DE60020251T2

DE60020251T2 - Pflanzen -promotersequenzen aus mais, die selektiv die genexpression kontrollieren

Info

Publication number: DE60020251T2
Application number: DE60020251T
Authority: DE
Inventors: W. Timothy CONNER; Iris Tzafrir
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2020-08-31
Also published as: AR089780A2; ES2241644T3; AU6947700A; US7563945B2; EP1571219A3; US20060123511A1; ATE397083T1; PT1214402E; EP1571219B1; WO2001016307A3; CN1387572B; ATE295880T1; CN1387572A; AR025485A1; DK1571219T3; US6506565B1; DE60020251D1; US7034204B2; DE60039079D1; BR0013728A

Description

ERFINDUNGSGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Verwendung von Nukleinsäure-Molekülen zur Kontrolle der Genexpression in Pflanzen, insbesondere neuartige Pflanzenpromotoren. Die vorliegende Anmeldung beansprucht Priorität gegen U.S. vorläufige Anmeldungsnummer 60/151.892, eingereicht am 01. September 1999, wobei der vollständige Inhalt dieser hier durch Quellenangabe eingefügt ist.
GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
Eines der Ziele der pflanzlichen Gentechnik ist, Pflanzen mit agronomisch wichtigen Charakteristika oder Merkmalen herzustellen. Jüngste Fortschritte in der Gentechnik haben die notwendigen Werkzeuge bereitgestellt, um Pflanzen zu transformieren, damit sie fremde Gene enthalten und exprimieren (Kahl et al. (1995) World Journal of Microbiology and Biotechnology 11:449–460). Besonders erwünschte Merkmale und Eigenschaften von Interesse in der pflanzlichen Gentechnik würden die Resistenz gegen Insekten und andere Schädlinge und krankheitsverursachende Agentien, Herbizidtoleranzen, verbesserte Stabilität, Ertrag oder Lagerungszeit, Umwelttoleranzen und Ernährungsverbesserungen umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt. Die technischen Fortschritte bei der Pflanzentransformation und -regeneration haben den Forschern ermöglicht, DNA-Stücke wie ein Gen oder Gene von einer heterologen Quelle oder einer nativen Quelle zu entnehmen, dann für andere oder verbesserte Eigenschaften zu modifizieren und die exogene DNA in das Pflanzengenom einzubauen. Das Gen oder die Gene können in der Pflanzenzelle exprimiert werden, um die hinzugefügten Charakteristika oder Merkmale zu zeigen. In einem Versuchsansatz kann die Expression eines neuen Gens, das normalerweise in einer bestimmten Pflanze oder einem pflanzlichen Gewebe exprimiert wird, eine erwünschte phänotypische Wirkung verleihen. In einem anderen Versuchsansatz kann eine Transkription eines Gens oder Teil eines Gens in Antisense-Orientierung eine erwünschte Wirkung durch Verhinderung oder Hemmung der Expression eines endogenen Gens herbeiführen.
Isolierte pflanzliche Promotoren sind für die Modifikation von Pflanzen mittels Gentechnik zweckdienlich, um erwünschte phänotypische Charakteristika zu erhalten. Um eine derartige transgene Pflanze herzustellen, wird ein Vektor, der eine heterologe Gensequenz enthält, die im Falle der Expression den erwünschten Phänotyp der Pflanze verleiht, in die Pflanzenzelle eingeführt. Der Vektor enthält ebenfalls einen pflanzlichen Promotor, der funktionell mit der heterologen Gensequenz verbunden ist, oftmals einen Promotor, der normalerweise mit dem heterologen Gen nicht assoziiert ist. Der Vektor wird dann in die Pflanzenzelle eingeführt, um eine transformierte Pflanzenzelle zu bilden, und die transformierte Pflanzenzelle wird zu einer transgenen Pflanze regeneriert. Der Promotor steuert die Expression der eingeführten DNA-Sequenz, mit der der Promotor funktionell verbunden ist, und beeinflusst folglich die von der DNA-Sequenz verliehenen erwünschten Charakteristika.
Da der Promotor ein 5' regulatorisches Element ist, das einen integralen Part in der Gesamtexpression eines Gens oder Gene spielt, wäre es von Vorteil, verschiedene Promotoren zu besitzen, um eine maßgeschneiderte Genexpression zu erhalten, so dass ein Gen oder Gene zur richtigen Zeit während des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung an der optimalen Stelle der Pflanze und in der erforderlichen Menge effizient transkribiert werden, um die erwünschte Wirkung zu schaffen. In einem Fall zum Beispiel kann eine konstitutive Expression eines Genprodukts an einer Stelle der Pflanze von Vorteil sein, aber weniger vorteilhaft in einem anderen Teil der Pflanze. In anderen Fällen kann es von Vorteil sein, ein in einem bestimmten Entwicklungsstadium der Pflanze produziertes Produkt oder als Reaktion auf bestimmte Umweltreize oder chemische Reize zu haben. Die kommerzielle Entwicklung von gentechnisch verbessertem Keimplasma hat ebenfalls Fortschritte gemacht, bis hin zur Einführung von mehreren Merkmalen in Nutzpflanzen, auch als Gen-Stapelung bekannt. Bei diesem Ansatz können mehrere Gene, die verschiedene Charakteristika von Interesse den Pflanzen verleihen, in eine Pflanze eingeführt werden. Es ist wichtig, wenn mehrere Gene in eine Pflanze eingeführt werden, dass jedes Gen für eine optimale Expression moduliert oder gesteuert wird und dass die regulatorischen Elemente unterschiedlich sind, um die Möglichkeit einer Ruhigstellung von Genen zu verringern, die durch Rekombination homologer Sequenzen verursacht sein kann. Im Lichte dieser und weiterer Betrachtungen ist es offensichtlich, dass eine optimale Steuerung der Genexpression und eine Diversität der regulatorischen Elemente in der Pflanzenbiotechnologie wichtig sind.
Die geeigneten regulatorischen Sequenzen für die neu inserierte DNA, die transkribiert werden soll, müssen vorhanden sein und an der richtigen Stelle bezüglich der DNA-Sequenz von Interesse liegen, um dadurch, falls erwünscht, in ein Protein in der Pflanzenzelle translatiert zu werden. Diese regulatorischen Sequenzen umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, einen Promotor, einen 5'-nicht-translatierten Leader und eine 3' Polyadenylierungssequenz. Die Fähigkeit zur Auswahl der Gewebe, in denen derartige fremde DNA transkribiert wird, und den Zeitraum des Pflanzenwuchses, in dem die Transkription derartiger fremder DNA erhalten wird, ist ebenfalls durch die Wahl der geeigneten Promotorsequenzen, die die Transkription steuern, möglich.
Eine Reihe verschiedener Typen und Klassen von Promotoren können in der Gentechnik bei Pflanzen verwendet sein. Promotoren können auf Basis ihrer Bereichs- oder Gewebespezifität klassifiziert werden. Zum Beispiel sind die als konstitutiv bezeichneten Promotoren in der Lage, funktionell verbundene DNA-Sequenzen effizient zu transkribieren und besagte DNA-Sequenzen in mehreren Geweben zu exprimieren. Gewebe-verstärkte oder Gewebespezifische Promotoren können stromaufwärts und mit DNA-Sequenzen funktionell verbunden gefunden werden, die normalerweise in höheren Levels in bestimmten Pflanzengeweben oder spezifisch in bestimmten Pflanzengeweben transkribiert werden. Andere Klassen von Promotoren können induzierbare Promotoren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die durch externe Stimuli wie chemische Agentien, Entwicklungsstimuli oder Umweltstimuli ausgelöst werden. Folglich können die erwünschten verschiedenen Promotortypen durch Isolieren der stromaufwärts liegenden 5' regulatorischen Bereiche von DNA-Sequenzen erhalten werden, die auf konstitutive, Gewebe-verstärkte oder induzierbare Weise transkribiert und exprimiert werden.
Die technologischen Fortschritte bei der Hochdzurchsatz-Sequenzierung und in der Bioinformatik haben zusätzliche molekulare Werkzeuge für die Promotorentdeckung bereitgestellt. Es können bestimmte Zielpflanzenzellen, -gewebe oder -organe in einem spezifischen Entwicklungsstadium oder unter bestimmten chemischen, physiologischen Bedingungen oder Umweltbedingungen als Ausgangsmaterial zur Isolierung von mRNA und Konstruktion von cDNA-Bibliotheken verwendet sein. Die cDNA-Bibliotheken sind schnell sequenziert und die exprimierten Sequenzen elektronisch katalogisiert. Unter Verwendung von Sequenzanalyse-Software können Tausende Sequenzen in kurzer Zeit analysiert werden und Sequenzen von ausgewählten cDNA-Bibliotheken können verglichen werden. Die Kombination von Labor-gestützten und Computer-gestützten Subtraktionsverfahren erlaubt den Forschern, cDNA-Bibliotheken einzulesen und zu vergleichen und Sequenzen mit dem erwünschten Expressionsprofil zu identifizieren. Zum Beispiel können Sequenzen identifiziert werden, die bevorzugt in einem Gewebe exprimiert werden, durch Vergleich einer cDNA-Bibliothek von einem Gewebe mit cDNA-Bibliotheken von anderen Geweben und elektronischer „Subtraktion" gewöhnlicher Sequenzen, um Sequenzen zu finden, die nur in dem Zielgewebe von Interesse exprimiert werden. Die Gewebe-verstärkte Sequenz kann dann als eine Sonde oder ein Primer verwendet sein, um die entsprechende vollständige cDNA zu klonieren. Eine genomische Bibliothek der Zielpflanze kann dann zur Isolierung des entsprechenden Gens und der assoziierten regulatorischen Elemente, einschließlich Promotorsequenzen, verwendet sein.
Mehrere Promotorsequenzen, die ein erwünschtes Expressionsprofil wie Embryonalgewebe- oder Kallusgewebe-verstärkte oder spezifische Promotoren verleihen, können durch selektives vergleichen von cDNA von embryonalen Zielgewebe- oder Kallusgewebe-Bibliotheken mit Nicht-Ziel oder Nicht-Ziel oder Hintergrund-cDNA-Bibliotheken wie Bibliotheken von Blatt- und Wurzelgewebe isoliert werden, um die 5' regulatorischen Bereiche zu finden, die mit den exprimierten Sequenzen in diesen Ziel-Bibliotheken assoziiert sind. Die isolierten Promotorsequenzen können zur selektiven Modulierung der Expression von jedem funktionell verbundenen Gen verwendet werden und eine zusätzliche Diversität regulatorischer Elemente in einem Pflanzenvektor in Gen-Stapelung-Versuchsansätzen bereitstellen.
Mutich und Shatters (Plant Cell Reports, Vol. 17, 1998, Seiten 476–481) legen den Mais-Ubiquitin (Ubi-1) Promotor offen, der im Samen aktiv ist, Montoliv et al. (Gene, Vol. 94, 1990, Seiten 201–207) legt das Tubo 3 Gen offen, dessen Expression auf embryonale Gewebe beschränkt ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuresequenzen bereit, die regulatorische Sequenzen umfassen, die stromaufwärts des 5'-Endes der Struktur-codierenden pflanzlichen DNA-Sequenzen liegen, die in Embryonal- oder Kallusgewebe transkribiert werden und in SEQ ID NR: 36–51 gezeigt sind.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Nukleinsäwesequenzen bereit, umfassend eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 36–51 oder beliebigen Fragmenten, Bereichen oder cis-Elementen der Sequenz, die in der Lage sind, die Transkription von funktionell verbundenen DNA-Sequenzen zu regulieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Nukleinsäwesequenzen bereit, umfassend eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 36–51, die Promotoren sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von wenigstens einem cis-Element oder Fragment oder Bereich davon von der offengelegten 5'- Promotorsequenz, die kombiniert sein kann, um neuartige Promotoren zu bilden, oder in einer neuartigen Kombination mit anderen heterologen regulatorischen Sequenzen verwendet sein kann, um einen chimären Promotor zu bilden, der in der Lage ist, die Transkription einer funktionell verbundenen DNA-Sequenz zu modulieren.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäursequenzen, die in SEQ ID NR: 36–51 offengelegt sind, oder ein beliebiges Fragment, Bereich oder cis-Elemente der offengelegten Sequenzen, die in der Lage sind, die Transkription einer DNA-Sequenz zu modulieren, wenn diese mit der DNA-Sequenz funktionell verbunden sind. Deshalb umfasst die Erfindung nicht nur Sequenzen, wie sie in SEQ ID NR: 36–51 offengelegt sind, sondern umfasst ebenfalls beliebig verkürzte oder deletierte Derivate oder Fragmente oder Bereiche davon, die in der Lage sind, unabhängig als Promotoren zu fungieren, einschließlich cis-Elemente, die in der Lage sind, als regulatorische Sequenzen zusammen mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen zu fungieren, wenn diese an eine transkribierbare Sequenz funktionell gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst folglich einen neuartigen Promotor oder einen chimären oder hybriden Promotor, umfassend eine wie in SEQ ID NR: 36–51 offengelegte Nukleinsäwesequenz. Die chimären oder hybriden Promotoren können aus beliebig langen Fragmenten, Bereichen oder cis-Elementen der offengelegten SEQ ID NR: 36–51 bestehen, kombiniert mit jedem anderen transkriptionell aktiven minimalen oder vollständigen Promotor. Zum Beispiel kann eine aus SEQ ID NR: 36–51 ausgewählte Promotorsequenz mit einem CaMV 35S oder anderen Promotor kombiniert sein, um einen neuartigen chimären Promotor zu bilden. Ein minimaler Promotor kann ebenfalls zusammen mit den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung verwendet sein. Ein neuartiger Promotor kann ebenfalls jeden Promotor umfassen, der durch Bearbeitung der in SEQ ID NR: 36–51 offengelegten Nukleinsäuresequenzen oder einem beliebigen Fragment, Bereich oder cis-Element der offengelegten Sequenzen in einer beliebigen hinreichenden Weise konstruiert ist, um eine funktionell verbundene DNA-Sequenz zu transkribieren.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Fähigkeit der Promotorsequenz von SEQ ID NR: 36–51 oder Fragmenten, Bereichen oder cis-Elementen davon, die Transkription von funktionell verbundenen Sequenzen in Embryonal- oder Kallusgeweben zu regulieren. Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente von SEQ ID NR: 36–51, die in der Lage sind, die Transkription von funktionell verbundenen Sequenzen in bestimmen Geweben zu regulieren, können aus den offengelegten Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NR: 36–51 isoliert werden und zur Herstellung neuartiger Promotoren verwendet werden, die eine Embryo-verstärkte oder Kallus-verstärkte Expression von funktionell verbundenen DNA-Sequenzen oder zusammen mit anderen heterologen regulatorischen Sequenzen verleihen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls DNA-Konstrukte, umfassend wie die in SEQ ID NR: 36–51 gezeigten offengelegten Sequenzen oder beliebige Fragmente, Regionen oder cis-Elemente davon, einschließlich neuartiger Promotoren, die unter Verwendung der offengelegten Sequenzen oder beliebiger Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente der offengelegten Sequenzen generiert sind.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls beliebige Zellen und transgene Pflanzen, die die in den SEQ ID NR: 36–51 offengelegten Sequenzen oder beliebige Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente davon enthalten.
Die vorliegende Erfindungstellt ebenfalls ein Verfahren zur Regulierung der Transkription einer DNA-Sequenz bereit, umfassend die funktionelle Verbindung der DNA-Sequenz mit einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die die gesamte oder ein beliebiges Fragment, beliebigen Bereich oder cis-Element einer Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 36–51.
In einer anderen Anwendungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verleihen einer Embryonalgewebe- oder Kallusgewebe-verstärkten oder spezifischen Expression durch ein funktionelles Verbinden einer DNA-Sequenz bereit, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 36–51 oder einem beliebigen Fragment, Bereich oder cis-Element der offengelegten Sequenzen, mit einer transkribierbaren Sequenz. Die Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente der offengelegten Promotoren, wie in SEQ ID NR: 36–51 gezeigt, die in der Lage sind, eine verstärkte Expression in Embryonal- oder Kallusgeweben den funktionell verbundenen DNA-Sequenzen zu verleihen, können hergestellt und unabhängig in neuartigen Kombinationen, einschließlich Multimere oder verkürzte Derivate, verwendet werden, und die neuartigen Promotoren können funktionell mit einer transkribierbaren DNA-Sequenz verbunden sein. Die offengelegten Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente der offengelegten Sequenzen, die in der Lage sind, eine verstärkte Expression in Embryonal- oder Kallusgeweben den funktionell verbundenen DNA-Sequenzen zu verleihen, können zusammen mit einem heterologen Promotor, einschließlich eines minimalen Promotors, verwendet sein, um einen neuartigen chimären oder hybriden Promotor zu bilden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze durch Einführung eines DNA-Konstrukts in die Zelle bereit, umfassend (i) einen Promotor, umfassend eine Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 36–51 oder Fragmenten, Bereichen oder cis-Elemente davon, und an den Promotor funktionell gebunden (ii) eine transkribierbare DNA-Sequenz und (iii) einen 3'-nicht-translatierten Bereich.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Isolieren von wenigstens einer 5' regulatorischen Sequenz mit einem erwünschten Expressionsprofil einer Zielpflanze von Interesse bereit, durch Bewertung einer Kollektion von Nukleinsäuresequenzen von ESTs, die von wenigstens einer aus einem Pflanzentyp von Interesse hergestellten cDNA-Bibliothek abstammen, Vergleich der EST-Sequenzen von wenigstens einer Zielpflanzen-cDNA-Bibliothek und wenigstens einer Nichtziel-cDNA-Bibliothek von ESTs von einem anderen pflanzlichen Zelltyp, Subtraktion der gewöhnlichen EST-Sequenzen, die sowohl in Ziel als auch Nichtziel-Bibliotheken gefunden werden, Konstruktion Gen-spezifischer Primer aus den verbleibenden ESTs nach den Subtraktionen, die für die exprimierten Zielsequenzen repräsentativ sind und Isolieren der wenigstens einen korrespondierenden 5' flankierenden und regulatorischen Sequenz, die wenigstens eine Promotorsequenz aus einer genomischen Bibliothek umfasst, die aus der Zielpflanze unter Verwendung Gen-spezifischer Primer hergestellt ist.
Die vorhergehenden und weitere Aspekte der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen noch offensichtlicher.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Karte des Plasmids pMON19469
2 ist eine Karte des Plasmids pMON39721
3 ist eine Karte des Plasmids pMON51002
4 ist eine Karte des Plasmids pMON51008
5 ist eine Karte des Plasmids pMON51001
6 ist eine Karte des Plasmids pMON51009
7 ist eine Karte des Plasmids pMON51003
8 ist eine Karte des Plasmids pMON51010
Plasmid pMON19469 ist ein Expressionsvektor, der aus den folgenden genetischen Komponenten besteht: P-CaMV.35S ist der Promotor für die 35S RNA von CaMV, der ein hintereinanderliegendes Duplikat des –90 bis –300 Bereichs enthält (US Patent, Nr. 5.322.938, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt); I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Mais Hitzeschock-Proteins, wie in U.S. Patent, Nr. 5.593.874 und 5.859.347 beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt); Ec.GUS:1 ist die codierende Region für β-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; ori-M13 und ori-pUC sind Replikationsursprünge; AMP ist die codierende Region für die Ampicillin-Selektion.
Plasmid pMON39721 ist ein doppelt begrenzter (rechte (RG) und linke (LG) T-DNA Grenzen) Pflanzentransformationsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: P-CaMV.35S ist der CaMV 35S Promotor (US Patent,-Nr. 5.352.605, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt); AGRTU.nptII ist die codierende Sequenz von Agrobacterium tumefaciens, die eine Kanamycin-Antiobiotikaresistenz verleiht; T-AGRTU.nos ist die 3'-Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens, das aus Agrobacterium tumefaciens isoliert ist; ori322 und oriV sind Replikationsursprünge; aad ist die codierende Sequenz, die eine Resistenz gegen die Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin verleiht.
Plasmid pMON51002 ist ein Expressionsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-70025861 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomicchen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp7p Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U. S. Patenten, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; ori322 und ori-pUC sind Replikationsursprünge; AMP ist der codierende Bereich für die Ampicillinselektion.
Plasmid pMON51008 ist ein doppelt begrenzter (rechte (RG) und linke (LG) T-DNA Grenzen) Pflanzentransformationsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-70025861 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomischen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischeniegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U. S. Patenten, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; P-CaMV.35S ist der CaMV 35S Promotor (US Patent, Nr. 5.352.605, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt); AGRTU.nptII ist die codierende Sequenz von Agrobacterium tumefaciens, die eine-Kanamycin-Antiobiotikaresistenz verleiht; T-AGRTU.nos ist die 3'-Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens, das aus Agrobacterium tumefaciens isoliert ist; ori322 und oriV sind Replikationsursprünge; aad ist die codierende Sequenz, die eine Resistenz gegen die Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin verleiht.
Plasmid pMON51001 ist ein Expressionsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-700267629 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomischen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U. S. Patenten, Nr, 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsvnthase-Gens; ori322 und ori-pUC sind Replikationsursprünge; AMP ist der codierende Bereich für die Ampicillinselektion.
Plasmid pMON51009 ist ein doppelt begrenzter (rechte (RG). und linke (LG) T-DNA Grenzen) Pflanzentransformationsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-700267629 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Ēmbryo genomischen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U. S. Patenten, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; P-CaMV.35S ist der CaMV 35S Promotor (US Patent, Nr. 5,352.605, hier durch Quellenangabe vollständig, eingefügt); AGRTU.nptII ist die codierende Sequenz von Agrobacterium tumefaciens, die eine Kanamycin-Antiobiotikaresistenz verleiht; T-AGRTU.nos ist die 3'-Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens, das aus Agrobacterium tumefaciens isoliert ist; ori322 und oriV sind Replikationsursprünge; aad ist die codierende Sequenz, die eine Resistenz gegen die Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin verleiht.
