl)phosphonate als Inhibitoren für Squalen-synthetase.
Die vorliegende Erfindung betrifft nicht-phosphorhaltige Inhibitoren für Squalens-synthetase.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen der Strukturformel (I), die Squalen-synthetase-Inhibitoren sind:
wobei Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
a) H;
b) C&sub1;-C&sub5;-Alkyl;
c) C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, substituiert mit einen Substituenten ausgewählt aus der Gruppe
i) Phenyl,
ii) Phenyl, substituiert mit Methyl, Methoxy, Halogen (Cl, Br, I, F) oder Hydroxy, oder
ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel (I), in der mindestens einer der Reste Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; Wasserstoff ist.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft solche Verbindungen der Formel (I), bei denen die relative stereochemische Konfiguration des 2,8-Dioxabicyclo[3,2,1]octan- Ringes unten angegeben ist.
In dieser Beschreibung und den Ansprüchen ist, wenn es sich um die Stereochemie des 2,8-Dioxabicyclo[3,2,1]octan-Ringes handelt, die relative Konfiguration gemeint. Die tatsächliche Konfiguration kann wie angegeben sein oder diejenige des Enantiomers.
Ferner erläuternd für diese Ausführungsform sind solche Verbindungen der Strukturformel (I), bei denen die relative Konfiguration in den Stellungen 3, 6 und 7 wie unten angegeben ist.
Eine Gruppe dieser Ausführungsform sind solche Verbindungen der Struktur (I), bei denen die relative Konfiguration in 4-Stellung wie unten angegeben ist:
Beispielhaft für diese Gruppe ist die Verbindung, bei der Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; jeweils Wasserstoff ist oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Die Verbindung, bei der Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; jeweils Wasserstoff ist, wird im folgenden als Verbindung A bezeichnet.
Ferner erläuternd für diese Gruppe sind solche Verbindungen, bei denen einer oder mehrere der Reste Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; C&sub1;-C&sub5;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, substituiert mit Phenyl oder mit methyl-, methoxy-, halogen- (Cl, Br, I, F) oder hydroxy-substituiertem Phenyl, ist. Bei einer speziellen Ausführungsform sind Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; jeweils Methyl. Diese Verbindung wird im Folgenden als Verbindung B bezeichnet.
Die Verbindungen der Formel (I) werden durch ein aerobes Fermentations-Verfahren hergestellt, bei dem eine neue Kultur, MF5453, angewandt wird, die als steriles Myzel beobachtet wird. Mutanten von MF5453 sind ebenfalls in der Lage, erfindungsgemäße Verbindungen zu bilden und fallen ebenfalls unter die Erfindung.
Die Kultur von MF5453 ist diejenige eines Pilzes, der aus einer Wassesrprobe vom Jalon, Zaragossa, Spanien gewonnen worden ist. Diese Kultur wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 als ATCC 20986 hinterlegt.
Der Mikroorganismus MF5453 zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften:
Kolonien 22-24 mm Durchmesser nach 2 Wochen auf Kartoffeldextrose-Agar (Difco) bei 25ºC in kontinuierlichem Fluoreszenz- Licht, 40-45 mm in 2 Wochen auf Wilddungextrakt-Agar (Mycology Guidebook, media M-11, S.660) bei 25ºC. Kolonien auf Kartoffeldextrose-Agar, bestehend aus mäßig dickem, 1-2 mm tiefem Myzel, in der Mitte watteartig, die zum Rand hin filz- oder samtartig werden, undeutliche konzentrische Grate bilden, gelegentlich Sektoren mit unterschiedlicher Myzeltextur und Farbe bilden, vollständiger Rand ohne Auslappungen oder submerse führende Hyphen. Kolonien-Farbe zunächst weiß oder einige weiße Luft-Hyphen, die bald cremefarben werden, Cream Color, Cartridge Buff, (die groß geschriebenen bzw. englischsprachigen Namen sind nach Rifgway, R. Color Standards and Nomenclature, Washington, D.C. 1912), schließlich hellgrau bis grau, Light Olive-Gray, Gray, Pallid Neutral Gray, Neutral Gray, Gull Gray, Deep Gull Gray. Kolonien-Rückseite graubraun bis gelbbraun oder cremefarben, Cinnamon-Drab, Cinnamon, Ochraceous-Buff, Antimony Yellow, Warm Buff, Cartridge Buff. Kein Geruch oder Exsudat.
Morphologie der Hyphen schlauchpilzartig, undifferenziert, getrennt, verzweigt 1,5-3,5 um Durchmesser, in Wasser und KOH durchscheinend. Es bildeten sich keine reproduktiven Strukturen unter allen untersuchten Bedingungen, einschließlich Inkubation sowohl unter kontinuierlichem Licht als auch bei 12/12 Stunden Dunkel-Zyklen auf Maismehl-Agar, Heuextrakt-Agar, Hafermehl- Agar, Dungextrakt-Agar oder Malzextrakt-Agar.
Erfindungsgemäße Verbindungen können erhalten werden durch Züchtung des oben angegebenen Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium, enthaltend Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen. Nährmedien können auch Mineralsalze und Antischaummittel enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Struktur
umfassend die Züchtung von MF5453 (ATCC 20986) oder einer aktiven Mutante davon in einem wäßrigen Nährmedium, enthaltend Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff, und Gewinnung der Verbindung.
Die bevorzugten Quellen für Kohlenstoff in dem Nährmedium sind Kohlenhydrate wie Glukose, Glycerin, Stärke, Dextrin u.ä. Andere Quellen, die enthalten sein können, umfassen Maltose, Mannose, Saccharose u.ä.. Außerdem können komplexe Nährstoffquellen wie Hafermehl, Maismehl, Hirse, Mais u.ä. verwertbaren Kohlenstoff liefern. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, hängt zum Teil ab von den anderen Bestandteilen in dem Medium, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 0,5 und 5 Gew-%. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln in einem vorgegebenen Medium verwendet werden oder es können verschiedene Quellen zusammen in dem selben Medium verwendet werden.
Die bevorzugten Quellen für Stickstoff sind Aminosäuren wie Glycin, Methionin, Prolin, Threonin u.ä., sowie komplexe Quellen wie Hefeextrakte (Hydrolysate, Autolysate), Trockenhefe, Tomatenpaste, Sojabohnenmehl, Pepton, Maiswasser, lösliche Brennereirückstände, Malzextrakte u.ä..Anorganische Stickstoffquellen wie Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.) können ebenfalls angewandt werden. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder in Kombination in Mengen im Bereich von 0,2 bis 90 Gew-%, bezogen auf das Medium, verwendet werden.
Die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden im allgemeinen zusammen verwendet, brauchen jedoch nicht in reiner Form vorzuliegen. Weniger reine Materialien, die Spuren von Wachstumsfaktoren, Vitaminen und mineralischen Nährstoffen enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Mineralsalze können zu dem Medium zugesetzt werden wie (aber nicht beschränkt auf) Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Magnesiumsalze, Kupfersalze, Cobaltsalze u.ä. Ebenfalls enthalten sind Spurenmetalle wie Mangan, Eisen, Molybdän, Zink u.ä.. Außerdem kann, soweit erforderlich, ein Antischaummittel wie Polyethylenglykol oder Silicon zugegeben werden, besonders wenn das Kulturmedium stark schäumt.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen besteht im Beimpfen eines geeigneten Mediums mit Sporen oder Mycel des produzierenden Organismus und Züchten unter aeroben Bedingungen.
