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DE69029107T2 - Substrate für beta-Galactosidase - Google Patents

Substrate für beta-Galactosidase

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DE69029107T2
DE69029107T2 DE69029107T DE69029107T DE69029107T2 DE 69029107 T2 DE69029107 T2 DE 69029107T2 DE 69029107 T DE69029107 T DE 69029107T DE 69029107 T DE69029107 T DE 69029107T DE 69029107 T2 DE69029107 T2 DE 69029107T2
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galactosidase
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Substrate für β-Galaktosidase, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Assays.
  • Das Enzym β-Galaktosidase und seine Derivate werden bei zahllosen Assays verwendet. β-Galaktosidase kann viele Substrate hydrolysieren. Die Wahl des Substrats für ein Assay, an dem ein Enzym mit β-Galaktosidase-Aktivität (EC 3.2.1.23) beteiligt ist, hängt von den Bedingungen ab, unter denen die enzymatische Reaktion stattfindet, sowie von den Bedingungen, unter denen die Konzentration der Reaktionsprodukte ermittelt werden muß. Zu den wichtigeren Faktoren, die bei der Wahl eines Substrats für ein bestimmtes Assay berücksichtigt werden müssen, gehören die Löslichkeit, die Stabilität, die Affinität für das Enzym, die Reaktionsgeschwindigkeit, die Stärke des erzeugten Signals und die Absorptionswellenlänge, bei der die Assayergebnisse ermittelt werden. Da die Vielfalt von Assays, die die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität einschließen, zunimmt, nimmt auch die Notwendigkeit für mehr Substrate mit verschiedenen Eigenschatfen zu, weil auch die Zwänge zunehmen, denen die Substrate unterliegen.
  • Die US-A-4,708,929 lehrt die Verwendung von ED und EA zur Messung der Analytkonzentration bei CEDIA -Assays.
  • Die EP-A-0 292 169 offenbart neue Substrate, die durch β-Galaktosidase hydrolysiert werden können. Andere β-Galaktosidase-Substrate werden in Analyt. Chimica Acta (1984) 163: 67-72; Stokes und Wilson, Biochemistry (1972) 11:1061-1064 und der EP- A-0 146 866 beschrieben. Die EP-A-0 263 435 offenbart ein hydrolysierbares Substrat, bei dem es sich um an D-Maltotriosid konjugiertes 2-Formyl-4-nitrophenol handelt. J.Chem.Soc.Perkins.Trans (1983) 2(3) 365-369 und Chem.Abs. (1989) 113, 2488r offenbaren Konjugate von 3,4-Dinitrophenol mit Galaktosiden.
  • Es werden neue Substrate für Enzyme mit β-Galaktosidase-Aktivität beireitgestellt. Diese Substrate sind β-D-Galaktopyranosid-Konjugate an ein Nitrophenylderivat. Diese Substrate verfügen über physikalische, chemische und enzymatische Substrateigenschaften, die sie herkömmlichen β-Galaktosidase-Substraten, wie ONPG (o-Nitrophenyl- β-D-galaktopyranosid) überlegen machen.
  • Die erfindungsgemäßen Substrate können bei Verfahren eingesetzt werden, bei denen sie gegenüber herkömmlichen β-Galaktosidase-Substraten deutliche Vorteile aufweisen.
  • Die bereitgestellten Verbindungen haben die Formel:
  • worin R eine β-D-Galaktosidyl-Gruppe ist.
  • Im speziellen werden in der vorliegenden Anmeldung die Synthese und die Eigenschaften dieser Verbindung beschrieben. Die chemische Bezeichnung dieser Verbindung ist m-Cyano-p-nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (m-CN-NPG).
  • Enzyme mit β-Galaktosidase-Aktivität wirken auf die erfindungsgemäßen Verbindungen durch Hydrolysierung der Bindung zwischen dem C&sub1; der Galaktopyranosid-Gruppe und dem benachbarten Sauerstoff. Die durch die enzymatische Reaktion freigesetzte Nitrophenylderivatkonzentration ist durch Spektroskopie leicht zu messen.
  • Die vorliegende Verbindung kann als Substrat für eine Vielzahl von Enzymen mit β- Galaktosidase-Aktivität verwendet werden. Diese Enzyme können β-Galaktosidase selbst, β-Galaktosidase-Fusionsproteine oder Komplexe von Fragmenten oder modifizierte Fragmente von β-Galaktosidase sein. Von besonderem Interesse ist es, wenn die vorliegenden Substrate durch einen Komplex von zwei Peptiden hydrolysiert werden, die von β-Galaktosidase abstammen, worin die Peptide aus einem α-Komplementierungsfragment (oder einem Derivat, worin das α-Komplementierungsfragment an einen zu messenden Analyten konjugiert ist) und einem α-Komplementierungsakzeptor besteht. Bei diesem Komplex aus zwei von β-Galaktosidase abstammenden Peptiden handelt es sich üblicherweise um EA- und ED-Derivate, wie in der US-A-4.708.929 beschrieben.