Plasmid pMON51003 ist ein Expressionsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-700263624 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomischen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U. S. Patenten, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; ori322 und ori-pUC sind Replikationsursprünge; AMP ist der codierende Bereich für die Ampicillinselektion.
Plasmid pMON51010 ist ein doppelt begrenzter (rechte (RG) und linke (LG) T-DNA Grenzen) Pflanzentransformationsvektor, der aus folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-700263624 ist der Promotor für die Zea mays Embryo-verstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomischen Bibliothek isoliert ist; I-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U, S. Patenten, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt; Ec.GUS:1 ist der codierende Bereich für beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal des Nopalinsynthase-Gens; P-CaMV.35S ist der CaMV 35S Promotor (US Patent, Nr, 5.352,605, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt); AGRTU.nptII ist die codierende Sequenz von Agrobacterium tumefaciens, die eine Kanamycin-Antiobiotikaresistenz verleiht; T-AGRTU.nos ist die 3'-Terminationssequenz des Nopalinsynthase-Gens, das aus Agrobacterium tumefaciens isoliert ist; ori322 und oriV sind Replikationsursprünge; aad ist die codierende Sequenz, die eine Resistenz gegen die Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin verleiht.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Anmeldung beansprucht Priorität vor der U.S. vorläufigen Anmeldung, Nr. 60/151.892, eingereicht am 09/01/99.
Gene von Interesse (GOI), die eine Toleranz für Herbizide oder Antibiotika verleihen, Insektenprotein-Gene, Krankheitsresistenz-Gene, Gene die das Wachstum, den Metabolismus oder die Entwicklung der Pflanze, die Ölproduktion und modifizierte Öle beeinflussen, und Gene, die für pharmazeutische Proteine codieren, werden zum Beispiel als Aspekte der Erfindung betrachtet, Derartige hier beschriebene Zusammensetzungen und Verfahren können bezogen auf jede Pflanze verwendet sein, die mit Verfahren der pflanzlichen Biotechnologie gentechnisch verändert werden kann. Die Zusammensetzungen und Verfahren beschreiben hier DNA-Sequenzen, die für eine Expression von transgenen Produkten in Pflanzenembryonen und Pflanzensamen zweckdienlich sind.
Die folgenden Definitionen und Verfahren dienen einer besseren Definition der vorliegenden Erfindung und der Anleitung des Fachmanns bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung. Falls nichts anderes angegeben ist, sind die Begriffe gemäß der herkömmlichen Verwendung vom Fachmann zu verstehen. Die Nomenklatur für DNA-Basen entspricht 37 CFR § 1.822. Es wird die Einbuchstaben- und Dreibuchstabenstandardbezeichnung für Aminosäure-Reste verwendet.
„Nukleinsäure-(Sequenz)" oder „Polynukleotid-(Sequenz)" bezieht sich auf einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, d.h. ein Polymer aus Desoxyribonukleotid- beziehungsweise Ribonukleotidbasen, das vom 5'-Ende (stromaufwärts) zum 3'-Ende (stromabwärts) gelesen wird. Die Nukleinsäure kann den Sense- oder den komplementären Antisense-Strang repräsentieren.
„Nativ" bezieht sich auf eine natürlich vorkommende („Wildtyp") Nukleinsäuresequenz. „Heterologe" Sequenz bezieht sich auf eine Sequenz, die von einer fremden Quelle oder Spezies stammt oder, falls es die gleiche Quelle ist, bezogen auf ihr Original modifiziert ist.
Eine „isolierte" Nukleinsäuresequenz ist im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuresequenzen getrennt oder gereinigt, mit denen die Nukleinsäuresequenz normalerweise in der Zelle des Organismus assoziiert ist, in dem die Nukleinsäuresequenz natürlicherweise vorkommt, d.h. andere chromosomale DNA oder extrachromosomale DNA. Der Ausdruck umfasst Nukleinsäuren, die biochemisch gereinigt sind, so dass im Wesentlichen kontaminierende Nukleinsäuren und andere Zellbestandteile entfernt sind. Der Ausdruck umfasst ebenfalls rekombinante Nukleinsäuren und chemisch synthetisierte Nukleinsäuren.
Der Ausdruck „im Wesentlichen gereinigt", wie er hier Verwendung findet, bezieht sich auf ein Molekül, das im Wesentlichen von allen anderen Molekülen getrennt ist, mit denen es normalerweise in seinem nativen Zustand assoziiert ist. Bevorzugter, ein im Wesentlichen gereinigtes Molekül ist die Spezies, die in einem Präparat überwiegend vorhanden ist. Ein im Wesentlichen gereinigtes Molekül ist zu mehr als 60% frei, bevorzugt zu 75% frei, noch bevorzugter zu 90% frei von anderen in dem natürlichen Gemisch vorhandenen Molekülen (ohne Lösemittel). Der Ausdruck „im Wesentlichen gereinigt" umfasst beabsichtigterweise keine Moleküle, die in ihrem nativen Zustand vorliegen.
Eine erste Nukleinsäuresequenz zeigt eine „wesentliche Identität" zu einer Referenznukleinsäuresequenz, falls, wenn sie optimal (mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder – deletionen, die weniger als 20 Prozent der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ausmachen) mit der anderen Nukleinsäure (oder ihrem komplementären Strang) aliniert ist, wenigstens etwa 75% Nukleotidsequenz-Identität, bevorzugt wenigstens etwa 80% Identität, bevorzugter wenigstens etwa 85% Identität und am bevorzugtesten wenigstens etwa 90% Identität über ein Vergleichsfenster von wenigstens 20 Nukleotid-Positionen, bevorzugt wenigstens 50 Nukleotid-Positionen, bevorzugter wenigstens 100 Nukleotid-Positionen, am bevorzugtesten über die gesamte Länge der ersten Nukleinsäure vorliegt. Eine optimale Alinierung der Sequenzen zum Alinieren eines Vergleichsfensters kann mit Hilfe des Algorithmus der lokalen Homologie nach Smith und Waterman Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; mit Hilfe der Homologie-Ausrichtung nach Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; mit Hilfe der Suche nach dem Ähnlichkeitsverfahren von Pearson und Lipman; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; bevorzugt mit Hilfe von Computer-gestützten Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, durchgeführt sein. Die Referenznukleinsäure kann ein vollständiges Molekül oder ein Teil eines längeren Moleküls sein. Alternativ besitzen zwei Nukleinsäuren eine wesentliche Identität, falls eine mit der anderen unter stringenten Bedingungen hybridisiert, wie es unten definiert ist.
Eine erste Nukleinsäuresequenz ist „funktionell verbunden" mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wenn die Sequenzen so angeordnet sind, dass die erste Nukleinsäuresequenz die Funktion der zweiten Nukleinsäuresequenz beeinflusst. Bevorzugt sind die beiden Sequenzen Teil eines einzigen zusammenhängenden Nukleinsäuremoleküls und bevorzugter grenzen sie aneinander. Zum Beispiel ist ein Promotor funktionell mit einem Gen verbunden, wenn der Promotor die Transkription des Gens in einer Zelle reguliert oder vermittelt.
Eine „rekombinante" Nukleinsäure wird durch eine künstliche Kombination zweier sonst getrennter Sequenzabschnitte, z.B. durch chemische Synthese oder durch Manipulation isolierter Nukleinsäure-Abschnitte mit Hilfe gentechnischer Verfahren, hergestellt. Techniken zur Manipulation von Nukleinsäuren sind bekannt (siehe Sambrook et al., 1989 und Ausubel et al., 1992). Verfahren zur chemischen Synthese von Nukleinsäuren sind zum Beispiel in Beaucage und Carruthers, Tetra Letts. 22:1859–1862, 1981 und Matteucci et al., J. Am.
Chem. Soc. 103:3185, 1981, diskutiert. Die chemische Synthese von Nukleinsäuren kann zum Beispiel mit kommerziellen automatisierten Oligonukleotid-Synthetisierern durchgeführt werden.
Eine „synthetische Nukleinsäuresequenz" kann zur verstärkten Expression in bestimmten Wirtszellen und für Klonierungszwecke in geeignete Vektoren konstruiert und chemisch synthetisiert werden. Wirtszellen zeigen oftmals ein bevorzugtes Codonverwendungsmuster (Murray et al., 1989). Synthetische DNAs, die für eine verstärkte Expression in bestimmten Wirtszellen konstruiert sind, sollten deshalb das Codonverwendungsmuster in der Wirtszelle widerspiegeln. Computerprogramme sind für diese Zwecke verfügbar, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, der „BestFit" oder „Gap" Programme der Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711.
„Amplifikation" von Nukleinsäuren oder „Nukleinsäure-Reproduktion" bezeichnet die Herstellung zusätzlicher Kopien von einer Nukleinsäuresequenz und wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Technologien durchgeführt. Eine Reihe von Amplifikationsverfahren sind in der Technik bekannt und beschrieben, unter anderem in U.S. Patenten, Nr. 4.683.195 und 4.683.202 und in PCR-Protokollen: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. In der PCR ist ein kurzes Oligonukleotid mit einer definierten Sequenz, das an eine DNA-Matrize assoziiert ist, um die Polymerase-Kettenreaktion zu starten, als Primer bezeichnet.
„Transformiert", „transfiziert" oder „transgen" bezieht sich auf eine Zelle, Gewebe, Organ oder Organismus, in den/das eine fremde Nukleinsäure, wie beispielsweise ein rekombinanter Vektor, eingeführt worden ist. Vorzugsweise ist die eingeführte Nukleinsäure in die genomische DNA der/des empfangenden Zelle, Gewebes, Organs oder Organismus integriert, so dass die eingeführte Nukleinsäure an die Nachkommen weitergegeben wird. Eine) „transgene(r)" oder „transformierte(r)" Zelle oder Organismus schließt die Nachkommen der Zelle oder des Organismus mit ein und die Nachkommen, die aus einem Züchtungsprogramm hervorgehen, das eine derartige „transgene" Pflanze als ein Elter in einer Kreuzung verwendet und einen veränderten Phänotyp zeigt, der aus dem Vorhandensein eines rekombinanten Konstrukts oder Vektors resultiert.
Der Ausdruck „Gen" bezieht sich auf chromosomale DNA, Plasmid-DNA, cDNA, synthetische DNA oder andere DNA, die ein Peptid, Polypeptid, Protein oder RNA-Molekül codiert und Bereiche, die die codierende Sequenz flankieren und an der Regulation der Expression beteiligt sind. Einige Gene können in mRNA transkribiert und in Polypeptide translatiert werden (strukturelle Gene); andere Gene können in RNA (z.B. rRNA, tRNA) transkribiert werden; andere Gentypen fungieren als Regulatoren der Expression (Regulatorgene).
„Expression" eines Gens bezeichnet die Transkription eines Gens, um die entsprechende mRNA herzustellen, und Translation dieser mRNA, um das entsprechende Genprodukt herzustellen, d.h. ein Peptid, Polypeptid oder Protein. Genexpression wird von regulatorischen Elementen, einschließlich 5' regulatorischer Elemente wie Promotoren, gesteuert oder moduliert.
„Genetische Komponente" bezieht sich auf jede(s) Nukleinsäuresequenz oder genetisches Element, die/das ebenfalls eine Komponente oder Teil eines Expressionsvektors sein kann. Beispiele genetischer Komponenten umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Promotorregionen, 5'-nicht-translatierte Leader, Introns, Gene, 3'-nicht-translatierte Bereiche und andere regulatorische Sequenzen, die die Transkription oder Translation einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen beeinflussen.
Die Ausdrücke „rekombinantes DNA-Konstrukt", „rekombinanter Vektor", „Expressionsvektor" oder „Expressionskassette" bezieht sich auf jedes Agens, wie ein Plasmid, ein Cosmid, Virus, BAC (bakterielles artifizielles Chromosom), eine autonom replizierende Sequenz, Phage oder lineare oder zirkuläre einzel- oder doppelsträngige DNA- oder RNA-Nukleotidsequenz, die aus einer beliebigen Quelle stammen und zur genomischen Integration oder autonomen Replikation fähig sind, umfassend ein DNA-Molekül, in dem eine oder mehrere DNA-Sequenzen in einer funktionell wirksamer Weise verbunden sind.
„Komplementär" bezieht sich auf die natürliche Assoziierung von Nukleinsäuresequenzen mittels Basenpaarung (A-G-T Paare mit der komplementären Sequenz T-C-A), Die Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann partiell sein, falls nur einige Nukleinsäurepaare komplementär sind; oder vollständig, falls alle Basenpaare komplementär sind. Das Ausmaß der Komplementarität beeinflusst die Effizienz und Stärke der Hybridisierungs- und Amplifikationsreaktionen.
„Homologie" bezeichnet den Grad der Ähnlichkeit zwischen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen in Form von prozentualer Nukleotid- oder beziehungsweise Aminosäurepositionsidentität, d.h. Sequenzähnlichkeit oder -identität. Homologie bezieht sich ebenfalls auf die Vorstellung ähnlicher funktioneller Eigenschaften bei verschiedenen Nukleinsäuren oder Proteinen.
„ESTs" oder exprimierte Sequenz-Tags sind kurze Sequenzen von zufällig ausgewählten Klonen von einer cDNA (oder komplementären DNA) Bibliothek, die für die cDNA-Inserts dieser zufällig ausgewählten Klone repräsentativ sind (McCombie, et al., Nature Genetics, 1:124, 1992; Kurata, et al., Nature Genetics, 8:365, 1994; Okubo, et al., Nature Genetics, 2:173, 1992).
Der Ausdruck „elektronischer Northern" bezeichnet eine Computer-gestützte Sequenzanalyse, die einen auf Parameter basierenden elektronischen Abgleich von Sequenzen aus mehreren DNA-Bibliotheken erlaubt und der Forscher identifiziert, einschließlich Häufigkeit in EST-Populationen in mehreren DNA-Bibliotheken, oder ausschließlich in EST-Sets von einer oder Kombination von Bibliotheken.
„Teilmengen-Bildung" bezeichnet ein Verfahren zum Vergleich von Nukleinsäuresequenzen von verschiedenen oder mehreren Quellen, das zur Bewertung eines Expressionsprofils der Nukleinsäuresequenzen verwendet sein kann, die die Transkriptionsaktivität und Informationsstabilität in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt oder unter bestimmten Bedingungen widerspiegeln.
„Promotor" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die sich stromaufwärts oder 5' zu einem Translationsstart-Codon eines offenen Leserahmens (oder Protein-codierenden Region) eines Gens befindet und an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase II oder anderer Proteine (trans-wirkender Transkriptionsfaktoren) beteiligt ist, um die Transkription zu starten. Ein „pflanzlicher Promotor" ist ein nativer oder nicht-nativer Promotor, der in Pflanzenzellen funktionsfähig ist. Konstitutive Promotoren sind in den meisten oder allen Geweben einer Pflanze über die gesamte pflanzliche Entwicklung funktionsfähig. Gewebe-, Organ- oder Zell-spezifische Promotoren werden nur oder überwiegend in einem bestimmten Gewebe, Organ oder beziehungsweise Zelltyp exprimiert. Ein Promotor kann eher eine verstärkte Expression zeigen, d.h. einen höheren Expressionslevel in einem Teil (z.B. Zelltyp, Gewebe oder Organ) der Pflanze verglichen mit anderen Teilen der Pflanze als in einem gegebenen Gewebe, Organ oder Zelltyp „spezifisch" exprimiert zu werden. Temporär regulierte Promotoren sind nur oder überwiegend während bestimmter Zeiträume der Pflanzenentwicklung oder zu bestimmten Tageszeiten funktionsfähig, wie bei Genen der Fall ist, die zum Beispiel mit dem circadianen Rhythmus assoziiert sind. Induzierbare Promotoren exprimieren selektiv eine funktionell verbundene DNA-Sequenz als Reaktion auf das Vorhandensein eines endogenen oder exogenen Stimulus zum Beispiel durch chemische Verbindungen (chemische Induktoren) oder als Reaktion auf umweltliche, hormonale, chemische und/oder Entwicklungssignale. Induzierbare oder regulierte Promotoren umfassen zum Beispiel Promotoren, die von Licht, Hitze, Stress, Überflutung, Trockenheit, Phytohormonen, Wunden oder Chemikalien wie Ethanol, Jasmonat, Salicylsäure oder Safeners reguliert sind.
Jeder pflanzlicher Promotor kann als eine 5' regulatorische Sequenz für die Modulation der Expression eines bestimmten Gens oder bestimmter Gene verwendet sein. Ein bevorzugter Promotor wäre ein pflanzlicher RNA-Polymerase II Promotor. Pflanzliche RNA-Polymerase II Promotoren, wie diejenigen von anderen höheren Eukaryoten, besitzen komplexe Strukturen und sind aus mehreren verschiedenen Elementen zusammengesetzt. Ein derartiges Element ist die TATA-Box oder Goldberg-Hogness-Box, die für die korrekte Expression von eukaryotischen Genen in vitro und für eine genaue, effiziente Initiation der Transkription in vivo erforderlich ist. Die TATA-Box ist typischerweise ungefähr –25 bis –35 positioniert, das heißt, an Basenpaare (bp) 25 bis 35 stromaufwärts (5') der Transkriptionsinitiationsstelle oder cap-Stelle, die als Position +1 definiert ist (Breathnach und Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50:349–383, 1981; Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds.,. Seiten 211–227, 1983). Ein weiteres übliches Element, die CCAAT-Box, befindet sich zwischen –70 und –100 bp. In Pflanzen kann die CCAAT-Box eine andere Konsenssequenz besitzen als die funktionsfähige analoge Sequenz von Säugerpromotoren (das planzliche Analogon ist als die „AGGA-Box" bezeichnet worden, um sie von ihrem tierischen Gegenstück zu unterscheiden; Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., Seiten 211–227, 1983). Zusätzlich umfassen praktisch alle Promotoren zusätzliche stromaufwärts liegende aktivierende Sequenzen oder Enhancer (Benoist und Chambon, Nature 290:304–310, 1981; Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:943–947, 1981; und Khoury und Gruss, Cell 27:313–314, 1983), die sich von etwa –100 bp bis –1.000 bp oder weiter stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle erstrecken.
Wenn derartige Promotoren an heterologe DNA-Sequenzen fusioniert sind, veranlassen sie normalerweise die Transkription der fusionierten Sequenz auf eine Weise, die ähnlich der Transkription der Gensequenz ist, mit der der Promotor normalerweise verbunden ist. Promotorfragmente, die regulatorische Sequenzen umfassen, können hinzugefügt sein (zum Beispiel an das 5'-Ende fusioniert oder innerhalb inseriert, wobei ein aktiver Promotor seine eigenen partiellen oder vollständigen regulatorischen Sequenzen besitzt (Fluhr et al., Science 232:1106–1112, 1986; Ellis et al., EMBO J. 6:11–16, 1987; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Poulsen und Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16–23, 1988; Comai et al., Plant Mol. Biol. 15:373–381, 1991). Alternativ können heterologe regulatorische Sequenzen an der 5' stromaufwärts liegenden Region eines inaktiven, verkürzten Promotors hinzugefügt sein, z.B. eines Promotors, der nur den Kern von TATA und manchmal die CCAAT-Elemente umfasst (Fluhr et al., Science 232:1106–1112, 1986; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225:65–71, 1991).
Promotoren sind typischerweise aus mehreren verschiedenen „cis-wirkenden transkriptionellen regulatorischen Elementen" oder einfach „cis-Elementen" zusammengesetzt, wobei jedes von diesen einen unterschiedlichen Aspekt der Gesamtsteuerung der Genexpression verleihen kann (Ellis et al., EMBO J. 6:11–16, 1987; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Benfey et al., EMBO J. 9:1677–1684, 1990). „cis-Elemente" binden trans-wirkende Proteinfaktoren, die die Transkription regulieren. Einige cis-Elemente binden mehr als einen Faktor und trans-wirkende Transkriptionsfaktoren können mit verschiedenen Affinitäten mit mehr als einem cis-Element wechselwirken (Johnson und McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58:799–839, 1989). Pflanzliche Transkriptionsfaktoren, die cis-Elementen entsprechen, und Analyse ihrer Wechselwirkung sind beispielsweise diskutiert in: Martin, Curr. Opinions Biotech. 7:130–138, 1996; Murai, In: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, Seiten 397–422; und Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, Seiten 233–300. Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können „cis-Elemente" enthalten, die die Genexpression modulieren können.
Cis-Elemente können mit einer Reihe an Techniken identifiziert werden, einschließlich Deletionsanalyse, d.h. Deletion eines oder mehrerer Nukleotide vom 5'-Ende oder innerhalb eines Promotors; DNA-Bindeprotein-Analyse unter Verwendung von Dnase I Footprinting-Methylierungsinterferenz, Elektrophorese-Mobilitätsverschiebungstests, in vivo genomisches Footprinting mit Hilfe Ligation-vermittelter PCR und andere herkömmliche Tests, oder durch Sequenzähnlichkeit mit bekannten cis-Element-Motiven mit Hilfe herkömmlicher Sequenzvergleichsverfahren. Die Feinstruktur eines cis-Elements kann durch Mutagenese (oder Substitution) eines oder mehrerer Nukleotide oder mit anderen herkömmlichen Verfahren näher untersucht werden. Siehe z.B. Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, Seiten 397–422; und Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, Seiten 233–300.
