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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum schnellen
Aufheizen und Abkühlen eines Reaktionsgefäßes auf
verschiedene Temperaturen, insbesondere solche Temperaturen, wie sie
bei der Anreicherung durch die Polymerase-Kettenreaktion
(PCR-Vervielfältigungen) Anwendung finden.
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Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht es,
eine Nukleinsäure wie die DNA, manchmal aus einer einzigen
Zelle extrahiert, hundertmillionenfach zu kopieren. Vor dem
Bekanntwerden der PCR-Technologie war es praktisch unmöglich,
eine einzelne DNA-Sequenz zu erfassen. Wenn jedoch eine
einzige DNA-Sequenz wie die DNA, die vom AIDS-Virus (Human
Immunodeficieny Virus, z.B. HIV-I) produziert wird, zu
Anreicherungsreagenzien hinzugefügt wird, die die jeweilige DNA
vervielfältigen, können in relativ kurzer Zeit hunderte von
Millionen von Kopien dieser DNA erhalten werden. Die Technologie
ermöglicht des weiteren die Erfassung des vervielfältigten
Nukleinsäurematerials (z.B. der DNA) durch Reagenzien, die
mit dem jeweiligen vervielfältigten Material hybridisieren,
wobei diese Reagenzien entweder immobilisiert oder an einem
festen Träger festgesetzt sind, etwa einer Filtermembran,
und/oder markiert sind, um mittels Enzymen oder anderen
Stoffen festgestellt werden zu können.
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Herkömmlich erfolgte dies durch Vervielfältigen des
Nukleinsäuremateriales in einem verschlossenen
Kunststoffbehälter, bis die erwünschte Anzahl von Kopien erhalten wurde.
Danach wurde der Behälter geöffnet, etwa entkorkt, und
entweder wurden die vervielfältigten Kopien entnommen und zu einem
Detektorgerät gebracht, oder es wurden Detektormaterialien in
den Behälter gefüllt, der für die Vervielfältigung verwendet
wurde, so daß die Erfassung im gleichen Behälter durchgeführt
wurde.
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Es hat sich jedoch herausgestellt, daß dieses
Vorgehen für einen einfachen und allgemeinen Gebrauch der PCR-
Technologie nicht geeignet ist, da beim Öffnen des Behälters
und/oder beim Transfer der Fluide Aerosole entstehen. Die
Aerosole enthalten einige wenige Moleküle des
vervielfältigten Nukleinsäuremateriales, die in der Folge in der Umgebung
verteilt werden. Normalerweise sind einige wenige Moleküle in
der Umgebung nicht von Bedeutung. Theoretisch reicht jedoch
ein einziges DNA-Molekül aus, um andere
Vervielfältigungsbehälter, die später noch verwendet werden sollen, zu
kontaminieren. Wenn das herumfliegende DNA-Molekül in einen später
benutzten Vervielfältigungsbehälter gelangt oder von einem
Bediener dorthin unabsichtlich übertragen wird, reicht nur
dieses eine Molekül aus, um die DNA bereitzustellen, die bei
der nächsten Vervielfältigung erforderlich ist. Es erübrigt
sich zu bemerken, daß jeder Test nutzlos ist, wenn der
nächste Test auf das Vorhandensein einer bestimmten DNA gerichtet
ist (z.B. der von HIV-I) und dann nur wegen der
herumfliegenden DNA und nicht wegen der des Patienten positiv ist. Die
Leistungsfähigkeit der DNA-Vervielfältigung wird daher zu
einer Quelle für ein mögliches Unwirksamwerden des Tests. Es
wurde auch tatsächlich bereits festgestellt, daß ein ganzes
Laboratorium durch das Öffnen von einigen wenigen Behältern,
in denen die Probe vervielfältigt wurde, kontaminiert worden
ist. Auch wenn dieses Problem durch sehr erfahrenes und gut
ausgebildetes Personal vermieden werden kann, das alles
unternimmt, um die Aerosolproduktion zu vermindern, macht das
Erfordernis nach einer solche Mühe die Technologie für den
allgemeinen Gebrauch ungeeignet.
