DE69027330T2

DE69027330T2 - Antivirales material

Info

Publication number: DE69027330T2
Application number: DE69027330T
Authority: DE
Inventors: John Marshall Scott Forrest; Werner E G Prof Dr Mueller; Derek Stewart
Original assignee: Scottish Crop Research Institute
Current assignee: Scottish Crop Research Institute
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-25
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2010-10-26
Also published as: JPH05501877A; AU6615090A; DE69027330D1; EP0497825B1; EP0497825A1; CA2071546A1; RU2082417C1; ATE138808T1; WO1991006311A1; OA09657A; US5462853A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein antivirales Material und auf Verfahren für dessen Gebrauch.
Der Human-Immunodeficiency-Virus (HIV) und der Human-T- Lymphotropic-Virus (HTLV) haben für die gesamte Welt ernsthafte Probleme geschaffen und es ist sehr wichtig, daß ein effektives Mittel zu ihrer Bekämpfung gefunden werden sollte. Eine große Anzahl von Materialien sind für die Anti-HIV-Aktivität untersucht worden, wobei sich einige mit einer positiven Wirkung erwiesen haben; es ist wünschenswert, Materialien zu identifizieren, die eine Anti-HIV-Aktivität haben, sodaß genügend Mengen für die Behandlung von Patienten hergestellt werden können.
Es ist bekannt, daß die Antiretroviral-Chemotherapie von Patienten mit einem Acquired-Immunodeficiency-Syndrom (AIDS) mit Dideoxynucleosiden, wie bspw. Azidothymidin (AZT), einigen Patienten hilft. Die Toxizität von AZT, einer Verbindung, die vermutlich eine virale DNA Polymerase in infizierten Zellen verhindert, ist jedoch von solcher Art, daß neue Strategien benötigt werden. Eine Strategie ist die Entwicklung von Substanzen, welche mit der viralen Adsorption und Penetration durch eine Blockierung des CD4 Rezeptors oder des viralen Glycoproteins interferieren. Es hat sich gezeigt, daß Dextransulfat dazu fähig ist, die Infektion von Zellen durch den Human-Immunodeficiency-Virus Typ 1 (HIV-1) zu blockieren. Anschließend wurde für andere sulfatierte Polysaccharide, wie bspw. Heparinsulfat, Chondroitinsulfat und polysulfatiertes Polyxylan, gefunden, daß sie eine Anti-HIV- Aktivität in vitro haben. Diese Verbindungen verhindern eine Virusadsorption und eine Bildung von Syncytium, obwohl ein direkter Einfluß dieser Drogen auf die Infektivität des Virus nicht demonstriert werden konnte.
Seit dem pandemischen Auftreten von AIDS und ATL (Adult-T- Cell Leukaemia) besteht ein dringendes Erfordernis für die Entwicklung eines Diagnostikums, welches das HIV und ähnliche Viren entweder intakt oder als Komponenten, insbesondere in Körperflüssigkeiten, direkt erkennen läßt. Diese Viren sind die wahrscheinlichen Ursachen der vorerwähnten Krankheiten.
Es wurde früher von Müller et al in Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 1:4$3-458 vorgeschlagen, D-Mannose-spezifisches Lektin von Gerardia savaglia für die Verhinderung einer Infektion von H9 Zellen innerhalb des HIV-1 zu verwenden. Dieses Lektin wird durch Extraktion von Korallen erhalten. Es agglutiniert jedoch menschliche Blutzellen und ist daher als ein therapeutisches Mittel ungeeignet.
Die folgenden Verfahren sind grundsätzlich für die Erfassung von HIV-l und HTLV anwendbar:
1. Direkte Erfassung bei Elektronenmikroskop-Ansätzen;
2. Visualisierung durch eine Immunfluoreszenz unter Verwendung von speziellen Antikörpern;
3. Erfassung von viralen Komponenten mittels genetischer Probenehmer und einer Hybridisation;
4. Vervielfachung des Virus in einer Zellenkultur; und
5. Antigen-Capture-Assay (ACA) oder konkurrierendes Einfangen, bspw. ELISA.
Bis jetzt wurde im Prinzip nur der Ansatz ACA beschrieben; ein Antikörper, der das Virus oder eine Komponente des Virus erkennt, wird an einer festen Phase befestigt, bspw. einem Glas oder Kunststoff. Danach wird menschliches Material, vorzugsweise ein Serum oder Plasma, in Berührung mit dem angebundenen Antikörper gebracht. Nach einer angemessenen Inkubation kann der Komplex des immobilisierten Antikörpers und des Virus (oder der viralen Komponenten) durch einen markierten Virus-spezifischen Antikörper visualisiert werden.
Bei dem konkurrierenden Einfangen wird der Antikörper zuerst mit einer Testlösung inkubatiert, welche das Virus oder virale Komponenten enthalten kann, und wird dann in Berührung mit demselben Virus oder seinen Komponenten gebracht, die zu einer festen Phase gebunden sind.
Wir haben festgestellt, daß Mannose-spezifisches Lektin zu einer Erkennung des Virus oder seiner Komponenten mit Genauigkeit fähig ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Mannose-spezifischen Lektins bereitgestellt, das von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae erhalten ist für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung von RNA Viren, wobei diese Viren Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose-Bindungen enthalten.