Cis-Elemente können durch chemische Synthese oder durch Klonierung von Promotoren erhalten werden, die derartige Elemente enthalten, und sie können mit zusätzlichen flankierenden Sequenzen synthetisiert werden, die zweckdienliche Restriktionsenzymstellen enthalten, um die nachfolgende Manipulation zu erleichtern. In einer Anwendungsform sind die Promotoren aus mehreren verschiedenen „cis-wirkenden transkriptionellen regulatorischen Elementen" oder einfach „cis-Elementen" zusammengesetzt, wobei jedes von diesen einen unterschiedlichen Aspekt der Gesamtsteuerung der Genexpression verleihen kann (Ellis et al., EMBO J. 6:11–16, 1987; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Benfey et al., EMBO J. 9:1677–1684, 1990). Zum Beispiel können Kombinationen von cis-Elementbereichen oder -fragmenten des 35S Promotors Gewebespezifische Expressionsmuster zeigen (siehe U. S. Patent 5.097.025, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt). In einer Anwendungsform können Sequenzbereiche, die „cis-Elemente" der Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NR: 36–51 umfassen, unter Verwendung von Computerprogrammen identifiziert werden, die für die Identifizierung von cis-Elementen, Domänen oder Motiven innerhalb von Sequenzen mit Hilfe eines Vergleichs mit bekannten cis-Elementen spezifisch entwickelt sind, oder können zum Alinieren mehrerer 5' regulatorischer Sequenzen verwendet sein, um neuartige cis-Elemente zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst cis-Elemente von SEQ ID NR: 36–51 oder Homologe von cis-Elementen, von denen bekannt ist, dass sie die Genregulation bewerkstelligen und eine Homologie mit den Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung zeigen. Mehrere derartige Elemente sind in der Literatur bekannt, wie die Elemente, die von zahlreichen Faktoren wie Licht, Hitze oder Stress reguliert sind; Elemente, die von Pathogenen oder Chemikalien reguliert oder induziert sind und ähnliche. Derartige Elemente können entweder die Genexpression positiv oder negativ in Abhängigkeit der Bedingungen regulieren. Beispiele für cis-Elemente können umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, auf Sauerstoff reagierende Elemente (Cowen et al., J, Biol. Chem. 268(36):26904, 1993), Licht regulatorische Elemente (siehe zum Beispiel Bruce und Quaill, Plant Cell 2(11):1081, 1990, und Bruce et al., EMBO J. 10:3015, 1991, ein cis-Element, das auf Methyljasmonat-Behandlung reagiert (Beaudouin und Rothstein, Plant Mol. Biol. 33:835, 1997, auf Salicylsäurereagierende Elemente (Strange et al., Plant J. 11:1315, 1997, auf Hitzeschock reagierende Elemente (Pelham et al., Trends Genet. 1:31, 1985, Elemente, die auf Wunden und abiotischen Stress reagieren (Loace et al., Proc. Natl, Acad. Sci. U. S. A. 89:9230, 1992; Mhiri et al., Plant Mol. Biol. 33:257, 1997), Elemente, die auf niedere Temperaturen reagieren (Baker et al., Plant Mol. Biol. 24:701, 1994; Jiang et al., Plant Mol. Biol. 30:679, 1996; Nordin et al., Plant Mol. Biol. 21:641, 1993; Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:23515, 1992) und auf Trockenheit reagierende Elemente (Yamaguchi et al., Plant Cell 6:251–264, 1994; Wang et al., Plant Mol. Biol. 28:605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant Science 2:48, 1997).
Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb Bereiche, Domänen, Fragmente oder "cis-Elemente" der offengelegten Nukleinsäure-Moleküle und die Nukleinsäure-Fragmente können jeden angrenzenden Bereich der offengelegten Sequenzen umfassen. Die Promotorregionen der vorliegenden Erfindung, wie in SEQ ID NR: 36–51 gezeigt, können ein oder mehrere regulatorische Elemente enthalten, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, „cis-Elemente" oder Domänen, die in der Lage sind, die Transkription von funktionell verbundenen DNA-Sequenzen in Pflanzensamen und Geweben der Pflanzensamen zu regulieren. Pflanzensamengewebe umfassen den Embryo, der aus embryonalen Zellen und Embryogewebe besteht, wie das Scutellum, das Endosperm, das Aleuron und die Samenschale.
Pflanzliche Promotoren können Promotoren umfassen, die mittels Manipulation bekannter Promotoren hergestellt sind, um synthetische, chimäre oder hybride Promotoren herzustellen. Derartige Promotoren können cis-Elemente von einem oder mehreren Promotoren kombinieren, zum Beispiel durch Hinzufügen einer heterologen regulatorischen Sequenz an einen aktiven Promotor mit seinen eigenen partiellen oder vollständigen regulatorischen Sequenzen (Ellis et al., EMBO J. 6:11–16, 1987; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Poulsen und Chua,Mol. Gen. Genet. 214:16–23, 1988 ; Comai et al., Plant Mol. Biol. 15:373–381, 1991). Chimäre Promotoren sind ebenfalls durch Hinzufügen einer heterologen regulatorischen Sequenz an die 5' stromaufwärts Region eines inaktiven, verkürzten Promotors, d.h. ein Promotor, der nur den TATA Kern und gegebenenfalls die CCAAT-Elemente umfasst (Fluhr et al., Science 232:1106–1112, 1986; Strittmatter und Chua, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8986–8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225:65–71, 1991). Die Gestaltung, Konstruktion und Verwendung chimärer oder hybrider Promotoren, die wenigstens eines der cis-Elemente von SEQ ID NR: 36–51 zur Modulation der Expression funktionell verbundener Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist folglich von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Promotorsequenzen, Fragmente, Bereiche oder cis-Elemente davon von SEQ ID NR: 36–51 sind in der Lage, DNA-Sequenzen in Embryonal- oder Kallusgeweben zu transkribieren, und können deshalb die Expression von Genen in diesen Geweben selektiv regulieren. Promotorsequenzen, die die Genexpression bevorzugt in Embryonal- oder Kallusgeweben regulieren, sind bei der Transformation und für die selektive Expression von Genen in maternalen Geweben nützlich. Zum Beispiel können Kallus-verstärkte oder Embryo-verstärkte Promotoren mit bewertbaren Markern wie GUS oder GFP funktionell verbunden sein. Diese Reportergene codieren für β-Glucuronidase beziehungsweise ein grün fluoreszierendes Protein und, wenn sie funktionell mit den 5' regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung verbunden sind, können sie einen Hinweis auf das Transformationspotenzial von Embryonalgeweben und für die Optimierung von Transformations- und Regenerationsparametern liefern. Die 5' regulatorische Sequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls für eine selektive Transkription eines beliebigen Gens oder Genen von Interesse verwendet sein, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, derjenigen Gene für eine Verbesserung Samenqualität.
Die Fortschritte in der Genomik, die Molekular- und Bioinformatiktechniken umfasst, haben zu einem schnellen Sequenzieren und zu schnellen Analysen einer großen Anzahl von DNA-Proben von einer enormen Anzahl von Zielen geführt, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Pflanzenspezies mit agronomischer Bedeutung. Um die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung aus einer Datenbank oder Kollektion von cDNA-Sequenzen zu identifizieren, beinhaltet der erste Schritt die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken von spezifischen pflanzlichen Gewebezielen von Interesse. Zusammengefasst: die cDNA-Bibliotheken werden zuerst aus diesen Geweben konstruiert, die zu einem bestimmten Entwicklungsstadium oder unter bestimmten Umweltbedingungen geerntet sind. Durch Identifizierung differentiell exprimierter Gene in pflanzlichen Geweben in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Bedingungen können die entsprechenden regulatorischen Sequenzen dieser Gene identifiziert und isoliert werden. Transkript-Abbildung ermöglicht die Identifizierung von Gewebe-bevorzugten Sequenzen basierend auf der spezifischen Abbildung von Nukleinsäuresequenzen von einer cDNA-Bibliothek. Transkript-Abbildung, wie der Begriff hier verwendet ist, bedeutet eine Analyse, die die Häufigkeit von exprimierten Genen in einer oder mehreren Bibliotheken vergleicht. Die Klone, die in einer cDNA-Bibliothek enthalten sind, werden sequenziert und die Sequenzen werden mit Sequenzen von öffentlich zugänglichen Datenbanken verglichen. Computergestützte Verfahren erlauben dem Forscher, Abfragen zu machen, die Sequenzen von mehreren Bibliotheken vergleichen. Das Verfahren erlaubt eine schnelle Identifizierung van Klonen von Interesse verglichen mit herkömmlichen Hybridisierungs- und Subtraktionsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Unter Verwendung herkömmlicher Methodologien können cDNA-Bibliotheken von der mRNA (Messenger-RNA) eines gegebenen Gewebes oder Organismus konstruiert sein unter Verwendung von poly dT Primern und reverser Transkriptase (Efstratiadis et al., Cell 7:279, 1976; Higuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 73:3146, 1976; Maniatis et al., Cell 8:163, 1976; Land et al., Nucleic Acids Res. 9:2251, 1981; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 2:161, 1982; Gubler et al., Gene 25:263, 1983.).
Mehrere Verfahren können angewandt werden, um vollständige DNA-Konstrukte zu erhalten. Zum Beispiel kann terminale Transferase zum Hinzufügen homopolymerer Schwänze von dC-Resten an die freien Hydroxyl-Gruppen verwendet sein (Land et al., Nucleic Acids Res. 9:2251, 1981). Dieser Schwanz kann dann von einem poly dG Oligo hybridisiert werden, das als ein Primer für die Synthese von einem vollständigen zweiten DNA-Strang dienen kann. Okayama und Berg berichten von einem Verfahren zur Gewinnung von vollständigen DNA-Konstrukten. Dieses Verfahren ist durch die Verwendung synthetischer Primer-Adapter vereinfacht worden, die sowohl homopolymere Schwänze zum Starten der Synthese des ersten und zweiten Strangs als auch Restriktionsstellen zur Klonierung in Plasmide (Coleclough et al., Gene 34:305, 1985) und Bakteriophagen-Vektoren besitzen (Krawinkel et al., Nucleic Acids Res. 14:1913, 1986; und Han et al., Nucleic Acids Res. 15:6304, 1987).
Diese Strategien können mit weiteren Strategien zur Isolierung seltener mRNA- Populationen gekoppelt sein. Zum Beispiel enthält eine typische Säugerzelle zwische 10.000 und 30.000 verschiedene mRNA-Sequenzen. Davidson, Gene Activity in Early Development, 2nd ed., Academic Press, New York, 1976. Die Anzahl von Klonen, die erforderlich ist, um eine bestimmte Wahrscheinlichkeit zu erreichen, mit der eine wenig häufige mRNA in einer cDNA-Bibliothek vorhanden ist, ist N = (1n(1–P))/(1n(1–1/n)), wo N die Anzahl von erforderlichen Klonen ist, P die erwünschte Wahrscheinlichkeit ist und 1/n der Anteil an der Gesamt-mRNA ist, der von einer einzigen seltenen mRNA repräsentiert ist (Sambrook et al., 1989).
Ein Verfahren zur Anreicherung von mRNA-Präparaten für Sequenzen von Interesse ist die Größenfraktionierung. Ein derartiges Verfahren ist die Fraktionierung mit Hilfe der Elektrophorese durch ein Agarosegel (Pennica et al., Nature 301:214, 1983). Ein anderes derartiges Verfahren nutzt die Sucrose-Gradientenzentrifugation in Gegenwart eines Agens wie Methylquecksilberhydroxid, das Sekundärstrukturen in der RNA denaturiert (Schweinfest et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 79:4997–5000, 1982).
Ein häufig angepasstes Verfahren ist die Konstruktion äquilibrierter oder normalisierter cDNA-Bibliotheken (Ko, Nucleic Acids Res. 18:5705, 1990; Patanjali, S. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1943, 1991). Typischerweise wird die cDNA-Population durch subtraktive Hybridisierung normalisiert. (Schmid, et al., J. Neurochem. 48:307; Fargnoli, et al., Anal. Biochem. 187:364, 1990; Travis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:1696; 1988; Kato, Eur. J. Neurosci. 2:704, 1990; und Schweinfest, et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 7:64, 1990). Die Subtraktion stellt ein weiteres Verfahren zur Verminderung der Population bestimmter Sequenzen in der cDNA-Bibliothek dar. (Swaroop, et al., Nucleic Acids Res. 19:1954, 1991). Normalisierte Bibliotheken können unter Verwendung des Soares-Verfahrens konstruiert werden (Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.) 91:9228, 1994). Dieser Versuchsansatz dient der Verminderung der anfangs 10.000-fachen Variation in einzelnen cDNA-Häufigkeiten, um Häufigkeiten in einer Größenordnung zu erreichen, während die Gesamtsequenzkomplexität der Bibliothek erhalten bleibt. Im Normalisierungsverfahren vermindert sich die Prävalenz sehr häufiger cDNA-Klone drastisch, Klone mit mittlerer Häufigkeit sind relativ unbeeinflusst und Klone für seltene Transkripte werden in ihrer Häufigkeit effektiv erhöht.
ESTs können mit mehreren Verfahren sequenziert werden. Es können zwei grundlegende Verfahren zum Sequenzieren der DNA angewandt werden, das Kettenabbruchverfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74:5463, 1977, und das chemische Abbauverfahren von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74:560, 1977. Automatisierung und Fortschritte in der Technik wie das Ersetzen von Radioisotopen durch ein auf Fluoreszenz basierendes Sequenzieren haben den erforderlichen Aufwand für das Squenzieren von DNA vermindert (Craxton, Methods, 2:20, 1991; Ju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:4347, 1995; Tabor und Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:6339, 1995). Sequenzier-Automaten sind von mehreren Herstellern erhältlich, zum Beispiel Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey (Pharmacia ALF), LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska (LI-COR 4.000) und Millipore, Bedford, Massachusetts (Millipore BaseStation).
Es ist festgestellt worden, dass ESTs, die länger als 150 bp sind, für Ähnlichkeitsrecherchen und Kartierung zweckdienlich sind (Adams et al., Science 252:1651, 1991). EST-Sequenzen liegen normalerweise im Längenbereich von 150–450 Basen. Dies ist die Länge der Sequenzinformation, die unter Verwendung der Sequenzdaten aus einem Laufs einfach und zuverlässig erzeugt wird. Typischerweise werden nur Sequenzdaten aus einem einzigen Lauf aus der cDNA-Bibliothek erhalten (Adams et al., Science 252:1651, 1991). Automatische Einzellauf-Sequenzierung führt typischerweise zu ungefähr 2–3% Fehler oder an Basenmehrdeutigkeit (Boguski et al., Nature Genetics, 4:332, 1993).
EST-Datenbanken sind von zum Beispiel von C. elegans (McCombrie, et al., Nature Genetics 1:124, 1992); von der humanen Leberzelllinie Hep2G (Okubo, et al., Nature Genetics 2:173, 1992); von der humanen Gehirn-RNA (Adams et al., Science 252:1651, 1991); Adams et al., Nature 355:632, 1992); von Arabidopsis, (Newman et al., Plant Physiol. 106:1241, 1994); und Reis (Kurata, et al., Nature Genetics 8:365, 1994) konstruiert oder partiell konstruiert worden. Die vorliegende Erfindung verwendet ESTs, die aus mehreren Bibliotheken isoliert worden sind und von Embryonal- und Kallusgewebe des Mais präpariert sind, als Werkzeug für die Identifizierung von Promotorsequenzen, die mit in diesen erwünschten Geweben exprimierten Genen verbunden sind, was dann die Isolierung von 5' regulatorischen Sequenzen wie Promotoren erleichtert, die die Gene regulieren.
Computer-gestützte Sequenzanalysen können zur Identifizierung differenziert exprimierter Sequenzen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, derjenigen Sequenzen, die in einem Gewebe verglichen mit einem anderen Gewebe exprimiert werden. Zum Beispiel kann ein unterschiedlicher Satz an Sequenzen von cDNA gefunden werden, die aus Pflanzengewebe wie Wurzelgewebe und Blattgewebe isoliert ist. Dementsprechend können Sequenzen von cDNA-Bibliotheken verglichen werden, die aus Pflanzen präpariert sind, die unter verschiedenen Umwelt- oder physiologischen Bedingungen gewachsen sind. Sobald die bevorzugten Sequenzen von der cDNA-Bibliothek von Interesse identifiziert sind, können die genomischen Klone von der genomischen Bibliothek isoliert werden, die aus dem Pflanzengewebe präpariert ist, und die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, 5' regulatorischer Sequenzen, können identifiziert und isoliert werden.
In einer bevorzugten Anwendungsform werden die exprimierten Sequenz-Tags (EST) Sequenzen von verschiedenen cDNA-Bibliotheken in einer Sequenzdatenbank katalogisiert. Die Datenbank wird zur Identifizierung von Promotor-Zielen von einem bestimmten Gewebe von Interesse verwendet. Die Selektion exprimierter Sequenz-Tags für die anschließende Promotorisolierung spiegelt das Vorhandensein einer oder mehrerer Sequenzen unter den repräsentativen ESTs von einer zufälligen Beprobung einer einzigen cDNA-Bibliothek oder einer Kollektion cDNA-Bibliotheken wider. Zum Beispiel erfolgt die Identifizierung regulatorischer Sequenzen, die die Expression von Transkripten in Embryonal- oder Kallusgewebe regulieren, mit Hilfe von ESTs, die in cDNA-Bibliotheken gefunden werden, die aus Embryonal- oder Kallusgewebe präpariert sind, und in anderen cDNA-Bibliotheken in der Datenbank in geringerer Häufigkeit vorkommen oder fehlen. Die identifizierten EST-Leads werden dann auf ihre relative Häufigkeit innerhalb der Bibliothek evaluiert und das Expressionsprofil für ein bestimmtes EST wird bewertet. Mit Häufigkeit, wie hier verwendet, ist gemeint, wie viel Mal ein Klon oder Cluster von Klonen in einer Bibliothek vorkommen. Die Sequenzen, die vermehrt oder in größerer Häufigkeit in einem spezifischen Gewebe oder Organ vorkommen, das ein Ziel-Expressionsprofil repräsentiert, werden auf diese Weise identifiziert und Primer können aus den identifizierten EST-Sequenzen konstruiert werden. Ein PCR-gestützter Versuchsansatz kann angewandt werden, um die flankierenden Bereiche von einer genomischen Bibliothek der Zielpflanze von Interesse zu amplifizieren. Mehrere Verfahren sind dem Fachmann bekannt, um unbekannte DNA-Sequenzen zu amplifizieren, die an die Kernregion einer bekannten Sequenz grenzt. Verfahren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, inverse PCR (IPCR), Vektorette PCR, Y-förmige PCR und Genom-Walking Ansätze.
In einer bevorzugten Anwendungsform wird eine genomische DNA, die an einen Adaptor ligiert ist, einem ersten PCR-Amplifikationscyclus mit einem Gen-spezifischen Primer und einem Primer, der an die Adaptorsequenz assoziiert, unterzogen. Das PCR-Produkt wird dann als Template für einen nested Cyclus der PCR-Amplifikation mit einem zweiten Gen-spezifischen Primer und zweiten Adaptor verwendet. Die von der nested PCR resultierenden Fragmente werden dann isoliert, gereinigt und in einen geeigneten Vektor subkloniert. Die Fragmente werden sequenziert und die Translationsinitiationsstellen können identifiziert werden, wenn das EST von einer verkürzten cDNA stammt. Die Fragmente können in pflanzliche Expressionsvektoren als transkriptionale oder translationale Fusionen mit einem Reportergen wie β-Glucuronidase (GUS) kloniert werden. Die Konstrukte können in vorläufigen Analysen untersucht werden und anschließend werden die 5' regulatorischen Regionen mit anderen Genen und regulatorischen Sequenzen von Interesse in einem geeigneten pflanzlichen Expressionsvektor funktionell verbunden und die transformierten Pflanzen werden auf die Expression von Genen von Interesse mit beliebigen dem Fachmann bekannten Verfahren untersucht.
Jede Pflanze kann für die Identifizierung von Genen und regulatorischen Sequenzen ausgewählt sein. Beispiele für geeignete pflanzliche Ziele für die Isolierung von Genen und regulatorischen Sequenzen können umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Acadia, Luzerne, Apfel, Aprikose, Arabidopsis, Artischocke, Rukola, Spargel, Avokado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Kantalupe, Karotte, Maniok, Rizinus, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicoree, Koriander, Zitrus, Clementinen, Klee, Kokosnuss, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglastanne, Aubergine, Endivie, Winterendivie, Eukalyptus, Fenchel, Feige, Knoblauch, Flaschenkürbis, Weintraube, Pampelmuse, Honigmelone, Jicama, Kiwifrucht, Kopfsalat, Lauch, Zitrone, Limone, Weihrauchkiefer, Leinsamen, Mango, Melone, Champignon, Nektarine, Nuss, Hafer, Ölpalme, Raps, Okra, Olive, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Palme, Papaya, Petersilie, Pastinake, Erbse, Pfirsich, Erdnuss, Birne, Pfeffer, Persimone, Pinie, Ananas, Spitzwegerich, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Pinus radiata, Radicchio, Rettich, Rübsamen, Himbeere, Reis, Roggen, Sorghum, Südkiefer, Soyabohne, Spinat, Squash-Kürbis, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, amerikanischer Amberbaum, Mandarine, Tee, Tabak, Tomate, Triticale, Gras, Kohlrabi, eine Rebe, Wassermelone, Weizen, Yams und Zucchini. Besonders bevorzugte Pflanzen umfassen Mais, Baumwolle, Sojabohne und Weizen.
Die Nukleinsäure-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind aus Mais (Zea mays) isoliert. Die Maispflanze entwickelt etwa 20–21 Blätter, Blüten etwa 65 Tage nach Emergenz und reift etwa 125 Tage nach Emergenz. Gewöhnliche Maispflanzen folgen einem allgemeinen Entwicklungsmuster, aber die Zeiträume zwischen den verschiedenen Stadien und die Morphologie variiert zwischen verschiedenen Hybriden, Wachstums- und Umweltbedingungen.
Es gibt mehrere erkennbare Stadien in der Entwicklung der Maispflanze. Die Stadien sind als vegetative (V) und reproduktive (R) Stadien definiert. Die Unterteilungen der V-Stadien sind nummerisch als V1, V2, V3, etc. bis V(n) bezeichnet, wo (n) das letzte Blattstadium vor dem Blühen (VT) und das erste V-Stadium das Emergenzstadium (VE) darstellt. Zum Beispiel ist VE die Emergenz eines Keimblatts aus dem Boden, V1 repräsentiert das erste richtige Blatt, V2 repräsentiert das zweite Blatt, etc. Die reproduktiven Stadien umfassen das erste Auftreten von Blüten bis zum am reifen Samen und sind folgendermaßen repräsentiert: R1 ist Blütenbildung, R2 ist Blasenbildung, R3 ist das Milchstadium, R4 ist das Teigstadium, R5 ist das Zahnstadium und R6 ist die physiologische Reife (siehe zum Beispiel Ritchie SW et al. (1986) How a Corn Plant Develops, Iowa State University of Science and Technology Cooperative Exension Service, Ames, 1A 48:1–21).
Jeder pflanzlicher Gewebetyp kann als Zielgewebe zur Identifizierung von Genen und assoziierten regulatorischen Sequenzen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Promotorsequenzen, verwendet sein. Für die vorliegende Erfindung wird Maisgewebe verwendet. Bevorzugter sind Embryonal- oder Kallusgewebe des Mais die Zielgewebe zur Identifizierung von Promotorsequenzen. Mais cDNA-Bibliotheken sind aus Embryogewebe konstruiert, das aus Mais 21 Tage nach Bestäubung (21-DAP) und 13 Tage nach Bestäubung (13-DAP) und Typell Maiskallusgewebe isoliert ist.