  • Die in dieser Anmeldung beschreibenen Substrate können bei Verfahren eingesetzt werden, die die Messung von β-Galaktosidase-Aktivität verlangen. Beispielsweise finden β-Galaktosidase und ihre Derivate in der Molekularbiologie zahlreiche Anwendungen. β-Galaktosidase wird üblicherweise verwendet, um die Expression von Genen, deren Assay auf herkömmlichem Weg schwierig ist, durch die Fusion des β-Galaktosidase- Gens an das Gen von Interesse zu messen.
  • β-Galaktosidase-Analyt-Konjugate können in einer Vielzahl von Diagnoseassays verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Verbindung mit diesen Assays eingesetzt werden. Derartige Assays können verwendet werden, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration verschiedener Verbindungen, einschließlich spezifischer Proteine, Kohlehydrate und Polynukleotide, zu ermitteln. Die Assays können heterogen sein, einschließlich ELISA-Assays. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Verbindungen in CEDIA -Assays eingesetzt werden. Bei CEDIA - Assays wird die Menge eines Analyten durch die Fähigkeit des Analyten gemessen, die beobachtete Enzymaktivität zu beeinflussen, wenn eine anti-Analyt-Antikörper- Bindereaktion an ein β-Galaktosidase-α-Komplementierungsfragment, das an Analyt oder eine kreuzreaktive Verbindung konjugiert ist, eingesetzt wird. Beim Fehlen von freiem Analyt ist die beobachtete β-Galaktosidase-Aktivität geringer. So nimmt bei CEDIA -Assays die β-Galaktosidase-Aktivität zu, wenn die Analytmenge zunimmt. Bei CEDIA -Assays wird das o:-Komplementierungsphänomen zwischen ED und EA ausgenutzt, wie im Detail in der US-A-4.708.929 beschrieben ist.
  • Die Wahl eines geeigneten Substrats für ein Verfahren, das die Messung der β- Galaktosidase-Aktivität umfaßt, hängt von mehreren Faktoren, wie z.B. der erforderlichen Empfindlichkeit des Assay, der erforderlichen Assaygeschwindigkeit, den in der Assayprobe vorhandenen Verbindungen, die das beobachtete Ergebnis stören können, der Aktivität des Enzyms usw. ab.
  • Die Substratverbindungen der vorliegenden Erfindung haben Eigenschaften, die sie in einer Anzahl von Situationen nützlicher machen als die gegenwärtig herkömmlicherweise verwendeten β-Galaktosidase-Substrate, z.B. ONPG. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und die Produkte, die bei Hydroyse der vorliegenden Verbindungen durch β-Galaktosidase freigesetzt werden, unterscheiden sich von herkömmlichen β- Galaktosidase-Substraten durch mehrere Eigenschaften. Die Gesamtheit dieser verschiedenen Eigenschaften macht die erfindungsgemäße Verbindung nützlicher als die zur Zeit verfügbaren β-Galaktosidase-Substrate.
  • Die erfindungsgemäße Verbindung unterscheidet sich von herkömmlichen β- Galaktosidase-Substraten durch die Absorption seines Nitrophenylderivatreaktionsproduktes. Der molare Extinktionskoeffizient der durch Hydrolyse der erfindungsgemäßen Verbindung hergestellten Nitrophenylderivate ist im allgemeinen größer als jene der Hydrolyseprodukte herkömmlicher β-Galaktosidase-Substrate, wie ONPG. Die Erhöhung des molaren Extinktionskoeffizienten (ε) des Reaktionsproduktes macht das Assay für spektrophotometrische Detektion empfindlicher, weil die Signalstärke für eine bestimmte Konzentration erhöht wird. Eine erhöhte Signalstärke ist besonders wünschenswert, wenn das Ausmaß an Bindereaktion, die moduliert wird, gering ist, beispielsweise, wenn das Probenvolumen klein ist, wenn die Analytkonzentration gering oder wenn die enzymatische Aktivität gering ist. Eine Erhöhung des molaren Extinktionskoeffizienten kann auch die Geschwindigkeit erhöhen, mit der der Assay abgeschlossen werden kann, weil, wenn alle anderen Faktoren gleich bleiben, ein nachweisbares Signal rascher erreicht wird. Die neuen Substrate können daher in diesen Situationen vorteilhaft eingesetzt werden, sodaß empfindlichere Assays mit geringerem Absorptionshintergrund erreicht werden.
