DE69034009T2

DE69034009T2 - Fruchtknotentranskriptionsfaktoren

Info

Publication number: DE69034009T2
Application number: DE69034009T
Authority: DE
Inventors: Catherine M. Houck; Belinda Martineau
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-07-19
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2010-07-20
Also published as: IL95131A0; WO1991001324A1; ES2185614T3; ATE226251T1; DE69034009D1; EP0409629A1; EP0409629B1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft in-vitro-konstruierte Transkriptions- oder Expressionskassetten, die zur Lenkung der Fruchtknotengewebe-Transkription in Pflanzen in einem sehr frühen Stadium der Fruchtentwicklung fähig sind. Die Erfindung wird durch Promotoren exemplifiziert, die zur Fruchtknotengewebe-Transkription eines Gens von Interesse in einer Tomatenpflanze dienen.

Hintergrund

Im Allgemeinen haben Gentechnologie-Verfahren auf die Modifizierung des Phänotyps einzelner prokaryotischer und eukaryotischer Zellen, insbesondere in Kultur abgezielt. Pflanzenzellen haben sich als unbeständiger als andere eukaryotische Zellen erwiesen, nicht nur aufgrund des Fehlens geeigneter Vektorensysteme, sondern auch als Ergebnis der verschiedenen angestrebten Ziele. Für viele Anwendungen ist es wünschenswert, in der Lage zu sein, die Genexpression in einer bestimmten Stufe des Pflanzenwachstums oder in einem speziellen Pflanzenteil zu steuern. Zu diesem Zweck sind regulatorische Sequenzen erforderlich, welche die gewünschte Initiation der Transkription in den geeigneten Zelltypen und/oder zur geeigneten Zeit in der Pflanzenentwicklung liefern, ohne ernsthaft nachteilige Auswirkungen auf die Pflanzenentwicklung und Produktivität zu haben. Es ist daher von Interesse, zur Isolierung von Sequenzen in der Lage zu sein, die dazu verwendet werden können, die gewünschte Regulation der Transkription in einer Pflanzenzelle während des Wachstumszyklus der Wirtspflanze zu erzielen. Ein Aspekt dieses Interesses ist die Fähigkeit, den Phänotyp der Frucht, sowohl der sukkulenten als auch der trockenen Frucht, zu verändern, sodass verbesserte Speise- und Nicht-Speise- Qualitätsaspekte, einschließlich Proteinzusammensetzung, Lagerung, Handhabung, Kochen, organoleptische Eigenschaften, Einfrieren, Nährwert und dergleichen bereitgestellt werden. Vergrößerte Früchte oder Früchte mit erhöhtem prozentuellem Feststoffanteil sind weitere Beispiele für erwünschte modifizierte Phänotypen.
Um jedoch erwünschte phänotypische Veränderungen zu bewirken, werden Transkriptionsinitiationsregionen benötigt, die nur zur Transkriptionsinitiation während der frühen Fruchtentwicklung fähig sind. Beispielsweise wäre es wünschenswert, vor dem Beginn der Pollenbildung zusätzliche Zellteilungen zu induzieren und diese Wirkung abklingen oder gar enden zu lassen, bevor Fruchtvergrößerung, Gewebereifung oder dergleichen auftreten, sodass vermehrt Feststoffe im reifen Gewebe oder größeres, reifes Gewebe, insbesondere der Frucht bereitgestellt werden.

Relevante Literatur

Eine Klasse von bei oder während der Anthese bis zur Fruchtentwicklung zumindest bis zum Beginn der Reifung exprimierten fruchtspezifischen Promotoren wird in der Europäischen Anmeldung Nr. 88.906296.4, veröffentlicht als WO 88/09334 diskutiert.
cDNA-Klone von Tomaten mit differentieller Expression während der Fruchtentwicklung sind isoliert und charakterisiert worden (Mansson et al., Mol. Gen. Genet. 200, 356-361 (1985); Slater et al., Plant Mol. Biol. 5, 137-147 (1985)). Diese Studien konzentrierten sich in erster Linie auf mRNAs, die sich während der Fruchtreifung anreichern. Eines dieser durch die reifungsspezifischen cDNAs kodierten Proteine ist als Polygalacturonase identifiziert worden (Slater et al., Plant Mol. Biol. 5, 137-147 (1985)). Ein cDNA- Klon, der für Tomaten-Polygalacturonase kodiert, ist sequenziert worden (Grierson et al., Nucleic Acids Research 14, 8395-8603 (1986)). Verbesserungen von Aspekten der Tomatenfruchtlagerung und -handhabung durch transkriptionelle Manipulation der Expression des Polygalacturonase-Gens sind berichtet worden (Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8805-8809; Smith et al., Nature 334, 724-726 (1988)). Reife PlastidmRNA für psbA (eine der Komponenten des Fotosystems II) erreicht ihren höchsten Level spät in der Fruchtentwicklung, wogegen nach dem Beginn der Reifung die PlastidmRNAs für andere Komponenten von Fotosystem I und II in Chloroplasten auf nicht detektierbare Level sinken (Piechulla et al., Plant Molec. Biol. 7, 367-376 (1986)). Kürzlich sind auch cDNA-Klone isoliert und charakterisiert worden, die Gene verkörpern, die of fenbar an Tomaten-Pollen-(McCormick et al., Tomato Biotechnology, Allan R. Liss Inc., NY (1987)) und -Stempel-(Gasser et al., Plant Cell 1, 15-24 (1889)) Wechselwirkungen beteiligt sind.
Andere Studien haben sich auf induzierbar regulierte Gene konzentriert, z. B. Gene, die für Serinprotease-Inhibitoren kodieren, die als Reaktion auf Verwundung in der Tomate exprimiert werden (Graham et al.,). Biol. Chem. 260, 6555-6560 (1985); Graham et al., J. Biol. Chem. 260, 6561-6554) und auf mRNA, die mit der Ethylensynthese in reifender Frucht und Blättern nach Verwundung (Smith et al., Planta 168, 94-100 (1986) in Beziehung stehen. Über die Anreicherung eines Metallocarboxypeptidase-Inhibitorproteins in Blättern von verwundeten Kartoffelpflanzen ist berichtet worden (Graham et al., Voiochem & BioPhys-Res Comm. 101, 1164-1170 (1981)).
Die Transformation von kultivierten Tomaten ist von McCormick et al., Plant Cell Reports 5, 81-89 (1986), und Fillatti et al., Bio/Technology 5, 726-730 (1987), beschrieben worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein DNA-Transkriptionskonstrukt bereitgestellt, das den Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der am etwa 1,8 kb-Fragment SalI-nach-NcoI, dargestellt als Nucleotide 808-2641 in der Genomsequenz aus Fig. 2 vorhanden ist, wobei der besagte Promotor in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verknüpft ist, die nicht die Wildtyp-Sequenz ist, wodurch diese DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle des besagten Promotors steht.
Ebenfalls bereitgestellt werden hierin mit solchen Konstrukten transferierte Pflanzenzellen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Pflanze bereitgestellt, die im Wesentlichen aus Zellen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das besagte Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor, der am etwa 1,8 kb-Fragment SalI-nach-NcoI, dargestellt als Nucleotide 808-2641 in der Genomsequenz aus Fig. 2 vorhanden ist, in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verknüpft ist, die nicht die Wildtyp-Sequenz ist und unter der Regulationskontrolle des besagten Promotors steht und eine Transkriptionsterminationsregion umfasst.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird eine modifizierte Frucht bereitgestellt, die im Wesentlichen aus Zellen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das besagte Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor, der am etwa 1,8 kb-Fragment SalI-nach-NcoI, dargestellt als Nucleotide 808-2641 in der Genomsequenz aus Fig. 2 vorhanden ist, in Transkriptionsrichtung mit einer fruchtmodifizierenden DNA-Sequenz von Interesse verknüpft ist, die nicht die Wildtyp-Sequenz ist und unter der Regulationskontrolle des besagten Promotors steht und eine Transkriptionsterminationsregion umfasst.
Auf diese Weise kann die Modulation endogener Fruchtprodukte ebenso wie die Produktion exogener Produkte erzielt werden. Die Verfahren und Konstrukte finden Anwendung bei der Modifizierung des Phänotyps von Frucht und Fruchtprodukten, die Konstrukte finden auch als molekulare Sonden Verwendung.