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Das obige Problem wurde durch einen umschließenden
Behälter gelöst, der ein flexibler Beutel sein kann. Dieser
Beutel weist ein Wandmaterial auf, das einen Reaktionsraum
bildet, wobei eine oder beide der Wände des Raumes flexibel
sind.
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Auch wenn ein solcher Beutel mit den verschiedensten
Geräten schnell auf die verschiedenen Temperaturen aufgeheizt
und abgekühlt werden kann, die bei der PCR-Vervielfältigung
bekanntermaßen erforderlich sind, bestand vor dieser Erfin
dung ein Bedürfnis nach einer einfachen, billigen und doch
wirksamen Temperaturkontrollvorrichtung, die besonders für
die schnellen Temperaturänderungen geeignet ist. Es hat sich
zum Beispiel herausgestellt, daß ein thermischer Zyklus mit
einem Aufheizen und Abkühlen eines Metallblocks, an dem der
Beutel angebracht ist, relativ langsam und uneffektiv ist.
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In der US-A-4 066 412 ist ein Reaktionsgefäßbeutel
beschrieben, der durch ein Heizgerät und durch eine den
Verschluß aufbrechende Station bewegt wird. Diese Technologie
ist jedoch auf die PCR nicht anwendbar, da kein aktiver
Kühlzyklus vorgesehen ist.
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Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
Temperaturkontrollvorrichtung zu schaffen, die die bei einem
der obigen PCR-Behälter erforderlichen Temperaturänderungen
wirkungsvoll erzeugt.
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
demnach eine Temperaturkontrollvorrichtung geschaffen, die in
einem Reaktionsgefäß schnelle Temperaturänderungen
hervorruft, wobei die Vorrichtung zwei Flächen für den Kontakt mit
dem Reaktionsgefäß aufweist, das dazwischen eingeschlossen
ist, wobei wenigstens eine der Flächen aus einem thermisch
leitenden Material ist, und wobei die Vorrichtung
gekennzeichnet ist durch
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a) ein Heizelement auf einer Seite der wenigstens
einen Fläche;
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b) eine von der Fläche beabstandete Wandfläche, um
einen Hohlraum zu bilden, der einen Luftstrom über das
Heizelement ermöglicht; und durch
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c) eine Kühleinrichtung in der Wandfläche, um dem
Hohlraum und dem Heizelement Kühlluft zuzuführen und um die
Luft aus dem Hohlraum abzuführen, die über das Heizelement
geströmt ist.
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Es ist ein vorteilhaftes Merkmal der Erfindung, daß
eine Vorrichtung geschaffen wird, die effektiv, nicht aufwen
dig und schnell innerhalb einer Zeit von etwa 20 s bis 105 s
mit einer kurzen Verweilzeit bei jeder der Temperaturen und
ohne interne Sensoren die Temperatur einer Flüssigkeit in
einem umschließenden Beutel mit einer Genauigkeit von ±1ºC
von.etwa 95ºC auf wenigstens 55ºC bis 70ºC und wieder zurück
auf etwa 95ºC bringen kann.
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Es ist ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der
Erfindung, daß dieser Temperaturzyklus hunderte Male mit hoher
Genauigkeit wiederholt werden kann.
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Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung ist,
daß die Vorrichtung klein ist und nicht viel Energie
verbraucht.
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Die vorliegende Erfindung wird nun beispielhaft
anhand der Zeichnung beschrieben. Es zeigen:
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Fig. 1 eine perspektivische Ansicht eines vereinfach
ten umschließenden Behälters, der mit der erfindungsgemäßen
Vorrichtung bearbeitet werden kann;
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Fig. 2 einen Teil-Querschnitt im wesentlichen längs
der Linie II-II in der Fig. 1;
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Fig. 3 eine Teil-Ansicht, die eine erfindungsgemäße
Temperaturkontrollvorrichtung mit einem eingesetzten Behälter
nach Fig. 1 darstellt;
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Fig. 4 einen Schnitt im wesentlichen längs der Linie
IV-IV der Fig. 3;
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Fig. 5 den Verlauf der Temperatur mit der Zeit bei
der Vorrichtung und dem Behälter der Fig. 3;
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Fig. 6 eine Teil-Ansicht ähnlich der, die in einem
Teil der Fig. 4 dargestellt ist, die jedoch hier eine
alternative Ausführungsform zeigt;
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Fig. 7 eine Aufsicht ähnlich der der Fig. 3, jedoch
von einer weiteren alternativen Ausführungsform;
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Fig. 8 eine Teil-Schnittansicht ähnlich der der Fig.