Gemäß der Erfindung ist weiterhin ein Impfstoff zum Schutz gegen RNA Viren bereitgestellt, die Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose- Bindungen haben, wobei der Impfstoff einen Anti-Lektin Antikörper aufweist, der sich mit einem Mannose-spezifischen Lektin verbindet, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae.
Gemäß der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereitgestellt, der Anti-Lektin Antikörper zur Bekämpfung von RNA Viren aufweist, wobei die Viren Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose-Bindungen haben, wobei das Verfahren besteht aus:
(a) Bereitstellung eines Mannose-spezifischen Lektins, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae; und
(b) Aussetzen des Lektins unter einen Antikörper erzeugende Mittel, um die Anti-Lektin Antikörper zu erzeugen.
Der Anti-Lektin Antikörper kann den Glycoprotein-Rezeptorort zur Umhüllung des Virus nachahmen und so als ein Impfstoff wirken.
Der Impfstoff wird vorzugsweise durch eine Züchtung der Antikörper entweder in vivo oder in vitro erzeugt.
Wahlweise kann das Anti-Lektin, welches den Impfstoff aufweist, für die Herstellung von Anti-Anti-Lektin Antikörpern in vivo verwendet werden, wie bspw. in syngenetischen Mäusen, oder in vitro, wie bpsw. von gezüchteten Zellen der Milz einer Maus. Einige dieser Anti-Anti-Lektin Antikörper ahmen das Lektin nach und können zur Behandlung von infizierten Patienten benutzt werden.
Die vorliegende Erfindung schafft so also auch ein therapeutisches Mittel zur Behandlung von Patienten mit RNA Virusinfektionen, wobei das RNA Virus Glycoproteine mit Mannose (α1T6) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose- Bindungen hat und das therapeutische Mittel einen Anti- Anti-Lektin Antikörper aufweist, der sich mit einem Anti- Lektin Antikörper verbindet, der sich seinerseits mit einem Mannose-spezifischen Lektin verbindet, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae, und wobei das Anti-Anti-Lektin das Lektin nachahmt
Das Virus ist vorzugsweise das HIV- oder das HTLV-Virus.
Das Lektin wird vorzugsweise von Narzissenzwiebeln erhalten und kann bspw. das Narcissus pseudonarcissus Lektin (NPL) sein. Andere Beispiele von besonderen Lektinen sind solche von Leucojum aestivum und Leucojum vernum. Das Lektin von NPL ist speziell für Mannose (α1T3) Mannose- und Mannose (α1T6) Mannose-Reste. Lektine der Zwiebeln von Schneeglöckchen können ebenfalls wirksam sein. Tests mit NPL haben ergeben, daß es bei der Verhinderung einer HIV Infektion bei 3 ug/ml (etwa 0.3 uM) bis zu 50 % wirksam ist.
Die Extraktion der Lektine kann in der Art und Weise durchgeführt werden wie beschrieben in Physiologia Plantarum 73: 52-57 ("Related mannose-specific lectins from different species of the family Amaryllidaceae") Els J M Van Damme, Anthony K Allen und Willy J Peumans.
Die Testverfahren für die Lektine werden vorzugsweise in der Art und Weise durchgeführt wie beschrieben in Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes 1: 453-458 ("The D-mannose-specific Lectin from Gerardia cavaglia blocks binding of Human Immunodeficiency Virus Type 1 to H9 cells and human lymphocytes in vitro") Werner E G Müller, Karin Renneisen, Matthias H. Kreuter, Heinz C Schröder und Irfin Winkler.
Die Lektine werden vorzugsweise auf Streifen eines künstlichen Materials, Glasperlen oder Kunststoffmaterial immobilisiert. Danach wird das immobilisierte Lektin über eine angemessene Periode mit einem definierten Volumen menschlichen Materials, einem Serum oder einem Medium inkubatiert. Nach dem Waschen mit einer Lösung von neutralem pH wird der Komplex des Lektin-Virus (oder der viralen Komponenten) durch Verwendung von Antikörpern quantifiziert, die für das Virus (oder seine Komponenten) spezifiziert sind bei dem eingeführten Verfahren "Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)" (Walker J M: Methods in Molecular Biology; Band 1, Urbana Press, Clihton: 1984).
Das Lekt in kann weiterhin direkt markiert werden. Die folgenden Markierungsverfahren können bspw. verwendet werden: radioaktives Jod 125, Fluorescein-Isothiocyanat oder ein Enzym wie bspw. Peroxidase (Nowotny, A: Basic Exercise in Immunochemistry, Springer-Verlag, Berlin; 1987). Für die Quantifizierung können die folgenden Verfahren angewendet werden: Schätzung der Radioaktivität (in dem Fall der Radiomarkierung) , Fluormetrie (für mit Fluorescein-Isothiocyanat markierte Antikörper) oder eine Enzymaktivität mit speziellem Substrat (in dem vorstehenden Fall Wasserstoffperoxid).
Die mit der neuen Diagnostik erhaltene Genauigkeit ist hoch. Es ist weiterhin von Vorteil, daß das Rohmaterial für diese Klasse des Lektins nicht teuer ist.
Ausführungsformen der Erfindung werden nun für den Zweck der Darstellung in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

Das Lektin von Narcissus pseudonarcissus (NPL) wurde gereinigt wie beschrieben von Van Damme et al 1988.