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist die DNA-Sequenz des cDNA-Klons pT130. Die dem pZ7-cDNA-Klon entsprechenden Sequenzen sind unterstrichen.
Fig. 2 ist die Sequenz derjenigen Region des genomischen Calgene-Lamda-140-Klons, die mit dem pZ130-cDNA-klon überlappt (diese Region ist unterstrichen) und eine Teilsequenz der Regionen 5' und 3' zu dieser Region. Der Startpunkt des pZ130-Gentrans kripts ist durch das unterstrichene, fettgedruckte "A" an Position 2567 bezeichnet. Ein Intron in der Gensequenz ist durch die Kleinbuchstaben-Sequenz von Position 2702 bis Position 2921 bezeichnet. Stellen für herkömmliche Restriktionsenzyme sind angezeichnet.
Die Symbole in der Sequenz haben die folgende Bedeutung:
A = Adenosin
C = Cytosin
G = Guanin
T = Tyrosin oder Uracil
R = A oder G
Y = C oder T oder U
M = C oder A
K = T oder U oder G
W = T oder U oder A
S = C oder G
N = entweder C, T, A, G oder U
B = nicht A
D = nicht C
H = nicht G
V = nicht T oder U
Fig. 3 ist eine Restriktionskarte von Calgene-Lamda-140. B: BamHI; G: BgIII; HindIII; R: EcoRI; S. SalI.
Fig. 4 ist eine vollständige DNA-Sequenz des cDNA-Klons pZ70. Die dem pZ8-cDNA- Klon entsprechende Sequenz ist unterstrichen. Start- und Endpunkt des durch das pZ70- Gen kodierten, reifen Proteins sind ebenfalls angezeichnet.
Fig. 5 ist eine Restriktionskarte von Calgene-Lamda-116. B: BamHI; G: BgIII; H: HindiII; P: SphI; R: EcoRI; S. SalI; X: XbaI.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Northern-Blot-Experiments, das einen Entwicklungs- Zeitverlauf der pZ7- und pZ8-RNA-Anreicherung veranschaulicht. Die Stadien der UC82B-Fruchtentwicklung (Blüten und Fruchtknoten/Frucht) sind oben dargestellt. Die Zahlen 1 bis 21 geben die Tage nach der Blütenöffnung an.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Neue DNA-Konstrukte werden beschrieben, die als molekulare Sonden verwendet oder in eine Wirtspflanze insertiert werden können, um die im Vergleich zu anderen Pflanzengeweben bevorzugte Transkription eines Gens von Interesse in Fruchtknotengewebe bereitzustellen, und zwar zumindest ein bis drei Tage vor der Anthese bis zum Altwerden der Blüten. Die DNA-Konstrukte umfassen Transkriptionsinitiations-Regulationsregionen, die mit der Genexpression im Fruchtknotengewebe assoziiert sind. Die Regulationsregionen sind in der Lage, die Transkription in Fruchtknoten von der Anthese bis zur Blüte zu lenken, lenken jedoch kaum oder nicht die Expression nach den anfänglichen Veränderungen, die zur Zeit um die Bestäubung und/oder Befruchtung herum auftreten; die Transkription aus diesen Regulationssequenzen ist zum Zeitpunkt von etwa drei Wochen nach Anthese nicht detektierbar. Fruchtknotengewebe-Transkript-Initiationsregionen dieser Erfindung sind typischerweise in anderen Pflanzengeweben nicht leicht detektierbar. Trotzdem können fruchtknotenspezifische Transkriptionsinitiationsregionen spezielle Anwendung finden.
Speziell bevorzugt sind Transkriptionsinitiationsregionen, die in anderen Stadien der Fruchtentwicklung nicht zu finden sind. Transkriptionsinitiationsregionen, die in der Lage sind, die Transkription in anderen Pflanzengeweben und/oder in anderen Stadien der Fruchtknotenentwicklung zu initiieren, sind zusätzlich zu den vorangegangenen insofern annehmbar, als solche Regionen signifikante Expressionslevel in Früchtknotengewe be zu den definierten Zeiträumen von Interesse bereitstellen und die Pflanze als Ganzes und insbesondere die Entwicklung der Frucht und/oder anderer Teile nicht negativ beeinflussen. Ebenfalls von Interesse sind Fruchtknotengewebe-Promotoren und/oder Promotor-Elemente in der Lage sind, die Transkription in speziellen Fruchtknotengeweben, wie z. B. äußeres Fruchthüllengewebe, innere Kerngewebe, Integumente und dergleichen zu lenken.
Eine in Fruchtknotengewebe bevorzugt exprimierte Transkriptionskassette umfasst in 5' → 3'-Transkriptionsrichtung eine Fruchtknotengewebe-Transkriptionsinitiationsregion und optional eine Translationsinitiationsregion, eine DNA-Sequenz von Interesse und eine Transkriptions- und optional eine Translationsterminationsregion, die in einer Pflanzenzelle funktionstüchtig ist. Wenn die Kassette die Transkription und Translation einer DNA-Sequenz von Interesse bereitstellt, wird sie als Expressionskassette angesehen. Ein oder mehrere Intron(s) kann/können ebenfalls vorhanden sein. Zur Verwendung in der gegenständlichen Erfindung werden Transkriptionsinitiationsregionen bevorzugt, die im Fruchtknotengewebe bei maximalem oder nahezu maximalem Level während des Zeitraums von Interesse dieser Erfindung, im Allgemeinen während der Blüteperiode von Pflanzenvermehrungszyklen, exprimiert werden. Die Transkriptionslevel sollte ausreichen, um eine RNA-Menge bereitzustellen, die eine modifizierte Frucht liefert. Der Begriff "Frucht" betrifft wie hierin verwendet das reife Organ, das als Ergebnis der Entwicklung der Fruchtwand einer Blüte und jeder anderen eng assoziierten Teile gebildet wird. Siehe T. E. Weirer (Hrsg.), "Botany - A Introduction to Plant Biology", 2. Ausg., John Wiley & Sons (1982); Tootill & Blackmore, "The Facts on File Dictionary of Botany", Market Home Books Ltd. (1984). Mit "modifizierter Frucht" ist eine Frucht mit einem Phänotyp gemeint, der sich von einer nicht transformierten Pflanze derselben Spezies, beispielsweise einer Pflanze, die in ihrem Genom die besagte Transkriptionskassette nicht aufweist, phänotypisch detektierbar unterscheidet.
Bezüglich der Transkriptions- und Translationsinitiationsregion (manchmal auch als "Promotor" bezeichnet) umfasst sie vorzugsweise eine Transkriptionsinitiations-Regula tionsregion und eine Translationsinitiations-Regulationsregion von 5'-untranslatierten Sequenzen, "Ribosombindungsstellen", die zur Bindung von mRNA an Ribosomen und Transiationsinitiation verantwortlich sind. Es wird bevorzugt, dass alle der transkriptions- und translationsfunktionalen Elemente der Initiationskontrollregion vom selben Gen abgeleitet oder erhältlich sind. In einigen Ausführungsformen wird der Promotor durch Addition von Sequenzen, wie z. B. Enhancern, oder Deletionen von nicht essentiellen und/ oder unerwünschten Sequenzen modifiziert. Mit "erhältlich" ist ein Promotor mit einer Sequenz gemeint, die der eines nativen Promotors hinreichend ähnlich ist, um die gewünschte Spezifität der Transkription einer DNA-Sequenz von Interesse zu liefern. Er umfasst natürliche und synthetische Sequenzen sowie Sequenzen, die eine Kombination von synthetischen und natürlichen Sequenzen sein kann.
Von besonderem Interesse sind Transkriptionsinitiationsregionen, die mit Genen assoziiert sind, die in Fruchtknotengewebe exprimiert werden und die zur Lenkung der Transkription zumindest 24 Stunden vor Anthese bis zum Altwerden der Blüte fähig sind. Der Begriff "Anthese" betrifft hierin den mit Blütenöffnung und Blütezeit assoziierten Zeitraum. Der Ausdruck "Altwerden der Blüte" betrifft hierin den mit dem Absterben der Blüte assoziierten Zeitraum, einschließlich dem Verlust der (Blüten-) Petalen usw.; M. Abercrombie et al., "A Dictionary of Biology", 2. Ausg., Penguin Books (1973). Geschlossene Blüten oder Knospen werden als "Prä-Anthese" betrachtet. Die Anthese beginnt mit der Öffnung der Blüten-Petalen; die einen sexuell empfänglichen Teil des Fortpflanzungszyklus der Pflanze darstellt. Typischerweise dauert die Blüte in der getesteten UCB82-Tomatensorte etwa eine Woche an. Es wird bevorzugt, dass die Transkriptionsinitiationsregionen dieser Erfindung die Transkription für eine signifikante Zeit oder in einem signifikanten Ausmaß vor der Pflanzenblütenknospung nicht initiiert. Idealerweise ist der Transkriptionslevel für zumindest etwa ein bis drei Tage hoch und umfasst den Anthesebeginn ("Perianthese").
Es ist darüber hinaus erwünscht, dass die Transkriptionsinitiationsregionen dieser Erfindung innerhalb von 1-3 Tagen nach Anthesebeginn einen herabgesetzten Level der Transkriptionsaktivität zeigen, der im Zeitablauf nicht ansteigt und vorzugsweise absinkt. Die Befruchtung eines Tomatenembryosacks zur Erzeugung der Zygote, welche die Embryopflanze bildet, tritt typischerweise 2-3 Tage nach Blütenöffnung auf. Dies deckt sich mit einer Abnahme der Aktivität einer Transkriptionsinitiationsregion dieser Erfindung. Folglich ist es erwünscht, dass die Transkriptionsaktivität des Promotors dieser Erfindung innerhalb von zwei Tagen nach Anthesebeginn signifikant abnimmt. Transkriptionsinitiationsregionen dieser Erfindung sind in der Lage, die Expression im Fruchtknotengewebe bei signifikanten Expressionsleveln während der oben beschriebenen, bevorzugten Zeiträume zu lenken.
In einigen Ausführungsformen ist es wünschenswert, die Transkription in bestimmtem Fruchtknotengewebe selektiv zu regulieren. Wenn in Verbindung mit einer untranslatierten, zur Translationsinitiation fähigen 5'-Sequenz verwendet, kann die Expression in definiertem Fruchtknotengewebe, einschließlich Fruchtknoten-Integumenten (auch bekannt als "Ovarienepidermiszellen"), Kern- oder Fruchtwandgewebe und dergleichen eine gewünschte, durch eine DNA-Sequenz von Interesse kodierte Nachricht in einem bestimmten Gewebe lenken, um eine gewünschte phänotypische Modifikation effizienter zu bewirken. Beispielsweise könnte die Expression in Fruchtknotenwandgewebe, auch bekannt als Fruchtwand und/oder Fruchtknotenkerngewebe, nützliche Modifikationen der essbaren Teile vieler Früchte liefern, wie etwa bei echten Beeren, wie z. B. Tomate, Wein, Heidelbeere, Preiselbeere, Johannisbeere und Aubergine; Steinfrüchten, wie z. B. Kirsche, Pflaume, Aprikose, Pfirsich, Nektarine und Avocado; und Sammelsteinfrüchten, wie z. B. Himbeere und Brombeere. Bei Hesperiden (Orangen, Zitrusfrüchten) wird die Expression solcher Expressionskassetten im "saftigen" Teil der Frucht erwartet. Bei Pepos (wie z. B. Wassermelone, Kantalupe, Honigmelone, Gurke und Kürbis) sind die entsprechenden Gewebe höchstwahrscheinlich die inneren, essbaren Teile. Bei anderen Früchten, wie z. B. Hülsenfrüchten, ist das entsprechende Gewebe die Samenschote.