4, jedoch von einer alternativen Ausführungsform;
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Fig. 9 eine Darstellung des Temperaturverlaufs mit
der Zeit, der mit der erfindungsgemäßen Kombination erreicht
wird, für sechs verschiedene Behälterräume, die wie
beschrieben bearbeitet werden, wobei die Kurven die
Reproduzierbarkeit der thermischen Zyklen der Vorrichtung zeigen; und die
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Fig. 10 und 11 jeweils eine Darstellung des Verlaufes
der Temperatur gegen die Zeit ähnlich wie in der Fig. 9, mit
der Ausnahme, daß jede Kurve hier für eine andere Kraft
erhalten wurde, die auf den nachgiebigen Behälter ausgeübt
wurde.
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Die Erfindung wird anhand von bevorzugten
Ausführungsformen beschrieben, bei denen ein umschließender
PCR-Behälter durch die Vorrichtung bearbeitet wird und in denen
beide Platten auf den gegenüberliegenden Seiten des Behälters
aufgeheizt und abgekühlt werden. Zusätzlich kann die
Erfindung zum Aufheizen und Abkühlen jeder Art von
Reaktionsgefäßen verwendet werden, ob sie nun zur PCR-Vervielfältigung
dienen oder nicht, wobei auch nur eine der Platten die
Temperaturänderungen bewirken kann.
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Gemäß den Fig. 1 und 2 besteht das bevorzugte
Reaktionsgefäß, auf das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung
eingewirkt wird, aus einem flexiblen Beutel 10 aus vorzugsweise
nachgiebigen, laminierten Folien 12 und 14, die wenigstens
entlang des Umfanges 16 rundum verschweißt sind. Die Folien
12 und 14 können wenigstens in dem Abschnitt, der einen
Reaktionsraum 20 bildet, wie er in der Fig. 2 gezeigt ist, aus
einem thermisch leitenden Material 18 bestehen, etwa aus
Aluminium, auf dem vorzugsweise eine Beschichtung aus einem
Polymermaterial 22 aufgebracht ist. Dadurch wird verhindert,
daß das Aluminium den Vervielfältigungsvorgang unterdrückt.
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Vorzugsweise bestehen die Folien 12 und 14 nur aus
einem flexiblen Kunststoffmaterial. Am besten bestehen sie
aus zwei Lagen aus Polyester und Polyethylen oder
Polypropylen mit einer Gesamtdicke zwischen etwa 0,06 mm und 0,2 mm.
Diese Dicken sind brauchbar, da sie sicherstellen, daß die
Wand ausreichend thermisch leitend ist, auch ohne eine
Schicht Aluminium. Es ist wichtig, daß, unabhängig von den
ausgewählten Materialien, die Folien nachgiebig genug sind,
um sich den Flächen anzupassen, die gegen die
gegenüberliegenden Seitenwände des Raumes 20 gedrückt werden, die in der
Fig. 2 als Seitenwände 21 und 23 dargestellt sind. Die beiden
Folien 12, 14 sind am Rand 24 um den Raum 20 verschweißt, so
daß durch einen Durchlaß (nicht gezeigt), der dann
verschlossen wird und bei der Bearbeitung verschlossen bleibt, eine
Probenflüssigkeit L eingeführt werden kann. In der
Darstellung erstreckt sich der Vorsprung für den Raum 20 nur in die
Folie 12, er kann sich jedoch auch in die Folie 14
erstrecken. Um ein selektives Platzen zu ermöglichen, ist
zwischen den beiden Folien 12 und 14 eine Stelle mit schwacher
Verschweißung vorgesehen, um einen Durchlaß 30 erzeugen zu
können, der die Flüssigkeit zu einem Detektionsraum 32, der
geeignete Detektionsreagenzien enthält, und dann zu einem
Abfallraum 34 führt. (Es kann auch ein (nicht gezeigter)
Speicherraum vorgesehen werden, der dem Raum 20 ähnlich ist,
jedoch flüssige Reagenzien enthält.) Die gestrichelte Linie