  • Die Substrate der vorliegenden Anmeldung weisen andere Löslichkeiten auf als herkömmliche β-Galaktosidase-Substrate. Die Nützlichkeit dieser Eigenschaft hängt von der Umgebung ab, in der der Assay durchgeführt wird. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf die hohe Wasserlöslichkeit von NSPG gelenkt werden (siehe Tabelle 1).
  • Es wurde auch festgestellt, daß die Verbindung gute hydrolytische Lagerungsstabilität aufweist, sodaß Reagenslösungen hergestellt und für längere Zeiträume verwendet werden können. Außerdem kann die erfindungsgemäße Verbindung aus allgemein verfügbaren Verbindungen in einfachen, effizienten, wirtschaftlichen chemischen Verfahren hergestellt werden.
  • Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Verbindung ist bei CEDIA -Assays im Vergleich zu herkömmlichen β-Galaktosidase-Substraten besonders nützlich.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
    • Beispiel 1: Synthese von m-Cyano-p-Nitrophenol MATERIALIEN
  • I. Eisessig (9,0 ml)
  • II. Natriumacetat (wasserfrei) (1,0 g)
  • III. Hydroxylaminhydrochlorid (0,6 g)
  • IV. 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd
    • VERFAHREN
  • Ein Gemisch aus I und II wurde in einen 25 ml-Kolben mit rundem Boden gegeben und in einem Ölbad zum Rückfluß gebracht. Ein Destillationskopf wurde auf den Kolben aufgesetzt und ein Volumen von 2ml Destillat gesammelt. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Reaktionskolben vom Ölbad entfernt, der heißen Lösung die Materialien III und IV zugegeben und der Destillationskopf durch einen Rückflußkühler ersetzt. Das resultierende Gemisch wurde im Ölbad drei Stunden lang am Rückfluß gehalten, dann wurde der Reaktionskolben herausgenommen und über 1,5 h auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Während dieses Zeitraums hatte sich ein Präzipitat gebildet, und dieses Material wurde filtriert, 10 min lang sauggetrocknet, dann 1 h lang in einen Vakuumofen gegeben, sodaß 450 mg eines gelben Feststoffs entstanden. Das IR-Spektrum des Materials zeigte eine ausgeprägte Absorption bei 2250cm&supmin;¹ im Infrarot, was auf das Vorhandensein der Cyanogruppe hindeutet, und war mit jenem eines Produktes identisch, das durch die Nitrierung von m-Cyanophenol isoliert wurde.
    • Beispiel 2: Synthese von m-Cyano-p-Nitrophenol-Galaktopyranosid (m-CN-NGP) MATERIALIEN
  • I. m-Cyano-p-Nitrophenol (620 mg, Beispiel 4)
  • II. Bromacetylgalaktose ("acetobromogalactose")(1,8 g, Sigma)
  • III. Kaliumkarbonat (wasserfrei) (0,9 g)
  • IV. Acetonitril (18 ml)
  • V. Methanol (100 ml)
  • VI. 25% Natriumethanolat/Methanol-Reagens (Aldrich)
  • VII. Essigsäure (0,5 ml)
    • VERFAHREN
  • Die Komponenten I, II und III wurden in einen mit einem Magnetrührer ausgestatteten 50 ml-Erlenmeyer-Kolben gefüllt. Diesem Gemisch wurde IV zugegeben, und das resultierende Gemisch bei Raumtemperatur 24 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat durch Rotationsverdampfung bei Wasserstrahlvakuum zu einem dicken glasartigen Material eingeengt (Wasserbad = 50ºC).
  • Diesem glasartigen Material wurden 10 ml Methanol zugegeben, und das glasartige Material wurde durch heftiges Rühren langsam aufgelöst. Der resultierenden Lösung wurden 0,5 ml VI tropfenweise zugegeben, und die Lösung wurde 20 min lang gerührt. Die Lösung wurde dann auf einen Rotationsverdampfer mit einer Badtemperatur von 60ºC aufgebracht und die Lösung in etwa auf die Hälfte ihres Volumens eingeengt. Die Lösung wurde vom Rotationsverdampfer genommen, und die resultierende Lösung mit 5 µl-Aliquoten Eisessig behandelt, bis die Zugabe von 3 µl-Aliquoten der Lösung zu leicht sauren Reaktionen führte, wenn sie auffeuchtes pH-Papier aufgetragen wurden (40 pl Essigsäure wurden verwendet).