Die Modifikation der analogen Strukturen einer nicht essbaren Frucht kann auch von Interesse sein. Folglich sind Transkriptionsinitiationsregionen von speziellem Interesse, die zumindest im äußeren Fruchtwandgewebe des Fruchtknotens exprimierbar sind. Beispielsweise ist in Baumwolle die Klette der Baumwollsamenkapsel die analoge Fruchtknotenstruktur, oder die Samenschote des Rübsamens. Auf ähnliche Weise kann die Regulation der Expression in Fruchtknoten-Integumenten und/oder Kerngewebe nützliche Modifikationen der entsprechenden, sich daraus entwickelnden, fruchtbezogenen Strukturen liefern.
Um eine speziell hergeleitete Transkriptionsinitiationsregion zu erhalten, können die folgenden Schritte angewendet werden. Messenger-RNA (mRNA) wird beispielsweise aus Gewebe des gewünschten Entwicklungsstadium isoliert. Diese mRNA wird dann verwendet, um cDNA-Klone zu konstruieren, die bezüglich der DNA-Primärsequenz der Klone sowie bezüglich der Abundanz verschiedener Klone in der Population der mRNA-Population entsprechen. mRNA wird auch aus Gewebe eines anderen Entwicklungsstadiums isoliert, in dem das Target-Gen nicht exprimiert werden sollte (alternatives Gewebe). Radiaktive cDNA aus dem gewünschten Gewebe und aus dem alternativen Gewebe wird verwendet, um auf Doppelkopien der cDNA-Klone zu screenen. Der vorläufige Screen erlaubt die Klassifizierung der cDNA-Klone als jene, die mRNAs entsprechen, die in beiden Geweben abundant sind; jene die mRNAs entsprechen, die in keinem der beiden Gewebe abundant sind, jene, die in einem der Gewebe abundant sind und im anderen vergleichsweise nicht abundant sind. Es werden dann Klone ausgewählt, die mRNAs entsprechen, die nur im gewünschten Gewebe abundant sind und dann näher charakterisiert.
Da die Hybridisierungssonde für den oben umrissenen, vorläufigen Screen Gesamt- cDNA aus einem bestimmten Gewebe ist, hybridisiert sie in erster Linie an die am meisten abundanten Sequenzen. Um den tatsächlichen Expressionslevel zu bestimmen, insbesondere in Gewebe, wo die mRNA nicht so abundant ist, muss die klonierte Sequenz als Hybridisierungssonde gegen die gesamte(n) mRNA-Population(en) des/der gewünsch ten Gewebe(s) und des/der verschiedenen, unerwünschten Gewebe(s) verwendet werden. Dies erfolgt am häufigsten als Northern-Blot, der Informationen über die relative Abundanz der mRNA in bestimmten Geweben, sowie die Größe des mRNA-Transkripts liefert.
Es ist wichtig zu wissen, ob die Abundanz der mRNA auf der Transkription aus einem einzelnen Gen beruht oder ob sie das Produkt der Transkription aus einer Genfamilie ist. Dies kann durch Sondierung eines genomischen Southern-Blots mit dem cDNA-Klon ermittelt werden. Genomische Gesamt-DNA wird mit einer Reihe von Restriktionsenzymen verdaut und mit dem radioaktiven cDNA-Kion hybridisiert. Aus Muster und Intensität der Hybridisierung kann man zwischen den Möglichkeiten unterscheiden, dass die mRNA durch ein oder zwei oder einer großen Familie verwandter Gene kodiert wird. Es kann schwierig sein zu bestimmen, welches der mehreren kreuzhybridisierenden Gene für die im gewünschten Gewebe auftretende, abundant exprimierte mRNA kodiert. Für das Beispiel pZ130, dessen Tests darauf hinweisen (siehe Beispiel 4), dass es ein Mitglied einer kleinen Genfamilie ist, ist jedoch die p27-Sonde in der Lage, pZ130 von den restlichen Familienmitgliedern zu unterscheiden.
Die wie beschrieben erhaltene cDNA kann sequenziert werden, um den offenen Leserahmen (wahrscheinliche Protein-kodierende Region) und die Transkriptionsrichtung zu bestimmen, sodass eine gewünschte Target-DNA-Sequenz später an der richtigen Stelle und in der richtigen Orientierung in eine Expressionskassette insertiert werden kann. Sequenzinformation für den cDNA-Klon erleichtert auch die Charakterisierung der entsprechenden genomischen Klone, einschließlich der unten beschriebenen Kartierung und Subklonierung. Gleichzeitig kann eine Genom-Bibliothek auf Klone gescreent werden, welche die vollständige Gensequenz, einschließlich die die transkribierenden Sequenzen flankierende Kontrollregion enthalten. Genomische Klone enthalten im Allgemeinen große DNA-Segmente (etwa 10-20 kb) und können mittels Restriktionsenzymen kartiert, subkloniert und teilweise sequenziert werden, um zu ermitteln, welche Segmente das entwicklungsregulierte Gen enthalten.
Unter Verwendung von Restriktionsenzymkarte und Sequenzinformation können Plasmide entworfen und konstruiert werden, die das mutmaßliche Fruchtknotengen oder andere erwünschte Promotorregionen aufweisen, die an Gene geknüpft sind, die im Fruchtknoten und/oder anderem gewünschten Gewebe exprimiert werden sollen. Diese Hybrid-Konstruktionen werden hinsichtlich ihres Expressionsmusters in transformierten, regenerierten Pflanzen getestet um sicherzustellen, dass der/die gewünschte(r) Zeitablauf und/oder Gewebeexpression und/oder Gesamt-Expressionslevel erfolgreich aufrechterhalten worden ist, wenn der Promotor nicht mehr mit dem nativen offenen Leserahmen assoziiert ist. Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens sind mehrere Transkriptionsregulationsregionen identifiziert worden. Ein Beispiel ist die von der Tomate hergeleitete Transkriptionsinitiationsregion, welche die Expression der Sequenz reguliert, die dem pZ130-cDNA-Klon entspricht. An den pZ130-Klon hybridisierbare Sequenzen, zum Beispiel Sonde pZ7, zeigen abundante mRNA, besonders in den Frühstadien der Anthese. Mit "hybridisierbar" sind Sequenzen gemeint, die unter geeignet stringenten Bedingungen zumindest etwa 60% Homologie zwischen Sonde und dem cDNA- Klon von Interesse aufweisen. Die Nachricht wird in Fruchtknoten-Integument und äußerem Fruchtknotenwandgewebe exprimiert und wird in anderen Geweben oder anderen Stadien der Fruchtentwicklung nicht exprimiert oder ist zumindest nicht leicht detektierbar. Folglich wird die pZ130-Transkriptionsinitiationsregion als fruchtknotenspezifisch im Sinne der Erfindung betrachtet. Fig. 1 stellt die DNA-Sequenz des cDNA-Klons pZ130 bereit. Die natürliche Funktion der durch das pZ130 enthaltende Strukturgen kodierten Aminosäuresequenz ist unbekannt.
Ein zweites Beispiel ist eine von der Tomate hergeleitete Fruchtknotengewebe-Transkriptionsinitiations-Kontrollregion, die abundante mRNA in Fruchtknoten, die aus ungeöffneten Blüten hergestellt wurden, keine detektierbare mRNA in der reifenden Frucht, jedoch unerwarteterweise erhöhte mRNA in Reaktion auf Tomatenblatt-Verwundung aufweist. An den pZ70-Klonhybridisierbare Sequenzen weisen hohe Expressionslevel und Gewebeselektivität in Fruchtknotengewebe auf. Wenn Prä-Anthese-Tomatenfruchtknoten an Sense- und Antisense-RNA-Sequenzen hybridisiert werden, hybridisiert die Antisense-Sonde spezifisch an die innere Kernregion des Fruchtknoten und die äußere Region der Samenanlagen (der Integumenten). Als Ergebnis der erhöhten Expression als Reaktion auf Blattverwundung, kann die Transkriptionsinitiationsregion von pZ70 auch als Wunden-induzierbarer Promotor Verwendung finden.
Andere Komponenten der Transkriptionskassette sind die folgenden. Stromab der und unter regulatorischer Kontrolle der Transkriptions-/Translationsinitiations-Kontrollregion des Fruchtknotengewebes befindet sich eine DNA-Sequenz von Interesse, die die Basis für die Modifikation des Phänotyps derjenigen Strukturen schafft, die aus dem Fruchtknotengewebe zur Reifung gelangen, wie z. B. die Frucht. Die DNA-Sequenz kann ein offener Leserahmen sein, der für ein Peptid von Interesse, zum Beispiel ein Enzym oder eine zu einer genomische Sequenz komplementäre Sequenz kodiert, worin die genomische Sequenz ein offener Leserahmen, eine nicht kodierende Leadersequenz oder jede andere Sequenz sein kann, wo die komplementäre Sequenz die Transkription, Messenger-RNA-Prozessierung, beispielsweise Spleißung oder Translation inhibiert. Eine solche phänotypische Modifikation kann durch Modulieren der Produktion irgendeines endogenen Produkts, zum Beispiel über die Menge, relative Verteilung oder dergleichen, oder eines exogenen Expressionsprodukts erzielt werden, zum Beispiel um darin eine neue Funktion oder neue Produkte bereitzustellen. Von besonderem Interesse sind DNA-Sequenzen, die für Expressionsprodukte kodieren, die mit der Entwicklung der Pflanzenfrucht assoziiert sind, einschließlich Gene, die am Metabolismus von Cytokininen, Ethylen, Abscisinsäure und dergleichen beteiligt sind. Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulation der Cytokinin-Expression werden beschrieben in der laufenden USSN 382.802, eingereicht am 19. Juli 1989 und in der Europäischen Anmeldung Nr. 90307925.9 der Erfinder, gleichzeitig eingereicht und als EP-A-409.628, wovon hierin eine Kopie eingereicht wird. Alternativ dazu können verschiedene Gene aus anderen Quellen, einschließlich anderen eukaryotischen und prokaryotischen Quellen, einschließlich Bakterien verwendet werden, wie z. B. jene aus Agrobacterium tumefaciens für biosynthetische T-DNA-Cytokinin-Genprodukte und aus Säugetieren, zum Beispiel Interferon.
Eine Expressionskassette umfasst ferner eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion. Die anzuwendende Terminationsregion wird in erster Linie eine bequem anzuwendende sein, da Terminationsregionen relativ austauschbar zu sein scheinen. Die Terminationsregion kann nativ zur Transkriptionsinitiationsregion, nativ zur DNA- Sequenz von Interesse oder aus einer anderen Quelle hergeleitet sein. Bequeme Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens erhältlich, wie z. B. die Octopinsynthase- und Napolinsynthase-Terminationsregionen. In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, die 3'-Terminationsregion zu verwenden, die zur Transkriptionsinitiationsregion des Fruchtknotengewebes nativ ist.