A-A stellt den Weg im Behälter 10 dar, den sich nach dem
entsprechenden Aufheizen und Abkühlen des Raumes 20 eine
Druckeinrichtung entlang bewegt. Die Druckeinrichtung drückt
wenigstens den Raum 20 zusammen, um die Flüssigkeit daraus in
den Raum 32 zu zwängen.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung 40, die vorzugsweise
die Temperaturbehandlung des Raumes 20 durchführt, ist in den
Fig. 3 und 4 gezeigt. Sie besteht vorzugsweise aus einer
feststehenden Halterung 41 und einem oberen Element 43, das
sich über die Halterung 41 bewegt. Alternativ kann sich auch
die Halterung 41 unter dem Element 43 bewegen. Die
Vorrichtung 40 besteht daher aus zwei gegenüberliegenden Platten 42,
44, wie es in der Fig. 4 gezeigt ist, die Oberflächen 46
aufweisen, mit denen sie mit dem Behälter in Kontakt kommen, in
der Regel auf einer Fläche (hier einer kreisförmigen), die
dem Umfang des aufzuheizenden Raumes entspricht. Die Platten
42 und 44 sind vorzugsweise aus thermisch leitendem Material,
etwa Aluminium. Sie können gerillt sein, damit
eingeschlossene Luft entweichen kann.
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Die Platten 42 und 44 sind vorzugsweise jeweils an
einem Gehäuse 48, 49 angebracht. Das Gehäuse 48 ist an der
Halterung 41 befestigt und weist bei 50 abgeschrägte
Außenecken auf, aus Gründen, die noch offensichtlich werden. Das
Gehäuse 48 ist vorzugsweise aus einem Material, das schlecht
leitet.
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Wenigstens einer der beiden Abschnitte 41 und 43
weist eine Heizeinrichtung und vorzugsweise eine Einrichtung
zum aktiven Kühlen der Heizeinrichtung auf. (Der Begriff
"aktiv" wird hier zur Unterscheidung vom passiven Abkühlen
verwendet, das immer dann erfolgt, wenn Heizenergie, z.B.
Elektrizität, nicht weiter zugeführt wird.) An der Seite 52
der Platten 42 und 44, die der Seite 46 gegenüberliegt, ist
daher ein Heizelement 54 angebracht (wegen der besseren
Übersichtlichkeit an der Platte 42 nicht dargestellt). Dieses
Heizelement ist vorzugsweise eine flexible, elektrische
betriebene Vorrichtung, etwa die flexible gedruckte Schaltung,
die von Ocean State Thermotics hergestellt wird und die mit
24 V Gleichstrom betrieben wird, um mit 20 W Wärme zu
erzeugen.
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An der Fläche 46 der Platte 42 und/oder 44 ist
vorzugsweise ein herkömmlicher Temperatursensor (nicht gezeigt)
angebracht. Verwendbare Sensoren schließen Thermoelemente und
Widerstandselemente (Resistive Temperature Device, RTD) ein.
Das Gehäuse für jede der Platten 42, 44 weist eine
Wandfläche 56 auf, die von der Platte 42, 44 und dessen
Heizelement 54 einen Abstand hat. Dieser Abstand bildet einen
Hohlraum 58 für einen Gasfluß. Um das Heizelement 54 aktiv zu
kühlen, ist die Wandfläche 56 mit vorzugsweise wenigstens
einer Düseneinlaßöffnung 60 und wenigstens einer
Auslaßöffnung 62 versehen. Vorzugsweise ist die Einlaßöffnung 60
direkt gegenüber dem Heizelement 54 angeordnet und darauf
gerichtet. Die Auslaßöffnung(en) 62 sind vorzugsweise mehrfach
vorgesehen und längs des Umfanges der Platten 42, 44
angeordnet. Mit der Einlaßöffnung 60 ist eine Gasleitung 64
verbunden, während die Auslaßöffnungen 62 das Gas aus dem Hohlraum
58 in die Atmosphäre abgeben. Vorzugsweise führt die Leitung
64 Luft (oder ein Inertgas) mit einem Druck zwischen etwa
0,98 bis etwa 34,32 KPa (etwa 0,01 und etwa 0,35 kgf/cm²) zu.