Das Fermentationsverfahren besteht im allgemeinen darin, eine aufrechterhaltene Quelle der Kultur in ein Saat-Nährmedium zu impfen und, manchmal durch ein zweistufiges Verfahren, den Organismus, der als Saat zur Herstellung der aktiven Verbindungen dient, wachsen zu lassen. Nach dem Beimpfen werden die Kolben unter Bewegen bei Temperaturen von 20 bis 30ºC, vorzugsweise bei 25 bis 28ºC inkubiert. Die Schüttelgeschwindigkeit kann bis zu 400 UpM, vorzugsweise 200 bis 220 UpM betragen. Saatkolben werden 2 bis 10 Tage, vorzugsweise 2 bis 4 Tage inkubiert. Wenn das Wachstum reichlich ist, üblicherweise nach 2 bis 4 Tagen, kann die Kultur verwendet werden, um Kolben mit Produktionsmedium zu beimpfen. Es kann eine zweite Stufe von Saat-Wachstum angewandt werden, besonders wenn in größere Gefäße übergegangen wird. Wenn dies der Falll ist, kann ein Teil des Kultur-Wachstums verwendet werden, um einen zweiten Saatkolben zu beimpfen, der unter ähnlichen Bedingungen, aber eine kürzeren Zeit inkubiert wird.
Nach dem Beimpfen wird das Fermentations-Produktions-Medium 3 bis 30 Tage, vorzugsweise 4 bis 14 Tage, mit oder ohne Bewegen (abhängig davon, ob flüssige oder feste Fermentationsmedien verwendet werden) inkubiert. Die Fermentation wird aerob bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 40ºC durchgeführt. Wenn (das Fermentationsgemisch) bewegt wird, kann die Geschwindigkeit 200 bis 400 UpM betragen. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, liegen die Temperaturen im Bereich von 22 bis 28ºC, insbesondere von 24 bis 26ºC. Der pH-Wert des Nährmediums, der zur Bildung der aktiven Verbindungen geeignet ist, liegt im Bereich von 3,55 bis 8,5, insbesondere 5,0 bis 7,5. Nach der entsprechenden Zeit zur Bildung der erwünschten Verbindung, werden die Kolben beerntet und die Verbindung isoliert.
Der pH-Wert der wäßrigen Myzel-Fermentation wird auf zwischen 1 und 9 (vorzugsweise zwischen 3 und 5) eingestellt, vorzugsweise gemischt mit einem wassermischbaren Lösungsmittel wie 50% Methanol, und das Myzel abfiltriert. Die aktive Verbindung wird dann aus dem wäßrigen Filtrat nach verschiedenen Methoden isoliert, umfassend:
1. Flüssig/flüssig-Extraktion des wäßrigen Filtrats in ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel wie Methyl-ethyl-keton, Ethyl-acetat, Diethyl-ether oder Dichlormethan, vorzugsweise nach Einstellen des pH-Werts auf zwischen 3 und 5.
2. Fest/flüssig-Extraktion des wäßrigen Filtrats auf eine organische Matrix wie SP207 oder HP-20 und Eluieren mit einem organischen Lösungsmittel (wäßrig oder nicht-wäßrig) wie 90/10 Methanol/Wasser oder 90/10 Aceton/Wasser.
3. Adsorption der aktiven Verbindung aus dem wäßrigen Filtrat auf ein Ionenaustauscher-Harz wie Dowex 1(Cl-) oder Dowex 50 (Ca²&spplus;) und Eluieren mit einem organisch/wäßrigen Lösungsmittel mit hoher Ionenstärke wie 90/10 Methanol/wäßriges 30%iges NH&sub4;Cl. Dieses Material könnte dann unter Anwendung der Methode 1 oder 2 entsalzt werden.
Jede dieser 3 Mthoden kann auch zur weiteren Reinigung der aktiven Verbindung angewandt werden.
Die Fraktion, die nach den obigen Methoden die aktive Verbindung enthält, könnte dann im Vakuum getrocknet werden unter Bildung der rohen aktiven Verbindung. Die rohe aktive Verbindung wird dann allgemein einigen Trenn-Stufen unterworfen wie Adsorptions- und Verteilungs-Chromatographie und Ausfällung. Bei jeder Trenn-Stufe werden Fraktionen gesammelt und zusammengegeben aufgrund von Ergebnissen eines Assays oder HPLC-Analyse.
Die chromatographischen Trennungen können durchgeführt werden unter Anwendung üblicher Säulenchromatographie mit einem ionischen oder nicht-ionischen Adsorbens. Wenn das Adsorbens Silicagel ist, ist ein Gemisch Alkohol/Chlorkohlenwasserstoff/organische Säure, wie Methanol/-Chloroform/Essigsäure/Wasser geeignet als Eluens. Zur Phasenumkehr-Chromatographie ist das bevorzugte Adsorbens ein Silicagel mit einer gebundenen C8- Phase. Das bevorzugte Eluens bei der Phasenumkehr-Chromatographie ist ein Gemisch aus Acetonitril und Wasser, das auf einen niedrigen pH-Wert gepuffert ist, wie 0,1% Phosphorsäure oder Trifluoressigsäure. Die aktive Verbindung kann aus einem nicht- polaren Lösungsmittel als Chinin-Salz ausgefällt werden. Das bevorzugte Lösungsmittel zur Ausfällung ist Diethyl-ether.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren gerichtet zur Hemmung der Cholesterin-Biosynthese, umfassend die Verabreichung einer nicht toxischen wirksamen Menge einer Verbindung, angegeben durch die Strukturformel (I) und pharmazeutisch annehmbarer Salze davon an ein Lebewesen, das einer solchen Behandlung bedarf. Speziell sind die erfindungsgemäßen Verbindugen nützlich als antihypercholesterinämische Mittel zur Behandlung von Arteriosklerose, Hyperlipidämie, familiärer Hypercholesterinämie und ähnlichen Krankheiten bei Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypercholesterinämie.
Erfindungsgemäße Verbindungen können oral oder parenteral in Form einer Kapsel, einer Tablette, einer injizierbaren Zubereitung oder ähnlichem verabreicht werden. Es ist üblicherweise erwünscht, die orale Route anzuwenden. Dosen können variieren in Abhängigkeit von dem Alter, der Schwere (der Erkrankung), dem Körpergewicht und anderen Zuständen des Patienten, aber eine tägliche Dosierung für Erwachsene liegt im Bereich von etwa 20 mg bis 2000 mg (vorzugsweise 20 bis 100 mg), die in 2 bis 4 Einzeldosen verabreicht werden kann. Höhere Dosen können bei Bedarf vorteilhaft verabreicht werden.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen solche, die gebildet worden sind von Kationen wie Natrium, Kalium, Aluminium, Calcium, Lithium, Magnesium, Zink und von Basen wie Ammoniak, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, Lysin, Arginin, Ornithin, Cholin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Diethanolamin, Procain, N-Benzylphenethylamin, Diethylamin, Piperazin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Tetramethyl-ammoniumhydroxid. Die Erfindung umfaßt Salze von 1, 2 oder 3 Carboxyl-Gruppen in der Formel (I).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen kationischen Polymeren verabreicht werden, die in der Lage sind, Gallensäuren in nicht reabsorbierbarer Form im Magen-Darm-Trakt zu binden. Beispiele für derartige Polymere umfassen Cholestyramin, Cholestipol und Poly[methyl-(3-trimethylaminopropyl)imino-trimethylendihalogenid]. Die relativen Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen und dieser Polymere liegen zwischen 1:100 und 1:15 000.
Die spezifische Hemmaktivität gegenüber Squalen-synthetase von repräsentativen Verbindungen nach der Erfindung wurde nach dem unten beschriebenen Standard-in-vitro-Verfahren gemessen:

Erzeugung von Mikrosomen:

Männliche Charles River CD-Ratten (120 bis 150 g) wurden 4 Tage mit einer Nahrung, enthaltend 0,1% Lovostatin, gefüttert. Die Lebern dieser Ratten wurden in 5 Volumina (ml/g) eiskaltem 50 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethan-sulfonsäure), 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 7,5, mit einer Gewebe-Mahlvorrichtung vom Potter-Elvehjem-Typ homogenisiert. Das Homogenisat wurde 2-mal 15 min. bei 4ºC mit 20 000 x g zentrifugiert, wobei die Perle jeweils verworfen wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde dann 1 Stunde bei 4ºC mit 100 000 x g zentrifugiert. Die erhaltene Mikrosomen-Perle wurde wieder in einem Volumen des obigen Homogenisierungs-Puffers, entsprechend 1/5 des Volumens des ursprünglichen Homogenisats suspendiert. Diese Mikrosomen-Zubereitung besaß eine Protein-Konzentration von etwa 7 mg/ml. Die Mikrosomen-Suspensionen wurden in gleichen Anteilen bei -70ºC aufbewahrt. Die Squalen-synthetase-Aktivität in diesen Anteilen war mindestens einige Monate stabil.

Partielle Reinigung von Prenyl-transferase:

Prenyl-transferase wurde gereinigt zur Verwendung bei der enzymatischen Synthese von radioaktiv markiertem Farnesyl-pyrophosphat. Prenyl-transferase wurde bestimmt nach dem Verfahren von Rilling (Methods in Enzymology 110, 125-129 (1985)) und eine Aktivitäts-Einheit ist definiert als die Enzym-Menge, die bei dem Standard-Assay 1 umol Farnesyl-pyrophosphat pro min. bei 30ºC bildet.
Die Lebern von 23 40 Tage alten männlichen Ratten, denen 5% Cholestyramin plus 0,1% Lovostatin verfüttert worden war, wurden in einem Waring-Mischer in 1 l 10 mM Mercaptoethanol, 2 mM EDTA, 25 uM Leupeptin, 0,005% Phenylmethyl-sulfonylfluorid, pH 7,0, enthaltend 0,1 Trypsin-Inhibitor-Einheiten an Aprotinin/ml homogenisiert. Das Homogenisat wurde 20 min. mit 20 000 x g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 6 N HOAc auf pH 5,5 eingestellt und 1 Stunde mit 100 000 x g zentrifugiert. Diese überstehende Flüssigkeit wurde mit 3 N KOH auf pH 7 gebracht und eine 35-60% Ammoniumsulfat-Fraktion entnommen. Die 60% Perle wurde erneut in 60 ml 10 mM Kaliumphosphat gelöst, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,0, (Puffer A) zugegeben und gegen 1 l Änderungen von Puffer A dialysiert. Diese dialysierte Fraktion wurde auf eine 12,5 x 5 cm Säule aus DEAE- Sepharose 4B, äquilibriert mit Puffer A, aufgebracht. Die Säule wurde mit 700 ml Puffer A und einem 1 l Gradienten von Puffer A zu 100 mM Kaliumphosphat, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,0, gewaschen. Fraktionen mit einer spezifischen Akivität > 0,20 Einheiten/mg wurden zusammengegeben, festes Ammoniumsulfat wurde zugegeben, um 60% Sättigung zu erreichen, und eine Perle gebildet. Die Perle wurde in 8 ml 10 mM Tris, 10 mM β- Mercaptoethanol, pH 7,0 (Puffer B) gelöst. Die wieder gelöste Perle wurde bis zu 60% Sättigunug in Ammoniumsulfat aufgenommen durch Zugabe von 1,5 Volumina gesättigtem Ammmoniumsulfat in Puffer B. DieseAmmoniumsulfat-Suspension enthielt 3,5 Einheiten/l mit einer spezifischen Aktivität von 0,23 Einheiten/mg und besaß keine Isopentenyl-pyrophosphat-isomerase-Aktivität. Diese Ammoniumsulfat-Suspension wurde verwendet zur Synthese von [4-¹&sup4;C)Farnesyl-pyrophosphat und ihre Aktivität konnte bei 4ºC stabil mindestens 6 Monate gelagert werden.

