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DE69026306T2 - Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine. - Google Patents

Verfahren für die Herstellung von Polyethylenglykolderivate und modifizierte Proteine.

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DE69026306T2
DE69026306T2 DE69026306T DE69026306T DE69026306T2 DE 69026306 T2 DE69026306 T2 DE 69026306T2 DE 69026306 T DE69026306 T DE 69026306T DE 69026306 T DE69026306 T DE 69026306T DE 69026306 T2 DE69026306 T2 DE 69026306T2
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eluent
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Yoshiyuki Kai
Kazuhisa Kashimoto
Michio Kubota
Hiroo Maeda
Keiichi Ono
Katsukiyo Sakurai
Yoshikatsu Tanaka
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Seikagaku Corp
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Seikagaku Corp
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von als Proteinmodifizierungsmittel geeigneten Polyethylenglykolderivaten sowie durch hochreine Polyethylenglykolderivate modifiziertes Protein.
    • STAND DER TECHNIK
  • In den vergangenen Jahren wurde es möglich, mit fortschreitender Gentechnik Protein mit physiologischer Aktivität in großer Menge herzustellen. Es wurde erwartet, daß sich ein solches Protein als Arzneimittel einsetzen läßt. Wenn jedoch physiologisch aktives Protein dem praktischen Gebrauch als Therapeutikum zugeführt wird, besitzt dieses manchmal keine therapeutische Wirkung, da es infolge Zersetzung durch im Körper vorhandene Peptidase, nichtwirksamer Ubertragung zum Zielgewebe u.dgl. extrem rasch aus dem Blutkreislauf verschwindet. Weiterhin besteht die Gefahr, daß es bei der Verabreichung von aus dem heterologen Organismus gewonnenem, physiologisch aktivem Protein an Menschen zu einer Immunreaktion kommen kann. Zur Lösung dieser Probleme wurde bereits versucht, das physiologisch aktive Protein mit einer künstlichen hochmolekularen Verbindung, insbesondere mit Hilfe von Polyethylenglykol, chemisch zu modifizieren. Bei Polyethylenglykol ist die Immunogenizität extrem gering. Durch chemische Bindung von Polyethylenglykol an Protein kommt es zu einer Senkung der Antigenizität und Immunogenizität, einer weitestgehenden Verminderung der Toxizität, einer Verlängerung der Plasmahalbwertszeit u.dgl..
  • Darüber hinaus ist das polyethylenglykolgebundene Protein in einem organischen Lösungsmittel löslich, so daß die Synthese unter Verwendung von Hydrolase (d.h. eines Proteins) wirksam durchgeführt werden kann.
  • Zur chemischen Bindung von Polyethylenglykol an Protein gibt es folgende Verfahren:
  • (1) Verfahren zur Einführung von zwei Polyethylenglykolmonoalkyletherketten in Aminogruppen eines Proteins über Cyanursäurechlond (Inada und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKOKU) Nr. 61-42558; Inada und Mitarbeiter in "Chemistry Letters", 773 (1980); Inada und Mitarbeiter in "Japanese Journal of Cancer Research", 77, 1264 (1986); Miyata und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 62-115280);
  • (2) Verfahren zur Einführung von Polyethylenglykol in Aminogruppen von Protein unter Verwendung von Polyethylenglykolmonoalkyletheracylaziden (N. Theodous Fan und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKOKU) Nr. 56-23587);
  • (3) Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykolmonoalkyletheraldehyden (Fujino und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 61-178926);
  • (4) Verfahren zum Einführen von Polyethylenglykolmonoalkylethern in Aminogruppen von Protein über Imidoylgruppen (Fujino und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 63-10800);
  • (5) Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykolmono alkylethern und N-Hydroxysuccinimid (M. Leonard und Mitarbeiter in "Tetrahedron", 40, 1581-1584 (1984); A. Abuchowski und Mitarbeiter in "Cancer Biochem. Biophys.", 7, 175 (1984));
  • (6) Verfahren zum Einführen einzelkettiger Polyethylenglykolmonoalkylether in Aminogruppen von Protein über Cyanursäurechlorid (A. Abuchowski und Mitarbeiter in "J. Biol. Chem.", 252, 3578 (1977));
  • (7) Verfahren, bei dem Polyethylenglykolmonoalkylether mit Carbonyldiimidazol aktiviert und danach die aktivierten Verbindungen in Aminogruppen von Protein eingeführt werden (Charles O.B. Cham und Mitarbeiter in "Anal. Biochem.", 131, 25 (1983)) und dergleichen.
  • Unter diesen Verfahren besteht das Verfahren (1) in einer Modifikation durch Einführen von Verbindungen der folgenden Formel (I):
  • worin R für eine Alkylgruppe steht und n einer gegebenenfalls variablen positiven ganzen Zahl entspricht, die von Polyethylenglykolmonoalkylethern und Cyanursäurechlorid abgeleitet sind, in Aminogruppen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß anders als bei den zuvor beschriebenen Modifizierungsverfahren (2) bis (7) zwei Polyethylenglykolketten in eine Aminogruppe eingeführt werden können. Als nach diesem Modifizierungsverfahren modifiziertes Protein sind Asparaginase (Inada und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKOKU) Nr. 61-42558; Inada und Mitarbeiter in "Chemistry Letters", 773 (1980); Inada und Mitarbeiter in "Japanese Journal of Cancer Research", 77, 1264 (1986)), Superoxiddismutase (Miyata und Mitarbeiter, japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 62- 115280) u.dgl. bekannt. Unter Verwendung von Verbindungen der folgenden Formel (III):
  • worin R und n die zuvor angegebene Bedeutung besitzen, erhaltenes modifiziertes Protein wurde mit unter Verwendung von Verbindungen der Formel (I) erhaltenem modifiziertem Protein verglichen. Der Vergleich zeigt, daß eine Modifizierung unter Verwendung von Verbindungen der Formel (I) die Antigenizität unter Erhaltung der Aktivität stärker vermindert.