Diese aktive Kühlung ermöglicht den schnellen
Temperaturabfall, der bei Reaktionen wie der PCR-Vervielfältigung
erwünscht ist.
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Das Gehäuse 48 ist an einer Spindel 70 angebracht, um
eine Relativbewegung der Platten 42, 44 aufeinander zu und
voneinander weg zu ermöglichen. Da die Platte 44 und das
Gehäuse 49 vorzugsweise feststehen, erfordert dies, daß die
Spindel 70 vom Behälter 10, der auf der Platte 44 angeordnet
ist, weg und darauf zu bewegt werden kann. Vorzugsweise wird
dies dadurch erreicht, daß die Spindel 70 in einer
Gleitpassung in einer Buchse 72 an einem Rahmen 74 angebracht wird.
Die Spindel 70 kann dann von Hand oder von einer Automatik
angehoben und abgesenkt werden. Alternativ kann es der
Spindel 70 und der Platte 42 ermöglicht werden, daß sie einfach
auf die Außenseite des Behälters 10 aufgleitet. Die
abgeschrägten Ecken 50 dienen daher dazu, die Platte 42
anzuheben, wenn das Gehäuse 48 auf einen der vorstehenden Räume
trifft.
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Vorzugsweise ist der Rahmen 74 ein C-förmiges Joch,
das auf einer Achse 76 sitzt, wie es in den Fig. 3 und 4
gezeigt ist. Das Joch trägt eine Druckrolle 78, die an der
Achse 76 gelagert ist. Die Achse 76 kann dann den Behälter 10
überqueren, so daß die Rolle 78 dem Weg A-A folgt, wie es in
der Fig. 3 gezeigt ist, wenn auch in einer nicht
kontinuierlichen Bewegung, die es den Platten 42 und 44 ermöglicht, vor
dem durch die Rolle 78 bewirkten Aufbrechen jeden Raum
wiederholt aufzuheizen und abzukühlen. Die Bewegung der Achse 76
erfolgt entweder manuell oder durch eine Automatik (nicht
gezeigt)
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Wenn von der Rolle 78 Räume wie der Raum 20
zusammenzupressen sind, um die Flüssigkeit daraus in die anderen
Durchlässe zu drücken, wird vorzugsweise eine Kraft F von
etwa 9,8 bis 68,6 N/cm (1 bis 7 kgf/cm) für die Rollenlänge
auf die Achse 76 aufgebracht, wie es in der Fig. 4 gezeigt
ist, wenn die Rolle eine Länge von etwa 4 cm hat.
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Vorzugsweise wird ein konventioneller Mikroprozessor
(nicht gezeigt) dazu verwendet, den Zyklus für das
Heizelement 54 und die Kühlleitung 64 zu steuern.
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Im Gebrauch werden das Gerät und die
Temperaturkontrollvorrichtung dazu verwendet, um einen bestimmten Teil des
Reaktionsgefäßes, z.B. einen Raum, der ein Reaktionsraum ist,
schnell auf die erforderliche hohe Temperatur aufzuheizen und
dann wieder schnell auf eine viel tiefere Temperatur
abzukühlen, was durch die aktive Kühleinrichtung bewirkt wird. Dies
wird für soviele Zyklen wie für die erwünschte Reaktion
erforderlich wiederholt, während die obere Platte 42 mit dem
Raum in Kontakt bleibt. Im Falle der DNA-Replikation mittels
der PCR-Technologie umfaßt der bevorzugte Zyklus zum Beispiel
bis zu 50 Wiederholungen.