Virus stämme

Der HTLV-IIIB (Popovic et al, 1984) Stamm von HIV-1 und zwei HIV-2 Stämme, HIV-25T (Kong et all, 1988) und HIV-2MS (Kanki et al, 1988) wurden getestet.
HIV-1 Teilchen wurden von dem Medium der mit HTLV-IIIB infizierten H9 Zellen hergestellt, wie beschreiben von Popovic et at (1984).
Das radiomarkierte Virus wurde wie folgt hergestellt.
Mit HTLV-IIIB infizierte, zwei Wochen alte H9 Zellen (Popovic et al, 1984) wurden für zwei Tage in einem Medium inkubatiert, das 50 nCi/ml [³&sup5;S]Methionin enthielt. Es wurde ein zellenfreier Flüssigkeitsüberstand durch eine Zentrifugierung bei niedriger Drehzahl (4.000 xg; 10m min; 4ºC) erhalten. Dieser wurde dann dialysiert gegen einen 0.1 M Tris-HCl Puffer (pH 7.4; 0.1 N NaCl, 0.001 M EDTA) für 5 Stunden bei 4ºC, und es wurden dann Teilchen des Virus durch eine Zentrifugierung bei 30.000 U/min in einem Beckman Ti-45 Rotor über 2 Stunden (4ºC) gesammelt. Das resultierende Pellet wurde über einem 3 ml Linearsucrose- Gradienten für 24 Stunden zentrifugiert, wie beschrieben von Popovic et al, 1984; die Fraktionen innerhalb des Dichtebereichs 1.18 bis 1.15 g/ml wurden gesammelt. Die spezielle Radioaktivität veränderte sich zwischen 1.3 und 2.9 x 10&supmin;¹&sup6; Ci-Virion. Die Teilchen wurden unter dem Elektronenmikroskop gezählt (Popovic et al, 1984). Ein zweites Reinigungsverfahren, die Technik der Zentrifugierung des Nycodenz-Gradienten, wurde dann für die Herstellung der Virionen (Vimer et al, 1984) angewendet. Nach diesem Verfahren wurde festgestellt, daß die spezielle Aktivität der Herstellung oder Vorbereitung des Virus identisch zu derjenigen war, die von der Zentrifugierung des Sucrose-Gradienten erhalten wurde. Es ist ein Anzeichen dafür, daß keine Zellenmembranen zusammen mit den Viruspartikeln sedimentiert waren.

Zellen und Virusinfektionen

Die menschlichen T-Zellinien MT-2 (Harada et al, 1985) CEM (Nara und Fischinger, 1988), ATH8 (Mitsuya and Broder, 1986) und H9 (Popovic et al, 1984), die menschliche Monocytlinie U937 (Ezekovitz et al, 1989) und die somatische Zellhybridkultur zwischen CEM und der B Zellinie 174 (Kong et al, 1988) wurde in einem RPMI 1640 Medium gewachsen, das mit einem 15 % (v/v) Fetalkalbserum (Müller et al, 1988) ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre bei 5 % CO&sub2; in der Luft beibehalten.

HIV-1 Infektion

Die Zellen wurden routinemäßig geimpft bei einer Konzentration von 1 x 10 Zellen/ml, und ein HIV-1 Virus wurde dann hinzugefügt, um eine Vervielfachung der Infektion (MOL) einer 0.03 infektiösen Dosis (TCID&sub5;&sub0;) der Mediumgewebekultur je MT-2 Zelle und 0.12 TCID&sub5;&sub0; je CEM oder U937 zu erhalten. Die Zellen wurden in Gegenwart oder bei Abwesenheit der Testverbindungen für 7 Tage inkubatiert. Während dieser Zeit ergaben die nicht infizierten MT2 Zellen 2.91 Verdopplungsstufen, die CEM Zellen ergaben 2.14 Verdopplungen und die U937 Zellen ergaben 1.93 Verdopplungen. Die infizierten Zellen unterliefen die folgenden Verdopplungsstufen: MT-2/HTLV-IIIB: 0.09, CEM/HTLV-IIIB: 0.04; und U937/THLV- IIIB: 0.08.
Sofern nicht anders erwähnt, wurde eine wie klargestellt vorbereitete HIV-1 Kulturflüssigkeit mit den verschiedenen Verbindungen vorbehandelt (30 Minuten bei 36ºC) und wurde dann zu den Zellen hinzugefügt, um die angegebene Verbindung und die Viruskonzentrationen zu ergeben. Die Herstellung des Virus wurde zuvor inkubatiert zusammen mit der Verbin- dung in einem Volumen von 100 ul und dann in einer zehnfach höheren Konzentration als derjenigen, die letztlich bei dem Versuch mit der Zellenkultur vorhanden war.