Enzymatische Synthese von [4-¹&sup4;C]Farnesyl-pyrophosphat

Das Lösungsmittel (Ethanol:0,15 N NH&sub4;OH, 1:1) wurde von 55 uCi [4-¹&sup4;C-Farnesyl-pyrophosphat (47,9 uCi/umol) durch Rotationsverdampfen entfernt. 600 ul 100 mM Tris, 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM Dithiothreitol, pH 7,5, wurden zugegeben und die Lösung wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Zentrifügenröhrchen gegeben. Geranylpyrophosphat, 250 ul einer 20 mM Lösung, und 50 ul der Ammoniumsulfat-Suspension der Prenyl-transferase wurden zugegeben, um die Reaktion einzuleiten. Diese Inkubation enthielt 5 umol Geranylpyrophaosphat, 1,15 umol Isopentenyl-pyrophosphat, 6 umol MgCl&sub2; und 0,18 Einheiten Prenyl-transferase in einem Volumen von 900 ul. Die Inkubation wurde bei 37ºC durchgeführt. Während der Inkubation wurde das Gemisch wolkig-weiß, indem der neu entstandene Magnesium-Komplex von Farnesyl-pyrophosphat aus der Lösung ausfiel. Das [4-¹&sup4;C]Farnesyl-pyrophosphat wurde durch 3 min. langes Zentrifugieren mit 14 000 UpM in einem Eppendorf- Zentrifugenröhrchen gesammelt, die überstehende Flüssigkeit entfernt und die Perle in 1,0 ml 50 mM HEPES, 5 mM EDTA, pH 7,5 gelöst. Die Ausbeute betrug 50,7 uCi (92%) [4-¹&sup4;C]Farnesyl-pyrophosphat.
Das [4-¹&sup4;C]Farnesyl-pyrophosphat wurde in einzelnen Anteilen bei -70ºC gelagert.

Squalen-synthetase-Bestimmung

Die Reaktion wurde in 16 x 125 mm Reagensgläsern mit Schraubverschluß durchgeführt. Ein Ansatz eines Reaktionsgemischs wurd hergestellt aus der folgenden Lösung: ul pro Bestimmung Volumen für 50 Bestimmungen HEPES, pH NaF, mM MgCl&sub2;, mM Dithiothreitol, mM NADPH, mM (frisch hergestellt) [4-¹&sup4;C] Farnesyl-pyrophosphat uCi/umol und uCi/3,0 ul
Dieses Bestimmungs-Gemisch wurde unter Vakuum entgast und mit N&sub2; gespült. Lösungen des Squalen-snthetase-Inhibitors wurden entweder in DMSO oder MeOH hergestellt und eine 1:120 Verdünnung des Mikrosomen-Proteins wurde mit dem ursprünglichen Homognenisierungs-Puffer hergestellt. Für jede Reaktion wurden 87 ul des Bestimmungs-Gemischs zusammen mit 3 ul einer Inhibitor-Lösung (DMSO oder MeOH bei den Vergleichen) genommen, in einem Wasserbad auf 30ºC erwärmt und dann die Reakton eingeleitet durch Zugabe von 10 ul der 1:120 Verdünnung des Mikrosomen- Proteins (0,6 ug Protein in der gesamten Bestimmung). Die Reaktionen wurden nach 20 min. abgebrochen durch Zugabe von 100 ul eines 1:1 Gemisches aus 40% KOH und 95% EtOH. Das gestoppte Gemisch wurde 30 min. auf 65ºC erwärmt, abgekühlt, 10 ml Heptan zugegeben und das Gemisch verwirbelt. 2 g aktivierte Tonerde wurden dann zugegeben, das Gemisch wieder verwirbelt, die Tonerde konnte sich setzen und es wurden 5 ml der Heptanschicht entfernt. Es wurden 10 ml Szintillationsflüssigkeit zu der Heptanlösung zugegeben und die Radioaktivität bestimmt durch Flüssigkeits-Szintillationszählung.
Die prozentuale Hemmung wird berechnet nach der Formel
1- [Probe - Blindprobe]/[Vergleich - Blindprobe] x 100
IC&sub5;&sub0;-Werte wurden bestimmt durch Auftragen des log der Konzentration der Testverbindung gegen die prozentuale Hemmung. IC&sub5;&sub0; ist die aus dieser Kurve bestimmte Konzentration des Inhibitors, die zu einer 50%igen Hemmung führt.
Typisch für die den erfindungsgemäßen Verbindungen innewohnenden Squalen-sythetase-Hemmaktivitäten sind die unten angegebenen IC&sub5;&sub0;-Werte: Verbindung Squalen-synthetase IC&sub5;&sub0;
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen auch ein breites Spektrum von Antipilzaktivität, bestimmt nach Brühen- oder Agar-Verdünnungsverfahren. Die Verbindungen sind besonders wirksam gegenüber Fadenpilzen und Hefen, einschließlich Candida albicans und Crypt neoformans. Die Empfindlichkeit von Fadenpilzen und Hefen wurde bestimmt, unter Anwendung von Inhibitor- Verdünnungs-Assays im Mikrotiterformat. Die Verbindungen wurden in DMSO in einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst und eine Reihenverdünnung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, in der Mikrotiterplatte von 100 bis 0,006 ug/ml hergestellt. Eine standardisierte Sporen-Suspension zur Untersuchung von Fadenpilzen wurde hergestellt durch Beimpfen von antibiotischem Medium #3, enthaltend 1,5% Agar mit Sporen, so daß 1,5 x 10³ Kolonien-bildende Einheiten pro Vertiefung zugegeben wurden. Die Mikrotiter-Vertiefungen wurden mit 50 ul Puffer, enthaltend die Verbindung und 50 ul beimpftes Medium, gefüllt. Die Empfindlichkeit der Hefen wurde bestimmt durch Beimpfen von Hefe-Stickstoffbase, enthaltend 1% Dextrose, (YNB/G) mit gleichen Anteilen einer über-Nacht-Kultur von Hefe, die in Hefe-Morphologie- Medium (YM) bei 35ºC gezüchtet worden war, und Verdünnen in YNB/G unter Bildung einer Endkonzentration von 1,5-7,5 x 10³ Kolonien-bildende Einheiten pro Vertiefung. 150 ul beimpftes Medium wurden pro Vertiefung zugegeben. Um die Empfindlichkeit der Hefe zu untersuchen, wurde die Verbindung in 10%igem wäßrigen DMSO in einer Konzentration von 2,56 mg/ml gelöst. Es wurde eine Reihenverdünnung in YNB/G von 128 bis 0,06 ug/ml hergestellt. Die Vertiefungen wurden mit 150 ul arzneimittelhaltigem Medium gefüllt. Die minimale Hemmkonzentratoin (MIC) ist definiert als die niedrigste Konzentration, um ein sichtbares Wachstum nach 42 stündiger Inkubation bei 28ºC für die Fadenpilze und 24 stündiger Inkubation bei 28ºC für die Hefen, zu verhindern. Die minimale fungicide Konzentration des Arzneimittels in ug/ml ist definiert als die niedrigste Konzentration des Arzneimittels, die das Wachstum vollständig verhinderte oder das Wachstum von nicht mehr als 3 Kolonien ermöglichte. Repräsentativ für die Antipilzaktivität sind die unten angegebenen Daten für die minimale Hemmkonzentration und die minimale fungicide Konzentration: Minimale Hemmkonzentration (mcg/ml) Organismus Fadenpilze Verbindung A. fumigatus MF4839 A. flavus MF383 A. niger MF442 Fus. oxysporum MF4014 Pen. italicum MF2819 Coch. miyabeanus MF4626 T. Mentagrphytes MF4864 Hefen C. albicans MY1055 C. tropicalis MY1012 C. parapsilosis MY1010 Crypt. neoformans MY1051 Minimale fungicide Kozentration (ug/ml) Hefen Verbindung C&sub1; albicans MY1055 C&sub1; tropicalis MY1012 C&sub1; parapsilosis MY1010 Crypt. neoformans MY1051