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Wenn der Zyklus beendet ist, hebt die
Temperaturkontrollvorrichtung 40 durch Rollen der Rolle 78 längs des Weges
A-A und relativ zum Reaktionsgefäß den Kontakt mit dem Raum
auf. Vorzugsweise wird dann die Rolle 78 mit dem Raum in
Kontakt gebracht, in dem die Reaktion erfolgt ist, um ihn
aufzudrücken und den Inhalt davon zum nächsten Teil des Gefäßes zu
schicken. Daraufhin bewegt sich die Vorrichtung 40 entlang
des Weges A-A zu einem anderen mit Flüssigkeit gefüllten Raum
(in der Fig. 1 nicht gezeigt). Für einige der anderen Räume
ist keine Wiederholung des Temperaturzyklusses erforderlich,
so daß über solchen Räumen die Verweilzeit der Heizplatte
klein oder Null ist und das Heizelement abgeschaltet bleibt.
Die Rolle bewirkt jedoch, daß die Räume aufgedrückt werden,
um deren Inhalt zu z.B. der Detektionskammer zu drücken.
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Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde ein
Temperaturverhalten erhalten, wie es in der Fig. 5 gezeigt ist.
Im vorliegenden Fall wurde der Raum 20 von Polyesterfolien 12
und 14 mit einer Dicke von 63,5 Mikron (2,5 mil) gebildet.
Das Volumen des Raumes betrug 140 µl, er war 2,16 mm dick.
Der Inhalt war Mineralöl (zum Zwecke der Temperaturmessung)
und in das Öl zwischen den Folien 12 und 14 wurde ein
Thermoelement eingesetzt.
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Die Kurve 100 zeigt die Temperatur, die von der
Platte 44 abgegeben wurde, gemessen von einer Temperatursonde.
Die Kurve 102 ist die Temperatur der Platte 42 selbst und die
Kurve 104 die vom Öl im Raum 20. Die Kurve 104 zeigt eine
bemerkenswerte Korrelation und den gleichen Verlauf der
Temperatur im Raum wie an der Platte 42, auch während des
drastischen Aufheizens und Abkühlens, das zwischen etwa 57ºC und
97ºC und zurück erfolgte, alles innerhalb der Zykluszeit von
etwa 78 s (1,3 min) für die gewählten Verweilzeiten. (Die
Temperaturplateaus in diesem Durchgang entsprechen
bekanntlich den bei der PCR-Vervielfältigung erwünschten
Temperaturen.) Es wurden auch schnellere Zykluszeiten erreicht - bis
herab zu 45 s.
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Es ist nicht wichtig, daß die Düseneinlaßöffnung, die
zum Abkühlen des Heizelementes verwendet wird, eine einzige
Öffnung ist. Statt dessen kann sie auch eine Anzahl von
Öffnungen umfassen, wie es in der Fig. 6 gezeigt ist. Den
vorstehend beschriebenen Teilen ähnliche Teile haben dabei das
gleiche Bezugszeichen, an das ein unterscheidendes "A"
angehängt ist.
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Der obere Teil der Vorrichtung 40A (nur zum Teil
gezeigt) umfaßt demnach eine Platte 42A in einem Gehäuse 48A
mit einem Heizelement 54A an der Fläche 52A, wie es oben
beschrieben ist. Die Spindel 70A führt der Kammer 58A Luft zu,
die über Auslaßöffnungen 62A abgeführt wird. Im vorliegenden
Fall ist jedoch eine Anzahl von Düseneinlaßöffnungen 60A
vorgesehen, die sich alle in der Fläche 56A befinden, die vom
Heizelement 54A einen Abstand hat.
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Vorzugsweise wird die obere Heiz- und Kühleinrichtung
mit einer bestimmten Kraft gegen den Beutel gedrückt, um den
Kontakt und damit die Wärmeleitfähigkeit zu verbessern.
Dadurch erhöht sich wiederum die Geschwindigkeit der Reaktionen
darin, wie es in der Fig. 7 gezeigt ist. Den vorstehend
beschriebenen Teilen ähnliche Teile haben dabei das gleiche
Bezugszeichen, an das ein unterscheidendes "B" angehängt ist.