HIV-2 Infektion

HIV-2ST erzeugende CEMXI74 Zellen und HIV-2MS erzeugende U937 Zellen wurden mit 10.000 rad bestrahlt und dann bei einer Dichte von 4 x 10&sup4; Zellen/ml des finalen Ansatzvolumens gemeinsam mit 2 x 10&sup5; ATH8 Zellen kultiviert. Nach einer Inkubation von 7 Tagen waren nur die ATH8 Zellen noch am Leben und wurden dann ihre Dichten geschätzt. Die Testverbindungen wurden zu den bestrahlten Zellen 30 Minuten vor der Hinzufügung der ATH8 Zellen hinzugefügt. Bei den nicht infizierten Kontrollen unterliefern die ATH8 Zellen 2.01 Verdopplungsstufen während der Inkubation über 7 Tage.

Auswertung

Die Zellenkonzentrationen wurden routinemäßig unter Verwendung des XTT colorimetrischen Ansatzsysterns (Scudiero et al, 1988) ausgewertet, gefolgt von einer Auswertung mit einem ELISA-Lesegerät, (Bio-RAD, Modell No. 3550, ausgerüstet mit dem Programm NCIMR IIIB). Um die Wachstumskurven zu standardisieren, wurden die Zellen elektronisch gezählt (Cytocomp Zähler; Modell Michaelis). The Anzahl der Verdopplungsstufen wurde bestimmt wie beschrieben von Müller et al, 1975.
Die 50 % cytoschützende Konzentration (IC&sub5;&sub0;) stellt diejenige Konzentration dar, bei welcher das Zellenwachstum von HIV-infizierten Zellen 50 % der Wachstumsrate der nicht infizierten Zellen während der Inkubationsperiode von 7 Tagen erreichte. Die 50 % cytotoxische Konzentration (TC&sub5;&sub0;) stellt diejenige Konzentration dar, bei welcher die Wachs- turnsrate der infizierten Zellen um 50 % reduziert war; dieser Wert ist gewöhnlich vergleichbar mit TC&sub5;&sub0; der nicht infizierten Zellen. Die 50 % Werte wurden durch die logische Regression (Sachs, 1984) geschätzt. Der antivirale Index (AI) wird aus dem Verhältnis TC&sub5;&sub0; : IC&sub5;&sub0; berechnet.

Syncytium Induktionsansatz

Dieser Ansatz wird durchgeführt wie beschrieben von (Matthews et al, 1987). Eine Gesamtheit von 1 x 10 HTLV- IIIB-infizierten H9 Zellen wurden mit 1 x 10 nicht infizierten Jurkat Zellen in einem finalen Volumen von 100 ul entweder in Gegenwart oder in der Abwesentheit der Verbindung vermischt. Fünf und 24 Stunden später wurde die Syncytium-Bildung (definiert als > 4 Kerne innerhalb einer gemeinsamen Zellmembrane) semiquantitativ bewertet (Lifson et al, 1986); -, keine Syncytia; 1+, selten kleine Syncytia; 2+, vielfach mäßig große Syncytia; 3+, große Syncytia in den meisten, jedoch nicht in allen Mikroskopfeldern (Vergrößerung 400 x); und 4+, zahlreiche große Syncytia in allen untersuchten Feldern.

Untersuchungen der Virus-Zellenbindung

1 x 10&sup5; MT-2 Zellen wurden in 1 ml des verbindenden Ansatzpuffers (20 mM Na-Phosphat, 1 mM CaCl&sub2;, 130 mM NaCl, 2 % (w/v) Rinderserurn Albumin [Müller et al, 1982]) suspendiert. Dann wurden 20 ul markiertes Virus (etwa 25 x 10&sup4; dpm/Ansatz [final]) hinzugefügt und für 0 bis 60 min bei 37ºC in 5 % CO&sub2; inkubatiert. Die Zellen wurden danach durch eine Zentrifugierung (2.000 x g; 10 min; 4ºC) gewaschen und die Radioaktivität wurde gemessen.
Wo angegeben, wurde die Virusherstellung (20 ul) zuvor über 1 Stunde bei 4ºC mit einer 10 ul Lösung des Narcissus Lektins inkubatiert und wurde dann den Zellen hinzugefügt.

Untersuchungen der Verbindung

Die Verbindung mit nicht infizierten MT-2 Zellen oder mit MT-2 Zellen, die mit HTLV-IIIB infiziert waren (die Infizierung wurde für 3 Tage wie vorstehend beschrieben durchgeführt) wurde gleichartig bestimmt. Die MT-2 Zellen (1 x 10&sup5;) in einem finalen Volumen von 1 ml des Bindungspuffers wurden zuvor für 30 Minuten bei 4ºC inkubatiert. Die Zellensuspension wurde dann zweifach durch eine Zentrifugierung (2.000 x g; 10 min; 4ºC) gewaschen, und die Zellen wurden dann inkubatiert (1 Stunde bei 4ºC) in einem 1 ml Volumen in der Gegenwart oder bei Abwesenheit von 1 mM Ca²&spplus; mit NPL.
Schließlich wurden die Zellen mit dem Bindungspuffer durch eine Zentrifugierung zweimalig gewaschen und wurde die mit den Zellen verbundene Radioaktivität bestimmt. Der Hintergrundwert (Ansatz ohne Zellen, aber in der Gegenwart von Ca²&spplus;) war 50 dpm ml.