  • Die Lösung wurde dann durch Rotationsverdampfung zur Trockene eingeengt und das resultierende glasartige Material 1 h lang unter Vakuum gesetzt. Das resultierende glasartige Material wurde dann aus 60 ml Methanol kristallisiert, sodaß 550 mg eines blaßgelben Materials entstanden.
    • Beispiel 3: Charakterisierung der physikalischen Eigenschaften der Substrate
  • Tabelle 1 gibt das Wellenlängenabsorptionsmaximum (λmax) für das Substrat und das Reaktionsprodukt an, den molaren Extinktionskoeffizienten ε für das Substrat und das Reaktionsprodukt, die Löslichkeit und die spontane Hydrolyserate der neuen Substrate (Stabilität). ONPC, das Standard-β-Galaktosidase-Substrat, ist zum Vergleich angeführt.
  • Es ist festzustellen, daß die erfindungsgemäße Verbindung einen Reaktionsprodukt-ε zeigt, der beinahe um das Sechsfache höher ist als der mit ONPG erreichte. Es sei auf die hohe Löslichkeit von NSPG verwiesen. Der hohe G und die hohe Löslichkeit von NSPG kann eingesetzt werden, um die Empfindlichkeit eines Assays zu erhöhen, da sowohl die relative Signalstärke als auch das absolute Signalausmaß erhöht werden können. Tabelle 1
  • *Die Hydrolyse wird bei Raumtemperatur gemessen. Die Ergebnisse sind auf eine Ausgangssubstratkonzentration von 100 µg/ml normiert.
    • Beispiel 4: Kinetische Eigenschaften der neuen Substrate
  • Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindung, als Substrat für β-Galaktosidase und ED28-Digoxigenin + EA zu wirken, wurde gemessen und mit den mit ONPG erhaltenen Ergebnissen verglichen. Bei ED28-Digoxigenin + EA handelt es sich um ein β-Galaktosidase-α-Fragment-Digoxigenin-Konjugat bzw. den α-Komplementierungsakzeptor. ED28-Digoxigenin besteht aus den β-Galaktosidase-Aminosäuren 1-46 mit Cysteinen an den Positionen 1 und 46, und an die Cysteine konjugiertem Digoxigenin. Assays, an denen ED und EA beteiligt sind, werden detaillierter in der US-A-4.708.929 beschreiben. E28-Digoxigenin und EA sind üblicherweise Komponenten eines CEDIA - Assays, bei dieser Versuchsreihe sind jedoch keine Antikörper vorhanden. 4 oder 5 Substratkonzentrationen wurden eingesetzt, um die Ergebnisse zu erzielen. Die Assayergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. Die Umsatzzahlen werden für EA+ED28- Digoxigenin und nicht β-Galaktosidase angeführt.
  • Beide Enzyme weisen im Vergleich zu ONPG klar eine um etwa das Dreifache höhere Vm auf, wenn sie mit den neuen Substraten gemessen werden. Beide Enzyme weisen für die meisten der neuen Substrate in etwas die gleiche Km auf wie für ONPG. NGPG scheint bei beiden Enzyme eine etwas geringere Affinität als ONPG aufzuweisen. Tabelle 2
    • Beispiel 5: Verwendung von Substraten bei CEDIA -Assays
  • Die Fähigkeit der neuen Substrate, in CEDIA -Assays zu funktionieren, wurde getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 angeführt. Alle Werte sind auf Reaktionsraten unter Verwendung von OCNPG (o-Chlornitrophenyl-β-D-galaktopyranosid) bezogen. OCNPG wird anstelle von ONPG als Standard verwendet, weil ONPG bei CEDIA -Assays ein außergewöhnlich schwaches Signal ergibt. Es wurden CEDIA -Assays für T3 (das Schilddrüsenhormon Trijodthyronin), Digoxin und Folat durchgeführt.
  • Die Bezeichnungen in Tabelle 3 werden wie folgt definiert. [Substrat]/Km ist das Verhältnis zwischen der Konzentration des im Assay verwendeten Substrats und dem Km des Enzyms für dieses Substrat. Die Zahlen für %offen, % Hemmung, % mod und % netto werden alle bezogen auf die mit OCNPG erhaltenen Ergebnissen angegeben.
  • % offen ist die Reaktionsrate in Abwesenheit von Antikörper. Die in Tabelle 3 angeführte Zahl ist die Reaktionsrate bezogen auf die mit OCNPG erhaltene Reaktionsrate.