In der Fig. 7 umfaßt die Vorrichtung 40B daher vorzugsweise
eine feststehende Halterung (nicht gezeigt) und ein oberes
bewegliches Element 43B, das dem Weg A-A über einen Beutel
oder ein flexibles Reaktionsgefäß 10B folgen kann. Sowohl die
Halterung als auch das Element 43B sind im wesentlichen so
aufgebaut, wie es oben beschrieben ist. Zusätzlich weist
jedoch das obere Element 43B eine Einrichtung 110 zum
Aufbringen einer bestimmten Belastung auf die Heizplatte im Gehäuse
48B auf. Wie gezeigt, ist diese Einrichtung eine auf einer
Achse 76B angebrachte Torsionsfeder mit einer
Federkonstanten, die so gewählt ist, daß die erwünschte Kraft aufgebracht
werden kann, wie es genauer weiter unten erläutert ist.
Alternativ kann diese kraf taufbringende Einrichtung 110 ein
zusätzliches bestimmtes Gewicht sein, das an der Spindel
angebracht ist, mit der die Leitung 64B verbunden ist, oder
auch eine hydraulische Einrichtung, die das Joch 74B so
beaufschlagt, daß es sich relativ zur Achse 76B mit einer
bestimmten Kraft nach unten bewegt. Zum Beispiel kann ein
Kolben
120 am Rahmen 121 dazu verwendet werden, um einen
variablen, vorbestimmten Druck P aufzubringen, wie es in der Fig.
8 gezeigt ist.
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Das Ausmaß der Belastung, das für eine optimale
Nachgiebigkeit der Seitenwand des jeweiligen Raumes bezüglich der
Oberfläche des Heiz- und Kühlelementes erforderlich ist,
hängt von den Materialien, der Materialdicke und dem Inhalt
des Raumes ab. Je flexibler, dünner und nachgiebiger die
Seitenwand ist, um so kleiner ist die erforderliche Kraft.
Vorzugsweise sind die Seitenwände und die Belastung so gewählt,
daß mindestens die Nachgiebigkeit der Seitenwände bezüglich
der Kontaktflächen erzeugt wird, die auftritt, wenn etwa 2,6
N (270 gf oder etwa 0,6 lbf) an Belastung durch die
Einrichtung 110 auf das obere Heiz- und Kühlelement 43 aufgebracht
wird, das mit einem Raum in Kontakt steht, der 170 ml einer
Flüssigkeit enthält und der aus zwei gegenüberliegenden
nachgiebigen Folien besteht, die im wesentlichen aus zwei Lagen
von etwa 0,013 mm dickem Polyester und etwa 0,1 mm dickem
Polyethylen bestehen. Dieser Aufbau ergibt eine Kontaktfläche
von etwa 180 mm².
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Es wurde festgestellt, daß eine solche Nachgiebigkeit
und die Einrichtung zu deren Erreichen außergewöhnliche PCR-
Reaktionen erzeugen. Es ist wichtig, daß der Inhalt des
aufgeheizten und abgekühlten Raumes eingeschlossen ist, um der
Temperatur der Heiz- und Kühleinrichtung auf wiederholbare
Art besser zu folgen. Dies ist von erheblicher Bedeutung, da
die Grenzen jedes thermischen Zyklusses genau eingehalten
werden müssen, um eine DNA-Replikation zu erhalten. Die
Reproduzierbarkeit der Zyklen ist in der Fig. 9 demonstriert,
in der jede Kurve für einen anderen Raum in sechs
verschiedenen Reaktionsgefäßen erhalten wurde, die getrennt für
mindestens fünf Zyklen mit 2,2 N (227 gf) Kraft durch die
Vorrichtung geleitet wurden. Die Temperatur des Inhalts wurde durch
eine eingesetzte Temperatursonde gemessen, das Volumen jedes
Raumes war 170 bis 190 µl. Das Ergebnis ist, daß jeder Raum
in jedem Zyklus eine hohe Temperatur von wenigstens etwa 93ºC
erreichte und eine niedrige Temperatur von wenigstens etwa
50ºC, dem Bereich, der bei PCR-Prozessen bevorzugt wird.
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Aus der Fig. 10 sind die Schwierigkeiten ersichtlich,
die sich bei einem Betrieb mit Kräften von weniger als 2,6 N
(270 gf) ergeben. Für jedes der in der Fig. 10 gezeigten
Beispiele wurde ein einziger Raum des Beutels verwendet, der im
wesentlichen aus zwei Lagen von etwa 0,013 mm dickem
Polyester und etwa 0, 1 mm dicken Polyethylen bestand, die
verschweißt waren, um ein abgeschlossenen Volumen zu erhalten,
das mit etwa 170 ml Wasser gefüllt wurde und dann von beiden
Seiten mit der Vorrichtung 40B der Fig. 7 bearbeitet wurde,
um die in der Fig. 10 angegebenen Temperaturen zu erreichen.