In Abhängigkeit von der Art und Weise der Einführung der Transkriptionskassette in die Pflanze können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation von Pflanzenzellen wie unten beschrieben verwendet wird, werden zumindest die rechte Begrenzung und häufig beide, die rechte und die linke Begrenzung der T-DNA das Ti- oder Ri-Plasmids als flankierende Regionen des Transkriptionskonstrukts verknüpft. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen ist ausführlich untersucht worden und wird in EP-A-120.516; von Hoekema, "The Binary Plant Vector System", Kapitel V, Offset-drukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985); Knauf et al., "Genetic Analysis of Host Range Expression by Agrobacterium", "Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction", A. Puhler (Hrsg.), Springer-Verlag, NY, S. 245 (1983); und An et al., EMBO J. 4, 277-284 (1985); beschrieben.
Alternativ dazu können zur Verstärkung der Integration in das Pflanzengenom terminale Wiederholungen von Transposons als Begrenzungen in Verbindung mit einer Transposase verwendet werden. Unter diesen Umständen sollt die Expression der Transposase induzierbar sein, sodass das Transkriptionsprodukt, wenn es einmal in das Genom integriert ist, relativ stabil integriert sein sollte.
Die verschiedenen Konstrukte werden normalerweise zur Selektion in Pflanzenzellen an einen Marker geknüpft. Zweckdienlicherweise kann der Marker Resistenz gegen ein Biozid, insbesondere ein Antibiotikum, wie z. B. Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol, oder dergleichen sein. Der jeweilig angewendete Marker ist üblicherweise einer, der die Selektion von transformierten Zellen im Gegensatz zu Zellen erlaubt, denen die eingeführte DNA fehlt. Komponenten der DNA-Konstrukte, die Transkriptionskassetten dieser Erfindung umfassen, können aus Sequenzen hergestellt werden, die dem Wirt nativ (endogen) oder fremd (exogen) sind. Mit fremd ist gemeint, dass die Sequenz im Wildtyp-Wirt, in den das Konstrukt eingeführt wird, nicht auftritt. Heterologe Konstrukte enthalten zumindest eine Region, die von einem Gen hergeleitet ist, das von jenem verschieden ist, aus dem die Fruchtknotengewebe-Transkriptionsinitiationsregion hergeleitet ist.
Die DNA-Sequenzen dieser Erfindung können synthetisch, natürlich hergeleitet oder eine Kombination davon sein. Abhängig vom Charakter der DNA-Sequenz von Interesse kann es wünschenswert sein, die Sequenz mit pflanzenbevorzugten Codons zu synthetisieren. Die pflanzenbevorzugten Codons können aus den Codons mit der höchsten Häufigkeit in denjenigen Proteinen bestimmt werden, die in der jeweiligen Pflanzenspezies von Interesse in der größten Menge exprimiert werden.
Bei der Herstellung der verschiedenen Kassetten können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass sie DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, wie jeweils anwendbar, im richtigen Leserahmen für die Expression liefern. Zu diesem Zweck können Adaptoren oder Linker zur Verknüpfung der DNA-Fragmente angewendet oder andere Manipulationen eingeschlossen werden, um zweckdienliche Restriktionsstellen, Entfernung überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen bereitzustellen. Zu diesem Zweck kann In-vitro-Mutagenese, Primer-Reparatur, Restriktion, Annelierung, Resektion, Ligation oder dergleichen angewendet werden, wobei Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, z. B. Transitionen und Transversionen umfasst sein können. Zweckdienlicherweise kann die Kassette eine multiple Klonie rungsstelle stromab der Fruchtknoten-bezogenen Transkriptionsinitiationsregion umfassen, sodass das Konstrukt für eine Reihe von Sequenzen auf effiziente Weise angewendet werden kann.
Durch geeignete Manipulationen, wie z. B. Restriktion, Zurückstutzen oder Auffüllung von Überhängen, um stumpfe Enden zu ergeben, Ligation von Linkern oder dergleichen, können komplementäre Enden der Fragmente zur Verknüpfung und Ligation bereitgestellt werden.
Bei Durchführung der verschiedenen Schritte wird Klonierung angewendet, um die DNA-Menge zu amplifizieren und um die Analyse der DNA zu erlauben, um sicherzustellen, dass die Arbeitsgänge auf geeignete Weise erfolgt sind. Eine breite Vielfalt von Klonierungsvektoren sind erhältlich, wo der Klonierungsvektor ein in E. coli funktionstüchtiges Replikationssystem und einen Marker umfasst, der die Selektion der transformierten Zelle erlaubt. Beispielhafte Vektoren umfassen pBR332, pUC-Reihe, M13mp- Reihe, pACYC184 usw. Folglich kann die Sequenz an geeigneter/n Restriktionsstelle(n) insertiert, das erhaltene Plasmid zur Transformation des E. coli-Wirts verwendet, E. coli in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet und die Zellen geerntet und lysiert und das Plasmid gewonnen werden. Die Analyse kann Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektrophorese oder dergleichen umfassen. Nach jeder Manipulation kann die im endgültigen Konstrukt zu verwendende DNA-Sequenz restriktionsgeschnitten und an die nächste Sequenz geknüpft werden. Jedes der Teilkonstrukte kann in dasselbe oder in verschiedene Plasmide kloniert werden.
Eine Reihe von Verfahren zur Einführung der Transkriptionskassette in einen Pflanzenzellenwirt sind verfügbar und dem Fachkundigen bekannt. Diese Verfahren umfassen Transformation mit DNA unter Anwendung von A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Transformationsmittel, Protoplastenfusion, Injektion, Elektroporation, Teilchenbeschleunigung usw. Für die Transformation mit Agrobacterium können Plasmide in E. coli hergestellt werden, die zum Ti-Plasmid, insbesondere T-DNA homologe DNA enthalten.
Das Plasmid kann zur Replikation in Agrobacterium fähig oder unfähig sein, dass heißt, es kann wie z. B. pRK290 ein prokaryotisches Breitband-Replikationssystem besitzen oder auch nicht, teilweise abhängig davon, ob die Transkriptionskassette in das Ti-Plasmid zu integrieren oder als unabhängiges Plasmid zu erhalten ist. Der Agrobacterium- Wirt wird ein Plasmid mit den vir-Genen enthalten, die zum Transfer der T-DNA zur Pflanzenzelle erforderlich ist und kann die vollständige T-DNA besitzen oder auch nicht. Bei Infektion, Teilchenbeschleunigung und Elektroporation kann entschärftes Ti- Plasmid, dem insbesondere die in der T-DNA-Region auftretenden Tumorgene fehlen, in die Pflanzenzelle eingeführt werden. Mithilfe eines Helferplasmids kann das Transkriptionskonstrukt in A. tumefaciens transferiert und der erhaltene transformierte Organismus zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet werden; Explantate können mit transformiertem A. tumefaciens oder A. rhizogenes kultiviert werden, um den Transfer der Transkriptionskassette in die Pflanzenzellen zu erlauben. Die Pflanzenzellen werden dann in ein geeignetes Selektivmedium gegeben, um transgene Zellen zu selektieren, die dann zu Kallus kultiviert werden, woraus Triebe gezogen und Pflänzchen aus den Trieben durch Züchten in Wurzelbildungsmedium gebildet werden.
Die Kassetten der gegenständlichen Erfindung können zur Variation des Phänotyps der Frucht angewendet werden. Transkriptionskassetten können verwendet werden, wenn die Transkription einer Antisense-Sequenz gewünscht wird. Wenn die Expression eines Polypeptids gewünscht wird, werden Expressionskassetten verwendet, welche die Transkription und Translation der DNA-Sequenz von Interesse bereitstellen. Vielerlei Veränderungen sind von Interesse; diese Veränderungen können die Modulation (Erhöhung oder Herabsetzung) der Bildung bestimmter Polysaccharide, Hormone, Enzyme oder anderer biologischer Parameter umfassen. Diese umfassen ferner die Modifikation der Zusammensetzung der endgültigen Frucht, nämlich die Veränderung des Verhältnisses und/oder der Mengen von Wasser, Feststoffen, Fasern oder Zucker.
Andere phänotypische Eigenschaften von Interesse für die Modifikation umfassen Reaktion auf Stress, Organismen, Herbizide, Bestreichen, Wachstumsregulatoren und der gleichen. Diese Ergebnisse können durch Vorsehen einer Herabsetzung der Expression eines oder mehrerer endogener Produkte, insbesondere eines Enzyms oder Cofaktors erzielt werden, und zwar durch Herstellung eines Transkriptionsprodukts, das komplementär (Antisense) zum Transkriptionsprodukt eines nativen Gens ist, um die Reifung und/oder Expression des Transkriptionsprodukts zu inhibieren, oder durch Vorsehen der Expression eines Gens, entweder endogen oder exogen, die mit der Entwicklung einer Pflanzenfrucht zu verbinden ist.
Die verschiedenen, hierin bereitgestellten Sequenzen können als molekulare Sonden zur Isolierung anderer Sequenzen verwendet werden, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, um beispielsweise verwandte Transkriptionsinitiationsregionen zum Beispiel aus derselben oder anderen Pflanzenquellen zu erhalten. Verwandte, aus den in dieser Erfindung bereitgestellten Sequenzen erhältliche Transkript-Initiationsregionen weisen zumindest etwa 60% Homologie und bevorzugtere Regionen sogar einen höheren Prozentanteil an Homologie auf. Von besonderer Bedeutung ist das Vermögen, verwandte Transkriptionsinitiations-Kontrollregionen mit den hierin beschriebenen Zeitsteuerungs- und Gewebeparametern zu erhalten. Zumindest 7 zusätzliche, mit pZ130 verwandte Klone sind ebenfalls identifiziert, jedoch nicht weiter charakterisiert worden. Folglich können durch Anwendung der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren und anderer fachbekannter Verfahren (wie z. B. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, New York (1982)) andere Transkriptionsinitiationsregionen bestimmt werden, die wie in dieser Erfindung beschrieben zur Lenkung der Fruchtknotengewebe-Transkription fähig sind.
Die Konstrukte können in Verbindung mit Pflanzen-Regenerationssystemen verwendet werden, um Pflanzenzellen und Pflanzen zu erhalten; die Konstrukte können auch verwendet werden, um den Phänotyp dadurch produzierter Frucht und Früchte zu modifizieren, und wird hierin ebenfalls bereitgestellt.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.