Anti-HIV Aktivität des Narcissus Lektins

Das Narcissus Lektin wurde auf seine Anti -HIV Aktivität getestet zuerst durch die Anwendung des Cytoschutz-Ansatzes; die Zellendichte wurde bestimmt durch den XTT Tetrazolium/Formazan-Ansatz. Wie angegeben in der Tabelle 1 zeigte das Mannose-spezifische Narcissus Lektin eine beträchtliche Anti-HIV-1 Cytoschutzwirkung mit einem AI zwischen > 14 und > 46. Bei den CEM x 174/HIV-2ST und den U937/HIV-2MS Systemen wurde das AI mit > 15 und > 12 bestimmt. Zusätzlich zeigte das NPL keine cytotoxischen Wirkungen bei bis zu 100 ug/ml, während das AZT eine 50 % cytotoxische Wirkung bei Konzentrationen von etwa 9 ug/ml (Tabelle 1) verursachte. Aus Vergleichsgründen ist die hemmende Aktivität von AZT gegen HIV-1 und HIV-2 in der Tabelle eingegliedert.

Verhinderung der Syncytium-Bildung durch das Narcissus Lektin

Die Hinzufügung des Narcissus Lektins zu dem Syncytium- Induktionsansatz während der gemeinsamen Inkubationsperiode in Jurkat Zellen mit HTLV-IIIB erzeugenden H9 Zellen hemmte die Bildung von Syncytium stark (Tabelle 2). Bei einer Konzentration von 3 ug/ml des Lektins konnte keine Bildung von Syncytium gemessen werden.