  • % Hemmung ist als Differenz zwischen der Reaktionsrate in Abwesenheit des Antikörpers und der Reaktionsrate in Gegenwart des bei CEDIA -Assays gefundenen hemmenden Antikörpers, dividiert durch die Reaktionsrate in Abwesenheit von Antikörper definiert. Die in Tabelle 3 angeführten Zahlen sind auf die mit OCNPG als Substrat erhaltene Zahl für % Hemmung bezogen.
  • % Netto ist als Differenz zwischen der Reaktionsrate eines CEDIA -Assays unter Verwendung des Testsubstrats in Abwesenheit von Analyt und Gegenwart von Antikörper und derselben Reaktion in Gegenwart einer Sättigungsmenge an Analyt (d.h. maximal erreichbare Reaktionsrate) und Gegenwart von Antikörper, dividiert durch die Differenz zwischen der Reaktionsrate unter Verwendung von OCNPG in Abwesenheit von Analyt und Gegenwart von Antikörper und der Reaktionsrate mit OCNPG unter Verwendung einer Sättigungsmenge an Analyt und in Gegenwart von Antikörper definiert.
  • % Mod ist als Differenz zwischen der Reaktionsrate eines CEDIA -Assays in Abwesenheit von Analyt und Gegenwart von Antikörper und der gleichen Reaktionsrate in Gegenwart einer Sättigungsmenge Analyt (d.h. maximal erreichbare Reaktionsrate) und Gegenwart von Antikörper, dividiert durch die gleiche Zahl, die für die Reaktionsrate in Gegenwart einer Sättigungsmenge Analyt erhalten wurde, definiert. Je größer %mod, desto größer ist der Bereich von Analytkonzentrationen, über den das Assay wirksam ist. Die in Tabelle 3 angeführte Zahl ist die für das neue Substrat erhaltene % mod-Zahl, dividiert durch die für OCNPG erhaltene % mod-Zahl.
  • In Tabelle 3 ist zu erkennen, daß sich die mit der neuen Verbindung erhaltenen Ergebnisse nicht deutlich von den mit OCNPG erhaltenen unterscheiden, obwohl die Zahlen idealerweise 100% oder mehr der mit OCNPG erhaltenen ausmachen sollten. Es sollte festgehalten werden, daß die mit m-CN-NPG erhaltenen T3-Assayergebnisse verbessert werden, wenn die Konzentration des Substrats von 2,7xkm auf 4,1xKm erhöht wird. Tabelle 3
  • Aus obiger Erörterung und den Beispielen geht hervor, daß eine neue Verbindung bereitgestellt wird, die zur Verwendung beim Nachweis von β-Galaktosidase-Aktivität in einer Vielzahl von Situationen zahlreiche Vorteile bietet. Die Verbindung weist eine Anzahl wünschenswerter Eigenschaften auf, wie z.B. ein anderes Absorptionsmaximum, erhöhte Raten in einem Enzymmedium, was ein Ergebnis der Löslichkeit ist, Km und Vmax, leichte Synthese und einen hohen Extinktionskoeffizienten.
  • Alle in der vorliegenden Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind durch Verweis hierin eingeschlossen, als wäre jede einzelne Veröffentlichung und Patentanmeldung spezifisch und einzeln als durch Verweis eingeschlossen bezeichnet.
  • Die obige Erfindung ist zwar durch Veranschaulichung und Beispiel im Detail beschrieben worden, um das klare Verstehen zu ermöglichen, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung wird aber im Lichte der Lehren der vorliegenden Erfindung klar sein, daß gewisse Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können.

Claims (7)

1. Verbindung zur Verwendung als Substrat für Enzyme mit β-Galaktosidase- Aktivität, wobei die Verbindung die Formel:
aufweist, worin R = β-D-Galaktosidyl ist.
2. Verfahren zum Bestimmen der β-Galaktosidase-Enzymaktivität eines Mediums, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrat die Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung als Substrat für Enzyme mit β-Galaktosidase-Aktivität verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die β-Galaktosidase-Aktivität das Ergebnis der Bildung eines Komplex aus einem β-Galaktosidase-Enzymdonorfragment und einem β-Galaktosidase-Fnzymakzeptorfragment ist, die aktives Enzym bilden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Enzymdonorfragment an eine Verbindung konjugiert wird, die mit einem Analyten von Interesse kreuzreaktiv ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die β-Galaktosidase-Enzymaktivität als Markierung in einem heterogenen Assay eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der heterogene Assay ein ELISA ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Assay zum Nachweis einer Nukleotidsonde dient.
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