Jedes Verfahren, das einen differentiellen Vergleich zwischen verschiedenen Typen oder Klassen von Sequenzen erlaubt, kann verwendet werden, um Gene oder regulatorische Sequenzen von Interesse zu isolieren. Zum Beispiel in einem Versuchsansatz zu differentiellen Screening kann eine cDNA-Bibliothek aus mRNA von einem bestimmten Gewebe in einem Bakteriophagen-Wirt unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kit hergestellt werden. Die Plaques werden auf Platten ausplattiert, die einen Rasen aus Wirtsbakterien wie E. coli enthalten, um Bakteriophagen-Plaques zu bilden. Nur etwa 10⁵ – 10⁶ Plaques können auf DNA-bindende Membranen übertragen werden. Doppelte Membranen können unter Verwendung von Sonden besondet werden, die von mRNA von den Ziel- und Nichtzielgeweben generiert sind, um die unterschiedliche Expression zwischen dem Zielgewebe und einem Nichtziel- oder Hintergrundgewebe zu bestimmen. Die Sonden sind markiert, um die Detektion nach Hybridisierung und Entwicklung zu erleichtern. Plaques, welche an Zielgewebe-abgeleiteten Sonden aber nicht an Nichtzielgewebe-abgeleiteten Sonden hybridisieren, die ein erwünschtes unterschiedliches Expressionsmuster zeigen, können für eine weitere Analyse ausgewählt werden. Genomische DNA-Bibliotheken können ebenfalls von einer gewählten Spezies durch partiellen Verdau mit Restriktionsenzym und Größenselektion der DNA-Fragmente innerhalb eines bestimmten Größenbereichs hergestellt werden. Die genomische DNA kann in einen geeigneten Vektor, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Bakteriophagen und unter Verwendung eines geeigneten Kits, wie bereits beschrieben, kloniert werden (siehe zum Beispiel Stratagene, LaJolla, CA oder Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
Beschriebene differentielle Hybridisierungstechniken sind dem Fachmann bekannt und können angewandt werden, um eine erwünschte Klasse von Sequenzen zu isolieren. Mit Klassen von Sequenzen, wie hier verwendet, sind Sequenzen bezeichnet, die basierend auf einem üblichen Identifikationsmittel, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Sequenzen, die von einer gewöhnlichen Zielpflanze, einer gewöhnlichen Bibliothek oder einem gewöhnlichen pflanzlichen Gewebetyp isoliert sind, eingruppiert werden können. In einer bevorzugten Anwendungsform werden die Sequenzen von Interesse basierend auf Sequenzanalysen und Abfragen einer Kollektion diverser cDNA-Sequenzen von Bibliotheken von verschiedenen Gewebetypen identifiziert. Das offengelegte Verfahren liefert ein Beispiel für ein differentielles Screening basierend auf elektronischen Sequenzanalysen von pflanzlichen ESTs, die von diversen cDNA-Bibliotheken stammen.
Mehrere für die Bewertung der Genexpression angewandte Verfahren basieren auf dem Messen des mRNA-Levels in einer Organ-, Gewebe- oder Zellprobe. Typische Verfahren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, RNA-Blots, Ribonuklease-Schutzassays und RT-PCR. In einer anderen bevorzugten Anwendungsform wird ein Hochdurchsatzverfahren angewandt, wodurch regulatorische Sequenzen von einem Versuchsansatz der Transkriptprofilierung identifiziert werden. Die Entwicklung der cDNA-Microarray-Technologie ermöglicht das systematische Monitoring von Genexpressionsprofilen für Tausende von Genen (Schena et al., Science, 270:467, 1995). Diese auf DNA-Chips basierende Technologie bringt Tausende von cDNA-Sequenzen auf einer Trägeroberfläche unter. Diese Anays werden gleichzeitig mit vielen markierten DNA-Sonden hybridisiert, die von RNA-Proben anderer Zell- oder Gewebetypen präpariert sind, was eine direkte vergleichende Analyse der Expression erlaubt. Diese Technologie wurde zuerst bei der Analyse von 48 Arabidopsis-Genen auf eine differentielle Expression in Wurzel und Spross gezeigt (Schena et al., Science, 270:467, 1995). Jüngst wurden die Expressionsprofile von über 1400 Genen unter Verwendung von cDNA-Microarrays kontrolliert (Ruan et al, The Plant Journal 15:821, 1998). Microarrays liefern ein quantitatves und reproduzierbares Hochdurchsatzverfahren zur Analyse der Genexpression und Charakterisierung der Genfunktion. Der Transkriptprofilierungsansatz unter Verwendung von Microarrays liefert folglich ein weiteres wertvolles Werkzeug für die Isolierung regulatorischer Sequenzen wie Promotoren, die mit diesen Genen assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung verwendet Hochdurchsatzsequenzanalysen und bildet die Basis einer schnellen Computer-gestützten Identifizierung von Sequenzen von Interesse. Der Fachmann kennt die verfügbaren Ressourcen für Sequenzanalysen. Sequenzvergleiche können durch Bestimmen der Ähnlichkeit der Test oder Abfragesequenz mit Sequenzen von öffentlich zugänglichen oder privaten Datenbanken („Ähnlichkeitsanalyse") oder durch Suchen nach bestimmten Motiven („intrinsische Sequenzanalyse") (z.B. cis-Elemente) unternommen werden (Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76, 1994; Birren et al., Genome Analysis, 1:543, 1997).
Die Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NR: 36–51 bereitgestellt sind, oder Fragmente davon oder Komplemente davon oder eine Nukleotidsequenz mit wenigstens 90% Identität, bevorzugt 95% Identität, noch bevorzugter 99% oder 100% Identität mit der in SEQ ID NR: 36–51 bereitgestellten Sequenz oder einem Fragment davon oder einem Komplement davon, kann in verschiedenen Medien „bereitgestellt" sein, um die Verwendung zu erleichtern. Ein derartiges Medium kann ebenfalls eine Teilmenge davon in einer Form bereitstellen, die dem Fachmann eine Untersuchung der Sequenzen erlaubt.
In einer Anwendung dieser Anwendungsform kann eine Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung auf einem Computer-lesbaren Medium aufgezeichnet sein. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Computer-lesbares Medium" auf jedes Medium, das von einem Computer gelesen werden kann und auf das dieser direkt zugreifen kann. Derartige Medien umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt: magnetische Speichermedien, Floppy Disks, Hard Disk, Speichermedium und Magnetband; optische Speichermedien wie CD-ROM; elektrische Speichermedien wie RAM und ROM; und Hybride dieser Kategorien wie magnetische/optische Speichermedien. Ein Fachmann kann leicht einschätzen, wie jedes der heute bekannten Computer-lesbaren Medien verwendet werden kann, um ein Produkt zu bilden, das ein Computer-lesbares Medium mit einer darauf aufgezeichneten Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfasst.
Mittels Bereitstellen einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung kann ein Fachmann auf die Sequenzinformation für verschiedene Zwecke einfach zugreifen. Sequenzen können mit mehreren Verfahren wie durch Analyse der Sequenzen ohne die Hilfe der für derartige Zwecke entwickelten Software analysiert werden. Computer-Software ist ebenfalls öffentlich zugänglich, die dem Fachmann einen Zugriff auf die Sequenzinformation erlaubt, die auf einem Computer lesbaren Medium bereitgestellt ist. Beispiele für öffentliche Datenbanken umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die DNA-Datenbank von Japan (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/Index.html); und die European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi_docs/embl_db.html) oder Versionen davon. Mehrere verschiedene Such-Algorithmen sind entwickelt worden, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, der als BLAST-Programme bezeichnete Programmreihe. Es gibt fünf BLAST-Implementierungen, drei sind für Nukleotidsequenz-Abfragen entwickelt worden (BLASTN, BLASTX und TBLASTX) und zwei sind für Proteinsequenz-Abfragen entwickelt worden (BLASTP und TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76–80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, 1:543, 1997).
Jedes Programm, das für eine Motivsuche entwickelt ist, kann ebenfalls in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden. Programme für die Sequenzanalyse, die für eine Motivsuche entwickelt sind, können zur Identifizierung von cis-Elementen verwendet werden. Bevorzugte Computerprogramme umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, MEME, SIGNAL SCAN und GENESCA. MEME ist ein Programm, das konservierte Motive (entweder Nukleinsäure oder Peptid) in einer Gruppe nicht alinierter Sequenzen identifiziert. MEME sichert diese Motive als eine Reihe von Profilen. Diese Profile können zum Durchsuchen von Sequenz-Datenbanken verwendet sein. Ein MEME Algorithmus (Version 2.2) kann in der Version 10.0 des GCG Packets gefunden werden; MEME (T, Bailey und C. Elkan, Machine Learning, 21(1–2):51–80, 1995 und die Adresse der Website ist folgende: (http://www.sdcs.edu/MEME/meme/website/COPYRIGHT.html). SignalScan ist ein Programm, das bekannte Motive in Testsequenzen unter Verwendung von anderen Motiv-Datenbanken identifiziert (Prestridge, D.S., CABIOS 7, 203–206 (1991)). Informationen zu SignalScan Version 4.0 sind auf der folgenden Website zugänglich: http://www.biosci.cbs.umn.edu/sofware/sigscan.html. Die ftp-Stelle für SignalScan ist ftp://biosci.cbs.umn.edu/sofware/sigscan.html. Mit SignalScan verwendete Datenbanken umfassen PLACE(http://www.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE (Higo et al., Nucleic Acids Res. 27(1):297–300 (1999) und TRANSFAC (Heinemeye, X. et al., Nucleic Acids Res. 27(1):318-322), die auf der nachfolgenden Website gefunden werden können: http://transfac.gbf.de/. GeneScan ist ein weiteres geeignetes Programm für die Motivsuche (Burge, C. und Karlin, S.J. Mol. Biol. 268, 78–94 (1997) und Version 1.0 Information ist auf der folgenden Website zugänglich: http://gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html. Wie hier verwendet, bezeichnet ein „Zielstrukturmotiv" oder „Zielmotiv" jede rational ausgewählte Sequenz oder Kombination von Sequenzen, in denen die Sequenzen) basierend auf einer dreidimensionalen Konfiguration ausgewählt sind, die nach dem Falten des Zielmotivs gebildet wird. Es gibt verschiedene Zielmotive, die dem Fachmann bekannt sind. Protein-Zielmotive umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, enzymatisch aktive Stellen und Signalsequenzen. Bevorzugte Zielmotive der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Promotorsequenzen, cis-Elemente, Haarnadel-Struktwen und andere Expressionselemente wie Protein bindende Sequenzen.
Wie hier verwendet, bezeichnet ein „Suchmittel" ein oder mehrere Programme, die in einem Computer-gestützten System implementiert sind, um eine Zielsequenz oder Zielstrukturmotiv mit der Sequenzinformation zu vergleichen, die in den Datenspeichern gespeichert sind. Derartige Mittel werden zur Identifizierung von Fragmenten oder Sequenzbereichen der vorliegenden Erfindung verwendet, die einer bestimmten Zielsequenz oder Zielmotiv entsprechen. Ebenfalls können mehrere Ziele verglichen werden, um gewöhnliche Bereiche oder Motive zu vergleichen, die für spezifische Funktionen verantwortlich sein können. Zum Beispiel können cis-Elemente oder Sequenzdomänen, die ein spezifisches Expressionsprofil verleihen, identifiziert werden, wenn mehrere Promotorregionen ähnlicher Promotorklassen abgeglichen und mit bestimmten Softwarepaketen untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Systeme, insbesondere Computer-gestützte Systeme bereit, die die hier beschriebene Sequenzinformation enthalten. Wie hier verwendet bezieht sich ein Computer-gestütztes System auf die Hardware, Software und Datenspeicherung, die zur Analyse der Nukleotidsequenzinformation der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die minimale Hardware-Ausstattung der Computer-gestützten Systeme der vorliegenden Erfindung umfasst eine Zentralprozessoreinheit (CPU), Eingabe-Mittel, Ausgabe-Mittel und Datenspeicherungsmittel. Der Fachmann weiß, dass viele verfügbare Computer-gestützte Systeme für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind und dass derartige Programme ein wirksames Werkzeug für die Sequenzdatenanalyse verglichen mit einer Analyse mittels Durchsicht von Sequenzen ohne Hilfe Computergestützte System liefern.
SEQ ID NR: 6–35 sind Primer, die aus cDNA-Sequenzen konstruiert sind, die von Computer-gestützten Sequenzvergleichen identifiziert sind. Diese Sequenzen werden verwendet, um die Nukleinsäuresequenz unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikationsverfahren zu verlängern (siehe zum Beispiel Mullis etal., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1986; Erlich, et al., European Patent Appln. 50.424; European Patent Appln. 84.796; European Patent Appln. 258.017; European Patent Appln. 237.362; Mullis, European Patent Appln. 201.184; Mullis, et al., U. S. Patent, Nr, 4.683.202; Erlich, U. S. Patent, Nr. 4,582.788 und Saiki, et al., U. S. Patent, Nr. 4.683.194). Mehrere PCR-Amplifikationsverfahren sind dem Fachmann bekannt und sind zur Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die an eine Kernregion einer bekannten Sequenz grenzen, beschrieben worden. Zum Beispiel sind inverse PCR-Verfahren zur Amplifizierung unbekannter DNA-Sequenzen, die an eine Kernregion einer bekannten Sequenz grenzt, beschrieben worden. Andere Verfahren sind ebenfalls verfügbar, wie Einfang-PCR (Lagerstrom, M., et al., PCR Methods Applic. 1:111, 1991, und Walking PCR (Parker, J.D. et al., Nucleic Acids Res. 19:3055, 1991). Mehrere Hersteller haben ebenfalls Kits basierend auf Modifikationen dieser Verfahren zum Zwecke der Identifizierung von Sequenzen von Interesse entwickelt. Technische Fortschritte, einschließlich Verbesserungen bei der Primer- und Adaptorentwicklung, Verbesserungen beim Polymerase-Enzym und bei Thermocycler-Eigenschaften haben schnellere, effiziente Verfahren zur Isolierung von Sequenzen von Interesse erleichtert.
In einer bevorzugten Anwendungsform werden die flankierenden Sequenzen, die die 5' regulatorischen Elemente der vorliegenden Erfindung enthalten, unter Anwendung eines Gen-Walking Ansatzes (Universal GenomeWalker^TM Kit, CLONTECH Laboratories; Inc., Palo Alto, CA) isoliert. Zusammengefasst, die gereinigte genomische DNA wird einem Restriktionsenzymverdau unterzogen, bei dem genomische DNA-Fragmente mit Enden gebildet werden, die dann mit GenomeWalker^TM Adaptoren ligiert werden. GenomeWalker^TM Primer werden zusammen mit Gen-spezifischen Primern in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen (primäre und nested PCR-Reaktionen) verwendet, um PCR-Produkte herzustellen, die die 5' regulatorischen Sequenzen enthalten, die anschließend kloniert und sequenziert werden.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung bei der Modulation der Genexpression können die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung ebenfalls als Sonden oder Primer bei Nukleinsäure-Hybridisierungsexperimenten verwendet werden. Die Nukleinsäuresonden und Primer der vorliegenden Erfindung können unter stringenten Bedingungen mit einer Ziel-DNA-Sequenz hybridisieren. Der Ausdruck „stringente Hybridisierungsbedingungen" ist definiert als die Bedingungen, unter denen eine Sonde oder Primer mit (einer) Zielsequenzen) und nicht mit Nicht-Zielsequenzen spezifisch hybridisiert, wie es empirisch bestimmt werden kann. Der Ausdruck „stringente Bedingungen" ist praktisch bezogen auf die Hybridisierung einer Nukleinsäuresonde mit einer Zielnukleinsäure (d.h. mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz von Interesse) mit Hilfe des spezifischen Hybridisierungsverfahrens definiert, das in Sambrook et al., 1989, 9.52–9.55 diskutiert ist. Siehe ebenfalls Sambrook et al., 1989, 9.47–9.52, 9.56–9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203–213, 1984; und Wetmur und Davidson, J. Mol. Biol. 31:349–370, 1968. Geeignete Stringenzbedingungen, die die DNA-Hybridisierung fördern, sind zum Beispiel 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, anschließend Waschen mit 2,0 × SSC bei 50°C und sind dem Fachmann bekannt oder können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1–6.3.6 gefunden werden. Zum Beispiel kann die Salzkonzentration im Waschschritt von geringer Stringenz von etwa 2,0 × SSC bei 50°C bis zu einer hohen Stringenz von etwa 0,2 × SSC bei 50°C gewählt werden. Zusätzlich kann die Temperatur des Waschschrittes von gering stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur von etwa 22°C bis zu hoch stringenten Bedingungen bei etwa 65°C gewählt werden. Sowohl Temperatur als auch Salzkonzentration können variiert werden oder es kann entweder die Temperatur oder die Salzkonzentration kann konstant gehalten werden, während die andere Variable verändert wird.
Zum Beispiel kann eine Hybridisierung unter Verwendung von DNA oder RNA-Sonden oder Primern bei 65°C in 6 × SSC, 0,5% SDS, 5 × Denhardts, 100 μl/ml nichtspezifische DNA (z.B, beschallte Lachssperma-DNA) mit Waschen mit 0,5 × SSC, 0,5% SDS bei 65°C für eine hohe Stringenz durchgeführt sein.
Es ist zu bedenken, dass eine Hybridisierung unter gering stringenten Bedingungen, wie niedrige Hybridisierungs- und/oder Waschtemperaturen eingesetzt sein können, um verwandte Sequenzen mit einem geringeren Ausmaß an Sequenzähnlichkeit zu identifizieren, falls die Spezifität der Bindung der Sonde oder des Primers an die Zielsequenzen) erhalten wird. Dementsprechend können die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit verwendet werden, Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten der DNA-Fragmente selektiv zu bilden. Die Detektion von DNA-Abschnitten über eine Hybridisierung ist dem Fachmann bekannt und folglich abhängig von der anvisierten Anwendung wird man wünschen, variierende Hybridisierungsbedingungen einzusetzen, um einen variierenden Selektivitätsgrad der Sonde mit der Zielsequenz zu erhalten und das Verfahren der Wahl hängt von den erwünschten Ergebnissen ab.
Die Nukleinsäuresequenzen in SEQ ID NR: 36–51 und beliebige Varianten davon sind in der Lage, an andere Nukleinsäuresequenzen unter geeignet ausgewählten stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Wie hier verwendet, werden zwei Nukleinsäure-Moleküle als fähig zur spezifischen Hybridisierung miteinander bezeichnet, falls die beiden Moleküle in der Lage sind, eine anti-parallele doppelsträngige Nukleinsäure-Struktur zu bilden. Ein Nukleinsäure-Molekül wird als das „Komplement" des anderen Nukleinsäure-Moleküls bezeichnet, wenn es vollständige Komplementarität zeigen. Wie hier verwendet, zeigen Moleküle eine „vollständige Komplementarität", wenn jedes Nukleotid des einen Moleküls zu einem Nukleotid des anderen Moleküls komplemantär ist. Zwei Moleküle werden als „minimal komplemantär" bezeichnet, wenn sie mit hinreichender Stabilität miteinander hybridisieren können und unter wenigstens herkömmlichen „gering stringenten" Bedingungen miteinander assoziiert bleiben. Ähnlicherweise werden die Moleküle als „komplementär" bezeichnet, wenn sie miteinander mit hinreichender Stabilität hybridisieren können und unter herkömmlichen „hoch stringenten" Bedingungen miteinander assoziiert bleiben. Herkömmliche Stringenzbedingungen sind von Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, und von Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985, beschrieben.
In einer bevorzugten Anwendungsform können die Nukleinsäuresequenzen, SEQ ID NR: 36–51 oder ein Fragment, Bereich oder cis-Element oder Oligomer dieser Sequenzen in Hybridisierungsassays anderer Pflanzengewebe verwendet werden, um eng verwandte oder homologe Gene und assoziierte regulatorische Sequenzen zu identifizieren. Diese umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Southern oder Northern Hybridisierungsassays auf beliebigen Substraten, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, geeignet präpariertes Pflanzengewebe, Cellulose, Nylon oder eine Kombination von Filter, Chip oder Objektträger. Derartige Methodologien sind in der Technik bekannt und in einem Kit oder Präparat verfügbar, das von Händlern erworben werden kann.
Natürlich können Fragmente mit anderen Techniken erhalten werden, wie direkte Synthese von Fragmenten mit Hilfe chemischer Mittel, wie es üblicherweise unter Verwendung automatisierter Oligonukleotid-Synthetisierer gemacht wird. Ebenfalls können Fragmente durch Anwendung der Nukleinsäurereproduktionstechnologie wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) Technologie mit rekombinanten DNA-Techniken erhalten werden, die allgemein dem Fachmann in der Molekularbiologie bekannt sind. Hinsichtlich der Amnplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz (z.B. mit PCR) unter Verwendung eines bestimmten Primerpaars beziehen sich „stringente PCR-Bedingungen", auf Bedingungen, die dem Primerpaar ein Hybridisieren nur mit der Zielnukleinsäuresequenz erlauben, an die ein Primer mit der korrespondierenden Wildtyp-Sequenz (oder deren Komplement) binden würde und um vorzugsweise ein einziges Amplifikationsprodukt zu bilden.
Ein Fragment einer Nukleinsäure, wie hier verwendet, bezeichnet einen beliebigen Teil der Nukleinsäure, der kleiner als die vollständige Sequenz ist. Ein Fragment kann ebenfalls wenigstens eine minimale Länge umfassen, die in der Lage ist, mit einer nativen Nukleinsäure unter wie oben definierten stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren. Die Länge eines derartigen minimalen Fragments beträgt bevorzugt wenigstens 8 aneinander liegende Nukleotide, bevorzugter 15 aneinanderliegende Nukleotide und noch bevorzugter wenigstens 20 aneinanderliegende Nukleotide und am bevorzugtesten 30 aneinanderliegende Nukleotide einer nativen Nukleinsäuresequenz.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können auch als Sonden oder Primer verwendet sein. Nukleinsäuresonden und -primer können basierend auf einer nativen Gensequenz hergestellt sein. Eine „Sonde" ist eine isolierte Nukleinsäure, an der ein herkömmlicher detektierbarer Marker oder Reportermolekül, z.B. radioaktives Isotop, Ligand, chemilumineszentes Agens oder Enzym, geheftet ist. „Primer" sind isolierte Nukleinsäuren, die an einen komplementären Ziel-DNA-Strang mittels Nukleinsäure-Hybridisierung assoziiert sind, um ein Hybrid zwischen dem Primer und dem Ziel-DNA-Strang zu bilden, dann entlang des Ziel-DNA-Strangs mit Hilfe einer Polymerase, z.B. eine DNA-Polymere, verlängert werden. Primerpaare können zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz verwendet sein, z.B. mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder herkömmlichen Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren.