Experimenteller Teil

Die folgenden Hinterlegungen sind an der American Type Culture Collection (ATCC) (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA) erfolgt. Die Bakteriophagen Calgene Lambda 116 und Calgene Lamda 140, die beide eine Transkriptionsinitiationsregion dieser Erfindung enthalten, sind am 13. Juli 1989 hinterlegt worden und erhielten die Zugangsnummern 40632 bzw. 40631.

Beispiel 1

Konstruktion von Prä-Anthese-Tomatenfruchtknoten-cDNA-Banken und Screening auf fruchtknotenspezifische Klone

Herstellung der cDNA-Bibliothek

Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum cv UC82B) wurden unter Gewächshausbedingungen gezüchtet. Poly(A)+ RNA wurde wie von Mansson et al., Mol. Gen. Genet. 200, 356-361 (1985), beschrieben isoliert. Die Synthese von cDNA aus Poly(A)+ RNA, präpariert aus den Fruchtknoten ungeöffneter Tomatenblüten, wurde unter Verwendung des cDNA-Klonierungs-Sets von BRL nach den Angaben des Herstellers (BRL, Bethesda, MD, USA) durchgeführt. Die Hinzufügung von Restriktionsendonuclease-EcoRI-Linkern (1078, New England Biolabs, Beverly, MA, USA) zur gebildeten doppelsträngigen cDNA wurde unter Verwendung der in Kapitel 2 von "DNA Cloning, Vol. I: A Practical Approach", Glover (Hrsg.) (IRL Press, Oxford (1985)) beschriebenen Verfahren erzielt. Die Klonierung der cDNA in die EcoRI-Stelle des Phagen Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA, USA) und Verpackung des gebildeten rekombinanten Phagen (mittels Giga- Pack Gold, Stratagene) wurde wie in den jeweiligen kommerziellen Vorschriften beschrieben durchgeführt.
Die cDNA-Bibliotheken wurden wie oben beschrieben aus derselben Prä-Anthese-Stadium-mRNA hergestellt. Für die zweite Bibliothek, die signifikant längere cDNA als die erste enthielt, wurde die Poly(A)+ RNA-Probe vor den Klonierungsvorgängen nach den Angaben des Herstellers durch eine RNA-Zentrifugensäule (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) geschickt.

Screening der cDNA-Bibliothek

Die erste cDNA-Bibliothek wurde durch differentielle Hybridisierung unter Verwendung 32P-markierter cDNA, hergestellt aus Prä-Anthese-mRNA, Blatt-mRNA und mRNA junger Keimlinge, gescreent. Klone wurden auf Basis der Hybridisierung nur an Prä-Anthese- mRNA selektiert. Die den selektierten Lamda-ZAP-(Stratagene) Klonen entsprechenden cDNAs wurden aus dem Phagenvektor herausgeschnitten und als Plasmide vermehrt (nach den Angaben des Herstellers).
Aus dem anfänglichen Screening von 1000 cDNAs, wurden 30 selektierte Klone isoliert, die auf Basis der Sequenzen ihrer cDNA-Inserts in fünf Klassen fallen. Zwei Klone, nämlich die Klone pZ7 und pZ8, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die DNA-Sequenzen von pZ7 und pZ8 sind als unterstrichene Teile der Fig. 1 bzw. 4 gezeigt.
Mehrere tausend rekombinante Klone aus der zweiten cDNA-Bibliothek wurden durch Plaquehybridisierung (wie in der Gebrauchsanleitung des Klonierungs-Sets von Stratagene beschrieben) mit einem Gemisch radioaktiv markierter DNA-Sonden gescreent. Das Screening von etwa dreitausend rekombinanten Klonen aus der zweiten Bibliothek mit den pZ7- und pZ8-DNA-Sonden lieferte die Selektion von vierzehn Klonen mit intensiven Hybridisierungssignalen. Die selektierten Klone wurden aus dem Phagenvektor herausgeschnitten und als Plasmide vermehrt. DNA wurde aus jedem Klon isoliert, mit der Restriktionsendonuclease EcoRI geschnitten und dann Elektrophorese auf 0,7%igem Agarosegel unterzogen. Je zwei Blot-Hybridisierungen wurden wie von Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, New York (1982), beschrieben mit radioaktiv markierten Sonden durchgeführt, welche die Gene von Interesse (pZ7 und pZ8) darstellten. Sieben Klone, die an pZ7 hybridisierten, und drei Klone, die an pZ8 hybridisierten, wurden ausgewählt. Die längsten davon für beide Sonden, pZ130 (pZ7-hybridisierend) und pZ70 (pZ8-hybridisierend), wurden näher charakterisiert und in zusätzlichen Experimenten verwendet.