  • Nunmehr benötigt man zur Herstellung des modifizierten Proteins ein Proteinmodifizierungsmittel hoher Reinheit. Es wurde versucht, die Verbindung (I), bei der es sich um ein bei dern in den zuvor beschriebenen Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren (1) benutztes Proteinmodifizierungsmittel handelt, zu synthetisieren. Eine Analyse durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie zeigt jedoch, daß es sich bei dem Reaktionsprodukt in jedem Falle um ein Gemisch mit der Verbindung (I) handelt. Bei dem Versuch zur Herstellung der Verbindung (I) mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000 unter Verwendung eines Polyethylenglykolmonoalkylethers eines mitt leren Molekulargewichts von 5 000 und von Cyanursäurechlorid nach dem aus der japanischen Patentanmeldung (KOKOKU) Nr. 61-42558 bekannten Verfahren (a) wurden 20 g Monomethoxypolyethylenglykol eines Molekulargewichts von 5 000 in 100 ml wasserfreiem Benzol mit 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst, die Lösung 30 min bei 80ºC am Rückfließen gehalten, 365 mg 2,4,6-Trichlor-s-triazin zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um es während 24 h unter Rückfluß bei 80ºC zur Reaktion zu bringen, der Reaktionsrückstand abfiltriert, 300 ml Petrolether zugesetzt, um einen Niederschlag zu bilden, und der Niederschlag (nach dem Abtrennen) mehrmals mit Petrolether gewaschen. Nach dern aus der japanischen Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 62-115280 bekannten Verfahren (b) wurden 730 mg Cyanursäurechlorid zu einem Gemisch aus 40 g Polyethylenglykolmonomethylether (eines mittleren Molekulargewichts von 5 000), 200 ml Benzol, 20 g wasserfreien Natriumcarbonats und 10 g Molekularsieb 3A zugegeben, das erhaltene Gemisch 20 h bei 80ºC reagieren gelassen und danach (unter dreimaliger Wiederholung) 400 ml Petrolether zum Reaktionsgemisch zugegeben, um einen Niederschlag auszufällen, der Niederschlag in Benzol gelöst und erneut mit Petrolether ein Niederschlag ausgefällt. Bei beiden Verfahren (a) und (b) wurde ein Gemisch aus verschiedenen Verbindungen einschließlich der Verbindung (III) (R = CH&sub3;) als Hauptprodukt mit Molekulargewichten über einen breiten Bereich von 5 000 bis in den hohen Molekulargewichtbereich (Fig. 2 und 3) erhalten. Weiterhin wurden bei dem aus "Chemistry Letters", 773 (1980) bekannten Verfahren 730 mg Cyanursäurechlorid in ein Gemisch aus 40 g Polyethylenglykolmonomethylether (eines mittleren Molekulargewichts von 5 000), 200 ml Benzol, 20 g wasserfreien Natriumcarbonats und 10 g Molekularsieb 3A eingetragen, das erhaltene Gemisch 44 h bei 80ºC reagieren gelassen und dann (unter sechsmaliger Wiederholung) mit 400 ml Petrolether gefällt, der Niederschlag in Benzol gelöst und erneut mit Petrolether gefällt. Hierbei wurde ein Gemisch der Verbindung (III) (R = CH&sub3;), der Verbindung (I) (R = CH&sub3;) und von Verbindungen mit höherem Molekulargewicht (Fig. 4) erhalten. Bei dem aus "Japanese Journal of Cancer Research", 77, 1264 (1986) bekannten Verfahren wurden 1,12 g Cyanursäurechlorid in ein Gemisch aus 60 g Polyethylenglykolmonomethylether, 200 ml wasserfreien Benzols, 20 g wasserfreien Natriumcarbonats und 20 g Molekularsieb 4A eingetragen, das erhaltene Gemisch 120 h bei 80ºC reagieren gelassen, das Benzol abdestilliert und danach (unter dreimaliger Wiederholung) der Rest in Aceton ge löst und mit Petrolether gefällt. Hierbei wurde ein Gemisch aus verschiedenen Verbindungen mit hauptsächlich Produkten höherer Molekulargewichte (Fig. 5) erhalten. In letzterer Literaturstelle wird auch darauf hingewiesen, daß auf Sephadex G-100 als Träger eine Gelfiltrationschromatographie durchge führt wurde, um das reine Produkt mit einem einzigen Peak entsprechend einem Molekulargewicht von 10 000 zu gewinnen. Dieses chromatographische Ergebnis belegt, daß eine homogene Verbindung (I) (R = CH&sub3;) erhalten wurde. In jüngster Zeit wurde jedoch die Hochleistungsgelfiltrationschromatographie mit hervorragender Trennfähigkeit im Vergleich zu der unter Verwendung von Sephadex G-100 u.dgl. als Träger mit geringer Geschwindigkeit durchgeführten Gelfiltrationschromatographie entwickelt, so daß die bislang nicht mögliche Trennung nunmehr möglich wurde (tiseikagakull, 56, 1481 (1984)). Dies bedeutet somit, daß eine Analyse mit Hilfe einer bei geringer Geschwindigkeit durchgeführten Gelfiltrationschromatographie mit Sephadex G-100 u.dgl. als Träger für eine Analyse der Reinheit unzureichend ist. In der Tat wurde nach dem in dieser Literaturstelle beschriebenen Verfahren die Gelfiltrationschromatographie auf Sephadex G-100 durchgeführt. Der hierbei erhaltene Teil, bei dem es sich bei dieser Chromatographie um den Hauptpeak (laut dieser Literaturstelle den Peak mit einem Molekulargewicht von 10 000 in Form eines einzigen Peaks auf dem Gelfiltrationschromatogramm unter Verwendung von Sephadex G-100 als Träger) handelte, wurde durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie weiter analysiert. Das Ergebnis zeigte, daß es sich bei diesem Teil um ein Gemisch verschiedener Verbindungen handelt, wobei die Hauptverbindungen aus solchen mit höherem Molekulargewicht bestanden (Fig. 6).
  • Tatsache ist, daß es bislang noch nicht möglich war, aus einem solchen Gemisch mit verschiedenen Verbindungen mit Molekulargewichten über einen breiten Bereich mit Hilfe industrieher Trenn- und Reinigungsmaßnahmen (Umkristallisieren, Umfällen, Ultrafiltration u.dgl.) die gewünschte Verbindung (I) wirksam zu gewinnen.
  • Wenn andererseits Protein unter Verwendung eines Gemischs mit verschiedenen Verbindungen mit Molekulargewichten über einen breiten Bereich modifiziert wird, besitzt das modifizierte Protein keine gleichmäßige Qualität. Es ist somit extrem schwierig, das Produkt mit gleichbleibender Qualität herzustellen. Im Falle, daß ein solches Protein als Therapeutikum verwendet wird, könnten infolge der Verunreinigungen verschiedene Probleme, wie Nebenwirkungen u.dgl. auftreten.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) in hoher Reinheit.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung eines durch die hochreinen Verbindungen der Formel (I) modifizierten Proteins, das einerseits die Eigenschaften des modifizierten Proteins, z.B. eine verlängerte Plasmahalbwertszeit, eine weitestgehend verminderte Immunogenizität u.dgl. erhält und die physiologischen Aktivitäten und sonstigen Eigenschaften des intakten Proteins als solche behält.
  • Im Rahmen umfangreicher Untersuchungen war den Erfindern der vorliegenden Erfindung der Erfolg beschieden, die Verbindung (I) in hoher Reinheit herstellen zu können. Nach weiteren Untersuchungen haben sie gefunden, daß durch die hochreine Verbindung (I) ein wertvolles Protein mit pharmakologischen Aktivitäten und andere Proteine extrem einfach modifiziert werden können. Solche durch die hochreine Verbindung (I) modifizierte Proteine garantieren eine gleichförmige Qualität, besitzen die Eigenschaften von modifiziertem Protein, z.B. eine verlängerte Plasmahalbwertszeit, eine weitestgehend verminderte Immunogenizität, eine gute Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln u.dgl. und weisen immer noch die physiologischen Aktivitäten und sonstige Eigenschaften des unmodifizierten Proteins als solchen auf.
  • Gegenstand einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von hochreinen Polyethylenglykolderivaten der Formel (I)
  • worin R für eine Alkylgruppe steht und n einer gegebenenfalls variablen positiven ganzen Zahl entspricht, durch Umsetzen einer Verbindung (II) der folgenden Formel (II):
  • R - (OCH&sub2;CH&sub2;)n - OH (II)
  • worin R und n die angegebene Bedeutung besitzen, mit Cyanursäurechlond in Gegenwart einer Verbindung eines Metalls der Gruppe IIB. Erfindungsgemäß läßt sich die Verbindung (I) in einer durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie bestimmten Reinheit von 75% oder mehr bereitstellen. Die Verbindung (I) enthält kaum Nebenprodukte mit höherem Molekulargewicht und Nebenprodukte, z.B. Verbindung (III) der Formel:
  • worin R und n die zuvor angegebene Bedeutung besitzen, oder sonstige Nebenprodukte, wenn sie durch Umsetzen einer Verbindung (II) mit Cyanursäurechlorid im Molverhältnis 1:1 hergestellt wurde.
  • Gegenstand einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mit der hochreinen Verbindung (I) modifiziertem Protein.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm eines nach dem Verfahren des Beispiels 1 erhaltenen hochreinen Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 2 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm eines nach dem Verfahren gemäß der japanischen Patentanmeldung (KOKOKU) Nr. 61-42558 erhaltenen Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 3 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm eines nach dem Verfahren gemäß der japanischen Patentanmeldung (KOKAI) Nr. 62-115280 erhaltenen Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 4 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm eines nach dem Verfahren gemäß "Chemistry Letters", 773 (1980) erhaltenen Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 5 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatograrnm eines nach dem Verfahren gemäß "Japanese Journal of Cancer Research", 77, 1264 (1986) erhaltenen Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 6 zeigt ein Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm eines nach dem Verfahren gemäß "Japanese Journal of Cancer Research", 77, 1264 (1986) synthetisierten und danach gereinigten Polyethylenglykolderivats.