Aufgrund der obigen MIC- und MFC-Daten wurde bestimmt, daß allgemein 2 bis 5 mg/kg als Einheitsdosis zur Antipilzbehandlung angewandt werden sollten.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Hemmung des Pilzwachstums im Boden oder in Pflanzenteilen oder in toten Gegenständen, umfassend das Aufbringen einer gegen Pilzbefall wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) auf den Bereich, wo das Wachstum kontrolliert werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Hemmung des Pilzwachstums in einem lebenden Organismus.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf verschiedenen Anwendungsgebieten als Antipilzmittel verwendet werden. Bei einer solchen Anwendung können die Verbindungen mit einem biologisch inerten Träger vermischt werden, allgemein mit Hilfe eines oberflächenaktiven Dispergiermittels, dessen Art variiert, abhängig davon, ob die Verwendung vorgesehen ist zur Bekämpfung von Pathogenen, die Säugetiere, wie Menschen oder Vögel oder Reptilien infizieren, oder zur Bekämpfung von Pilzen in der Landwirtschaft, wie im Boden oder in Pflanzenteilen, oder zur Bekämfpung von Pilzen in toten Gegenständen.
Bei Mitteln für medizinische Anwendungen können die Verbindungen vermischt werden mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, dessen Art davon abhängt, ob das Mittel topisch, parenteral oder oral angewandt werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Mittel, umfassend eine nicht toxische, therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Wenn die Anwendung topisch sein soll, kann das Arzneimittel in übliche Cremes und Salben, wie weiße Vaseline, wasserfreies Lanolin, Cetylalkohol, Cold Cream, Glyceryl-monostearat, Rosenwasser o.ä. eingearbeitet werden.
Für parenterale Verabreichungen können die Verbindungen in übliche parenterale Lösungen, wie 0,85% Natriumchlorid oder 5% Dextrose in Wasser, oder andere pharmazeutisch annehmbare Mittel eingebaut werden.
Mittel zur oralen Verabreichung können hergestellt werden durch inniges Vermischen der Wirkstoffe mit irgendeinem der üblichen pharmazeutischen Medien, umfassend für flüssige Zubereitungen flüssige Träger, Kaolin, Ethylcellulose, oberflächenaktive Dispergiermittel, allgemein mit Gleitmittel wie Calciumstearat, zusammen mit Bindemitteln, Zerfallmitteln u.ä.
Diese Mittel werden dann in Mengen verabreicht, die ausreichen, um die erwünschte Antipilzwirkung zu erzielen. Für medizinische Anwendungen umfaßt das Verfahren die Verabreichung einer gegen Pilzbefall wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf. Die geeigneten Dosen hängen ab vom Alter, der Schwere der Erkrankung, dem Körpergewicht und anderen Bedingungen. Für die topische Anwendung werden die Verbindugnen direkt auf den Bereich aufgebracht, wo die Bekämpfung erwünscht ist. Zur internen Verabreichung, können die Verbindungen durch Injektion oder oral verabreicht werden.
Zur nicht-medizinischen Anwendung kann das erfindungsgemäße Produkt, entweder allein oder als Gemisch, in Mitteln angewandt werden in einem inerten Träger, umfassend feinteilige trockne oder flüssige Verdünnungsmittel, Streckmittel, Füllstoffe, Konditioniermittel und Exzipientien, einschließlich verschiedene Tone, Diatomeenerde, Talkum u.ä. oder Wasser und verschiedene organische Flüssigkeiten wie niedere Alkanole, z.B. Ethanol und Isopropanol, oder Kerosin, Benzol, Toluol und andere Erdölfraktionen oder Gemische davon.
Diese Mittel können angewandt weden durch Aufbringen auf die Oberfläche oder Einbauen in das zu schützende Medium. Zur Bekämpfung von Reisbrand (brusone-Krankheit), Braunfäule von Tomaten, Dörrfleckenkrankheit von Tomaten, Weizenrost, echtem Mehltau von Bohnen und Tomaten-Fusarium-Welkkrankheit können die Mittel bei topischer Anwendung direkt auf die Pflanze aufgebracht oder bei systemischer Anwendung in den Boden eingebracht werden. Das Verfahren umfaßt das Verabreichen einer gegen Pilzbefall wirksamen Menge der Verbindung der Formel I an die befallene Pflanze, den Boden oder das zu schützende Medium.
Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) und ihren Einbau in pharmazeutische Mittel und sind als solche nicht begrenzend für die Erfindung, die in den angefügten Ansprüchen angegeben ist. Die bevorzugte Route zu der Verbindung A ist Beispiel 2.
Die Zusammensetzung der in den folgenden Beispielen angewandten Medien ist unten angegeben. Spurenelemente-Gemisch gelöst in HCl KF-SAAT-MEDIUM pro Liter Maiswasser Tomatenpaste Hafermehl Glucose Spurenelemente-Gemisch pH eingestellt auf 6,8 (presteril) Erlenmeyerkolben ohne Einsätze Autoklav min (ºC, psi) MBM-Produktions-medium Malzextrakt (Difco) Glucose Pepton dest. H&sub2;O (keine pH-Einstellung) Erlenmeyerkolben ohne Einsätze Autoklav min (ºC, psi)