Hemmung der HIV-1 Verbindung mit MT-2 Zellen durch das Narcissus Lektin

Die Hinzufügung des Narcissus Lektins (20 ug/ml) vernichtete nahezu vollständig die Bindung von HIV-1 [HTLV-IIIB]Teilchen an die MT-2 Zellen. Fig. 1 zeigt die Wirkung des Narcissus Lektins auf die Bindung von HIV-1 an die MT-2 Zellen. [³&sup5;S] Methionin-markiertes HIV-1 [HTLV-IIIB] wurde mit MT-2 Zellen entweder bei Abwesenheit von jeder zusätzlichen Verbindung oder in der Gegenwart von 20 ug/ml Narcissus Lektin inkubatiert. Die Proben wurden nach 0 - 60 min entnommen, und es wurde dann die Radioaktivität, die durch die MT-2 Zellen gebunden war, bestimmt, wie beschrieben.
Dieses Beispiel demonstriert die Funktion von NPL bei der Anbindung an HIV und bei der Verhinderung einer Infektion der Zellen durch HIV-1 und HIV-2. Tabelle 1 Tabelle 2
Die Wirkung auf die Verbindung von HIV-1 mit den MT-2 Zellen des Narcissus Lektins ist in Fig. 1 dargestellt. [³&sup5;S]Methionin-rnarkiertes HIV-1 [HTLV-IIIB] wurde mit MT-2 Zellen entweder bei Abwesenheit von irgendeiner zusätzlichen Verbindung (Linie.) oder in der Gegenwart von 20 ug/ml Narcissus Lektin (Linie X) inkubatiert. Die Proben wurden nach 0 - 60 Minuten entnommen und es wurde die Radioaktivität, gebunden an die MT-2 Zellen, wie in dem Beispiel beschrieben bestimmt.
Fig. 2 zeigt graphisch die Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern des inneren Bildes zur Verwendung bei der Behandlung gegen eine Infektion durch HIV. Das Lektin NPL ist bei 10 gezeigt und ist zu einer Verbindung mit dem Umhüllung-Glycoprotein des HIV Virus 12 durch Rezeptororte 14, 16 fähig. Das Lektin kann daher in eine Empfängermaus eingeführt werden, welche die Anti-Lektin Antikörper 18 erzeugt. Einige dieser Antikörper 18 ahmen den Virusumhüllung-Glycoprotein-Rezeptorort nach und werden durch die Affinitätschromatographie ausgewählt sowie ihre Fähigkeit zu einer Vermehrung der antudiotypischen Antikörper, die das Lektin nachahmen, wie beschrieben in Weiler et al, 1990; Journal of General Virology.
Die ausgewählten Antikörper können dann als ein Impfstoff verwendet werden oder zur Immunisierung von syngenetischen Mäusen 20, um Anti-Antilektin Antikörper für die Behandlung von infizierten Patienten zu erzeugen. Alternativ können die ausgewählten Antikörper für die Herstellung von Anti- Antilektin Antikörpern durch eine Kultivierung in vitro mit Zellen von der Milz einer Maus verwendet werden.
Die Verwendung der Verbindung NPL zur Anhebung eines Impfstoffes gegen HIV oder ähnliche Viren kann erreicht werden durch eine Reinigung der Verbindungen mit der Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder mit der Affinitätschromatographie und ihrer Verwendung für eine Erhöhung der eine Maus betreffenden Antikörper durch eine passende Routine der Immunisierung.
Wenn die Produkte eine niedrige Antigenität haben, können sie auch mit Trägerproteinen vor der Immunisierung gekuppelt werden oder bei dessen Fehlen verwendet werden für eine Immunisierung von Mäusezellinien in vitro (Vaux et al, 1988; Nature 336, 36-42).
Antikörper, die das Innenbild des viralen Rezeptorortes nachahmen, können dann durch die Affinitätschromatographie und/oder durch die Fähigkeit zur Erzeugung von aktiven anti-idiotypischen Antikörpern ausgewählt werden (Weiler et al, 1990; Journal of General Virology, in Presseveröffentlichung).
Der Impfstoff kann schließlich durch eine passende Routine in Verbindung mit immunostirnulierenden Komplexen oder anderen Adjuvants verabreicht werden (Takahashi et al, 1990; Nature 344, 873-875).
Unter Bezugnahme auf die Fig. 3 kann das Virus 24, welches sich mit einem Ort an der Gastrnernbrane 28 verbindet, als ein Immunogen verwendet werden zur Erzeugung einer Bibliothek von antiviralen monoklonalen Antikörpern 22 in einer Maus. Der monoklonale Antikörper 22 gegen den Ort der Rezeptorbindung an Virus 24 wird wegen seiner Neutralisierungsfähigkeit ausgewählt. Wenn der antivirale monoklonale Antikörper 22 in eine syngenetische Empfängermaus eingespritzt wird, werden Anti-Antikörper (anti-idiotypische Antikörper) 26 erzeugt mit dem speziellen Vermögen in Bezug auf den Antigen-Bindungsort 28 des antivirale monoklonen Antikörpers 22.
Eine Subsatz der anti-idiotypischen Antikörper 26 wird übereinstimmende Ähnlichkeiten mit dem Rezeptor-Bindeort des primären Virus aufweisen. Solche anti-idiotypischen Antikörper 26 des "inneren Bildes" reagieren daher mit dem Zellmembran-Rezeptor.
Eine Immunisierung mit solchen anti-idiotypischen Antikörpern 26 des "inneren Bildes" werden weiterhin eine Vergrösserung der anit-antudiotypischen Antikörper ergeben, von denen einige speziell mit dem Bindungsort an dem Virus 24 reagieren.
Wenn das Lektin einmal gereinigt worden ist, kann es bswp. in eine Maus eingespritzt werden, die Anti-Lektin Antikörper erzeugt. Diese Antikörper können auf mehrere Arten verwendet werden, bpsw. zur Immunisierung einer zweiten Maus in vivo oder in vitro durch eine Herausnahme von Zellen aus der Milz der Maus und deren Kultivierung in vitro.
Weitere Beispiele werden nun zur Darstellung der Verwendung der Erfindung bei der Diagnose angegeben.

Beispiel 2

Das Lektin von der Pflanze Narcissus pseudonarnissus kann isoliert werden, wie beschrieben von van Damme et al, 1988. Dieses Lektin erkennt speziell die D-Mannose.
Seine Entdeckung als ein Diagnostiziermittel wurde durch den Ouchterlony/Doppelgel-Diffusionsansatz (Ouchterlony, O.; Acta Pathol. Microbiol, Scand, 26: 507, 1949) erreicht. 1 % Agar in physiologischer Kochsalzlösung wurde in Glasschalen verteilt und für eine Verfestigung zugestanden. Danach wurden Quellen mit einem Durchmesser von 3 mm in einem Abstand von 7 mm ausgestanzt. In eine Quelle wurden 20 ul Lektin (2 ug/ml) eingebracht und in der benachbarten Quelle 20 ul virales Protein (2 ug/ml). Das ausgewählte virale Protein war gp120 von HIV-1. gp 120 wurde isoliert, wie beschrieben von Matthew et al, 1987. Die Schale wurde für 2 Tage bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer stehengelassen, wonach die Abscheidungslinie klar sichtbar war. Die Bildung einer solchen Abscheidung ist die klare Anzeige einer typischen speziellen Erkennungsreaktion.