  • Fig. 7 zeigt ein Elektrophoresemuster von in Beispiel 40 hergestelltem PEG-HDMA.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Das erfindungsgemäß erhaltene modifizierte Protein ent spricht der Formel:
  • worin R und n die zuvor angegebene Bedeutung besitzen, R' für ein Protein mit einer Aminogruppe steht und x einer gegebenenfalls variablen positiven ganzen Zahl entspricht.
  • In den angegebenen Formeln steht die durch R wiedergegebene Alkylgruppe vorzugsweise für eine solche mit 1 bis 18 Kohlenstoffatom(en). Beispiele für die Alkylgruppe sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, n-Pentyl, Isopentyl, n-Hexyl, Isohexyl, n-Octyl, n-Nonyl, Isononyl, n-Decyl, Isodecyl, n-Undecyl, n-Dodecyl, n-Tridecyl, n-Tetradecyl, n-Hexadecyl, n-Heptadecyl, n-Octadecyl u.dgl.. Von diesen werden Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom(en) bevorzugt. Besonders bevorzugt ist Methyl.
  • In den angegebenen Formeln bedeutet die durch n darge stellte positive ganze Zahl vorzugsweise 10 bis 700, insbesondere 50 bis 350.
  • In der Formel (IV) steht R' für ein Protein mit einer Aminogruppe. Bei dem Protein kann es sich um irgendein Protein von den verschiedensten Tieren einschließlich Menschen, Mikroorganismen und Pflanzen, um gentechnisch erzeugte Produkte und synthetisierte Produkte handeln. Beispiele für ein solche Protein sind Cytokinin [beispielsweise die verschiedensten Interferone (Interferon-α, Interferon-β, Interferon-γ), Interleukin-2, Interleukin-3 u.dgl.], Hormone [beispielsweise Insulin, Wachstumshormon freigebender Faktor (GRF), Calcitonin, Calcitonin genverwandtes Peptid (CGRP), atrionatriuretisches Peptid (ANP), Vasopressin, Corticotropin freigebender Faktor (CRF), gefäßaktives intestinales Peptid (VIP), Sekretin, α-Melanozyten stimulierendes Hormon (α-MSH), adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Cholecystokinin (CCK), Glucagon, Nebenschilddrüsenhormon (PTH), zu Nebenschilddrüsenhormon verwandtes Protein (PTHRP), Somatostatin, Enkephalin, Endothelin, Substanz P, Dynorphin, Oxytocin, Wachstumshormon freisetzendes Peptid (GHRP, beispielsweise vgl. "Endocrinology", 114, 1537 (1984), u.dgl.], Wachstumsfaktoren [beispielsweise Wachstumshormon (GH), insulinartiger Wachstumsfaktor (IGF-I, IGF-II), β-Nervenwachstumsfaktor (β-NGF), Basefibroblastenwachstumsfaktor (BFGF), transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Erythropoietin, Granulozytenkolonie stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozytenmakrophagenkolonie stimulierender Faktor (GM-CSF), von Plättchen herrührender Wachstumsfaktor (PDGF), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) u.dgl.], Enzyme [beispielsweise Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Elastase, Superoxiddismutase (SOD), Bilirubinoxidase, Katalase, Uricase, Urokinase, Thermolysin, Trypsin, Chymotrypsin, V&sub8;-Protease, Chondroitin ABC- Lyase, Asparaginase u.dgl.], sonstige Proteine [beispielsweise Ubiquitin, Islet-aktivierendes Protein (IAP), Serumthymusfaktor (STF), Peptid-T, Albumin, Globulin, Transferrin, Lipoprotein, Lipid A-Derivate, Hausstaubmilbenprotein, Trypsininhibitor u.dgl.] sowie deren Derivate.
  • In Formel (IV) steht x für eine gegebenenfalls variable positive ganze Zahl, sie übersteigt jedoch nicht die Anzahl der in dem zu modifizierenden Protein enthaltenen Aminogruppen.
  • Die zuvor beschriebene hochreine Verbindung (I) läßt sich beispielsweise wie folgt herstellen:
  • Die Verbindung (I) kann durch Umsetzen der Verbindung (II) mit Cyanursäurechlorid in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart einer Verbindung eines Metalls der Gruppe IIB hergestellt werden. Die Reaktionsdauer reicht im allgemeinen von 1 - 300 h. Die Reaktionstemperatur reicht im allgemeinen von 50 - 140ºC, vorzugsweise von etwa 70 - 110ºC. Bei dem für die Umsetzung verwendeten Lösungsmittel kann es sich um ein beliebiges Lösungsmittel handeln, solange dieses gegenüber den für die Umsetzung benutzten Reagenzien inert ist. Beispiele für Lösungsmittel sind Lösungsmittel vom Typ aromatischer Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol u.dgl., sowie halogenierter Kohlenwasserstoffe, wie 1,2-Dichlorethan u.dgl.. Bei den Verbindungen eines Metalls der Gruppe IIB handelt es sich vorzugsweise um Oxide des Metalls der Gruppe IIB, z.B. Zinkoxid, Cadmiumoxid und Quecksilberoxid. Zweckmäßigerweise sollte aus dem Reaktionssystem Wasser entfernt werden. Zu diesem Zweck kann man beispielsweise Molekularsiebe u.dgl. verwenden.
  • Die Reinheit des erfindungsgemäß erhaltenen hochreinen Polyethylenglykolderivats wird durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie unter folgenden Bedingungen bestimmt: Bedingungen:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW 7,5 mm φ x 60 cm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Ethanol/[0,01 M Phosphatpuffer (pH- Wert: 7) + 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung] = 1/19
  • Fließrate: 0,7 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm.
  • Wie aus Fig. 1 hervorgeht, besitzt das erfindungsgemäß erhaltene Polyethylenglykolderivat eine weit höhere Reinheit als die nach dem Stand der Technik (Fig. 2 bis 6) erhaltenen Polyethylenglykolderivate. Die Reinheit des erfindungsgemäß erhaltenen Polyethylenglykolderivats übersteigt, nach der prozentualen Flächenmethode ermittelt, 75%.
  • Dies bedeutet, daß das erfindungsgemäß erhaltene Polyethylenglykolderivat eine durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie ermittelte Reinheit über 75% aufweist.
  • Die durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie ermittelte Reinheit bedeutet hier und im folgenden einen prozentualen Flächenanteil der durch die Verbindung (I) eingenommenen Peakfläche in bezug auf die Fläche sämtlicher auf dem Hochleistungsgelfiltrationschromatogramm erscheinender Peaks. Im allgemeinen wird die Datenverarbeitung mit Hilfe eines Datenprozessors, wie Chromatopak C-R6A (Shimadzu) u.dgl. durchgeführt.
  • Das nach dem beschriebenen Verfahren erhaltene Reaktionsprodukt ist bereits extrem reich an der Verbindung (I). Somit kann das Reaktionsprodukt als solches als Modifizierungsmittel (I) verwendet werden. Wenn die Verbindung (I) mit noch höherer Reinheit hergestellt werden soll, wird das Reaktionsprodukt weiterhin industriell durchgeführten Trenn- und Reinigungsmaßnahmen, z.B. einer Umkristallisation, einer Umfällung, einer Ultrafiltration u.dgl. unterworfen.