Beispiel 1

Herstellung der Verbindung A

A. Züchtung von MF5453

MF5453-Kultur wurde in KF-Saatmedium geimpft unter Verwendung von einem Glaslöffel des ursprünglichen Bodenrohrs. Der KF-Saatkolben wurde 73 h bei 25ºC, 220 UpM, 85% Feuchte inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden 2,0 ml Anteile aseptisch in jeden Kolben mit 75 MBM Produktionsmedium übertragen. Diese Produktionskolben wurden dann bei 25ºC, 220 UpM, 85% Feuchte inkubiert mit einem Fermentationszyklus von 14 Tagen. Die Kolben wurden wie folgt beerntet: Das Myzelwachstum wurde 20 s mit hoher Geschwindigkeit unter Anwendung eines Biohomogenizer/Mischers (Biospec Products Inc. Bartlesville, Ok) homogenisiert; dann wurden 45 ml Methanol zu jedem Kolben gegeben (Methanol-Endkonzentration etwa 50%). Die Kolben wurden dann wieder in die Schüttelvorrichtung gegeben und 30 min mit 220 UpM bewegt. Anschließend wurde der Inhalt der Kolben zusammengegeben.

B. Isolierung der Verbindung A

Es wurde ein homogenisierter Pilzextrakt in 50% Methanol mit einem pH von 4,5 bei dem folgenden Isolier-Verfahren angewandt. Das Myzel wurde durch Celite filtriert und das gewonnenen Myzel erneut extrahiert durch Bewegen über Nacht mit 3 l 50%igem Methanol und erneut filtriert.
Der kombinierte Auszug (9 l) in 50%igem Methanol wurde mit Wasser auf 25% Methanol verdünnt (Gesamtvolumen 18 l) und auf eine Mitsubishi HP-20-Säule (750 ml) aufgebracht mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/min. Die Säule wurde mit Wasser (1 l) gewaschen und mit einem Stufen-Gradienten von Methanol, bestehend aus 50/50 Methanol/H&sub2;O (1 l), 60/40 Methanol/H&sub2;O (1 l), 80/20 Methanol/H&sub2;O (2 l), 90/10 Methanol/H&sub2;O (1 l), 100% Methanol (2 l) und 100% Aceton (1 l) eluiert. Die Fraktionen von 50/50 bis 90/10 Methanol/H&sub2;O wurden zusammengegeben und mit Wasser auf 35/65 Methanol/H&sub2;O (Gesamtvolumen 10 l) verdünnt.
Die 10 l 35/65 Methanol/H&sub2;O wurden mit 1,0 N HCl (20 ml) auf pH 3,0 angesäuert und in EtOAc (4 l) extrahiert. Die EtOAc- Schicht wurde abgetrennt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt unter Bildung von 260 mg eines orangefarbenen Öls.
Ein Teil (10%) des orangefarbenen Öls wurde in 1 ml Methanol gelöst und mit 0,8 ml 10 mM Kaliumphoosphat (pH 6,5) unter leichter Ausfällung verdünnt. Die Suspension wurde auf eine präparative HPLC-Säule (Whatman Magnum 20 C&sub1;&sub8; 22 mm ID x 25 cm) mit 8 ml/min aufgebracht. Die anfängliche mobile Phase bestand aus 60/40 Methanol/10 mM K&sub3;PO&sub4;, pH 6,5, und nach 20 min wurde die mobile Phase in 60/40 Methanol/10 mM K&sub3;PO&sub4;, pH 6,5, verändert. Es wurden Fraktionen von jeweils 8 ml gesammelt und die Fraktionen von 31 bis 33 min (2) zusammengegeben, mit Wasser auf 35% Methanol verdünnt, mit 10%iger HCl auf pH 3 angesäuert und in EtOAc extrahiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und man erhielt ein klares leicht gelbliches Öl, das als die Titelverbindung identifiziert wurde.

Beispiel 2

Herstellung der Verbindung A

A. Züchtung von MF5453

Ein 250 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 54 ml Saatmedium (KF) wurde mit MF5453 beimpft und 72 h bei 25ºC, 85% Feuchte, 220 UpM inkubiert. 10 ml der Kultur wurden in jeden von 3 2-l Erlenmeyer-Kolben, enthaltend jeweils 500 ml KF-Saatmedium, übertragen. Diese Kolben wurden 44 h bei 25ºC, 85% Feuchte 220 UpM inkubiert. 750 ml der erhaltenen Kultur wurden verwendet, um jeden von 2 22-l Fermentatoren, enthaltend 15 l MBM-Produktionsmedium, zu beimpfen. Die Sterilisationsbedingungen waren wie folgt: 122ºC, 15 psi, 25 min. Der pH-Wert des Mediums nach dem Sterilisieren betrug 5,0. Die Fermentationsbedingungen waren wie folgt: 25ºC bei einer Rührgeschwindigkeit von 300 UpM, einem Luftstrom von 4,5 l/min und einem Rückdruck von 5 psi. Nach 357 h Züchtung unter diesen Bedingungen wurden die Ansätze geerntet.

B. Isolierung der Verbindung A

Es wurden 3 unabhängige Fermentationen (3 l), (10 l) und (10 l) bei dem folgenden Isolierungsverfahren durchgeführt. Die 3 l-Fermentation wurde entsprechend Beispiel 1A durchgeführt und jede der beiden 10 l-Fermentationen entsprechend Beispiel 2A. Jedes Fermentationsgemisch wurde durch Celite filtriert und die Myzele einzeln über Nacht mit 1 l, 3 l bzw. 3 l 50%igem Methanol extrahiert.
Die Filtrate und Auszüge wurden alle zusammengegeben und mit Wasser auf 25% Methanol verdünnt (Gesamtvolumen 45 l). Dises wurde auf eine Mitsubishi HP-20-Säule (1,5 l) mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ml/min aufgebracht. Die Säule wurde dann mit Wasser (4 l) und 40%igem Methanol (6 l) gewaschen. Die Säule wurde dann mit 100% Methanol (6 l) eluiert.
Das 100% Methanol-HP-Eluat wurde mit 10 mM H&sub3;PO&sub4; (6 l, Gesamtvolumen 12 l) verdünnt und in CH&sub2;Cl&sub2; (4 l) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt unter Bildung von 21 g eines gelben Öls.
Das obige Konzentrat wurde in Methanol (500 ml) gelöst und mit 20 mM K&sub3;PO&sub4;, pH 7,0, (500 ml) verdünnt. Diese Lösung wurde auf eine Dowex 1 x 2 (Cl-) Säule (350 ml) mit einer Geschwindigkeit von 25 ml/min aufgebracht. Die Säule wurde mit 50/50 Methanol/Wasser (2 l), 50/50 Methanol/3% NaCl-Lösung (1 l) gewaschen und das Produkt mit 90/10 Methanol/30% wäßriger NH&sub4;Cl- Lösung (2 l) eluiert. Das Methanol/NH&sub4;Cl-Eluat wurde mit 20 mM H&sub3;PO&sub4; (2 l) verdünnt und mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 l) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt unter Bildung eines dicken orangefarbenen Öls.
Ein Teil des orangefarbenen Öls (24 mg) wurde in 1 ml Methanol gelöst und 0,4 ml 10 mM H&sub3;PO&sub4; unter leichter Wolkenbildung zugegeben. Diese Suspension wurde auf eine präparative HPLC- Säule aufgebracht (Whatman Magnum 20 C&sub1;&sub8;, 22 mm ID x 25 cm, mit 8 ml/min, mobile Phase 80/20 Methanol/10 mM H&sub3;PO&sub4;, pH 2,5). Die zwischen 16 und 20 min eluierten Fraktionen wurden zusammengegeben, mit 50 mM H&sub3;PO&sub4; (50 ml) verdünnt und in CH&sub2;Cl&sub2; (2 x 75 ml) extrahiert. Das CH&sub2;Cl&sub2; wurde im Vakuum entfernt und man erhielt ein leicht gelbliches Öl. Dieses Material zeigte ¹H-NMR- und UV-Spektren, die mit denjenigen der nach Beispiel 1 isolierten Verbindung A identisch waren.