Der durch die Einrichtung 110 aufgebrachte Druck wurde für
jede Kurve um das angegebene Ausmaß variiert. Die Temperatur
wurde innerhalb des Raumes gemessen. Erst bei einer Kraft von
mindestens etwa 2,6 N (270 gf) (der Kurve auf der rechten
Seite der Gruppe) wurden für diesen nachgiebigen Raum die
Extremtemperaturen in vorhersagbarer Weise erreicht.
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Am besten ist die von der Einrichtung 110
aufgebrachte Kraft und die Nachgiebigkeit der Seitenwände wenigstens
die, die beim Aufbringen von wenigstens 8,8 N (900 gf) Kraft
auf den beschriebenen Raum erreicht wird. Die zusätzliche
Kraft bewirkt, daß sich die Temperatur des Inhalts noch
schneller anpaßt, wie sich aus der Fig. 11 ergibt, in der die
"flachen" oder Doppel-Extrema-Anteile der Kurvenspitzen und
-täler bei 8,8 N (900 gf) oder mehr erhalten wurden, was
anzeigt, daß die erwünschten Endtemperaturen schneller erreicht
werden. In diesen Beispielen wurde so vorgegangen wie in der
Fig. 10, mit der Ausnahme, daß die durch die obere Heiz- und
Kühleinrichtung ausgeübte Kraft jeweils die in der Fig. 11
angegebene Größe hatte. Die "flachen" Anteile treten auf,
weil vorzugsweise die Heizeinrichtung und die Kühleinrichtung
so programmiert sind, daß sich für einige Sekunden, z.B. für
etwa 1 s, an den Extremwerten der durchlaufenen Temperaturen
eine flache, konstante Temperatur ergibt. Dadurch wird
sichergestellt, daß die Flüssigkeitstemperatur voraussagbar und
wiederholt den erforderlichen Wert erreicht. Nur diejenigen
Räume, die diese Werte zeitlich exakt erreichen, zeigen eine
Konstanz der Endtemperaturen. Auf diese Weise bearbeitete
Geräte und Beutel sind besser in der Lage, die
PCR-Vervielfältigung zu kontrollieren.
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Es ist offensichtlich, daß die Obergrenze der vom
oberen Element 43, 43A oder 43B ausgeübten Kraft
hauptsächlich durch die Kraft begrenzt ist, bei der der Reaktionsraum
aufbricht. Die vom Element 43 ausgeübte Kraft wird so
gewählt, daß sie etwas kleiner ist als dieser Wert, und die von
der folgenden Rolle ausgeübte Kraft ist etwas größer. Die
Aufbrechkraft des Raumes 20, wie er in der Fig. 1 gezeigt
ist, kann z.B. etwa 17,6 N (1800 gf) betragen.
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Einige der Kurven der Fig. 11 zeigen an den
Kurvenspitzen doppelte Maxima. Dies tritt nur deshalb auf, da das
Heizelement so programmiert war, daß die erwünschte
Temperatur überschritten wurde - was nicht erforderlich ist, wenn
Ergebnisse wie für die Kurven bei 8,8 N (900 gf) oder höher
erhalten werden.
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Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen zeigen
den bevorzugten Gebrauch der Rolle als Einrichtung zum
Zusammendrücken und Aufbrechen der eine Flüssigkeit enthaltenden
Kammern. Es kann aber auch jeder andere Mechanismus verwendet
werden. Zum Beispiel kann in der Fig. 8 die Rolle 78B
weggelassen werden und anstelle dessen der Kolben 120 dazu
verwendet werden, die Kraft auf die Kammer 20B zu erhöhen, bis sie
bei z.B. 17,6 N (1800 gf) Kraft aufbricht, um die Flüssigkeit
zu veranlassen, in den Auslaß-Durchgang (nicht gezeigt) zu
fließen.