  • Die chemische Modifizierung eines Proteins mit der erfindungsgemäß erhaltenen hochreinen Verbindung (I) kann in üblicher bekannter Weise durchgeführt werden. Die Reaktion erfolgt in einer Pufferlösung von Borsäure, Phosphorsäure, Essigsäure u.dgl. eines pH-Werts von etwa 8 bis 10 bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur während etwa 1 bis etwa 72 h. Die Menge des verwendeten Modifizierungsrnittels ist entsprechend dern gewünschten Modifikationsgrad variabel. Wenn erforderlich und gewünscht, kann die Reaktionslösung durch übliche Reini gungsmaßnahmen für Proteine, z.B. Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese u.dgl., gereinigt werden. Auf diese Weise läßt sich das gewünschte modifizierte Protein herstellen.
  • Die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung (I) hoher Reinheit eignet sich zum Modifizieren von Protein zum Zwecke einer Senkung der Antigenizität, einer Verlängerung der Halbwertszeit, einer Verbesserung der Übertragung auf Gewebe u.dgl.. Durch Modifizieren von Protein mit der hochreinen Verbindung (I) läßt sich ohne Schwierigkeiten das modifizierte Protein für ein Therapeutikum akzeptabler Qualität, beispielsweise modifizierte Asparaginase, herstellen.
  • Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich die Verbindung (I) mit im Vergleich zu nach den zuvor beschriebenen bekannten Verfahren hergestellten Verbindungen hoher Reinheit herstellen.
  • Das erfindungsgemäß hergestellte modifizierte Protein wird oral oder parenteral an Säugetiere (beispielsweise Kühe, Pferde, Schweine, Schafe, Menschen u.dgl.) in Form von Arzneimittelzubereitungen (beispielsweise Kapseln, Injektionslösungen u.dgl.) mit geeigneten Arzneimittelkomponenten zusammen mit üblichen Trägern, Verdünnungsmitteln u.dgl. verabreicht.
  • Bei Verabreichung beispielsweise des in Beispiel 46 her gestellten modifizierten Gewebeplasminogenaktivators zur Behandlung von Herzinfarkt wird das Arzneimittel im allgemeinen in einer Dosis von 1 - 100 rng einmal pro Tag oder in mehreren Portionen verabreicht.
  • Wenn das modifizierte Protein aus modifizierter Hydrolase besteht, kann die Synthesereaktion wirksam unter Verwendung des Enzyms durchgeführt werden.
  • Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele und Testbeispiele sollen die vorliegende Erfindung näher veranschaulichen.
  • In der folgenden Beschreibung besitzen die verschiedenen Abkürzungen folgende Bedeutung:
  • Asx: Asparaginsäure oder Asparagin
  • Glx: Glutaminsäure oder Glutamin
  • Ser: Serin Gly: Glycin
  • His: Histidin Arg: Arginin
  • Thr: Threonin Ala: Alanin
  • Pro: Prolin Tyr: Tyrosin
  • Val: Valin Met: Methionin
  • Ile: Isoleucin Leu: Leucin
  • Phe: Phenylalanin Lys: Lysin
  • TFA: Trifluoressigsäure
  • Z: Carbobenzoxy
  • HPLC: Hochleistungsgelflüssigchromatographie
  • Bz: Benzoyl
    • Beispiel 1 Herstellung von 2,4-Bis-methoxypolyethylenglykol-6-chlor-s- triazin (PEG2)
  • Ein Gemisch aus 110 g Polyethylenglykolmonomethylether eines mittleren Molekulargewichts von 5 000 und 25 g Molekularsieb 4A wurde in 0,5 l Benzol 6 h unter Rückfluß auf 80ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reak tionsgemisch mit 50 g Zinkoxid und 1,85 g Cyanursäurechlorid versetzt und 53 h unter Rückfluß auf 80ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde 0,5 l Benzol zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat zur Trockene eingeengt, wobei 108 g PEG2 als Verbindung (I) erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW 7,5 mm φ x 60 cm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Ethanol/[0,01 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 7) + 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung] = 1/19
  • Fließrate: 0,7 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 20.967 min
  • Reinheit: 91,5% (Flächenprozentmethode)
  • Chromatogramm: Vgl. Fig. 1
  • Silikageldünnschichtchromatographie:
  • Silikagel: Kieselgel 60 (hergestellt von Merck Inc.)
  • Entwicklerlösungsmittel: Methylenchlorid/Methanol = 15/2
  • Rf-Wert: 0,5
    • Beispiel 2 Herstellung von 2,4-Bis-methoxypolyethylenglykol-6-chlor-s- triazin (PEG2)
  • Nachdem 11 g Polyethylenglykolmonomethylether eines mittleren Molekulargewichts von 5 000 in 50 ml Benzol 4 h unter Rückfluß auf 80ºC erwärmt worden waren, wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Danach wurden 2,5 g Molekularsieb 4A zugegeben und das Ganze 4 h unter Rückfluß auf 80 ºC erwärmt. Nach dem Abkühlenlassen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 13,5 g gelbem Quecksilberoxid und 184 mg Cyanursäurechlorid versetzt und dann unter Rückfluß 27 h auf 80ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 50 ml Benzol zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach dem Zentrifugieren wurde das Benzol abdestilliert. Der hierbei angefallene Rest wurde getrocknet, wobei 9,79 g PEG2 als eine Verbindung (I) (Reinheit, bestimmt durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie mit TSK-Gel G3000SW, 78,2%) erhalten wurden.
    • Beispiel 3 Herstellung von 2,4-Bis-methoxypolyethylenglykol-6-chlor-s- triazin (PEG2)
  • Nachdem 11 g Polyethylenglykolmonomethylether eines mitt leren Molekulargewichts von 5 000 in 50 ml Benzol 4 h unter Rückfluß auf 80ºC erwärmt worden waren, wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Danach wurden 2,5 g Molekularsieb 4A zugegeben und das Ganze 4 h unter Rückfluß auf 80 ºC erwärmt. Nach dem Abkühlenlassen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch mit 7,8 g Cadmiumoxid und 184 mg Cyanursäurechlorid versetzt und dann 34 h unter Rückfluß auf 80ºC erwärmt. Nach dern Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 50 ml Benzol zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach dem Zentrifugieren wurde das Benzol abdestilliert. Der hierbei angefallene Rückstand wurde ge trocknet, wobei 9,35 g PEG2 als eine Verbindung (I) (Reinheit, durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie unter Verwendung von TSK-Gel G3000SW bestimmt, 78,5%) erhalten wurden.
    • Beispiel 4 Reinigung von 2,4-Bis-methoxypolyethylenglykol-6-chlor-s- triazin (PEG2) durch Gelfiltration
  • Nachdem 800 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Reaktionsprodukts in 20 ml Wasser aufgelöst worden waren, wurde die Lösung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK-Gel G3000SW (21,5 mm φ x 600 mm, eluiert wurde mit Wasser) gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei 324 mg noch weiter gereinigtes PEG2 als eine Verbindung (I) (Reinheit, bestimmt durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie unter Verwendung von TSK-Gel G3000SW, 99,6%) erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Fp: 56 - 58ºC
  • Elementaranalyse: C 53,65 (54,17), H 8,99 (9,05), N 0,46 (0,41), C* 10,33 (0,35) *wahrscheinlich O
  • Die Daten innerhalb der Klammern sind berechnete Werte unter der Annahme, daß das Molekulargewicht des Polyethylenglykolmonomethylethers 5004 beträgt.
  • ¹³C-NMR (CDCl&sub3;, vollständige Entkopplung) δ 58.6, 67.9, 68.2, 69.7, 69.9, 70.1, 70.3, 70.6, 71.5, 171.6, 172.1.