Die Länge der Sonden und Primer beträgt im Allgemeinen 15 Nukleotide, bevorzugt 20 Nukleotide oder mehr, bevorzugter 25 Nukleotide oder mehr und am bevorzugtesten 30 Nukleotide oder mehr. Derartige Sonden und Primer hybridisieren spezifisch mit einer Ziel-DNA- oder RNA-Sequenz unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen und hybridisieren spezifisch mit einer nativen Ziel-Sequenz einer anderen Spezies unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen. Vorzugsweise haben die Sonden und Primer der vorliegenden Erfindung eine vollständige Sequenzähnlichkeit mit der nativen Sequenz, obwohl Sonden, die sich von der nativen Sequenz unterscheiden und die die Fähigkeit beibehalten mit nativen Ziel-Sequenzen zu hybridisieren, mit herkömmelichen Verfahren konstruiert werden können. Verfahren zur Präparation und Verwendung von Sonden und Primer sind zum Beispiel beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. ed., Vol. 1–3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (nachfolgend "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (mit periodischen Aktualisierungen) (nachfolgend "Ausubel et al., 1992"); und : Innis et al., PCR-Protokolle: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990. PCR-Primerpaare können von einer bekannten Sequenz abstammen, zum Beispiel unter Verwendung von Computer-Programmen, die für diesen Zweck gedacht sind, wie Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Primer und Sonden, die auf den hier offengelegten nativen Promotorsequenzen basieren, können verwendet werden, um die offengelegten Sequenzen mit Hilfe herkömmlicher Verfahren, z.B. Reklonierung und Resequenzierung, zu bestätigen oder, falls erforderlich, zu modifizieren.
In einer anderen Anwendungsform können die Nukleotidsequenzen der hier offengelegten Promotoren modifiziert sein. Der Fachmann kann DNA-Moleküle kreieren, die Variationen in der Nukleotidsequenz aufweisen. Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, wie in SEQ ID NR: 36–51 gezeigt, können modifiziert oder verändert werden, um ihre Steuerungscharakteristika zu verbessern. Ein bevorzugtes Verfahren zur Veränderung einer Nukleinsäuresequenz ist die Anwendung der PCR, um die ausgewählten Nukleotide oder Sequenzbereiche zu modifizieren. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt, Sequenzen können zum Beispiel mittels Insertion, Deletion oder Ersetzen von Template-Sequenzen in einem PCR-basierten DNA-Modifikationsversuchsansatz modifiziert werden. „Variante" DNA-Moleküle sind DNA-Moleküle, die Änderungen enthalten, bei denen ein oder mehrere Nukleotide einer nativen Sequenz deletiert, hinzugefügt und/oder substituiert sind, vorzugsweise während die Promotorfunktion im Wesentlichen erhalten bleibt. Im Falle eines Promotorfragments, kann eine „variante" DNA Änderungen umfassen, die die Transkription eines minimalen Promotorfragments beeinflussen, an dem sie funktionell gebunden ist. Variante DNA-Moleküle können zum Beispiel mittels DNA-Mutagenese-Standardtechniken oder mittels chemischer Synthese des varianten DNA-Moleküls oder eines Teils davon hergestellt sein.
In einer anderen Anwendungsform umfassen die in SEQ ID NR: 36–51 gezeigten Nukleotidsequenzen Sequenzen beliebiger Länge, die in der Lage sind, eine funktionell verbundene DNA-Sequenz zu modulieren. Zum Beispiel können die in SEQ ID NR: 36–51 offengelegten Sequenzen verkürzt oder deletiert sein und ihre Fähigkeit noch beibehalten, die Transkription einer funktionell verbundenen DNA-Sequenz zu regulieren. In einer verwandten Anwendungsform kann ein cis-Element der offengelegten Sequenzen eine besondere Spezifität verleihen, wie eine verstärkte Expression von funktionell verbundenen DNA-Sequenzen in Embryonal- oder Kallusgeweben und ist deshalb ebenfalls in der Lage, die Transkription zu regulieren. Folglich können beliebige Sequenzfragmente, -teile oder – bereiche der offengelegten Sequenzen als regulatorische Sequenzen verwendet sein, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, cis-Elemente oder Motive. Zum Beispiel können ein oder mehrere Basenpaare von dem 5' oder 3'-Ende einer Promotorsequenz deletiert werden, um einen „verkürzten" Promotor herzustellen. Ein oder mehrere Basenpaare können ebenfalls innerhalb einer Promotorsequenz inseriert, deletiert oder substituiert sein. Promotoren können so konstruiert sein, dass die Promotorfragmente oder -elemente funktionell verbunden sind, zum Beispiel mittels Einsetzen eines Fragments stromaufwärts des minimalen Promotors. Ein minimaler oder basaler Promotor ist ein DNA-Stück, das in der Lage ist, die basale Transkriptionsmaschine zu rekrutieren und zu binden. Ein Beispiel für eine basale Transkriptionsmaschine in eukaryotischen Zellen ist der RNA-Polymerase II Komplex und dessen akzessorischer Proteine. Die Enzymkomponenten der basalen Transkriptionsmaschine sind in der Lage, die Transkription eines gegebenen Gens unter Verwendung eines minimalen oder basalen Promotors zu starten und zu verlängern. Das heißt, es gibt keine angefügten cis-wirkenden Sequenzen in dem Promotorbereich, die in der Lage sind, Transkriptionsfaktoren zu rekrutieren und zu binden, die die Transkription modulieren, z.B. verstärken, reprimieren, die Transkription von Hormonen abhängig macht, etc. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinantionen davon können kombiniert werden, um das endgültige Konstrukt herzustellen.
Native oder synthetische Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können in Nukleinsäure-Konstrukte, typischerweise DNA-Konstrukte, eingebaut sein, die in der Lage sind, in eine Wirtszelle eingeführt zu werden und zu replizieren. In einer bevorzugten Anwendungsform sind die wie in SEQ ID NR; 36–51 gezeigten Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung oder Fragmente, Varianten oder Derivate davon in einer Expressionsvektorkassette eingebaut, die Promotonegionen der vorliegenden Erfindung mit einer genetischen Komponente wie ein selektierbares, durchmusterbares oder bewertbares Markergen funktionell verbunden umfasst. Die offengelegten Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise mit einergenetischen Komponente funktionell verbunden, wie eine Nukleinsäure, die ein erwünschtes Merkmal verleiht, das mit der Morphologie, Physiologie, dem Wachstum und der Entwicklung, dem Ertrag, der Ernährungsverbesserung, Krankheits- oder Schädlingsresistenz oder Umwelt- oder Chemikalientoleranz der Pflanze assoziiert ist. Diese genetischen Komponenten wie Markergene oder agronomischen Gene von Interesse können zur Identifizierung einer transformierten Pflanzenzelle oder Pflanze oder zur Herstellung eines Produkts mit agronomischem Nutzen dienen. Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Regulation der Expression einer beliebigen funktionell verbundenen transkribierbaren Sequenz verwendet sein. Besonders bevorzugte funktionell verbundene transkribierbare Sequenzen umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, diejenigen Sequenzen, die bevorzugt in Embryonal- oder Kallusgewebe(n) exprimiert werden.
In einer bevorzugten Anwendungsform bildet eine genetische Komponente ein Produkt, das als ein Selektionsmittel dient und in einem regenerierbaren Planzengewebe arbeitet, um eine Verbindung herzustellen, die dem pflanzlichen Gewebe eine Resistenz gegen eine sonst toxische Verbindung verleiht. Gene von Interesse zur Verwendung als einen selektierbaren, durchmusterbaren und bewertbaren Marker umfassen, sind hierauf aber nicht beschränkt, GUS (für die beta-Glucuronidase codierende Region), GFP für das grün fluoreszierende Protein codierende Sequenz), LUX (für Luciferase codierende Region) oder Antibiotika- oder Herbizid-Toleranzgene. Beispiele für Transposons und assoziierte Antibiotika-Resistenzgene umfassen die Transposons Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), Penicilline, Kanamycin (und Neomycin, G418, Bleomycin); Methotrexat (und Trimethoprim); Chloramphenicol; Kanamycin und Tetracyclin.
Zweckdienliche Merkmale für selektierbare Marker in Pflanzen sind in einem Bericht über die Verwendung von Mikroorganismen grob dargestellt worden (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, Juli 1994). Diese umfassen eine strenge Auswahl mit einer minimalen Anzahl nicht-transformierter Gewebe, großer Anzahl unabhängiger Transformationsereignisse ohne signifikante Interferenz mit Regeneration, Anwendung mit einer großen Anzahl von Spezies und Verfügbarkeit eines Tests zur Bewertung der Gewebe auf das Vorhandensein eines Markers.
Mehrere selektierbare Markergene sind in der Technik bekannt und einige Antibiotika-Resistenzmarker erfüllen diese Kriterien, einschließlich solcher, die Resistenz gegen Kanamycin (nptII, Hygromycin B (aph IV) und Gentamycin (aac3 und aacC4) verleihen. Zweckdienliche dominante selektierbare Markergene umfassen Gene, die Antibiotika-Resistenzgene (z.B. Resistenz gegen Hygromycin, Kanamycin, Bleomycin, G418, Strepromycin oder Spectinomycin) und Herbizid-Resistenzgene (z.B. Phosphinothricin-Acetyltransferase) codieren. Ein zweckdienliche Strategie zur Selektion von Transformanten für die Herbizidresistenz ist z.B. in Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. I–III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984, beschrieben. Besonders bevorzugte selektierbare Markergene für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wären Gene, die eine Resistenz gegen Verbindungen wie Antibiotika wie Kanamycin und Herbizide wie Glyophosat verleihen (Della-Cioppa et al., Bio/Technology 5(6), 1987, U.S. Patent 5.463.175, U.S. Patent 5.633.435). Andere Selektionsmittel können ebenfalls verwendet sein und würden noch im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
Für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung sind herkömmliche Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Vektoren und Wirtszellen eingesetzt, wie es unter anderem in Sambrook et al., 1989 diskutiert ist. In einer bevorzugten Anwendungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle. Mehrere Vektoren, die für eine stabile Transfektion von Pflanzenzellen oder für die Etablierung von transgenen Pflanzen geeignet sind, sind beschrieben worden in z.B. Pouwels et al., Cloning Vectors. A Laboratory Manual, 1985, suppl. 1987; Weissbach und Weissbach, Methods for Plant Moleculat Biology, Academic Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990; und R.R.D. Croy, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. Pflanzliche Expressionsvektoren können zum Beispiel ein oder mehrere geklonte pflanzliche Gene unter der transkriptionellen Kontrolle von 5' und 3' regulatorischen Sequenzen enthalten. Sie können ebenfalls einen wie beschriebenen selektierbaren Marker enthalten, um die das Konstrukt enthaltende Wirtszelle zu selektieren. Derartige pflanzliche Expressionsvektoren enthalten ebenfalls einen Promotor regulatorischen Bereich (z.B. einen regulatorischen Bereich, der induzierbare oder konstitutive umwelt- oder entwicklungsregulierte oder Zell- oder Gewebe-spezifische Expression steuert), eine Transkriptionsinitiationsstelle, eine Ribosomenbindungsstelle, ein RNA-Prozessierungssignal, eine Transkriptionsterminationsstelle und ein Polyadenylierungssignal. Andere Arten regulatorischer Sequenzen, die als genetische Elemente für einen Expressionsvektor in Betracht gezogen werden, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, eine nicht-translatierte Leadersequenz, die mit dem Promotor gekoppelt sein kann. In einer besonders bevorzugten Anwendungsform ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle und der pflanzliche Expressionsvektor umfasst eine wie in SEQ ID NR: 36–51 offengelegte Promotonegion. Pflanzliche Expressionsvektoren können ebenfalls zusätzliche Sequenzen, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Restriktionsenzymstellen umfassen, die für Klonierungszwecke zweckdienlich sind.
Mehrere Promotoren sind für die pflanzliche Genexpression für jedes Gen von Interesse nützlich, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, selektierbare Marker, bewertbare Macker, Gene für Schädlingstoleranz, Krankheitstoleranz, Ernährungsverbesserungen und jedes andere Gen von agronomischen Interesse. Beispiele für konstitutive Promotoren, die für die pflanzliche Genexpression zweckdienlich sind, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, den Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) 35S Promotor, der eine konstitutive Expression auf hohem Niveau in den meisten Pflanzengeweben verleiht (siehe z.B. OdeI et al., Nature 313:810, 1985), einschließlich Monocotyledone (siehe z.B. Dekeyser et al., Plant Cell 2:591, 1990; Terada und Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990); den Nopalinsynthase-Promotor (An et al., Plant Physiol. 88:547, 1988) und den Octopinsynthase-Promotor (Fromm et al., Plant Physiol. 1:977, 1989) und den Braunwurz-Mosaikvirus (FMV) Promotor (US Patent, Nr. 5.378.619 ist ein doppelt begrenzter, rechte (RG) und linke (LG) T-DNA-Grenzen, Pflanzentransformationsvektor, der aus den folgenden genetischen Komponenten besteht: ZM-700267629 ist der Promotor für die Zea mays embryonalverstärkte Expression, der aus einer Zea mays Embryo genomischen Bibliothek isoliert ist; 1-Zm.Hsp70 Intron ist die dazwischenliegende Sequenz des Hitzeschockproteins des Mais, wie in U.S. Patent, Nr. 5.593.874 und 5.859.347, beschrieben, die hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt sind); Ec.GUS ist die codierende Region für die beta-Glucuronidase von E. coli; T-AGRTU.nos ist das Terminationssignal vom Nopalinsynthase-Gen; P-CaMV.35S ist der CaMV 35S Promotor (U.S. Patent, Nr. 5.352.605, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt).
Eine Reihe pflanzlicher Genpromotoren, die als Antwort auf umweltliche, hormonale, chemische und/oder Entwicklungssignale reguliert sind, können für die Expression eines funktionell verbundenen Gens in Pflanzenzellen verwendet sein, einschließlich Promotoren, die durch (1) Hitze (Callis et al., Plant Physiol. 88:965, 1988), (2) Licht (z.B. pea rbcS-3A Promotor, Kuhlemeier et al., Plant Cell 1:471, 1989; Mais rbcS Promotor, Schaffner und Sheen, Plant Cell 3:997, 1991; oder Chlorophyll a/b bindendes Protein Promotor, Simpson et al., EMBO J. 4:2723, 1985), (3) Hormonen wie Abszissinsäure (Marcotte et al., Plant Cell 1:969, 1989), (4) Wunden (z.B. wunI, Siebertz et al., Plant Cell 1:961, 1989); oder (5) Chemikalien wie Methyljasmonat, Salicylsäure oder Safener reguliert werden. Es kann ebenfalls von Vorteil sein, (6) Organ-spezifische Promotoren einzusetzen (z.B. Roshal et al., EMBO J. 6:1155, 1987; Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249, 1988; Bustos et al., Plant Cell 1:839, 1989). Die Promotoren der vorliegenden Erfindung sind Embryozell-verstärkte und Embryogewebe-verstärkte oder Kallusgewebe-verstärkte Pflanzenpromotoren, die mit einem beliebigen Gen von Interesse in einem Expressionsvektor funktionell verbunden sein können.
Pflanzliche Expressionsvektoren können RNA prozessierende Signale, z.B. Introns, umfassen, die stromaufwärts oder stromabwärts einer Polypeptid-codierenden Sequenz in dem Transgen positioniert sein können. Zusätzlich können die Expressionsvektoren zusätzliche regulatorische Sequenzen vom 3'-nicht-translatierten Bereich von Pflanzengenen enthalten (Thornburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:744 (1987); An et al., Plant Cell 1:115 (1989), z.B. eine 3'-Terminatorregion, um die mRNA-Stabilität der mRNA zu erhöhen wie die PI–II Terminatorregion von Kartoffel oder der Octopin- oder Nopalinsynthase 3' Terminatorregionen. 5'-nicht-translatierte Bereiche einer mRNA können eine wichtige Rolle bei der Translationsinitiation spielen und können ebenfalls eine genetische Komponente in einem pflanzlichen Expressionsvektor sein. Zum Beispiel ist von 5'-nicht-translatierten Leadersequenzen gezeigt worden, die von Hitzeschockprotein-Genen stammen, dass sie die Genexpression in Pflanzen verstärken (siehe zum Beispiel U.S. Patent 5.362.865, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt). Diese zusätzlichen stromaufwärts und stromabwärts liegenden regulatorischen Sequenzen können nativen oder heterologen Ursprungs bezogen auf die anderen im Expressionsvektor vorhandenen Elemente sein.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung werden zur Steuerung der Genexpression in Pflanzenzellen verwendet. Bevorzugter werden die Promotorsequenzen zur Steuerung der Genexpression in Pflanzensamen verwendet. Noch bevorzugter werden die Promotorsequenzen zur Steuerung der Expression in Pflanzenembryonen verwendet. Die offengelegten Promotorsequenzen sind genetische Komponenten, die Teil von Vektoren sind, die bei der Transformation von Pflanzen Verwendung finden. Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können mit jedem geeigneten Pflanzentransformationsplasmid oder – vektor verwendet sein, der/das einen selektierbaren oder durchmusterbaren Marker und wie beschrieben regulatörische Elemente zusammen mit einer oder mehreren Nukleinsäuren enthält, die in hinreichender Weise exprimiert werden, um ein bestimmtes erwünschtes Merkmal zu verleihen. Beispiele für geeignete strukturelle Gene von agronomischem Interesse, die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen sind, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, ein oder mehrere Gene für die Insektentoleranz wie B. t., Schädlingstoleranz wie Gene für die Kontrolle von Pilzkrankheiten, Herbizidtoleranz wie Gene, die eine Glyphosat-Toleranz verleihen, und Gene für Qualitätsverbesserungen wie Ertrag, Ernährungsverbesserung wie Vitamin-, Öl- und Aminosäure-Zusammensetzung, Umwelt- oder Stresstoleranzen oder beliebig erwünschte Änderungen in Physiologie, Wachstum, Entwicklung, Morphologie der Pflanze oder pflanzlichen Produkt(en).
Alternativ können die DNA-codierenden Sequenzen diese Phänotypen bewirken, indem sie ein nicht-translatierbares RNA-Moleküls codieren, das die gezielte Hemmung der Expression eines endogenen Gens bedingt, zum Beispiel über Antisense- oder Co-Suppression-vermittelte Mechanismen (siehe zum Beispiel Bird et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9:207, 1991). Die RNA könnte ebenfalls ein katalytisches RNA-Molekül sein (z.B. ein Ribozym), das hergestellt ist, um ein erwünschtes endogenes mRNA-Produkt zu schneiden (siehe zum Beispiel Gibson und Shillitoe, Mol. Biotech. 7:125, 1997). Folglich ist jedes Gen, das ein Protein oder eine RNA produziert, das eine Phänotyp- oder Morphologieänderung von Interesse exprimiert, für die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung zweckdienlich.
Zusätzlich zu regulatorischen Elementen oder Sequenzen, die stromaufwärts (5') oder innerhalb einer DNA-Sequenz liegen, gibt es stromabwärts (3') liegende Sequenzen, die die Genexpression beeinflussen, und folglich bezieht sich der Ausdruck regulatorische Sequenz, wie er hier verwendet ist, auf jede Nukleotidsequenz, die stromaufwärts, innerhalb oder stromabwärts zu einer DNA-Sequenz liegt, die die Expression eines Genprodukts zusammen mit dem Proteinsyntheseapparat der Zelle steuert, vermittelt oder beeinflusst.
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können modifiziert sein, zum Beispiel für die Expression in anderen pflanzlichen Systemen. In einem anderen Versuchsansatz können neuartige chimäre oder hybride Promotoren mit mehreren Verfahren entwickelt und hergestellt sein. Viele Promotoren enthalten stromaufwärts Sequenzen, die die Stärke und/oder Spezifität des Promotors aktivieren, verstärken oder definieren (Atchison, Ann. Rev. Cell Biol. 4:127, 1988). T-DNA Gene enthalten zum Beispiel "TATA" Boxen, die die Transkriptionsinitiationsstelle definieren, und andere stromaufwärts liegende Elemente, die stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle liegen, modulieren Transkriptionslevels (Gelvin, In Transgenic Plants (Kung, S.-D. und Us, R. eds), San Diego: Academic Press, Seiten 49–87, 1988). Weitere chimäre Promotoren kombinierten ein Trimer des Octopinsynthase (ocs) Aktivators mit dem Mannopinsynthase (mas) Aktivator plus Promotor und berichteten von einer Steigerung der Expression eines Reportergens (Min Ni et al., The Plant Cell Journal 7:661, 1995). Die stromaufwärts liegenden regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung können zur Konstruktion eines derartigen chimären oder hybriden Promotors verwendet werden. Verfahren zur Konstruktion von verschiedenen Promotoren der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Kombinieren von Steuerungselementen verschiedener Promotoren oder Duplizieren von Teilen oder Bereichen eines Promotors (siehe zum Beispiel U.S. Patent 5.110.732, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt, und U.S. Patent 5.097.025, hier durch Quellenangabe vollständig eingefügt). Der Fachmann ist mit Standardressourcen vertraut, die spezifische Bedingungen und Verfahren zur Konstruktion, Manipulation und Isolierung von Makromolekülen (z.B. DNA-Moleküle, Plasmide etc.), Erzeugung rekombinanter Organismen und Durchmusterung und Isolierung von Genen beschreiben (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: Volume 1, Analyzing DNA, (1997); Volume 2, Detecting Genes, (1998); Volume 3, Cloning Systems, (1999), Volume 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, New York).
Die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung können in einen Expressionsvektor unter Verwendung von wie beschriebenen durchmusterbaren oder bewertbaren Markern eingebaut sein und in transienten Analysen getestet sein, die einen Hinweis auf die Genexpression in stabilen pflanzlichen Systemen liefern. Verfahren zum Testen der Genexpression in transienten Tests sind dem Fachmann bekannt. Von einer transienten Expression von Markergenen ist bei verschiedenen Pflanzen, Geweben und DNA-Übertragungssystemem berichtet worden. Zum Beispiel können Arten von transienten Analysen die direkte Genübertragung mittels Elektroporation oder Partikelbombardements von Geweben in einem beliebigen transienten Pflanzentest unter Verwendung einer beliebigen Pflanzenspezies von Interesse umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt. Derartige transiente Systeme würden umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Protoplasten von Suspensionskulturen von Weizen (Zhou et al., Plant Cell Reports 12:612, 1993), Elektroporation von Blatt-Protoplasten von Weizen (Sethi et al., J. Crop Sci. 52:152, 1983); Elektroporation von Protoplasten, die aus Maisgewebe präpariert sind (Sheen, J. The Plant Cell3:225, 1991) oder Partikelbombardement von spezifischen Geweben von Interesse. Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines beliebigen transienten Expressionssystems, um regulatorische Sequenzen, die funktionell mit ausgewählten Reportergenen, Markergenen oder agronomischen Genen von Interesse verbunden sind, zu bewerten. Beispiele für Pflanzengewebe, die zum transienten Testen mit einem geeigneten Übertragungssystem in Betracht gezogen werden, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Blattbasisgewebe, Kallus, Kotyledonen, Wurzeln, Endosperm, Embryonalgewebe, Blütengewebe, Pollen und Epidermisgewebe.