Beispiel 3

Als spezielle Ausführungsform eines oralen Mittels einer erfindungsgemäßen Verbindung werden 20 mg der Verbindung des Beispiels 1 mit ausreichend feinteiliger Lactose zubereitet, um eine Gesamtmenge von 580 bis 590 mg zu erhalten, um eine Hartgelatinekapsel der Größe 0 zu füllen.

Beispiel 4

Herstellung eines Ammoniumsalzes

Eine 0,1 mmol Probe der freien Säure der Verbindung (I) wird in 10 ml Ethylacetat gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit gasfärmigem Ammoniak gesättigt, wobei das Ammoniumsalz aus der Lösung ausfällt.

Beispiel 5

Herstellung von Kaliumsalzen

Eine Lösung von 0,1 mmol der freien Säure der Verbindung (I) in 10 ml Methanol wird mit einer wäßrigen oder methanolischen Lösung, enthaltend 0,3 mmol Kaliumhydroxid behandelt. Abdampfen des Lösungsmittels ergibt das Trikaliumsalz. Die Zugabe von 0,1 bis 0,2 mmol Kaliumhydroxid ergibt analog Gemische von Mono-kalium-, Di-kalium- und Tri-kaliumsalzen, dessen Zusammensetzung von der genauen Menge des zugesetzten Kaliumhydroxids abhängt.
Auf ähnliche Weise können die Natrium- und Lithiumsalze der Verbindung (I) gebildet werden.

Beispiel 6

Herstellung eines Calciumsalzes

Eine Lösung von 0,1 mmol der freien Säure einer Verbindung (I) in 20 ml 6:4 Methanol/Wasser wird mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 mmol Calciumhydroxid behandelt. Die Lösungsmittel werden abgedampft und man erhält das entsprechende Calciumsalz.

Beispiel 7

Herstellung eines Ethylendiaminsalzes

Eine Lösung von 0,1 mmol der freien Säure einer Verbindung (I) in 10 ml Methanol wird mit 0,1 mmol Ethylendiamin behandelt. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das Ethylendiaminsalz.

Beispiel 8

Herstellung eines Tris(hydroxymethyl)aminomethansalzes

Zu einer Lösung von 0,1 mmol der freien Säure einer Verbindung der Formel (I) in 10 ml Methanol werden 0,1 bis 0,3 mmol Tris(hydroxymethyl)aminomethan, gelöst in 10 ml Methanol gegeben. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man eine entsprechende Salzform von Verbindung (I), deren genaue Zusammensetzung durch das Molverhältnis des zugesetzten Amins bestimmt wird.
Das Verfahren kann auch auf andere Amine, wie z.B., aber nicht beschränkt auf, Diethanolamin und Diethylamin, angewandt werden.

Beispiel 9

Herstellung eines L-Argininsalzes

Eine Lösung von 0,1 mmol der freien Säure einer Verbindung der Formel (I) in 10 ml 6:4 Methanol/Wasser wird mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 bis 0,3 mmol L-Arginin behandelt. Beim Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das Titelsalz, dessen genaue Zusammensetzung durch das Molverhältnis von Aminosäure zu der freien Säure einer Verbindung der Formel (I) bestimmt wird.
Ähnlich hergestellt werden die Salze von L-Ornithin, L-Lysin und N-Methylglucamin.

Beispiel 10

Herstellung der Verbindung B (Methode 1)

Eine Lösung von 90 mg der Verbindung A in 5 ml Ethylacetat wurde mit einem leichten Überschuß von etherischem Diazomethan behandelt. Nach 5 min wurde überschüssiges Diazomethan entfernt und das Lösungsmittel abgedampft unter Bildung der Verbindung B.

Beispiel 11

Herstellung der Verbindung B

Eine Lösung von 2 mg der Verbindung A in 0,5 ml Acetonitril wurde bei Raumtemperatur mit 10 Äq. DBU und 10 Äq. MeI behandelt. Nach 2 h wurde das Reaktionsgemisch mit 10 ml Dichlormethan verdünnt und nacheinander mit 10 ml 0,1 M Phosphorsäure, 10 ml Wasser, 10 ml gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung und 10 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wurde die organische Schicht eingeengt und der Rückstand über Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus Hexan und Ethylacetat chromatographiert und ergab die Verbindung B.
Die Methode des Beispiels 11 ist auch geeignet zur Herstellung von anderen Ester-Derivaten wie 1) Ethyl- und andere nieder-Alkyl-ester und 2) Benzyl- und substituierte Benzyl-ester.

Daten der Massenspektren

Es wurden Massenspektren aufgenommen mit Finnigan-MAT Modell MAT212 (Elektronenaufschlag, EI, 90 eV), MAT 90 (schneller Elektronenbeschuß, FAB) und TSQ70B (FAB, EI) Massenspektrometern. Es wurden genaue Massen-Bestimmungen bei hoher Auflösung (HR-EI) unter Verwendung von Perfluorkerosin (PFK) oder Perfluorpolypropylenoxid (Ultramark U160F) als interner Standard durchgeführt. Trimethylsilyl-Derivate wurden hergestellt mit einem 1:1 Gemisch aus BSTFA/Pyridin bei Raumtemperatur.

¹³C-NMR-Daten

Das ¹³C-NMR-Spektrum der Verbindung A wurde aufgenommen in CD&sub3;OD bei 100 MHz mit einem Varian XL400 Spektrometer. Die chemischen Verschiebungen sind angegeben in ppm, bezogen auf Tetramethylsilan (TMS) bei 0 ppm, unter Verwendung des Lösungsmittel-Peaks bei 49,0 ppm als interner Standard. Das ¹³C- NMR-Spektrum der Verbindung B wurde aufgenommen bei 75 MHz (Umgebungstemperatur) mit einem Varian XL300 Spektrometer in C&sub6;D&sub6; unter Verwendung des Lösungsmittel-Peaks bei 128,0 ppm als interner Standard.

¹H-NMR-Spektren

Die ¹H-NMR-Spektren wurden aufgenommen bei 400 MHz in CD&sub3;OD und C&sub6;D&sub6; mit einem Varian XL400 Spektrometer. Die chemischen Verschiebungen sind angegeben in ppm, bezogen auf TMS bei 0 ppm, unter Verwendung der Lösungsmittel-Peaks bei 3,30 ppm (CD&sub3;OD) und 7,15 (C&sub6;D&sub6;) als interne Standards.

Physikalische Eigenschaften der Verbindungen der Struktur I.

Verbindung A

- die Verbindung der Struktur (I), in der Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; jeweils Wasserstoff sind.