    • Beispiel 5 Herstellung von PEG2-modifiziertem Papain (PEG2-Pa)
  • Nachdem 45 mg Papain in 9 ml 0,2 M Acetatpuffer (pH-Wert: 4,5) gelöst worden waren, wurde die Lösung mit 0,9 PEG2 versetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch Zusatz von 0,1 N Natriumhydroxid auf 10 erhöht, worauf das Ganze 1 h bei 28ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 200 ml gekühlten 0,2 M Acetetpuffers (pH-Wert: 6,25) zu der Reaktionslösung unterbrochen. Nachdem überschüssiges PEG2 unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) entfernt worden war, wurde das Filtrat gegen eine Lösung mit 0,1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit (DTT) dialysiert.
  • Modifizierungsgrad: 37,4%
  • Aktivität: 19,7 U/mg Protein (70,3%) (eine Einheit hydrolysiert 1,0 µmol Nα-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) bei einem pH-Wert von 6,2 und 25 ºC innerhalb von 1 min).
    • Beispiel 6 Herstellung von PEG2-modifiziertem Chymotrypsin (PEG2-Ch)
  • Nachdem 1 g α-Chymotrypsinogen in 840 ml 0,1 M Boratpuf fer (pH-Wert: 10,0) gelöst worden war, wurde die Lösung auf 4ºC gekühlt. Zu der Lösung wurden innerhalb von 1 h 24,2 g PEG2 zugegeben, worauf das Gemisch 20 h bei 4ºC umgesetzt wurde. Die Reaktionslösung wurde mit 0,1 N Salzsäure neutralisiert. Überschüssiges PEG2 wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) entfernt. Durch diese Umsetzung wurden 27% der Aminogruppen nach der Trinitrobenzolsulfonsäuremethode modifiziert. Das modifizierte α-Chymotrypsinogen wurde in üblicher bekannter Weise durch Trypsin aktiviert und gegen Wasser dialysiert, wobei PEG2-Ch erhalten wurde.
  • Modifizierungsrate: 27,0%
  • Aktivität: 30,51 U/mg Protein (67,8%) (eine Einheit hydrolysiert 1,0 µmol N-Benzoyl-L-tyrosinethylester (BTEE) bei einem pH-Wert von 7,8 und 25ºC während 1 min).
    • Beispiel 7 Herstellung von PEG2-modifiziertem Thermolysin (PEG2-Th)
  • Nachdem 344 mg Thermolysin in 68,8 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) gelöst worden waren, wurde die Lösung auf 4ºC gekühlt. Der Lösung wurden innerhalb von 1 h 1,1 g PEG2 zugesetzt, worauf das Ganze 17 h bei 4 ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde mit 0,1 N Salzsäure neutralisiert. Überschüssiges PEG2 wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) entfernt, wobei das Produkt erhalten wurde. Durch diese Reaktion wurden 26,9% der Aminogruppen modifiziert.
  • Modifizierungsgrad: 26,9%
  • Aktivität: 4970 U/mg Protein (71,0%) (eine Einheit hydrolysiert Milchcasein bei einem pH-Wert von 7,2 und 35ºC während 1 min unter Bildung von 1,0 µg Tyrosin).
    • Beispiel 8
  • Entsprechend den Beispielen 1 bis 3* wurden die in Tabelle 1 aufgeführten PEG2-modifizierten Enzyme synthetisiert. *wahrscheinlich 5 und 6 TABELLE 1 Liste PEG2-modifizierter Enzyme Modifiziertes Enzym Modifizierungsgrad (%) Aktivität (U/mg Protein) (% *1) Löslichkeit (mg/ml Methanol) Kommentar PEG2-Papain PEG2-Trypsin PEG2-Chymotrypsin PEG2-Pepsin PEG2-Thermolysin Papain (Papayalatex), Molekulargewicht , U/mg Protein Trypsin (Rinderpankreas), Molekulargewicht , U/mg Protein Chymotrypsin (Rinderpankreas), Molekulargewicht , U/mg Protein Pepsin (Schweinemagenschleimhautmembran), Molekulargewicht , U/mg Protein Thermolysin (Bacillus thermoprotealyticus), Molekulargewicht , U/mg Protein V8 (Staphylococcus aureus V8), Molekulargewicht U/mg
  • *1: PEG2-Papain Eine Einheit hydrolysiert 1,0 µmol Nα-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) bei einem pH-Wert von 6,2 und 25ºC innerhalb 1 min.
  • PEG2-Trypsin Eine BAEE-Einheit = Verwendung von BAEE als Substrat bei einem pH-Wert von 7,6 und 25ºC, eine Einheit liefert 0,ß001ΔA&sub2;&sub5;&sub3; innerhalb von 1 min.
  • PEG2- Chymotrypsin Eine Einheit hydrolysiert 1,0 µmol Nα-Benzoyl-L-tyrosinethylester (BTEE) bei einem pH-Wert von 7,8 und 25ºC innerhalb von 1 min.
  • PEG2-Pepsin Bei Messung als TCA-lösliches Produkt unter Verwendung von Hämoglobin als Substrat liefert eine Einheit innerhalb von 1 min bei einem pH-Wert von 2,0 und 37ºC 0,001ΔA&sub2;&sub8;&sub8;.
  • PEG2-Thermolysin Eine Einheit hydrolysiert Milchcasein unter Bildung von 1,0 µg Tyrosin bei einem pH-Wert von 7,2 und 35ºC innerhalb 1 min.
  • PEG2-V8 Bei Bestimmung als TCA-lösliches Produkt unter Verwendung von Casein als Substrat liefert eine Einheit innerhalb von 1 min bei einem pH-Wert von 7,8 und 37 ºC 0,001ΔA&sub2;&sub8;&sub8;.
    • Beispiel 9 Synthese eines Peptids unter Verwendung von PEG2-modifiziertem Enzym
  • Jeweils 1 mM einer N-geschützten Aminosäure und C-geschützten Aminosäure wurden in einer Pufferlösung (die auch ein organisches Lösungsmittel enthalten kann) gelöst, worauf die Lösung mit einem PEG2-modifizierten Enzym versetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei 20 - 50 ºC reagieren gelassen. Nach dem Ausfallen von Kristallen in der Reaktionslösung wur den Wasser zugegeben und die Kristalle abfiltriert. Wurden keine Kristalle gebildet, wurde die Reaktionslösung eingeengt und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde eingeengt, worauf der Rest mit Ether, Hexan u.dgl. zur Verfestigung und Bildung des Reaktionsprodukts versetzt wurde. Auf diese Weise wurden unter Verwendung verschiedener PEG2-modifizierter Enzyme die in Tabelle 2 aufgeführten Produkte erhalten. modifiziertes Enzym
  • In der Gleichung bedeuten X und Y jeweils eine Schutzgruppe. TABELLE 2 Produkt Fp (ºC) Ausbeute (%) Modifiziertes Enzym Trypsin Chymotrypsin Papain Thermolysin Fußnote: Z: Carbobenzoxy Bz: Benzoyl NH&sub2;: Amid Obzl: Benzylester OMe: Methylester
    • Beispiel 10 PEG2-modifiziertes Humaninsulin (PEG2-Humaninsulin)
  • In 2 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 9,5) wurden 10 mg Humaninsulin gelöst, worauf die Lösung mit 400 mg PEG2 ver setzt wurde. Nach dem Rühren über Nacht wurde der pH-Wert des Gemischs auf 7,0 eingestellt. Nachdem das nicht umgesetzte PEG2 durch Hindurchlaufen durch Sephadex G-50 entfernt worden war, wurde dem System Wasser zugegeben. Danach wurde das Gemisch durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 10 000) auf ein Gesamtvolumen von 2 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde in einem Gefrierschrank gelagert. Nachdem ein Teil des Konzentrats gefriergetrocknet worden war, wurde es einer Elementaranalyse unterworfen, um sein Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis (N/C x 100) (im folgenden als "N/C-Wert" bezeichnet) zu bestimmen. N/C-Wert: 6,5.