Jeder bewertbare und durchmusterbare Macker kann in einem transienten Test Verwendung finden. Bevorzugte Markergene für transiente Analysen der Promotoren oder 5' regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen ein GUS-Gen (für β-Glucuronidase codierende Sequenz) oder ein GFP-Gen (für ein grün fluoreszierendes Protein codierende Sequenz). Die Expressionsvektoren, die die 5' regulatorische Sequenzen funktionell verbunden mit einem Markergen enthalten, werden den Geweben übertragen und die Gewebe werden mit Hilfe geeigneter, vom Marker abhängigen Mechanismen untersucht. Die quantitativen oder qualitativen Analysen werden als ein Werkzeug eingesetzt, um das potenzielle Expressionsprofil der Promotorsequenzen zu bewerten, wenn sie mit Genen von agronomischen Interesse in stabilen Pflanzen funktionell verbunden sind. Schließlich werden die 5' regulatorischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung direkt in geeignete pflanzliche Transformationsexpressionsvektoren mit den 5' regulatorischen Sequenzen funktionell verbunden mit selektierbaren Markern und Genen von Interesse eingebaut, in Pflanzen transformiert und die stabil transformierten Pflanzen und Nachkommen davon auf das erwünschte Expressionsprofil untersucht, das von den 5' regulatorischen Sequenzen verliehen wird. Der Fachmann kennt die Vektoren, die für eine Transformation von Pflanzen geeignet sind. Geeignete Vektoren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die unschädlich gemachten Ti-Plasmide für Agrobacterium-vermittelte Verfahren. Diese Vektoren können einen Resistenzmarker, 1–2 T-DNA-Grenzen und Replikationswsprünge für E. coli und Agrobacterium zusammen mit einem oder mehreren Genen von Interesse und assoziiert mit regulatorischen Bereichen enthalten. Der Fachmann weiß, dass für Agrobacterium-vermittelte Versuchsansätze mehrere Stämme und Verfahren verfügbar sind. Derartige Stämme umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Agrobacterium-Stämme C58, LBA4404, EHA101 und EHA105. Besonders bevorzugte Stämme sind Stämme von Agrobacterium tumefaciens. Andere DNA-Übertragungssysteme für die Transformation von Pflanzen sind ebenfalls dem Fachmann bekannt und umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Partikelbombardement ausgewählter Pflanzengewebe. Andere DNA-Übertragungssysteme für die Transformation von Pflanzen sind ebenfalls dem Fachmann bekannt und umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Partikelbombardement ausgewählter Pflanzengewebe, die im Allgemeinen für bestimmte Pflanzen von Interesse optimiert sind.
Beispielhafte Nukleinsäuren, die mit Verfahren, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, eingeführt werden können, umfassen zum Beispiel DNA-Sequenzen oder Gene von einer anderen Spezies oder sogar Gene oder Sequenzen, die der gleichen Spezies entstammen oder in dieser vorliegen, aber in Empfängerzellen eher mit Hilfe gentechnischer Verfahren als mit den klassischen Reproduktions- oder Züchtungstechniken eingeführt werden. Allerdings bezieht sich der Ausdruck exogen mit Absicht auf Gene, die normalerweise in der zu transformierenden Zelle nicht vorliegen oder vielleicht einfach in dieser Form, Struktur etc. nicht vorliegen, wie sie im zu transformierenden DNA-Abschnitt oder Gen gefunden werden, oder Gene, die normalerweise schon vorliegen, die man wünscht, z.B. überexprimiert zu haben. Folglich bezieht sich der Ausdruck „exogenes" Gen oder DNA mit Absicht auf jedes Gen oder jeden DNA-Abschnitt, der in eine Empfängerzelle eingeführt ist, ungeachtet ob ein ähnliches Gen schon in einer derartigen Zelle vorhanden ist. Der in der exogenen DNA enthaltene DNA-Typ kann DNA, die schon in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA von einer anderen Pflanze, DNA von einem anderen Organismus oder eine extern generierte DNA, wie eine DNA-Sequenz, die eine Antisense-Information eines Gens enthält, oder eine DNA-Sequenz, die ein synthetisches oder modifizierte Version eines Gens codiert, umfassen.
Die Pflanzentransformationsvektoren, die die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten, können in Pflanzen mit einem beliebigen Verfahren zur Transformation von Pflanzen eingeführt werden. Mehrere Verfahren sind für die Einführung von DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen verfügbar und in der Technik bekannt. Geeignete Verfahren umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, bakterielle Infektion, binäre bakterielle künstliche Chromosomenvektoren, direkte DNA-Übertragung (z.B. über PEG-vermittelte Transformation, Trocknungs/Inhibition-vermittelte DNA-Aufnahme, Elektroporation, Schütteln mit Siliziumcarbidfasern und Beschleunigung von DNA-beschichteten Partikeln (Übersicht in Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205, 1991).
Verfahren zur spezifischen Transformation von Dikolydonen verwenden primär Agrobacterium tumefaciens. Zum Beispiel umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die genannten transgenen Pflanzen Baumwolle (U. S. Patent, Nr. 5.004.863; U. S. Patent, Nr. 5.159.135; U. S. Patent, Nr. 5.518.908; WO 97/43430), Sojabohne (U. S. Patent, Nr. 5.569.834; U. S. Patent, Nr. 5.416.011; McCabe et al., Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou et al., Plant Physiol., 87:671, 1988); Kohl (U. S. Patent, Nr. 5.463.174) und Erdnuss (Cheng et al., Plant Cell Rep., 15:653, 1996).
Ähnliche Verfahren sind für die Transformation von Monokotyledonen berichtet worden. Transformation und Pflanzenregeneration unter Anwendung dieser Verfahren sind für mehrere Feldfrüchte beschrieben worden, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Spargel (Asparagus officinalis; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:5345, 1987); Gerste (Hordeum vulgarae; Wan und Lemaux, Plant Physiol., 104:37, 1994); Mais (Zea mays; Rhodes, C.A., et al., Science, 240:204, 1988; Gordon-Kamm, et al., Plant Cell, 2:603, 1990; Fromm, et al., Bio/Technology, 8:833, 1990; Koziel, et al., Bio/Technology, 11:194, 1993); Hafer (Avena sativa; Somers, et al., Bio/Technology, 10:1589, 1992); Wiesen-Knäuelgras (Dactylis glomerata; Horn, et al., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); Reis (Oryza sativa, einschließlich indica und japonica Varietäten, Toriyama, et al., Bio/Technology, 6: 10, 1988: Zhang, et al., Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo und Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang und Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, et al., Bio/Technology, 9: 957, 1991); Sorghum (Sorghum bicolor; Casas, A.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11212, 1993); Zuckerrohr (Saccharum spp.; Bower und Birch, Plant J., 2: 409, 1992); Rohrschwingel (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. et al., Bio/Technology, 10: 691, 1992); Gras (Agrostis palustris; Zhong et al., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); Weizen (Triticum aestivum; Vasil et al., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T., et al., Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, et al., Plant, J. 5: 299, 1994) und Luzerne (Masoud, S.A., et al., Transgen. Res., 5: 313, 1996). Es ist dem Fachmann klar, dass mehrere Transformationsmethoden zur Erzeugung stabil transformierter Pflanzen von einer beliebigen Anzahl an Zielfeldfrüchten von Interesse angewandt und modifiziert sein können.
Die transformierten Pflanzen werden auf das Vorhandensein der Gene von Interesse und auf das Expressionsniveau und/oder -profil untersucht, die von den Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung verliehen sind. Der Fachmann kennt die zahlreichen Verfahren, die für die Untersuchung von transformierten Pflanzen verfügbar sind. Eine Reihe von Verfahren werden angewandt, um die Genexpression zu bewerten und zu bestimmen, ob das/die eingeführte(n) Gene) integriert sind, korrekt arbeiten und, wie erwartet, vererbt werden. Die Promotoren der vorliegenden Erfindung können durch Bestimmen der Expressionsniveaus der Gene, mit denen die Promotoren funktionell verbunden sind, evaluiert werden. Eine vorläufige Bewertung der Promotorfunktion kann mit einem transienten Testverfahren unter Verwendung von Reportergenen erhalten werden, aber eine genauere Bewertung des Promotors kann mit der Untersuchung stabil transformierter Pflanzen erhalten werden. Verfahren zur Untersuchung von Pflanzen umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, Southern Blots und Northern Blots, PCR-basierte Versuchsansätze, biochemische Analysen, Phänotyp-Durchmusterungsverfahren, Feldbewertungen und Immundiagnosetests.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, Herstellung einer cDNA-Bibliothek, einer genomischen Bibliothek, Sequenzieren, Sequenzanalysen, PCR-Technologien, Vektorkonstruktion, transienter Assays und Verfahren zur Transformation von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt und werden unter Anwendung von Standardtechniken oder Modifikationen davon durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Anwendungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Der Fachmann sollte wissen, dass die in den Beispielen offengelegten Techniken, die aus von den Erfindern entdeckten repräsentativen Techniken folgen, bei der praktischen Umsetzung der Erfindung gut funktionieren. Allerdings weiß der Fachmann angesichts der vorliegenden Erfindung, dass viele Änderungen in den offengelegten spezifischen Anwendungsformen gemacht werden können und noch immer die gleichen oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden, ohne den Geist und Rahmen der Erfindung zu verlassen, und deshalb sind alle dargelegten oder in den begleitenden Zeichnungen gezeigten Gegenstände als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung aufzufassen.
BEISPIELE
Mehrere Gewebe und pflanzliche Entwicklungsstadien werden für Herstellung der Mais Bibliotheken ausgewählt. Der Fachmann kennt die Variationen bei der Gewebeauswahl und Präparation, die von einer Gewebeprobe zur nächsten auftreten. Nachfolgend sind die Bedingungen für die Ziel-Bibliotheken.
BEISPIEL 1
Embryogewebe von Mais dreizehn Tage nach der Bestäubung (13-DAP) (SATMON033 Bibliothek) oder einundzwanzig Tage nach der Bestäubung (21-DAP) (SATMON017 Bibliothek) wird als Ausgangsmaterial für Embryo-13-DAP beziehungsweise Embryo-21-DAP cDNA Bibliotheken verwendet. Die Bibliotheken werden aus Mais (DK604, Dekalb Genetics, Dekalb, Illinois U.S.A.) gebildet. Samen werden in einer Tiefe von 3 cm in Erde in 2''–3'' Töpfen gepflanzt, die Metro 2000-Nährmedium enthalten, und werden nach 2–3 Wochen in größere 10'' Töpfe, die die gleiche Erde enthalten, umgetopft. Nach dem Umtopfen wird 3 mal die Woche Peters 15–16–17 Dünger mit einem Gehalt von 150 ppm N 2–3 mal während der Lebenszeit der Pflanze von dem Umtopfen bis zur Blüte zugegeben. Zwei- oder dreimal während der Lebenszeit der Pflanze von dem Umtopfen bis zur Blüte wird insgesamt ca. 900 mg Fe zu jedem Topfgegeben. Die Maispflanzen werden in einem Gewächshaus mit 15 h Tag-/9 h Nachtzyklen gezogen. Die Tagtemperatur beträgt annähernd 80°F und die Nachttemperatur annähernd 70°F. Die zusätzliche Beleuchtung erfolgt mit 100 W Natriumdampflampen.
Maispflanzen werden nach dem V10 Stadium ausgewählt und für eine Fertilisation bereite Kolbenschösslinge werden von einer Papiertüte vor dem Erscheinen der Blüten umschlossen, um den Pollen abzuhalten. Dreizehn Tage nach der Bestäubung (13-DAP) oder einundzwanzig Tage nach der Bestäubung (21-DAP) werden die Kolben herausgezogen und die Körner aus den Kolben herausgelöst. Jedes Korn wird in Embryo und Endosperm aufgeteilt und die Aleuronschicht wird entfernt. Nach der Präparation werden die Embryonen in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur RNA-Präparation bei –80°C aufbewahrt.
Zur Herstellung der neu gebildeten HI II Typ II Kallus-Bibliothek (SATMON025), werden Petrischalen, die Kallusiniationsmedium enthielten, hergestellt. Das Medium enthält N6-Salze und Vitamine, 3% Sucrose, 2,3 g/Liter Prolin, 0,1 g/Liter Caseinhydrolysat, 2 mg/Liter 2,4-D, 15,3 mg/Liter AgNO₃ und 0,8% Bacto-Agar und das Medium wird vor dem Autoklavieren auf pH 6,0 eingestellt. 9–11 Tage nach der Bestäubung wird ein Kolben mit unreifen Embryonen mit einer Länge von annähernd 1–2 mm ausgewählt. Die Hülsen und Blüten werden entfernt und der Kolben wird in zwei Hälften geteilt und in eine autoklavierte Lösung aus Clorox/Tween 20 gelegt. Der Kolben wird mit deionisiertem Wasser gewaschen und jeder Embryo wird aus dem Korn herausgeholt. Intakte Embryonen werden mit dem Medium, mit der Scutellum-Seite nach oben, in Kontakt gebracht. Mehrere Embryonen werden auf jede Platte gelegt und die Platten werden bei 25°C im Dunklen inkubiert (alle Medienbestandteile sind kommerziell erhältlich, und die meisten werden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO bezogen). Der gebildete krümelige Typ II Kallus wird in das beschriebene Medium ohne AgNO₃ transferiert und alle 7–10 Tage subkultiviert. Etwa 4 Wochen nach der Embryoisolierung wird der Kallus von den Platten abgelöst und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das geerntete Gewebe wird bis zur RNA-Präparation bei –80°C aufbewahrt.
Die RNA wird mit Hilfe von Trizolreagenz, erhältlich von Life Technologies (Gaithersburg, Maryland), im Wesentlichen nach den Herstellerangaben, aus den geernteten Gewebe gereinigt. Poly-A+ RNA (mRNA) wird mit Hilfe von magnetischen Oligo-dT-Kügelchen im Wesentlichen nach den Herstellerangaben (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, New York) gereinigt.
Die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken ist dem Fachmann bekannt und es gibt mehrere Klonierungsstrategien. Mehrere cDNA-Bibliothek-Konstruktionskits sind im Handel erhältlich. Das Superscript^TM Plasmid-System zur cDNA-Synthese und Plasmidklonierung (Gibco BRL, Life Technologies, Gaitherburg, MD) wird gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen verwendet.
Die cDNA-Bibliotheken werden auf LB-Agar, der die geeigneten Antibiotika zur Selektion enthält, ausplattiert und für eine hinreichende Zeit, um das Wachstum einzelner Kolonien zu ermöglichen, bei 37°C inkubiert. Die Einzelkolonien werden einzeln in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die flüssiges LB-Medium einschließlich selektiver Antibiotika enthalten, verbracht. Die Platten werden über Nacht bei annähernd 37°C mit leichtem Schütteln, um das Wachstum zu fördern, inkubiert. Das Plasmid wird aus jedem Klon mit Hilfe des Qiaprep Plasmidisolierungskits unter den vom Hersteller (Qiagen Inc., Santa Clara, CA) empfohlenen Bedingungen isoliert.
Template-Plasmid DNA-Klone werden für eine nachfolgende Sequenzierung verwendet. Zur Sequenzierung wurde das ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Ready Reaction Kit mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase, FS, (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) verwendet.
BEISPIEL 2
Die Promotoren werden mit Hilfe einer Datenbank von EST-Sequenzen identifziert, die von cDNA-Bibliotheken stammen, die von verschiedenen Maisgeweben einschließlich embryonaler Zellen und Embryonalgewebe-verstärkten oder Kallusgewebe-verstärkten mRNAs präpariert sind. Die Sequenzen werden ebenfalls als Abfrage-Sequenzen in GenBank Datenbanken, die zuvor identifizierte und annotierte Sequenzen enthalten, verwendet und mit Hilfe von BLAST-Programmen auf Homologie-Bereiche durchsucht. Die Auswahl von exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) für eine nachfolgende Promotorisolierung wird durch das Vorhandensein einer oder mehrerer Sequenzen unter den repräsentativen ESTs aus einer Stichprobe einer einzelnen cDNA-Bibliothek oder Sammlung von cDNA-Bibliotheken reflektiert. Um regulatorische Sequenzen, die die Expression von Transkripten in dem Maisembryo regulieren, zu identifizieren, wurde eine Teilmenge-bildende Funktion ausgeführt, die alle in Ziel-Embryo-Bibliotheken gefundenen ESTs und die fehlenden oder in geringer Häufigkeit in anderen Nicht-Ziel-EST-Bibliotheken in der Datenbank vorkommenden ESTs heraussucht. Die resultierenden in Frage kommenden ESTs wurden einer elektronischen Northern-Funktion unterzogen, in der das mutmaßliche Gewebeexpressionsprofil und Häufigkeitslevel in einer Bibliothek für ein gegebenes EST angezeigt wird. Ziel-ESTs mit dem erwünschten Gewebeexpressionsprofil und Häufigkeiten wurden identifiziert und Gen-spezifische Primer wurden basierend auf den identifizierten EST-Sequenzen entwickelt. Die Produktbewertung bezieht sich auf die Stärke einer BLAST-Übereinstimmung zwischen einem EST-Klon von Interesse und einer GenBank Sequenz. Prozentuale Häufigkeit bezieht sich darauf wie viele Mal die Mitglieder einer Gruppe von verwandten exprimierten Sequenzen in einer Bibliothek, aus der sich das EST ableitet, auftritt. Eine beliebige Anzahl von Abfragen kann durchgeführt werden, um die erwünschten ESTs zu erhalten und ist von der EST-Datenbasis und den für Sequenzanalysen verfügbaren Computerprogrammen abhängig. Für die vorliegende Erfindung werden die Sequenzen durch Auswahl von gewünschten Werten für relative Häufigkeit, Stringenz, und/oder Produktbewertung identifiziert. Für die Promotorsequenzen von SEQ ID NR: 36–51 wird eine Ziel-Häufigkeit von ≥ 1 gewählt mit einem Hintergrund von ≤ 0, einer Stringenz von ≥ 50 und einem Produktbewertung von ≤ 100.
Die Klon IDs für EST-Sequenzen von Interesse, die cDNAs mit dem anvisierten Expressionsprofil darstellen, werden aufgrund dieser Datenbankabfragen identifiziert. Tabelle 1 stellt Klon ID (EST) Hintergrundinformation, Ausgangsbibliotheken und GenBank Kennung (gi) Information für die ESTs bereit, die für eine nachfolgende Isolierung der Promotorsequenzen SEQ ID NR: 36–51 verwendet werden. Die Sequenz-Annotierung ist für die Klon IDs aufgeführt und beruht auf einer GenBank BLAST Suche mit einem p-Grenzwert von 10⁸. Die Information unterliegt Veränderung, wenn neue Sequenzen in die Sequenzdatenbanken übermittelt werden. Die Annotierungen für die ESTs sind folgendermaßen mit der Annotierungsinformation in Klammern aufgeführt: Klon 700614347 (Oryza sativa subsp. Indica Embryo-spezifisches Protein (Ose731) Gen, vollständige cds).; Klon 700257959 (Oryza sativa Globulin-ähnliches Protein mRNA, Klon Ose709, partielle cds).; Klon 700265029 (Zea mays Myo-inositol 1-Phosphatase-Synthase mRNA, vollständige cds).; Klon 700321659 (Zea mays mRNA für Gruppe 3 Lea-Protein MGL3).; Klon 700616085 (Oryza sativa subsp. Indica Embryo-spezifisches Protein (Ose731) Gen, vollständige cds).
TABELLE 1. Promotor Übersichtsinformation
BEISPIEL 3
Die genomischen Bibliotheken wurden aus Mais-DNA (aus Mais-Hybrid Fr27 × FrMo 17) hergestellt, die mit Hilfe von eines CsCI-Reinigungsprotokolls gemäß Ausubel et al., 1992, oder mittels eines CTAB-Reinigungsverfahren (Roger und Bendich, Plant Mol. Biol., 5:69 (1985) isoliert wurde. Die Reagenzien sind kommerziell erhältlich (zum Beispiel, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Bibliotheken wurden gemäß den Herstellerangaben hergestellt (GENOME WALKER, ist eine Handelsmarke von CLONTECH Laboratories, Inc, Palo Alto, CA). In getrennten Reaktionen wird die genomische DNA über Nacht bei 37°C einem Restriktionsenzymverdau mit den fogenden Stumpfe-Enden-Endonukleasen unterzogen: EcoRV, ScaI, DraI, PvuII oder StuI (CLONTECH Laboratories, Inc, Palo Alto, CA). Die Reaktionsmischungen wurden mit Phenol:Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Tris-EDTA Puffer resuspendiert. Die gereinigten genomischen DNA-Fragmente mit stumpfen Enden wurden dann an die GenomWalker^TM Adaptoren ligiert und die Ligation der resultierenden DNA-Fragmente an die Adaptoren wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Die GenomWalker^TM Sub-Bibliotheken wurden aliquotiert und bei –20°C aufbewahrt.
Die an den GenomWalker^TM Adaptor (oben) ligierte genomische DNA wird einer ersten PCR-Amplifikationsrunde mit Gen-spezifischen Primer 1 (GSP1) und einem Primer, der an die Adaptorsequenz anneliert, Adaptor-Primer 1 (AP1), in SEQ ID NR: 1 gezeigt, unterzogen. Eine verdünntes (1:50) Aliquot der ersten PCR-Reaktion wird als die Ausgangs-DNA für eine nested-PCR-Amplifikationsrunde mit Gen-spezifischem Primer 2 (GSP2) und Adaptor-Primer 2 (AP2), gezeigt in SEQ ID NR: 2 oder Adaptor-Primer 3 (AP3), gezeigt in SEQ ID NR: 3, verwendet. Die Annelierungstemperaturen der Genom Walker des ersten Primer (AP1) und des nested-Primer (AP2) sind 59°C beziehungsweise 71 °C. Im Allgemeinen werden Genspezifische Primer konstruiert, die die folgenden Eigenschaften besitzen: 26–30 Nukleotide lang, GC-Gehalt 40–60 % mit sich daraus ergebenden Temperaturen für die meisten Genspezifischen Primern in dem hohen Bereich von 60°C oder etwa 70°C. Die verwendete Taq Polymerase ist AmpliTaq^TM Gold, erhältlich von Perkin Elmer Biosystems (Branchbury, New Jersey). Mehrere Temperatur cyklisierende Instrumente und Reagenzienkits sind von mehreren Herstellern zur Durchführung von PCR-Experimenten kommerziell verfügbar und umfassen diejenigen, die von PE Biosystems (Foster City, CA), Stratagene (La Jolla, CA), und MJ Research Inc. (Watertown, MA) erhältlich sind. Im Anschluss an eine erste PCR-Reaktion wurde ein Aliquot (10–15 μl) für eine Agarosegel-Analyse entnommen. Jede Unbekannte ist von 5 subgenomischen Bibliotheken und einer negativ Kontrolle (ohne DNA) amplifiziert worden.