Daten des Massenspektrums:

Diese Verbindung hat das Molekulargewicht 690 durch FAB-MS (beobachtet [M+H]&spplus; bei m/z 691, und bei Zugabe von Lithiumacetat [M Li&sub3;+Li]&spplus; (d.h. das Lithium-Addukt des Trilithiumsalzes) bei m/z 715). Die Summenformel C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub6;O&sub1;&sub4; wurde bestimmt durch HR-EI-Messung des Pentatrimethylsilyl-Derivats (ber.für C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub6;O&sub1;&sub4; + (SiC&sub3;H&sub8;)&sub5; 1050,4864, gef. 105,4829). Andere kritische Fragment-Ionen wurden wie folgt in dem Silyl-Spektrum beobachtet: [M-AcOH&spplus;, ber.für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub4;O&sub1;&sub3; + (SiC&sub3;H&sub8;)&sub5; 990,4597, gef. 990,4625; C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub5;O&sub1;&sub0; + (SiC&sub3;H&sub8;)&sub4; ber. 749,3015, gef. 749,3022; [M-(CO&sub2;H+(SiC&sub3;H&sub8;)]&spplus;, ber.für C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub5;O&sub1;&sub2; + (SiC&sub3;H&sub8;)&sub4; 933,4458, gef. 933,4450; C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub3;O&sub8; + (SiC&sub3;H&sub8;)&sub4;, ber. 631,2974, gef. 631,2944.
¹H NMR-Spektrum (CD&sub3;OD,40ºC): Siehe Fig.1
¹³C NMR chemische Verschiebungen (CD&sub3;OD, 40ºC): 11,5, 14,3, 19,4, 20,6, 21,0, 26,7, 30,8, 33,3, 35,2, 35,6, 37,9, 41,0, 44,5, 75,8, 76,8, 80,4, 81,3, 82,7, 91,3, 106,9, 111,7, 120,0, 127,0, 129,4 (2x), 130,3 (2x), 141,7, 147,9, 157,6, 166,8, 168,7, 170,3, 172,2, 172,7 ppm.
UV (MeOH) λ max 209 nm ( &epsi; = 36 000)
IR (als freie Säure, Film auf ZnSe): 3400-2500 br., 2960, 2930, 2875, 1745-1700, 1650, 1450, 1375, 1280-1225, 1185, 1135, 1020, 985, 750 und 700 cm&supmin;¹.

Verbindung B

- der Trimethyl-ester der Verbindung A, d.h. die Verbindung der Struktur (I), in der Z&sub1;, Z&sub2; und Z&sub3; jeweils Methyl sind.

Daten des Massenspektrums:

Diese Verbindung hat das Molekulargewicht 732 durch EI-MS und bildet ein Di-(trimethylsilyl)-Derivat. Die Summenformel C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub2;O&sub1;&sub4; wurde direkt bestimmt durch HR-EI-Messung (ber. 732,3357, gef. 732,3329).
¹H-NMRSpektrum (C&sub6;H&sub6;, 22ºC): Siehe Fig.2
¹³C-NMR chemische Verschiebungen (C&sub6;H&sub6;, 75 MHz): 11,3, 14,0, 18,9, 20,2, 20,6, 26,3, 30,0, 32,1, 34,6, 34,7, 37,1, 40,2, 43,3, 51,9, 52,1, 53,3, 75,3, 76,2, 78,8, 82,0, 82,8, 89,8, 106,2, 111,8, 118,8, 126,2, 128,6 (2x), 129,6 (2x), 140,9, 146,6, 157,2, 166,0, 166,5, 167,2, 169,5, 170,3 ppm.

Claims

1. Verbindung der Strukturformel I

wobei

Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus

a) H;

b) C&sub1;-C&sub5;-Alkyl;

c) C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, substituiert mit einen Substituenten der Gruppe

i) Phenyl,

ii) Phenyl, substituiert mit Methyl, Methoxy, Halogen (Cl, Br, I, F) oder Hydroxy, oder

ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel (I), in der mindestens einer der Reste Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; Wasserstoff ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die relative Konfiguration der Strukturformel (I)

3. Verbindung nach Anspruch 2, der Formel

4. Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, in der Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; jeweils Wasserstoff bedeuten, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

5. Verbindung nach Anspruch 2 oder 3, in der Z&sub1;, Z&sub2;, und Z&sub3; jeweils Methyl bedeuten.

6. Verbindung nach Anspruch 1 mit den folgenden Spektral-Daten:

¹³C NMR, chemische Verschiebungen (CD&sub3;OD, 40ºC): 11,5, 14,3, 19,4, 20,6, 21,0, 26,7, 30,8, 33,3, 35,2, 35,6, 37,9, 41,0, 44,5, 75,8, 76,8, 80,4, 81,3, 82,7, 91,3, 106,9, 111,7, 120,0, 127,0, 129,4 (2x), 130,3 (2x), 141,7, 147,9, 157,6, 166,8, 168,7, 170,3, 172,2, 172,7 ppm;

UV (MeOH) λ max 209 nm (&epsi; = 36 000)

IR (als freie Säure: Film auf ZnSe): 3400-2500 br, 2960, 2930, 2875, 1745-1700, 1650, 1450, 1375, 1280-1225, 1185, 1135, 1020, 985, 750 und 700 cm&supmin;¹.

7. Verbindung nach Anspruch 1 mit den folgenden Spektral-Daten:

¹³C NMR, chemische Verschiebungen (C&sub6;D&sub6;, 75 MHz): 11,3, 14,0, 18,9, 20,2, 20,6, 26,3, 30,0, 32,1, 34,6, 34,7, 37,1, 40,2, 43,3, 51,9, 52,1, 53,3, 75,3, 76,2, 78,8, 82,0, 82,8, 89,8, 106,2, 111,8, 118,8, 126,2, 128,6 (2x), 129,6 (2x), 140,9, 146,6, 157,2, 166,0, 166,5, 167,2, 169,5, 170,3 ppm.

8. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine nicht-toxische wirksame Menge einer Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

9. Kultur von MF5453 (ATCC 20986) oder einer aktiven Mutante davon, die in der Lage ist, eine Verbindung der Struktur

in gewinnbaren Mengen zu bilden.

10. Verfahren zur Herstellung einer Struktur

umfassend die Züchtung von MF5453 (ATCC 20986) oder einer aktiven Mutante davon, in einem wäßrigen Nährmedium, enthaltend Quellen für assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff, und Gewinnung der Verbindung.

11. Verfahren zur Hemmung des Pilzwachstums im Boden oder in Pflanzenteilen oder in unbelebten Objekten, umfassend das Aufbringen einer gegen Pilze wirksamen Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 auf den Bereich, auf dem das Wachstum kontrolliert werden soll.

12. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Pilzwachstums in einem lebenden Organismus.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hypercholesterinämie.