    • Testen des PEG2-Humaninsulins
  • Humaninsulin und PEG2-Humaninsulin mit derselben Menge Humaninsulin wurden zu Testzwecken einem Kaninchen injiziert, worauf dessen Blutzuckerwert nach der Glukostatmethode der Washington Biochemical Company in Freehold City, New Jersey, bestimmt wurde. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 3. TABELLE 3 Glucosespiegel im Blut nach h PEG2-Humaninsulin % des Normalspiegels Humaninsulin % des Normalspiegels
    • Beispiel 11 PEG2-modifiziertes Humaninsulin
  • 280 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,42 mg (Human-)Insulin wurden bei 4ºC mit 8,6 mg des in Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt, worauf das Gemisch bei 4ºC stehengelassen wurde. 6,5 h später wurde das Gemisch mit 2,9 mg PEG2 versetzt und dann 29 h bei 4ºC stehengelassen.
  • Nach der Neutralisation mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser mit 0,1% TFA und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdern die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugegeben, um eine das gewünschte Produkt enthaltende wäßrige Lösung zuzubereiten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.4 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Chlorwasserstoffsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.5 (3), Glx 5.2 (7), Ser 2.6 (3), Gly 3.4 (4) His 1.5 (2), Arg 0.7 (1), Thr 1.9 (3), Ala* 1 (1), Pro 059 (1), Tyr 2.9 (4), Val 2.7 (4), Cys - (6), Ile 1.1 (2), Leu 4.4 (6), Phe 2.2 (3), Lys 0.7 (1) *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 12 PEG2-modifiziertes Elcatonin (PEG2-Elcatonin)
  • In 2 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 9,5) wurden 10 mg Elcatonin gelöst, worauf die Lösung mit 300 mg PEG2 versetzt wurde. Nach dem Rühren über Nacht wurde der pH-Wert des Gemischs auf 7,0 eingestellt. Das nichtumgesetzte PEG2 wurde durch Hindurchlaufen durch Sephadex B-50 entfernt. Nach Zugabe von Wasser zu dem System wurde das Gemisch durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 10 000) auf ein Gesamtvolumen von 2 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde in einem Gefrierschrank gelagert. Nachdem ein Teil des Konzentrats gefriergetrocknet worden war, wurde es zur Bestimmung seines N/C-Werts einer Elementaranalyse unterworfen. N/C Wert: 4,5.
    • Testen des PEG2-Elcatonins
  • Elcatonin (5 µg/kg) bzw. PEG2-Elcatonin (Elcatoningehalt: 5 µg/kg) wurde einer Ratte in die Schwanzvene intravenös verabreicht. In diesem Falle wurde die Verminderung des Blutcalciumspiegels mit 100 festgelegt. Es wurde die Zeitdauer bis zur Verminderung des Blutcalciumspiegels auf 50 bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 4. TABELLE 4 Dauer bis zum Erreichen %iger Verminderung des Blutcalciumspiegels PEG2-Elcatonin Elcatonin
  • Bestimmung der Halbwertszeit des Elcatoninblutspiegels beim Kaninchen mittels RIA
  • Elcatonin (5 µg/kg) bzw. PEG2-Elcatonin (Elcatoningehalt: 5 µg/kg) wurden intravenös an ein Kaninchen verabreicht. Wenn dessen Blutkonzentration 2 min nach der Verabreichung mit 100 angesetzt wurde, wurde die Halbwertszeit bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 5. TABELLE 5 Halbwertszeit PEG2-Elcatonin Elcatonin
    • Beispiel 13 PEG2-modifiziertes Humancalcitonin
  • In 180 µl 0,1 M Boratpuffer wurde 0,59 g Humancalcitonin gelöst, worauf die Lösung bei 4ºC mit 6,90 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das Gemisch 8 h bei 4ºC stehengelassen. Nach der Neutralisation mit 0,1 M Essigsäure wurde eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min), Fließrate: 1 ml/min] durchgeführt. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistunqsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 24.89 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.3 (3), Glx 2.2 (2), Ser 0.9 (1), Gly 4.3 (4), His 1.0 (1), Thr 5.0 (5), Ala 2.3 (2), Pro 2.1 (2), Tyr 1.0 (1), Val 1.1 (1), Met 0.8 (1), Ile 1.0 (1), Leu* 2 (2), Phe 3.2 (3), Lys 0.9 (1), Cys - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 14
  • Ähnlich den Beispielen 6 und 8 wurden die in Tabelle 6 aufgeführten PEG2-Peptide hergestellt. Weiterhin wurden im Rahmen des in Beispiel 8 durchgeführten Tests unter Verwendung eines Kaninchens bestätigt, daß die Halbwertszeit der PEG2- Peptidblutkonzentration verlängert war (vgl. Tabelle 7). TABELLE 6 N/C-Wert Anzahl PEG2 Molekulargewicht PEG2-Insulin PEG2-Elcatonin PEG2-Secretin PEG2-Vasopressin PEG2-Enkephalin
  • In der Tabelle bedeuten hEGF bzw. rEGF Human-EGF bzw. Ratten-EGF.
  • In diesem Beispiel verwendetes Secretin und VIP sind vom Schweinetyp und Insulin, Vasopressin, CGRP, Enkephalin, PTHrP (7-34), CRF und GRF sind vom Menschentyp. TABELLE 7 Dosis, iv (µg/kg) Halbwertszeit (min) PEG2-Secretin Secretin PEG2-Vasopressin Vasopressin PEG2-Enkephalin Enkephalin
  • Der verwendete Sekretionsantikörper ist ein Handelsprodukt von Daiichi Radio Isotope Co., Ltd.; die verwendeten Antikörper gegen Calcitonin, VIP, Arginin, Vasopression CGRP, Enkephalin, PTHrP (7-34), CRF und GRF sind Handelsprodukte von Peninsula Co., Ltd.; die verwendeten Antikörper gegen rEGF und HEGF sind Handelsprodukte von Otsuka Assay Co., Ltd.