Beispiel 3

Das HIV Virus und seine Komponenten reagieren speziell mit Lektin in einem Doppelgel-Diffusionstest. Bei diesem Beispiel wird demonstriert, daß das Narcissus Lektin in ein Diagnostizierverfahren eingegliedert werden kann.
Die Quellen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte (96 Quellen mit flachen Böden) wurden mit 100 ul einer Narcissus Lektinlösung (20 ug/ml in physiologischer Kochsalzlösung) bedeckt. Die Platten wurden für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubatiert. Die Quellen wurden dann mit einer 0.5 % wässrigen Lösung von Tween 80 (Polyoxyethylensorbitan-Monooleat) gewaschen, welches 0.1 M NaCl und 0.02 M Tris hydroxymethyl aminomethan, pH 7.4 enthielt. Tween 80 wurde von Sigma, St. Louis, MO, USA für die Entfernung von ungebundenem Lektin erhalten. Die Quellen wurden dann mit 100 ul der Testllsung (siehe später), dem Serum eines AIDS Patienten oder einer Lösung des HIV-1 Protein gp120 gefüllt. Nach der Inkubation für 8 Stunden bei Raumtemperatur wurden sie mit dem vorerwähnten Tween 80 genügend gewaschen (3 x 5 min) um ungebundenes Material zu entfernen. Danach wurden 100 ul eines polyklonalen Antikörpers gegen HIV-1-spezifisches gp120 zu den Quellen hinzugefügt (wobei der polyklonale Antikörper in Kaninchen gezüchtet war und von der Fa. Biochrome, Berlin erhalten wurde). Der bei diesem Verfahren verwendete Antikörper war biotinylisiert; er wurde mit einer Konzentration von 10 ng/rnl verwendet. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 60 Minuten wurden die Quellen wieder mit der Tween Lösung gewaschen (3 x 5 min) und mit 100 ul einer 1:500 Avidin-Peroxidase Lösung (Sigma Ltd) für weitere 60 min inkubatiert. Die Quellen wurden dann mit der Tween Lösung gewaschen ( 3 x 5 min) und mit 100 ul des Peroxidase-Substrats bedeckt. Dieses bestand aus 0.03 % wässriger Wasserstoff-Peroxidaselösung und einer Ethanol 8 mM 4-Chlor-1-naphthol Lösung (mit einer Mischung 1:1). Nach der Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur wurde die Absorbanz bei einer Wellenlänge von 414 nm mit einem Lichtmeßgerät gemessen. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse eines typischen Experiments angegeben. Tabelle 3
Die Absorbanz wurde gegen einen Leerwert (Kontrollserum von einer gesunden Person oder das Humanserum Albumin) von derselben Konzentration gemessen.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß der beschriebene Antigen-Einfangansatz für eine Erfassung der Gegenwart des HIV-1 Virus oder eines seiner Antigene gp120 präzise fähig war.

Beispiel 4

Die Eingliederung des Lektins von Narcissus pseudonarcissus in einen Einfangansatz auf der Basis eines HIV-Proteins.
Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatten mit 96 Quellen (Costar) wurden mit 0.1 ml HIV-Protein [10 ug/ml in einem 0.1 M Natriumcarbonatpuffer (pH 9.6)] bedeckt. Nach der Inkubation von 12 Stunden bei 4ºC in einer feuchten Atmosphäre wurde die Proteinlösung entfernt und wurden die Quellen mit Verdünnungspuffer gefüllt (3 % Rinderserum Albumin mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung [PBS], ergänzt mit 1 mM CaCl&sub2; und 0.02 % Na-Azid). Nach einer weiteren Inkubation für 2 Stunden bei 20ºC wurden die Platten zweimal mit PBS gewaschen.
Danach wurden die Platten mit 100 ul der Antigentestlösung für 2 Stunden bei 37ºC inkubatiert. Die Antigeltestlösung bestand aus 50 ul einer konstanten Menge von alkalischer Phophatase, verbunden mit Narcissus pseudonarcissus Lektin NPL (5 ng) und 50 ul von ansteigenden Konzentrationen von freiem gp120 (0 bis 10 ng) in einem Verdünnungspuffer (siehe oben). Vor der Hinzufügung zu den mit HIV Protein bedeckten Quellen wurde die Testlösung, bestehend aus NPL und freiem gp120, in einer feuchten Atmosphäre inkubatiert (2 Stunden; 20ºC).
Bei einer Reihe von Experimenten wurden die 50 ul des Enzym-gekuppelten NPL zuerst zu der bedeckten Quelle hinzugefügt. Nach einer Waschstufe mit PBS wurden 50 ul freies gp120 in dieser Reihenfolge 10 min später hinzugefügt.
Nach der Inkubation der mit HIV-Protein bedeckten Platten (i) mit einer Probe des zuvor inkubatierten Materials [NPL und freies gp120] oder (ii) nach einer aufeinanderfolgenden Hinzufügung der Komponenten (zuerst einer Inkubation der Platten mit NPL und danach eine Waschstufe mit gp120) für 60 min bei 37ºC wurden die Quellen zweimal mit 0.05 % Tween 20 in PBS gewaschen und dann zweimal mit 10 mM Dietanolamin (pH 9.5, enthaltend 0.5 mM MgCl&sub2;). Nach einem Trocknen der Platten wurden 50 ul einer alkalischen Substratlösung (p- Nitrophenylphosphat) hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch eine Hinzufügung von 50 ul 0.1 M EDTA gestoppt,und dann wurde die Absorbanz bei 405 nm in einem ELISA Lesegerät gelesen.
Fig. 4 veranschaulicht die Kalibrierung des Einfangansatzes auf der Basis des HIV-Proteins. Mit HIV-Protein bedeckte Quellen von Mikrotiter-Platten wurden mit einer konstanten Menge von alkalischem Phosphatase-gekuppeltem NPL (Narcissus pseudonarcissus Lektin) (5 ng) inkubatiert sowie mit steigenden Mengen von freiem gp120 ( 0 - 10 ng). Die Komponenten wurden auf zwei verschiedene Arten hinzugefügt, (i) NPL und gp120 wurden zuerst inkubatiert und dann zu den bedeckten Quellen hinzugefügt [NPL/9p120 (zuerst inkubatiert)] oder (ii) die Komponenten wurden aufeinanderfolgend hinzugefügt, zuerst wurde NPL zu den bedeckten Quellen hinzugefügt und dann wurde gp120 hinzugefügt [NPL+gp120 (aufeinanderfolgend)]. Nach der Inkubation und der nachfolgenden Hinzufügung der alkalischen Phosphatase-Substratlösung wurden die Immunokornplexe,gebunden an den festen Träger,quantifiziert durch ein Lesen der Absorbanz in einem ELISA Lesegerät Die Mittelwerte von fünf parallelen Experimenten sind angegeben; das SD war kleiner als 12 %.