Beispiel 2

Analyse von cDNA-Klonen

Northern-Analyse

Gewebespezifität der cDNA-Klone wurde wie folgt nachgewiesen: RNA wurde aus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 14, 17 und 21 Tage Post-Anthese-, Anthese- und Prä-Anthese-Stadium- Tomatenfruchtknoten, Tomatenblättern und unorganisiertem Tomatenkallus isoliert, und zwar unter Verwendung des Verfahrens von Ecker und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5203 (1987), mit den folgenden Modifikationen: Nach der ersten Fällung der Nucleinsäure wurden die Pellets in 2 ml Diethylpyrocarbonat-(DEP-) behandeltem Wasser auf Eis resuspendiert. Die Lösungen wurden auf 1 mM MgCl&sub2; gebracht und 1/&sub4; Volumsanteil an 8 M LiCl zugesetzt. Die Proben wurden gut durchmischt und bei 4ºC über Nacht aufbewahrt. Die Proben wurden dann bei 8.000 U/min für 20 min bei 4ºC zentrifugiert. Die Pellets wurden getrocknet, in DEP-behandeltem Wasser auf Eis wie zuvor resuspendiert und nochmals in Ethanol gefällt. Die RNAs wurden an Formaldehyd/Agarosegelen gemäß dem durch Fourney et al., Focus 10, 5-7 (1988), beschriebenen Verfahren der Elektrophorese unterworfen, an Nytran-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) immobilisiert und mit ³²P-markierten Sonden hybridisiert.
Auf Basis der Northern-Blot-Analyse mit einer ³²-P-markierten pZ7-EcoRI-Insert-DNA oder einer pZ8-EcoRI-Insert-DNA ist es klar, dass beide dieser Gene in der Tomatensorte UC82B bei Anthese am stärksten und vor sowie einen Tag nach der Öffnung der Blüte etwas weniger stark exprimiert werden. Fig. 6 zeigt Tomatenblüten in verschiedenen Entwicklungsstadien und unmittelbar darunter einen repräsentativen Fruchtknoten, der aus einer Blüte im selben Entwicklungsstadium präpariert worden ist. Wie in Fig. 6 zu sehen ist die Expression beider Gene bis zum Zeitpunkt 2 Tage nach dem Beginn der Anthese drastisch abgefallen. Die Größe der an die pZ7- und pZ8-Sonden hybridisierenden mRNA-Spezies betrug etwa 800 nt bzw. 500 nt.
Von zwei Tagen nach Anthese an wurde die pZ8-RNA-Anreicherung auf einem relativ niedrigen Level aufrechterhalten, wogegen die pZ7-Anreicherung weiter gleichmäßig abfiel, bis sie zum Zeitpunkt drei Wochen nach Anthese durch diese Analyse nicht mehr nachweisbar war. pZ8-RNA-Anreicherung war in RNA-Proben, die aus Tomatenfrucht älter als das unreife, grüne Stadium der Fruchtreifung isoliert worden waren, durch das oben beschriebene Verfahren nicht nachweisbar. Keine an pZ7 und pZ8 hybridisierende RNA wurde in Kallusgewebe gefunden; keine an pZ7 hybridisierende RNA wurde in Blattgewebe gefunden; bei längeren Expositionen wurde ein kaum nachweisbares Hybridisierungssignal für pZ8 in Blatt-RNA beobachtet.

Expressionslevel

Die den cDNA-Sonden entsprechende Message-Abundanz wurde durch Vergleich der Hybridisierungsintensität einer bekannten RNA-Menge, die in vitro aus den Klonen (unter Verwendung von T7- oder T3-RNA-Polymerase im Riboprobe System (Promega)) synthetisiert wurden, mit RNA aus dem Anthese-Stadium und drei Wochen alten Tomatenfruchtkörper bestimmt. Diese Analyse zeigte, dass pZ7- und pZ8-cDNAs abundante RNA-Klassen in Anthese-Stadium-Tomatenfruchtkörpern repräsentieren, die etwa 5% bzw. 2% der Message betrugen.

Zellspezifität

Die Zelispezifität der cDNA-Sonden kann unter Verwendung der Technik der In-situ-Hybridisierung nachgewiesen werden. UC82B-Tomatenfruchtköper im Prä-Anthese-Stadium wurden über Nacht in einer Lösung bestehend aus 4% Paraformaldehyd, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 5 mM MgCl&sub2;, pH 7,4, fixiert (PBS besteht aus 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 150 mM NaCl) (Singer et al., Biotechniques 4, 230-250 (1986)). Nach der Fixierung durchlief das Gewebe eine abgestufte tert-Butylalkohol-(TBA-) Serie beginnend mit 50% Alkohol, wurde mit Paraplast infiltriert und für das Anfertigen von Schnitten in Paraffinblöcke gegossen (Berlyn und Miksche, Botanical Microtechnique and Cytochemistry, Iowa, USA (1976)). Von den eingebetteten Fruchtkörpern wurden an einem Reichert Rotationsmikrotom 8 um dicke Querschnitte angefertigt. Paraffinbänder mit 5-7 Fruchtknotenschnitten wurden an mit Gelatine-Chrom-Alaun beschichtete Objektträger (Berlyn und Miksche, s. o. (1976)) angeheftet und bis zur Durchführung der In-situ-Hybridisierung in einer staubfreien Box aufbewahrt. Zur Hybridisierung bereite Objektträger wurden in Xylol entparaffiniert und durch Durchlaufen einer Ethanol-Hydratationsreihe wie in Singer et al., s. o. (1986), beschrieben rehydratisiert.
Ein 2X-Hybridisierungsgemisch wurde hergestellt und bestand aus 100 ul 20X SSC, 20 ul 10% BSA, 100 ul 750 mM DTT, 200 ul 50% Dextransulfat, 50 ul RNasin und 30 ul sterilem Wasser. Sense- und Antisense-³&sup5;S-RNA-Sonden wurden aus cDNAs von Interesse unter Verwendung von T3- und T7-RNA-Polymerasen in In-vitro-Transkriptions-(Riboprobe Promega Biotec oder Stratagene) Reaktionen nach den Angaben des Herstellers erzeugt. 2,5 ul tRNA (20 mg/ml), 2,5 ul Lachsspermien-DNA (10 mg je ml) und 4 · 10&sup6; cpm/Sonde wurden mit einem Lyophilisator getrocknet. Dieses Gemisch wurde dann in 25 ul 90% Formamid, das 25 ul 2X-Hybridisierungsgemisch je Objektträger enthielt, resuspendiert. 40 ul dieses Hybridisierungsgemischs wurde auf jeden Objektträger aufgetragen. Ein Deckglas wurde über die Schnitte gelegt und die Kanten mit Gummilösung versiegelt. Die Objektträger wurden in Objektträgerhalter in einem Glas-Objektträgerbehälter gegeben, zugedeckt und zur Hybridisierung über Nacht bei 37ºC in einen Tro ckenschrank gegeben. Behandlungen nach der Hybridisierung wurden wie von Singer et al., s. o. (1986), beschrieben durchgeführt.
Autoradiographie wurde wie in KODAK Materials for Light Microscope (KODAK (1986); Rochester, NY, USA) beschrieben unter Verwendung der Emulsion NTB-3 durchgeführt. Die Objektträger werden in einer Box unter Lichtausschluss für etwa zwei Wochen exponiert. Nach Entwicklung der autoradiographischen Objektträger wurden die Schnitte in 0,05% Toluidinblau gefärbt und dann über eine abgestufte Ethanol reihe entwässert; Xylol; 10% Ethanol, 1 : 1, gefolgt von 2 Wechseln zu 100% Toluol, fünf Minuten in jeder Lösung. Die Deckgläser wurden mit Cytoseal (VWR; San Francisco, CA, USA) beschichtet und bis zur Trockene auf einem Objektträgerwärmer belassen (45-50ºC, 1-2 Tage). Die autoradiographischen Objektträger waren dann bereit für die mikroskopische Untersuchung.
Wenn Prä-Anthese-Tomatenfruchtkörper an Sense- und Antisense ³&sup5;S-pZ7-RNA hybridisiert wurden, hybridisierten die Antisense-Transkripte spezifisch an die äußere Fruchtwandregion des Fruchtknotens und an die äußere Region der Ovula (Integumente). Die Sense-Transkripte (negative Kontrolle) zeigten keine Hybridisierung. Wenn Prä-Anthese- Tomatenfruchtkörper an Sense- und Antisense ³&sup5;S-pZ8-RNA hybridisiert wurden, hybridisierten die Antisense-Transkripte spezifisch an die innere Kernregion des Fruchtknotens und an die äußere Region der Ovula. Die Sense-Transkripte zeigten keine Hybridisierung.
Zusammenfassend wurden die durch die pZ7 und pZ8 entsprechenden Gene kodierten mRNA-Transkripte während eines sehr spezifischen Stadiums der Tomatenfruchtentwicklung, hauptsächlich bei Anthese und einen Tag vor und nach Öffnung der Blüte ab- undant exprimiert. Die Transkripte wurden zusätzlich in einer speziellen Untergruppe von Fruchtknoten-Zelltypen während dieses Entwicklungsstadium, insbesondere in den Integumenten (pZ7 und pZ8) sowie der äußeren Fruchtwand des Fruchtknotens (pZ7) und der inneren Kernregion (pZ8) exprimiert.

Beispiel 3

Sequenzierung der pZ130- und pZ70-cDNA-Klone

Die vollständigen DNA-Sequenzen der cDNA-Klone pZ130 und pZ70 wurden unter Verwendung der Didesoxy-Technik von Sanger et al. (1971) bestimmt. Die DNA-Sequenzen von pZ130 sowie pZ70 wurden in drei Rahmen translatiert. Die Sequenzen, einschließlich der längsten offenen Leserahmen für beide sind in Fig. 1 (pZ130) und Fig. 4 (pZ70) gezeigt.

Beispiel 4

Analyse der Genfamilie

Southern-Blot-Analyse wurde wie von Maniatis et al., s. o. (1982), beschrieben durchgeführt. Gesamt-Tomaten-DNA aus der Kultursorte UC82B wurde mit BamHI, EcoRI und Hindill verdaut, durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und auf Nitrozellulose transferiert. Southern-Hybridisierung wurde unter Verwendung von ³²P-markierten, durch Random-Priming von pZ130 und pZ70 hergestellten Sonden durchgeführt. Ein einfaches Hybridisierungsmuster wies darauf hin, dass die für pZ130 und pZ70 kodierenden Gene in wenigen oder vielleicht nur einer Kopie im Tomatengenom vorhanden waren.
Zusätzliche Analyse mit einer pZ130-Hybridisierungssonde zur Hybridisierung an genomische, mit der Restriktionsendonuclease BGIII verdauter Tomaten-DNA wies darauf hin, dass dieses Gen eigentlich ein Mitglied einer kleinen (etwa 5-7 Mitglieder) Genfamilie ist. Der ursprüngliche pZ7-cDNA-Klon, bestehend aus zur 3'-untranslatierten Region des längeren pZ130-Klons restriktionsverdauten Sequenzen, hybridisierte jedoch nur an eine Bande intensiv und vielleicht schwach an eine zweite Bande basierend auf Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer BgIII-verdauten, genomischen Tomaten- DNA.