    • Beispiel 15 PEG2-modifiziertes Human[Arg&sup8;]-Vasopressin
  • In 450 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,55 mg Human[Arg&sup8;]-Vasopressin gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 20,0 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das Gemisch wurde 25,5 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, um das gewünschte Produkt herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.00 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 0.9 (1), Glx 0.9 (1), Gly 1.0 (1), Arg 0.8 (1), Pro 1.0 (1), Try 1.0 (1), Phe* 1 (1), Cys - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 16 PEG2-modifiziertes CGRP
  • In 300 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 1 mg Human-CGRP gelöst, worauf die Lösung bei 4ºC mit 16 mg des ge mäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das Gemisch wurde 31 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 21.25 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.5 (4), Ser 2.7 (3), Gly 3.8 (4), His 0.9 (1), Arg 1.9 (2), Thr 3.6 (4), Ala* 4 (4), Pro 1.1 (1), val 4.1 (5), Leu 2.8 (3), Phe 1.9 (2), Lys 1.6 (2), Cys - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 17 PEG2-modifiziertes Mäuse-EGF (PEG2-MEGF)
  • 60 µl 0,07 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 150 µg Mäuse- EGF wurde bei 4ºC mit 2 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt. Das Gemisch wurde 30 h bei 4 ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,5 N Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 20.73 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Asx 5.3 (7), Glx 2.8 (3), Ser 5.4 (6), Gly 5.9 (6), His 0.9 (1), Arg 3.4 (4), Thr 1.9 (2), Pro 2.0 (2), Tyr 4.4 (5), Val 1.6 (2), Met 0.4 (1), Ile 1.5 (2), Leu* 4 (4), Cys - (6), Trp - (2)
  • * Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 18 PEG2-modifiziertes Human-GRF(1-44)NH&sub2;
  • In 2 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 5 mg Human-GRF(1-44)NH&sub2; gelöst, worauf zu der Lösung bei 4ºC 59,5 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 zugegeben wurden. Das Gemisch wurde 18 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 1 cm φ x 30 cm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 32%, Gradient: 0,25%/min); Fließrate: 3 ml/min]. Die die Produkte A, B und C enthaltenden drei Fraktionen wurden gefriergetrocknet, wobei 5 mg Produkt A, 25 mg Produkt B bzw. 14 mg Produkt C erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften von Produkt A:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 32%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 22.63 min
  • Arninosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.4 (4), Glx 7.5 (7), Ser 3.5 (4), Gly 2.7 (3), Arg 6.1 (6), Thr 0.9 (1), Ala 4.3 (5), Tyr 2.0 (2), Val 1.0 (1), Met 1.1 (1), Ile 2.1 (2), Leu* 5 (5), Phe 0.9 (1), Lys 2.0 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
  • Physikalische Eigenschaften von Produkt B:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 32%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 26.25 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.2 (4), Glx 5.8 (7), Ser 3.6 (4), Gly 3.1 (3), Arg 4.8 (6), Thr 0.7 (1), Ala 4.3 (5), Tyr 1.9 (2), Val 1.1 (1), Met 0.3 (1), Ile 2.0 (2), Leu* 5 (5), Phe 0.9 (1), Lys 2.1 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
  • Physikalische Eigenschaften von Produkt C:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 32%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 28.61 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110 ºC)
  • Asx 3.0 (4), Glx 6.5 (7), Ser 3.6 (4), Gly 2.3 (3), Arg 6.4 (6), Thr 0.8 (1), Ala 4.0 (5), Tyr 2.2 (2), Val 1.2 (1), Met 0.5 (1), Ile 2.3 (2), Leu* 5 (5), Phe 0.9 (1), Lys 2.6 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 19 PEG2-modifiziertes Human-GRF(1-29)NH&sub2;
  • In 2 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 5 mg Human-GRF(1-29)NH&sub2; gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 86 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das Gemisch wurde 20,5 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reingung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 1 cm φ x 30 cm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 32%, Gradient: 0,25%/min); Fließrate: 3 ml/min]. Die vier Fraktionen mit den Produkten A, B, C bzw. D wurden gefriergetrocknet, wobei 121 µg*/500 µl Produkt A, 178 µg*/500 µl Produkt B, 472 µg /500 µl Produkt C bzw. 195 µg*/500 µl Produkt D erhalten wurden (*: Proteingehalt).
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts A:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 35%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.34 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.5 (3), Glx 1.6 (2), Ser 2.9 (3), Gly 1.3 (1), Arg 3.8 (3), Thr 0.9 (1), Ala 3.2 (3), Tyr 1.2 (2), Val 1.0 (1), Met 0.3 (1), Ile 1.9 (2), Leu* 4 (4), Phe 1.0 (1), Lys 1.9 (2)
  • * Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts B:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 35%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 20.05 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.5 (3), Glx 1.8 (2), Ser 2.9 (3), Gly 1.1 (1), Arg 3.0 (3), Thr 0.9 (1), Ala 3.2 (3), Tyr 2.0 (2), Val 0.9 (1), Met 0.4 (1), Ile 1.9 (2), Leu* 4 (4), Phe 1.0 (1), Lys 1.9 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts C:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 35%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 21.72 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.5 (3), Glx 1.8 (2), Ser 2.9 (3), Gly 1.1 (1), Arg 3.1 (3), Thr 0.9 (1), Ala 3.3 (3), Tyr 2.0 (2), Val 1.0 (1), Met 0.4 (1), Ile 1.9 (2), Leu* 4 (4), Phe 1.0 (1), Lys 1.7 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts D:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 35%
  • Konzentrationsgradient: 0,5%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 22.53 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.4 (3), Glx 1.9 (2), Ser 2.9 (3), Gly 1.2 (1), Arg 3.1 (3), Thr 0.9 (1), Ala 3.1 (3), Tyr 1.9 (2), Val 1.0 (1), Met 0.1 (1), Ile 1.9 (2), Leu* 4 (4), Phe 1.0 (1), Lys 1.8 (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 20 PEG2-modifiziertes Humaninterferon α
  • 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 80,4 µg Humaninterferon α wurde mit 3 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt. Weitere 2 h und 45 min später wurden 2,5 mg PEG2 zu dem Gemisch zugegeben. Dieses wurde dann 24 h bei einer Reaktionstemperatur von 4 ºC stehengelassen. Danach erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol]. Nachdem die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion entsalzt und gefriergetrocknet worden war, wurden 50 µl Wasser zugegeben, um eine das Produkt enthaltende wäßrige Lösung (Proteingehalt: 41,3 µg/50 µl) bereitzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 15.94 min.
    • Beispiel 21 PEG2-modifiziertes Schweine-α-MSH
  • In 360 ml 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,51 mg α-MSH (vom Schwein) gelöst, worauf die Lösung mit 12 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das Gemisch wurde dann 16 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC- ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugesetzt, um eine wäßrige Lösung des gewünschten Produkts bereitzustellen (Proteingehalt: 49,2 µg/200 µl).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 18.52 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Glx 0.8 (1), Ser 2.1 (2), Gly 1.1 (1), His 1.0 (1), Arg 1.2 (1), Pro 1.1 (1), Tyr 1.0 (1), Val 1.1 (1), Met 0.3 (1), Phe* 1 (1), Lys 1.0 (1), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 22 PEG2-modifiziertes Human-ACTH (4-10)
  • In 130 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,50 mg Human-ACTH (4-10) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 5,2 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. 5 h später wurden 15,6 mg PEG2 und weitere 2 h später 20,8 mg PEG2 zugegeben. Dann wurde das Gemisch 17 h lang stehengelassen. Da die Umsetzung noch nicht vollständig war, wurden 135 111 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) sowie weitere 20,8 mg PEG2 zu dem Gemisch zugegeben. Dieses wurde dann 9 h lang bei einer Reaktionstemperatur von 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC- ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 20%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdern die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugesetzt, um eine wäßrige Lösung mit dem gewünschten Produkt bereitzustellen (Proteingehalt: 19,1 µg/200 µl).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 20%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 29.83 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure Phenol bei 110ºC)
  • Glx 0.8 (1), Gly 1.1 (1), His 1.0 (1), Arg 0.8 (1), Met 0.3 (1), Phe* 1 (1), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 23 PEG2-modifizierter Mäuse-β-NGF
  • 850 µl 50 mM Natriumacetatpuffer (pH-Wert: 5,0) mit 350 µg Mäuse-β-NGF wurden unter Einstellung des pH-Werts auf etwa 10 mit 0,5 N NaOH versetzt. Der Lösung wurden bei 4ºC 25 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde dann 3,5 h lang bei 4ºC stehengelassen. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert mit Hilfe von 0,1 N NaOH auf 9 - 10 gehalten. Nch dem Neutralisieren mit 0,5 N Essigsäure erfolgte eine Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW (7,5 mm φ x 650 mm, 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol), wobei eine Fraktion mit dem Produkt A und eine Fraktion mit dem Produkt B erhalten wurden. Nachdem die Fraktionen entsalzt und gefriergetrocknet worden waren, wurden jeweils 200 µl Wasser zugegeben, um wäßrige Lösungen mit dem Produkt A bzw. mit dem Produkt B bereitzustellen (Proteingehalt: Produkt A: 0,73 µg/µl; Produkt B: 1 µg/µl). Das erhaltene Produkt B wurde auf PC12-Zellen in einer Konzentration von 100 ng (Protein)/ml wirken gelassen. Die Anzahl der Zellen mit Neunten war im Vergleich zur Kontrollprobe auf das etwa zweifache erhöht.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts A:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 18.74 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110 ºC)
  • Asx 9.7 (11), Glx 7.6 (8), Ser 9.5 (11) Gly 5.2 (5), His 4.0 (4), Arg 6.2 (7), Thr 11.8 (14), Ala* 8 (8), Pro 2.3 (2), Tyr 2.0 (2), Val 12.1 (13), Met 0.9 (1) Ile 5.0 (5), Leu 3.4 (3), Phe 6.9 (7), Lys 7.7 (8), Cys - (6), Trp - (3)
  • * Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts B:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 20.41 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 9.3 (11), Glx 6.9 (8), Ser 9.5 (11) Gly 5.1 (5), His 4.2 (4), Arg 6.3 (7), Thr 12.0 (14), Ala* 8 (8), Pro 2.4 (2), Tyr 1.9 (2), Val 12.1 (13), Met 0.5 (1) Ile 4.9 (5), Leu 3.2 (3) Phe 6.8 (7), Lys 7.7 (8), Cys - (6), Trp - (3)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 24 PEG2-modifiziertes Human-ANP (1-28)
  • 80 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,54 mg Human- ANP (1-28) wurden bei 4ºC mit 54 ml einer wäßrigen Lösung mit 7 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt. Das Gemisch wurde 6,5 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Verdünnen mit 1 ml Wasser wurde das Gemisch mit 2 N Essigsäure neutralisiert und dann durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 22.77 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 1.9 (2), Glx 1.0 (1), Ser 4.8 (5), Gly 5.1 (5), Arg 5.2 (5), Ala 0.8 (1) Tyr 1.0 (1), Met 0.3 (1), Ile 1.1 (1), Leu* 2 (2), Phe 1.9 (2), Cys - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 25 PEG2-modifizierte Schweineelastase
  • In 540 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 1,04 mg Schweineelastase gelöst. Die erhaltene Lösung wurde bei 4ºC mit 6,90 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt. Dann wurde das Gemisch 6,5 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure folgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000PWXL [(7,8 mm φ x 300 mm) x 2; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung]. Nachdem die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion entsalzt und gefriergetrocknet worden war, wurden 100 ml Wasser zugegeben, um eine wäßrige Lösung mit dem Produkt bereitzustellen (Proteingehalt: 64,5 µg/100 µl).