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Claims

1. Verwendung eines Mannose-spezifischen Lektins, das von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae erhalten ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Bekämpfung von RNA Viren, wobei die Viren Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose-Bindungen enthalten.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Lektin von einem Mitglied der Spezies Narcissus erhalten ist.

3. Impfstoff zum Schutz gegen RNA Viren, die Glycoproteine mit Mannose ( α1T3) Mannose- oder Mannose ( α1T6) Mannose-Bindungen haben, wobei der Impfstoff einen Anti- Lektin Antikörper aufweist, der sich mit einem Mannosespezifischen Lektin verbindet, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae.

4. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der Anti- Lektin Antikörper zur Bekämpfung von RNA Viren aufweist, wobei die Viren Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose ( α1T6) Mannose-Bindungen haben, wobei das Verfahren besteht aus:

(a) Bereitstellung eines Mannose-spezifischen Lektins, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae; und

(b) Aussetzen des Lektins unter einen Antikörper erzeugende Mittel, um die Anti-Lektin Antikörper zu erzeugen.

5. Impfstoff nach Anspruch 3 oder Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem der Anti-Lektin Antikörper sich mit einem Lektin verbindet, das von einem Mitglied der Spezies Narcissus erhalten ist.

6. Impfstoff nach Anspruch 3 oder Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem der Virus HIV oder HTLV ist.

7. Therapeutisches Mittel zur Behandlung von Patienten mit RNA Virusinfektionen, wobei der RNA Virus Glycoproteine mit Mannose ( α1T3) Mannose- oder Mannose ( α1T6) Mannose-Bindungen hat, wobei das therapeutische Mittel einen Anti-Anti-Lektin Antikörper aufweist, der sich mit einem Anti-Lektin Antikörper verbindet, der sich seinerseits mit einem Mannose-spezifischen Lektin verbindet, erhalten von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae, und wobei das Anti-Anti-Lektin das Lektin nachahmt.

8. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 7, bei welchem das Mannose-spezifische Lektin von einem Mitglied der Spezies Narcissus erhalten ist.

9. Diagnostikverfahren zur Erfassung von Komponenten der RNA Viren, wobei die Viren Glycoproteine mit Mannose (α1T3) Mannose- oder Mannose (α1T6) Mannose-Bindungen enthalten, wobei das Verfahren besteht aus:

(a) Bereitstellung eines Amaryllidaceae-abgeleiteten Lektins, welches sich speziell mit Mannose verbindet;

(b) Aussetzung des Lektins unter eine Probe der zu erfassenden Komponenten; und

(c) Bestimmung, ob eine Bindung des Lektins mit den Komponenten stattgefunden hat.

10. Verfahren nach Anspruch 9, welches weiterhin die Stufe einer Bestimmung der Menge der durch das Lektin gebundenen Komponenten durch einen Vergleich mit einem bekannten Standard umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, bei welchem das Lektin mit einem Enzym konjugiert ist und das Verfahren weiterhin besteht aus der Aussetzung eines Substrats für das Enzym unter das Lektin und die Komponenten, wobei die relative Menge der durch das Lektin gebundenen Komponenten bestimmt wird durch eine Messung der Wirkung des Enzyms auf das Substrat und einen Vergleich dieser Wirkung mit einem bekannten Standard.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches weiterhin die Stufen einer Aussetzung eines Enzymkonjugierten Antikörpers unter das Lektin und die Komponenten aufweist sowie ein nachfolgendes Aussetzen eines Substrats für das Enzym unter den Antikörpern, das Lektin und die Komponenten, wodurch die relative Menge der durch das Lektin gebundenen Komponenten bestimmt wird durch eine Messung der Wirkung des Enzyms auf das Substrat und einen Vergleich dieser Wirkung mit einem bekannten Standort.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei welchem das Lektin von einer Zwiebel der Pflanzenfamilie Amaryllidaceae abgeleitet ist.