Beispiel 5

Herstellung eines pZ130-Expressionskonstrukts

Herstellung von genomischen Klonen

Zwei genomische Klone, jeweils einer davon die cDNA-Klone pZ130 und pZ70 verkörpernd, wurden wie folgt erhalten. Eine aus teilweise mit der Restriktionsendonuclease Sau3A verdauten DNA der Tomatenkultursorte UC82B konstruierte Genbibliothek wurde im Lamda-Phagenvektor Lamda-FIX gemäß den Anleitungen des Herstellers (Stratagene; La Jolla, CA, USA) etabliert. Diese Bibliothek wurde unter Verwendung von ³²P-markiertem pZ130 und pZ70 als Sonden gescreent. Ein genomischer Klon wurde isoliert, der etwa 14,5 kb Sequenz aus dem Tomatengenom enthielt die an pZ70 hybridisierte. Diejenige Region, die an die pZ70-Sonde hybridisierte, wurde innerhalb des XbaI-Hind-III-Restriktionsfragments mit etwa 2 kb von Calgene Lamda 116 gefunden (siehe Fig. 5). Ein zweiter genomischer Klon wurde isoliert, der eine etwa 13 kb Sequenz aus dem Tomatengenom enthielt und an pZ130 (und pZ7) hybridisierte. Diejenige Region, die an die pZ130-Sonde hybridisierte, wurde innerhalb des größeren EcoRI-HindIII-Restriktionsfragments von Calgene Lamda 140 gefunden (siehe Fig. 3).

Herstellung von pCGN2015

pCGN2015 wurde durch Verdau von pCGN565 mit Hhal, Glättung mit Mungobohnen- Nuclease und Insertieren des erhaltenen Fragments in einen EcoRV-verdauten BluescriptKSM13-Vektor (Stratagene) hergestellt. pCGN2008 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut, mit Klenow geglättet und das Chloramphenicol-Fragment mit 1156 bp isoliert. BluescriptKSM13+ (Stratagene) wurde mit Dral verdaut und das Fragment mit 2273 bp isoliert und mit dem pCGN2008-Chloramphenicol-Fragment ligiert, wodurch pCGN- 2015 erzeugt wurde.

Herstellung von pCGN2901/pCGN2902

pCGN2901 enthält die Region, welche die pZ7-hybridisierende Region des genomischen pZ130-Klons umgibt, einschließlich etwa 1,8 kb in 5'-Richtung und etwa 4 kb in 3'-Richtung. Um pCGN2901 herzustellen, wurde Calgene Lamda 140 mit SalI verdaut und das gebildete Fragment, das die pZ7-hybridisierende Region enthält, in pCGN2015 an der einzigartigen SalI-Stelle von pCGN2015 insertiert, um pCGN2901 zu erzeugen.
pCGN2902 enthält das andere SalI-Fragment (nicht an pZ7 hybridisierend) des pZ130- Genoms, hergeleitet vom SalI-Verdau von Calgene Lamda 140, das ebenfalls in ein pCGN2015-Konstrukt eingebaut wurde.

Herstellung eines pZ130-Expressionskonstrukts

Aus pCGN2901 isolierte Plasmid-DNA wurde vollständig mit NcoI verdaut und dann mit Exonuclease, isoliert aus Mungobohnen (Promega, Madison, WI; USA) behandelt, um einzelsträngige DNA-Sequenzen einschließlich der ATG-Sequenz, die einen Teil der NcoI-Erkennungssequenz ausmacht, zu entfernen. Die Probe wurde dann vollständig mit SacI verdaut. Das gebildete 5'-SacI zu NcoI-Fragment von 1,8 kb (etwa) wurde dann in ein pUC-hergeleitetes Ampicillin-resistentes Plasmid, pCGP162 (unten beschrieben) insertiert, das wie folgt hergestellt worden ist. pCG261 wurde mit XbaI vollständig verdaut, die einzelsträngigen DNA-Sequenzen wurden durch Behandlung mit dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt und die pCGP261-DNA mit SacI wiederverdaut. Das gebildete Expressionskonstrukt enthielt, in 5' → 3'-Transkriptionsrichtung, einen von Lamda 140 hergeleiteten Fruchtknotengewebe-Promotor, ein tmr-Gen und die tmr-3'-Transkriptionsterminationsregion.
Das Plasmid pCGP261 enthält die Sequenzen von Position 8.762 bis 9.836 aus dem Agrobacterium tumefaciens-Octopine-Ti-Plasmid pTi15955 (sequenziert von Barker et al., Plant Molec. Biol. 2, 335-350 (1983)). Diese Region enthält die gesamte kodierende Region für den mit tmr bezeichneten genetischen Locus, der für Isopentenyltransferase (Akiyoshi et al., PNAS 81, 4776-4780 (1984)), 8 bp 5' des Translationsinitiations-ATG- Codons und 341 bp der Sequenz 3' zum Translationsstop-TAG-Codons kodiert.
Plasmid pCGP261 wurde wie folgt erzeugt. Plasmid pCGN1278 (beschrieben in der laufenden Anmeldung USSN 382.176, eingereicht am 19. Juli 1989, die hiermit in vollem Umfang durch Verweis aufgenommen ist) wurde mit XbaI und EcoRI verdaut. Die erzeugten einzelsträngigen DNA-Sequenzen wurden durch Behandlung mit dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Das das tmr-Gen enthaltende XbaI zu Eco- RI-Fragment wurde dann in den Vektor m13 Bluescript minus (Stratagene Inc., La Jolla, CA, USA) an der SmaI-Stelle ligiert, was das Plasmid pCGP259 lieferte. Die gesamte stromauf des ATG-Translationsinitiationscodons auftretende Region und ein Teil der tmr- Gen-kodierenden Region wurden durch Verdau von pCGP259 mit BspMI und BstXI eliminiert. Die sich ergebende kodierende Region und 8 bp der ursprünglich stromauf des ersten ATG-Codons befindlichen Sequenz wurden wieder in das Plasmid eingeführt und es wurde eine XbaI-Stelle in das Plasmid eingeführt, und zwar über ein synthetisches Oligonucleotid der folgenden Sequenz: 5' AATTAGATGCAGGTCCATAAGTTTTTTCTA- GACGCG 3'. Das gelieferte Plasmid ist pCGP261. Ein XbaI-Kpnl-Fragment von pCGP- 261, welches das Konstrukt aus pZ130-Gen-5'-Region und tmr-Gen-Kodier- und -3'-Region, wurde dann in eine binäre Kassette, wie z. B. pCGN1557, insertiert und transgene Pflanzen hergestellt (siehe die laufende Anmeldung ISSN 382.176, oben beschrieben).

Beispiel 6

pZ130 Promotorkassette

Die Kassette enthält 1,8 kb DNA 5' der Translationsstartstelle und die 3'-Region (vom TAA-Stopcodon bis zu einer Stelle 1, 2 kb stromab) des pZ130-Gens. Die pZ130-Kassette wurde wie folgt hergestellt.

Transkriptionsinitiationsregion

Aus pCGN2901 isolierte Plasmid-DNA (siehe oben) wurde vollständig mit NcoI verdaut und dann mit aus Mungobohnen (Promega, Madison, WI, USA) isolierter Exonuclease behandelt, um einzelsträngige DNA-Sequenzen, einschließlich der einen Teil der NCoI- Erkennungsstelle ausmachenden ATG-Sequenz zu eliminieren. Die Probe wurde dann vollständig mit SacI verdaut. Das erhaltene 5'-SacI-NcoI-Fragment von 1,5 kb wurde dann in pCGN2015 (oben beschrieben) insertiert, um pCGN2904 zu erzeugen.
Um redundante Restriktionsenzymstellen zu eliminieren und die nachfolgende Klonierung zu erleichtern, wurde aus pCGN2904 isolierte Plasmid-DNA vollständig mit Slal und EcoRI verdaut und das erhaltene, die pZ130-5'-Sequenzen enthaltende 1,8 kb-Fragment in pBluescriptII (Stratagene; La Jolla, CA, USA) insertiert, um pCGN2907 zu erzeugen.