Die PCR-Komponenten und Bedingungen sind unten grob dargestellt. ERSTE PCR

Komponente	Menge/benötigtes Volumen
Sub-Bibliothek Aliquot	1 μl
Gen-spezifischer Primer 1	1 μl (100 pmol)
GenomeWalker^TM Adaptorprimer 1(AP1)	1 μl
dNTP Mischung (10 mM von jedem dNTP)1	1 μl
DMSO	2,5 μl (oder 2–5 % Endkonzentration)
10X PCR Puffer (MgCl₂ haltig)	5 μl (Endkonzentration 1X)
AmpliTaq Gold^TM	0,5 μl
Destilliertes Wasser	für ein Endvolumen von 50 μl

Reaktionsbedingungen für die erste PCR:

A. 9 Minuten bei 95°C
B. 94°C für 2 Sekunden, 70°C für 3 Minuten; Wiederholung 94°C/70°C insgesamt 7 Runden
C. 94°C für 2 Sekunden, 65°C für 3 Minuten; Wiederholung 94°C/65°C insgesamt 36 Runden
D. 65°C für 4 Minuten als finale Extension
E. 10°C für eine verlängerte Inkubation

Komponente	Menge/benötigtes Volumen
1:50 Verdünnung der ersten PCR-Reaktion	1 μl
Gen-spezifischer Primer 2	1 μl (100 pmol)
GenomeWalker^TM Adaptorprimer 2 (AP2 oder 3)	1 μl
dNTP Mischung (10 mM von jedem dNTP)	1 μl
DMSO	2,5 μl (oder 2–5 % Endkonzentration)
10X PCR Puffer (MgCl₂ haltig)	5 μl (Endkonzentration 1X)
AmpliTaq Gold^TM	0,5 μl
Destilliertes Wasser	für ein Endvolumen von 50 μl

Reaktionsbedingungen für Nested PCR:

A. 9 Minuten bei 95°C
B. 94°C für 2 Sekunden, 70°C für 3 Minuten; Wiederholung 94°C/70°C insgesamt 5 Runden
C. 94°C für 2 Sekunden, 65°C für 3 Minuten; Wiederholung 94°C/65°C insgesamt 24 Runden
D. 65°C für 4 Minuten als finale Extension
E. 10°C für eine verlängerte Inkubation

Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 36 (Klon ID 700264271) wird SEQ ID NR: 1 (A) mit SEQ ID NR: 6 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 7 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 37 (Klon ID 700265872) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 8 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 9 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 38 (Klon ID 700263624) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 10 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 11 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 39 (Klon ID 700267629) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 12 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 13 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 40 (Klon ID 700258061) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 14 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 15 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 41 (Klon ID 700614347) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 16 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 17 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 42 (Klon ID 700257959) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 18 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 19 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 43 (Klon ID 700265029) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 20 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 21 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 44 (Klon ID 700266438) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 22 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 23 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 45 (Klon ID 700259522) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 24 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 25 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 46 (Klon ID 700321659) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 26 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 27 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 47 (Klon ID 700257969) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 28 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 29 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 48 (Klon ID 700613864) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 30 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 2 mit SEQ ID NR: 31 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 49 (Klon ID 700260279-PvuII-Bibliothek) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 32 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 3 mit SEQ ID NR: 33 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ ID NR: 50 (Klon ID 700260279-DraI-Bibliothek) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 32 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die nested-PCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 3 mit SEQ ID NR: 34 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
Für die Isolierung der Promotorsequenz SEQ II) NR: 51 (Klon ID 700266176) wird SEQ ID NR: 1 mit SEQ ID NR: 34 in der ersten PCR-Reaktion kombiniert. Für die nestedPCR-Reaktion wird SEQ ID NR: 3 mit SEQ ID NR: 35 in einer zweiten PCR-Reaktion kombiniert.
BEISPIEL 4
Die aus der nested PCR-Amplifikation resultierenden DNA-Fragmente werden isoliert und auf einem Gel gereinigt. Ein 40 μl Aliquot der zweiten PCR wird in einem Agarosegel aufgetrennt. Das DNA-Fragment des Produkts der zweiten PCR wird aus dem Agarosegel mit Hilfe des BIO101 Geneclean II Sets (Midwest Scientific, Valley Park, MO) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen aufgereinigt. Die gereinigte DNA wird in einen pGEM-T Easy Vector (pGEM-T Easy Vector System I, Promega Corp., Madison, WI) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen ligiert. Ein Aliquot der Ligationsreaktion wird in einen geeigneten E. coli Wirt wie DH10B transformiert und die Zellen auf Selektionsmedium (für DH10B, 100 μg/ml Carbenicillin) ausplattiert. Bakterielle Transformanten werden selektiert, in Flüssigkultur angezogen und die Plasmid-DNA wird mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits, wie beispielsweise Qiaprep Spin Microprep Kit (Qiagen Corp., Valencia, CA) isoliert. Das gereinigte Plasmid, das die aufgrund von Restriktionsenzym-Analysen vorausgesagte Insertgröße enthält, wird mit Hilfe des Farbstoffterminator-Verfahrens in beide Richtungen unter Verwendung der M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die in SEQ ID NR: 4 (M13 Vorwärtsprimer und SEQ ID NR: 5 (M13 Rückwärtsprimer) gezeigt sind, sequenziert. Die verwendeten Restriktionsenzyme sind ebenfalls bei mehreren Herstellern erhältlich (zum Beispiel Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Die 5' flankierende Region, die die Promotorsequenz enthält, wird bestimmt und ist in SEQ ID NR: 36–51 gezeigt. Die Herstellung von Restriktionsschnittstellen zur Klonierung der Promotor-Fragmente in geeignete Vektoren wird typischerweise mit Hilfe der dem Fachmann bekannten PCR-Verfahren durchgeführt.
BEISPIEL 5
Für transiente Expressionsanalysen werden die Promotorfragmente in Expressionsvektoren kloniert. Wenn ein Startcodon (AUG) eines Ziel-Promotorgens identifiziert ist, wird das Promotorfragment in einen Vektor, wie es in 1 (pMON19469) gezeigt ist, anstelle des genetischen Elements P-CaMV.35S kloniert. Wenn ein AUG nicht identifiziert wird, wird das Promotorfragment in einen modifizierten Expressionsvektor kloniert, um translationale Fusionen mit einem Reportergen wie GUS oder GFP zu ermöglichen.
Die Expressionskonstrukte werden in einem transienten Pflanzentest getestet. Mehrere Tests sind verfügbar und dem Fachmann bekannt. Für histochemische Tests auf GUS-Aktivität werden Embryos 13-DAP gesammelt und auf ein Kulturmedium wie MS-Medium (Physiologia Plantarum 15:473 (1962) gemeinsam mit embryonalem Kallus Typ II verbracht. Um die Promotoren in einem transienten Test zu analysieren, werden Schnitte vom Endosperm aus 13-DAP Körnern und Segmente eines etiolierten Blatts von einem Sämling 14 Tage nach der Keimung (DAG) mit Hilfe einer geeigneten Partikelkanone mit der Expressionsvektor-DNA bombardiert (siehe zum Beispiel Christou et al., Plant Physiol., 87:671 (1989); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305 (1988); Ye, G.-N., et al., Plant Mol. Biol., 15:809 (1990). Jeder Expressionsvektor wird auf zwei verschiedenen Platten bombardiert. Die Gewebe können 48 Stunden regenerieren und werden dann mit X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indoyl β-D-Glucuronid) gefärbt, um das GUS-Gen in den Geweben von Interesse zu detektieren (Jefferson et al., EMBO J., 6:3901 (1987).
BEISPIEL 6
Für eine stabile Pflanzentransformation werden die Promotorsequenzen in einen Pflanzentransformationsvektor, wie er in 2 (pMON39721) gezeigt ist, kloniert und in eine Zielfeldfrucht von Interesse mit einem geeigneten Übertragungssystem, wie die Agrobacterium-vermittelte Transformation, transformiert (siehe zum Beispiel U. S. Patent, Nr: 5.569.834, 5.416.011, 5.631.152, 5.159.135 und 5.004.863, sämtliche sind durch Quellenangabe hier vollständig eingefügt) oder Patikelbombardement-Verfahren (siehe zum Beispiel Patentanmeldungen WO 92/15675, WO 97/48814 und Europäische Patentanmeldung 586.355 und U. S. Patent, Nr: 5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 und 5.015.580, sämtliche sind durch Quellenangabe hier vollständig eingefügt)
Das NotI-Fragment aus pMON51002 (3) einschließlich Promotor Zm.700258061 (SEQ ID NR: 40), der die Expression des Ec.GUS Gens steuert, wurde isoliert und in die NotI-Schnittstelle des Pflanzentransformationsvektors pMON39721 (2) kloniert, um pMON51008 (4) für eine stabile Transformation von Mais zu erzeugen. Das NotI-Fragment von pMON51001 (5) einschließlich des Promotors Zm.700267629 (SEQ ID NR: 39), der die Expression des Ec.GUS Gens steuert, wurde isoliert und in die NotI-Schnittstelle des Pflanzentransformationsvektors pMON39721 kloniert, um pMON51009 (9) für eine stabile Transformation von Mais zu erzeugen. Das NotI-Fragment aus pMON51003 (7) einschließlich Promotor Zm.700263624 (SEQ ID NR: 38), der die Expression des Ec.GUS Gens steuert, wurde Isoliert und in die NotI-Schnittstelle des Pflanzentransformationsvektors pMON39721 (2) kloniert, um pMON51010 (8) für eine stabile Transformation von Mais zu erzeugen. Die Verfahren wie Endonuklease-Verdau, DNA-Fragment-Reinigung, Ligation, Bakterien-Transformation, Antibiotika-Selektion, Plasmid-Reinigung sind in der Molekularbiologie bekannt, und wurden für die Konstruktion dieser Pflanzentransformationskonstrukte angewandt (Sambrook et al., 1989). Die Pflanzentransformationskonstrukte wurden in Agrobacterium tumefaciens mittels eines triparentalen Paarungsverfahrens transferiert (Ditty et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7347 (1980).
Agrobakterium tumefaciens (ABI-Stamm) wurde verwendet und in flüssigem LB-Medium (50 ml Medium pro 250 ml Kolben), das 100 mg/L Kanamycin, 50 mg/L Spectinomycin und 25 mg/L Chloramphenicl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) enthielt, 24 Stunden (auf einem Rotationsschüttler bei 150–160 rpm) bei 27°C kultiviert. Die Kultur wurde bei 3400 rpm abzentrifugiert und in flüssigen AB-Medium (die OD wurde auf 0,2 bei 660 nm eingestellt) resuspendiert, das 1/2 der Menge an Spectinomycin und Kanamycin, die für LB verwendet wurde, zusätzlich 200 μM Acetosyringon (AS; verwendet zur Induktion der Virulenz) in einem 250 ml Kolben enthielt. Nach 15–16 stündiger Kultivierung unter den gleichen Bedingungen wie bei der LB-Kultur wurde vor der Resuspension in dem 1/MS PL-Medium (das ebenfalls die gleiche Menge an AS enthielt) die Agrobakterium Suspension geerntet und in 1/2 MS VI-Medium, das AS enthielt gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Endkonzentration an Agrobacterium lag bei ca. 1 × 10⁹ cfu/ml (was einer OD von 1,0 bei 660 entspricht).
Ein dreifach hybrider Mais (Pa91 × H99) × A188 wurde zur Transformation in unseren Experimenten verwendet. Unreife Maisembryonen mit einer Größe von 0,5 mm bis 2,0 mm Länge wurden aseptisch gesammelt und in flüssigem 1/2 MS PL-Medium, das Agrobacterium und 200 μM AS enthielt, 30 Minuten eingetaucht. Die unreifen Embryonen wurden auf einem Stück Papier getrocknet, bevor sie auf 1/2 Ms-Co-Kulturmedium, das 3,0 mg/L 2,4-D, 200 μM Acetosyringon, 2 % Sucrose, 1% Glucose, 12 mM Prolin und 20 μM Silbernitrat enthielt, ausplattiert und bei 23°C 2 oder 3 Tage kultiviert wurden. Die Embryonen wurden dann in ein 15AA Verzögerungsmedium transferiert, das 15AA Makro- und Mikrosalze, 1 mg/L 2,4-D, 12 mM Prolin und 500 mg/L Carbenicillin enthielt, und 5 Tage bei 27°C kultiviert. Die Embryonen wurden in das erste Selektionsmedium, das 14AA-Medium enthielt, das 1,0 mg/L 2,4-D, 12 mM Prolin, 750 mg/L Carbenicillin und 50 mg/L Paromycin enthielt, transferiert und 2 Wochen bei 27°C kultiviert. Dann wurden die Embryonen in das gleiche Medium, jedoch mit höherem Gehalt an Selektionsmittel (100 mg/L) Paromomycin) 2 Wochen transferiert, bevor diese Embryonen in das Medium, das 200 mg/L Paromomycin enthielt, für eine oder zwei Selektionen transferiert. Selektierte Kalli wurden in MS 6BA Regenerationsmedium etwa 2 Wochen verbracht, bevor sie mit MS OD Medium in Phytatrays verbracht und im Lichtraum kultiviert wurden. Pflänzchen mit kräftiger Wurzel- und Sprossentwicklung wurden ausgewählt und in Erde gesteckt und 7 Tage abgehärtet, bevor sie in das Gewächshaus gestellt wurden.
Die transgenen Pflanzen im Gewächshaus wurden mit H99 gekreuzt und ihre unreifen Embryonen wurden 13 und 21 Tage nach der Bestäubung für eine GUS-Färbung (Tabelle 2) und MUG-Aktivitätstests (Tabelle 3) geerntet. Die GUS-Färbungstests der transgenen Pflanzengewebe (Jefferson et al., EMBO J., 6:3901 (1987) lieferten eine qualitative Analyse der Maisembryo-verstärkten Promotoren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung des Expressionsmusters in Blatt-, Wurzel-, Embryo-, Endosperm- und Samenschalengeweben von Mais. Eine GUS-Expression von den Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung wurde in Blättern nicht und in Wurzelgeweben selten detektiert. Eine GUS-Expression wurde in Samen, insbesondere in den Embryonen des Samens detektiert. Diese Promotoren zeigen eine verstärkte Expression in Samen und Samen-assozierten Geweben bezogen auf die Expression in Wurzeln, Blättern oder anderen vegetativen Geweben.
Tabelle 2. Qualitative GUS-Aktivität in transgenen Maisgewebe-Extrakten

+ hatte GUS-Aktivität
– keine detektierbare GUS-Aktivität
+/– nicht eindeutige oder negative
* Wurzelgewebe von einigen Pflanzen war positiv

Die MUG-Tests lieferten eine quantitative Analyse der Embryo- und Endospermexpression in den transgenen Samen. Gesamtprotein wurde aus 10 Embryonen und 10 Endosperme extrahiert, die von jedem halben Kolben einer transgenen Maispflanze präpariert wurden. Die negative Kontrolle Maisgewebe PH×A/CK Wildtyp wurde an dem 13dpp Zeitpunkt untersucht. Der MUG-Test verwendete 500 μl GUS Extraktionspuffer zugefügt zu den Geweben und die Gewebe wurden mit einem Teflonpistill in einem 1.5 ml Eppendorfgefäß zermahlen und bei 10 K RPM 5 min bei 4 Grad zentrifugiert (Beckman GS-15R). 400 μl des Überstand wurden in eine frische Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen übertragen. Die Extrakte werden auf Trockeneis gefroren und bei –80°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Der MUG-Test bestand aus der Herstellung einer Aktivitätstandardkurve mit einer Verdünnungsreihe von 4-Methylumbelliferon (Sigma M1381) von 31,2 pmol bis 2000 pmol. Jeweils 5 μl Extrakt wurde in eine 96-Mikrotitterplatte mit flachen Boden (Falcon 3872) als doppelter Ansatz gegeben, nachdem die Platte zur Bestimmung des Leerwerts gemessen wurde. 200 μl der GUS-Testlösung (0,1 M KPO₄, pH 7,8, 1,0 mM EDTA, 5 % Glycerol, 10,0 mM DTT, 2 mM 4-Methylumbelliferylglucuronid Fluka 69602) wurden zu jede Vertiefung gegeben und mit den Proben mittels Pipettieren gemischt. Die Platte wurde kinetisch auf einem F-max (Molecular Divices) bei 37°C mit dem Filterpaar: Anregung-355/Emmisionsenergie-460 gelesen. Ein typischer Durchlauf besteht aus 21 Ablesungen in 3 min. Intervallen und zuletzt 1 Stunde. Die GUS-Aktivität (pmol/min/μg/ Protein) wurde basierend auf MUG- und Protein-Ergebnissen von jeder Probe berechnet. Das Gesamtprotein wurde mit Hilfe eines Bio-Rad Protein-Testkits analysiert. Eine BSA Proteinverdünnungsreihe von 0,05 mg/ml bis 0,5 mg/ml wurde für eine Standardkurve verwendet. 1,5 μl Extrakte wurde zu einer 96-Mikrotiterplatte mit flachen Boden (Falcon) im Doppelansatz gegeben. 200 μl verdünntes Farbstoffreagenz wurde zugegeben und mit den Proben vermischt. Die Absorption wurde in einem Spectromax 250 (Molecular Devices) bei Raumtemperatur 5 Minuten nach Inkubation bei Raumtemperatur bei 595 nm gemessen. Die MUG-Analysen zeigten, dass der mit Hilfe der zuvor beschriebenen Erfindung isolierte Promotor in Maissamengewebe exprimiert und in Embryo- und Endospermgeweben differentiell exprimiert. Unabhängig transformierte Maislinien können aus einer mit den Promotoren dieser Erfindung transformierten Pflanzenpopulation ausgewählt werden, die in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Embryo- und Endospermentwicklung in den Samen exprimieren.
Tabelle 3. MUG-Test/pmol/min/μg Protein
Eine große Anzahl an Transformations- und Regenerationssystemen und -verfahren sind verfügbar und dem Fachmann bekannt. Die stabil transformierten Pflanzen und Nachkommen werden nachfolgend auf Expression der Gene in den Geweben von Interesse mittels einer beliebigen Anzahl an molekularen, immundiagnostischen, biochemischen und/oder Feldbewertungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, untersucht.
BEISPIEL 7.
Cis-wirkende regulatorische Elemente, die für eine korrekte Promotorregulation notwendig sind, können mit mehreren Mitteln identifiziert werden. In einem Verfahren wird eine Deletionsanalyse durchgeführt, um Bereiche des Promotors zu entfernen und die resultierenden Promotorfragmente werden auf Promotoraktivität untersucht. DNA-Fragmente werden als notwendig für die Promotonegulation erachtet, wenn die Aktivität des verkürzten Promotors im Vergleich zum ursprünglichen Promotorfragment verändert ist. Mit dieser Deletionsanalyse können kleine DNA-Bereiche identifiziert werden, die für eine positive oder negative Translationsregulation notwendig sind. Promotorsequenzmotive können ebenfalls identifiziert werden und neuartige Promotoren, die konstruiert wurden, um diese cis-Elemente für eine Modulation der Expression von funktionell verbundenen transkribierbaren Sequenzen, zu enthalten. Siehe zum Beispiel U. S. Patent, Nr. 5.223.419, durch Quellenangabe hier vollständig eingefügt, U. S. Patent Nr., 4.990.607, durch Quellenangabe hier vollständig eingefügt und U. S. Patent, Nr. 5097025, hier durch Quellenangabe hier vollständig eingefügt.
Ein alternativer Versuchsansatz ist, nach ähnlichen Sequenzen zwischen Promotoren mit ähnlichen Expressionsprofilen zu suchen. Promotoren mit überlappenden Aktivitätsmustern können gemeinsame Regulationsmechanismen besitzen. Verschiedene Computerprogramme, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, MEME, SIGNAL SCAN oder GENE SCAN. können verwendet werden, um konservierte Sequenzmotive zwischen Promotoren zu identifizieren. Diese Motive können Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren darstellen, die zur Regulation der Promotoren dienen. Sind einmal die Sequenzen identifiziert, kann ihre Funktion untersucht werden. Zum Beispiel können die Motivsequenzen aus dem Promotor deletiert werden, um zu bestimmen, ob das Motiv für eine korrekte Promotorfunktion notwendig ist. Alternativ kann das Motiv an einen minimalen Promotor angefügt sein, um zu testen, ob es für eine Transkriptionsaktivierung hinreichend ist. Im Verdacht stehende negative regulatorische Elemente können auf Funktionstüchtigkeit durch Anfügen an einen aktiven Promotor auf eine Verminderung der Promotoraktivität getestet werden. Einige cis-wirkende regulatorische Elemente könnten andere Elemente benötigen, um zu funktionieren. Deshalb können mehrer Elemente in unterschiedlichen Kombinationen mittels einer beliebigen Anzahl an dem Fachmann bekannter Verfahren getestet werden.
Sobald funktionelle Promotorelemente identifiziert worden sind, können die Promotorelemente auf Nukleotidebene modifiziert werden, um die Proteinbindung zu beeinflussen. Die Modifikationen können entweder eine höhere oder geringere Bindungsaffinität verursachen, die den Transkriptionslevel von diesem Promotor beeinflussen.
Promotorelemente können additiv oder synergistisch wirken, um die gesamte Promotoraktivität zu beeinflussen. In dieser Hinsicht können Promotor-Elemente von unterschiedlichen 5' regulatorischen Bereichen hintereinander angeordnet werden, um einen Promotor mit einem unterschiedlichen Expressionsspektrum oder einem höheren Expressionsniveau zu erhalten. Zusätzlich können Promotorelemente vervielfacht werden, um die Expressionslevel spezifisch in dem Muster zu erhöhen, das durch dieses Promotorelement beeinflusst wird.
Die benötigten technischen Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die neuartigen konstruierten 5' regulatorischen Elemente enthalten, sind dem Fachmann bekannt. Die konstruierten Promotoren werden in Expressionsvektoren getestet und durch ein funktionelles Verbinden der neuartigen Promotoren mit einem geeigneten Reportergen, wie beispielsweise GUS, transient getestet und in einem transienten Pflanzentest getestet, Die neuartigen Promotoren sind funktionell mit einem oder mehreren Genen von Interesse verbunden und in einen Pflanzentransformationsvektor gemeinsam mit einem oder mehreren zusätzlichen regulatorischen Elementen eingebaut und in eine Zielpflanze von Interesse mit Hilfe eines geeigneten DNA-Übertragungungssystems transformiert. Die stabil transformierten Pflanzen und nachfolgende Nachkommen werden durch beliebige molekulare, immundiagnostische, biochemische, phänotypische Verfahren oder Feldverfahren, die für eines Abschätzung des (der) erwünschten agronomischen Merkmals(e) geeignet ist (sind), bewertet.
Mittels Durchführen der hier offengelegten Verfahren kann der Fachmann für Pflanzenmolekularbiologie DNA-Promotorsequenzen isolieren, die in der Lage sind, die Transkription einer mit den Promotorsequenzen funktionell verbundenen heterologen DNA-Sequenz zu regulieren. Diese Promotoren sind für eine verstärkte Expression von Transgenen in Pflanzensamen, pflanzlichen embryonalen Gewebe und pflanzlichen Kallusgeweben zweckdienlich und bezüglich der Expressionsniveaus können diese Promotoren in anderen Pflanzenzellen und Geweben wie Wurzeln und Blättern steuern. Die DNA-Moleküle, die die Promotorsequenzen der vorliegenden Erfindung sind, umfassen verschiedene cis-wirkende Elemente, die isoliert und mit DNA-Molekülen bekannter Promotorsequenzen fusioniert werden können, um eine hybride Promotorsequenz zu kreieren. Diese hybriden Promotoren zeigen Expressionsmuster, die sich von anderen bekannten Promotorsequenzen und den mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung isolierten Promotorsequenzen unterscheiden. Bekannte Promotoren, die in Pflanzen arbeiten, umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, die Blumenkohl-Mosaik-Virus 35S und 19S Promotoren, Braunwwz-Mosaik-Virus 35S Promotor, Rohrzucker bacilliformer Virus-Promotor und anderen Pflanzenvirus-Promotoren, Pflanzen Aktin-Promotoren, wie beispielsweise der Reis Aktin-Promotor und die Arabidopsis Aktin-Promotoren und Pflanzen Ubiquitin-Promotoren. Diese Promotoren besitzen minimale Sequenzen, die identifiziert worden sind, dass sie eine Transkription in transgenen Pflanzenzellen steuern. Die minimalen Sequenzen sind Komponenten der hybriden Promotoren mit den cis-wirkenden Elementen der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung.
SEQUENCE LISTING

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, umfassend ein Polynukleotid mit mindestens 80% Nukleotidsequenz-Identität zu SEQ ID NR: 51.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, weiter umfassend ein zweites DNA-Molekül, das üblicherweise nicht mit dem isolierten DNA-Molekül assoziiert ist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 2, wobei das Polynukleotid ein Hybridpromotor ist.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 3, weiter umfassend eine minimale Promotorsequenz.
Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid durch SEQ ID NR: 51 gekennzeichnet ist.
Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend ein Polynukleotid wie es in Anspruch 1 definiert ist, wobei das isolierte Polynukleotid funktionell mit einem zweiten Polynukleotid verbunden ist, das ein Protein von Interesse und einen 3'-nicht-translatierten Bereich kodiert.
Rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 6, wobei das Polynukleotid durch SEQ ID NR: 51 gekennzeichnet ist.
Transgene monokotyle Pflanze oder monokotyle Pflanzenzelle, umfassend das rekombinante DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 6.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 8, wobei die Pflanze Mais ist.
Verfahren zur Herstellung einer monokotylen Pflanze, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: i. Einführen eines DNA-Konstrukts in eine monokotyle Pflanzenzelle, wobei das DNA-Konstrukt Folgendes umfasst: a. einen Promotor, umfassend ein Polynukleotid mit mindestens 80% Nukleotidsequenz-Identität zu SEQ ID NR: 51, wobei der Promotor funktionell mit b. einem zweiten Polynukleotid und c. einem 3'-nicht-translatierten Bereich verbunden ist; ii. Selektieren der Pflanzenzelle und iii. Regenerieren der Pflanzenzelle zu einer Pflanze.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Polynukleotid durch SEQ ID NR: 51 gekennzeichnet ist.