Transkriptions- und Translationsterminationsregion

Aus pCGN2901 isolierte Plasmid-DNA wurde vollständig mit EcoRI und BamHI verdaut. Das gebildete EcoRI-BamHI-Fragment von 0,72 kb, das stromab (3') der für pZ130 kodierenden Region lokalisiert ist, wurde in pCGN2907 insertiert, was pCGN2908 ergab.
Die Insertion der (ca.) 0,5 kb-DNA-Sequenz, umfassend das pZ130-Gen-TAA-Stopcodon und die Sequenzen zwischen dem Stopcodon und der EcoRI-Stelle stromab (3'), sowie die Addition einzigartiger Restriktionsstellen zur Erleichterung der Insertion fremder Gene wurde wie folgt erzielt.
Ein die Sequenz 5'-GTTCCTGCAGCATGCCCGGGATCGATAATAATTAAGTGAGGC-3' umfassender Polylinker/"Primer" wurde synthetisiert, um einen Polylinker mit den Stellen PstI-SphI-SmaI-ClaI zu erzeugen, der das pZ130-Gen-Stopcodon und die folgenden (3') 13 Basenpaare der pZ130-Gen-3'-Region-Sequenz umfasst. Ein anderes, die Sequenz 5'-CAAGAATTCATAATATTATATATAC-3' umfassendes Oligonucleotid wurde synthetisiert, um einen "Primer" mit einer EcoRI-Restriktionsstelle und 16 Basepaaren der pZ130-Gen-3'-Region unmittelbar benachbart der EcoRI-Stelle, etwa 0,5 bp 3' des pZ130-Gen-TAA-Stopcodons lokalisiert zu erzeugen.
Diese synthetischen Oligonucleotide wurden in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, in der aus pCGN2901 isolierte Plasmid-DNA als das Substrat in einem Thermocycler (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT, USA) nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Das erhaltene DNA-Produkt von 0,5 kb wurde vollständig mit PstI und EcoRI verdaut und das erhaltene DNA-Fragment von 0,5 kb in pCGN2908 insertiert, um pCGN2909 zu erzeugen. Die vollständige DNA-Sequenz der 0,5 kb-Region aus der PstI-Stelle zur EcoRI-Stelle wurde unter Anwendung der Didesoxy-Technik von Sanger et al. (1971) bestimmt, um zu verifizieren, dass zwischen den Oligonucleotidprimem während der PCR-Reaktion keine Fehler aufgetreten sind.
Die pZ130-Kassette pCGN2909 umfasst folglich die 5'-pZ130-DNA-Sequenzen aus der SalI-Stelle an Position 808 zur Position 2636 (siehe Fig. 2), einzigartige PstI-, SphI- und SmaI-Stellen, die bequem zur Insertion von Genen verwendet werden können, und die 3'-pZ130-DNA-Sequenzen vom TAA-Stopcodon an Position 3173 (Fig. 2) bis zur Bam- HI-Stelle an Position 4380.

Beispiel 7

Herstellung und Analyse von Testkonstrukten

Ein β-Glucuronidase-(GUS-) Reportergen wurde verwendet, um die Expression und Gewebespezifität der pZ130-GUS-Konstruktionen zu evaluieren. GUS ist ein zweckdienliches Reportergen in Pflanzensystemen, da es ein höchst stabiles Enzym produziert, wenig oder keine Hintergrund-(endogene) Enzymaktivität in Pflanzengeweben auftritt und das Enzym mit fluoreszenten oder spektrophotometrischen Substraten leicht gemessen werden kann (siehe beispielsweise Jefferson, Plant Mol. Rep. 5, 387-405 (1987)). Histochemische Färbungen für GUS-Enzymaktivität sind ebenfalls erhältlich, die dazu verwendet werden können, das Muster der Enzymanreicherung in transgenen Pflanzen zu analysieren ()efferson, s. o. (1987)).

Herstellung der Testkonstrukte pCGN2917 und pCGN2918

Diese Konstrukte enthalten 1,8 kb der pZ130-5'-Sequenz, die für GUS-Gen kodierende Region und 1, 2 kb der pZ130-3'-Sequenz. Sie unterscheiden sich voneinander nur in der Orientierung der pZ130/GUS-Konstruktion bezüglich der anderen Elemente des binären Vektor-Plasmids, zum Beispiel dem 355-Promotor aus CaMV.
Die Konstrukte wurden durch Insertieren des PstI-Fragments von pRAJ250 (Jefferson, s. o. (1987)) oder jedes anderen Plasmidkonstrukts mit dem PstI-Fragment, das die für GUSkodierende Region enthält, in die PstI-Stelle von pCGN2909. Das erhaltene Plasmid mit dem GUS-Gen in Sense-Orientierung bezüglich der pZ130-Gen-Promotorregion wurde pCGN2914 benannt. Die pZ130/GUS-Konstruktion wurde als ein XbaI nach KpnI-Fragment herausgeschnitten und in die binären Vektoren pCGN1557 und pCGN1558 kloniert, um pCGN2917 bzw. pCGN2918 herzustellen. pCGN1557 und pCGN1558 werden von McBride und Summerfelt, Plant Mol. Bio. 14, 269-296 (1990), beschrieben.

Analyse der GUS-Enzymaktivität

Die β-Glucuronidase-Aktivität der Transformanten wurde unter Verwendung von 4-Methylumbelliferylglucuronid als Substrat, wie von Jefferson, s. o. (1987), umrissen gemessen. GUS-Enzymaktivität konnte in den Fruchtknoten der transformierten Pflanzen leicht detektiert werden und war quantitativ ziemlich hoch im Vergleich zur beobachteten Hintergrundaktivität in Fruchtknoten, die aus nicht transformierten Tomatenpflanzen und aus Blättern transformierter Pflanzen isoliert worden sind. Interessanterweise wurde beim Vergleich der pCGN2917- und pCGNZ918-Transformanten gefunden, dass die Nachbarschaft zu einer 335S-CaMV-Enhancerregion (pCGN1558) die Fruchtknotengewebespezifität herabsetzen oder eliminieren könnte.
Obgleich die obige Erfindung zum besseren Verständnis durch Veranschaulichungen und anhand von Beispielen ziemlich detailliert beschrieben wurde, versteht es sich für Fachleute, dass daran gewisse Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können.

Claims

1. DNA-Transkriptionskonstrukt, das den Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808- 2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, worin der Promotor in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist, wodurch die DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle des Promotors steht.

2. Konstrukt nach Anspruch 1, das weiters eine Fruchtknotengewebe-Transkriptions/- Translations-Region umfasst und worin das Konstrukt weiters eine Transkriptionsterminationsregion umfasst, die an das 3'-Ende der DNA-Sequenz von Interesse gebunden ist.

3. Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, worin die Transkription vom Promotor etwa 3 Wochen nach der Anthese nicht in Fruchtknotengewebe nachweisbar ist.

4. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Fruchtknotengewebe Integumentzellen umfasst.

5. Konstrukt nach Anspruch 4, worin das Fruchtknotengewebe äußere Perikarpzellen umfasst.

6. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Promotor ein Tomaten- Fruchtknotengewebe-Promotor ist.

7. Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das weiters eine selektierbare Markierung umfasst.

8. Transformierte Pflanzenzelle, die ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.

9. Transformierte Pflanzenzelle, die ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.

10. Pflanzenzelle nach Anspruch 8 oder 9, worin die Transkription von der Promotor-Transkriptionsregion etwa 3 Wochen nach der Anthese nicht im Fruchtknotengewebe nachweisbar ist.

11. Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin das Fruchtknotengewebe Integumentzellen umfasst.

12. Pflanzenzelle nach Anspruch 11, worin das Fruchtknotengewebe äußere Perikarpzellen umfasst.

13. Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 12, worin der Promotor ein Tomaten-Fruchtknotengewebe-Promotor ist.

14. Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 8 bis 13, die weiters eine selektierbare Markierung umfasst.

15. Pflanze, die im Wesentlichen aus Zellen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 Kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808- 2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, und in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist und unter der Regulationskontrolle des Promotors und einer Transkriptionsterminationsregion steht.

16. Modifizierte Frucht, die im Wesentlichen aus Zellen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 Kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808-2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, und in Transkriptionsrichtung mit einer Frucht-modifizierende DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist und unter der Regulationskontrolle des Promotors und einer Transkriptionsterminationsregion steht.

17. Frucht nach Anspruch 16, worin die Frucht eine Tomate ist.

1. Verfahren, umfassen die Herstellung eines DNA-Transkriptionskonstrukts, das den Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808-2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, worin der Promotor in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist, wodurch die DNA-Sequenz von Interesse unter der Regulationskontrolle des Promotors steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Konstrukt weiters eine Fruchtknotengewebe-Transkriptions/Translations-Region umfasst und worin das Konstrukt weiters eine Transkriptionsterminationsregion umfasst; die an das 3'-Ende der DNA-Sequenz von Interesse gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Transkription vom Promotor etwa 3 Wochen nach der Anthese nicht in Fruchtknotengewebe nachweisbar ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Fruchtknotengewebe Integumentzellen umfasst.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Fruchtknotengewebe äußere Perikarpzellen umfasst.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Promotor ein Tomaten- Fruchtknotengewebe-Promotor ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das weiters eine selektierbare Markierung umfasst.

15. Pflanze, die im Wesentlichen aus Zeilen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 Kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808- 2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, und in Transkriptionsrichtung mit einer DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist und unter der Regulationskontrolle des Promotors und einer Transkriptionsterminationsregion steht.

16. Modifizierte Frucht, die im Wesentlichen aus Zellen besteht, die ein DNA-Expressionskonstrukt umfassen, wobei das Konstrukt einen Fruchtknotengewebe-Promotor umfasst, der auf dem SalI-NcoI-Fragment mit etwa 1,8 Kb vorhanden ist, das als Nucleotide 808-2641 in der genomischen Sequenz aus Fig. 2 dargestellt ist, und in Transkriptionsrichtung mit einer Frucht-modifizierende DNA-Sequenz von Interesse verbunden ist, die nicht die Sequenz der Wildform ist und unter der Begulationskontrolle des Promotors und einer Transkriptionsterminationsregion steht.

17. Frucht nach Anspruch 16, worin die Frucht eine Tomate ist.