  • Das erhaltene modifizierte Produkt zeigte eine Enzymaktivität, die dem nichtmodifizierten Enzym in einer Konzentration von 2 µg (Protein)/ml entsprach.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PWXL,[(7,8 mm φ x 300 mm) x 2 (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)]
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 20.89 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 21.8 (24), Glx 18.7 (19), Ser 20.8 (22), Gly 25.1 (25), His 6.2 (6), Arg 11.4 (12), Thr 16.7 (19), Ala* 17 (17), Pro 7.5 (7), Tyr 11.6 (11), Val 25.1 (27), Met 1.9 (2), Ile 9.6 (10), Leu 19.8 (18), Phe 3.2 (3), Lys 2.9 (3), Cys - (8), Trp - (7)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 26 PEG2-modifiziertes Humaninterleukin-3
  • In 200 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 50 µg Humaninterleukin-3 gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4CC mit 8 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde dann 24 h lang bei 4 ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 1 N Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol)]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde entsalzt und eingeengt, wobei 30 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 17.67 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure-Phenol bei 110ºC)
  • Asx 19.5 (19), Glx 16.1 (14), Ser 8.3 (7), Gly 2.8 (2), His 2.3 (3), Arg 5.8 (6) Thr 8.3 (11), Ala 11.6 (11), Pro 11.7 (9), Tyr 1.6 (1), Val 3.1 (2), Met 4.1 (3), Ile 8.5 (9), Leu* 20 (20), Phe 4.8 (5), Lys 9.1 (7), Cys - (2), Trp - (2)
  • * Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 27 PEG2-modifizierter Rinderpankreastrypsininhibitor
  • IN 350 µl 0,07 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 500 µg Rinderpankreastrypsininhibitor gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 15 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde dann 44 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 1 N Essigsäure erfolgte die Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm&sub1; 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol)]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde entsalzt und eingeengt, wobei 60 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 18.44 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 4.8 (5), Glx 2.9 (3), Ser 1.0 (1), Gly 6.0 (6), Arg 4.5 (6), Thr 2.3 (3), Ala 6.2 (6), Pro 4.2 (4), Tyr 3.9 (4), Val 1.0 (1), Met 1.3 (1), Ile 1.4 (2), Leu* 2 (2), Phe 3.9 (4), Lys 3.0 (4), Cys - (6)
  • * Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 28 PEG2-modifiziertes IAP
  • in 150 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 150 µg IAP gelöst, worauf die Lösung bei 4ºC mit 6 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde dann 44 h lang bei 4 ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 1 N Essigsäure erfolgte eine Reinigung duch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol)]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde entsalzt, wobei 75 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 15.9 min
    • Beispiel 29 PEG2-modifiziertes Human-Somatostatin
  • In 400 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,45 mg Human-Somatostatin gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 16,2 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Danach wurde das Gemisch 26 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%, Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 75 µl Wasser zugesetzt, um eine das gewünschte Produkt enthaltende wäßrige Lösung bereitzustellen (Proteingehalt: 0,70 µg/µl).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.23 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110 ºC)
  • Asx 0.8 (1), Ser 0.9 (1), Gly 1.1 (1), Thr 1.6 (2), Ala* 1 (1), Phe 3.0 (3), Lys 1.8 (2), Cys - (2), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 30 PEG2-modifiziertes SOD (PEG2-SOD)
  • SOD wurde in 0,1 M Boratpuffer in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst, worauf die erhaltene Lösung auf 4ºC gekühlt wurde. Nach Zugabe von PEG2 wurde die Lösung 15 - 20 h reagieren gelassen. Die Reaktionslösung wurde neutralisiert und dann mit Hilfe einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) von überschüssigem PEG2 befreit. Die Herstellungsbeispiele sind in Tabelle 8 dargestellt. TABELLE 8 Bedingungen für die Herstellung von PEG-2-SOD Los Nr. Quelle und Menge Modifizierungsgrad (%) Aktivität (U/mg Protein) Human-Erythrocyt Rinder-Erythrocyt E. coli Human-Erythrocyt SOD: 2700 U/mg Protein Rinder-Erythrocyt SOD: 3000 U/mg Protein E. coli SOD: 3000 U/mg Protein Aktivität: Methode nach J.M. McCord und I. Fidovich in "J. Biol. Chem.", 244, 6049 (1969)
    • Testbeispiel 1 Verminderung der Antigenizität von gemäß Beispiel 30 synthetisiertem PEG2-SOD-5
  • Unter Verwendung weiblicher Mäuse vom Swiss-Webster-Stamm als eine Gruppe wurde eine Lösung von SOD bzw. PEG2-SOD in 0,05 M Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung eines pH-Werts von 7,0 (im folgenden als "PBS" abgekürzt) intraperitoneal (im folgenden als i.p. abgekürzt) in einer Dosis von 0,1 mg Protein einmal pro Woche während 12 aufeinanderfolgender Wochen verabreicht. In den Wochen 0, 3, 6, 9 und 12 wurde aus dem Blutgefäß hinter der Augenhöhle Blut entnommen und bei -20ºC gelagert. Der Titer jeden Serums wurde durch ELISA (enzymverknüpfter Immmunsorbtionsmitteltest) bestimmt. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 9. TABELLE 9 Immunologische Aktivität von PEG2-SOD Sensibilisiertes Antigen Provoziertes Antigen ( µg Protein) Antigenizität (ausgedrückt durch den Antikörper-Verdünnungsfaktor) E. coli
    • Beispiel 31 PEG2-modifizierte Katalase (PEG2-Katalase)
  • In Tabelle 10 dargestellte PEG2-modifizierte Katalase wurde entsprechend Beispiel 30 synthetisiert. TABELLE 10 Bedingungen für die Herstellung von PEG-2-Katalase Los Nr. Quelle und Menge Modifizierungsgrad (%) Aktivität (U/mg Protein) PEG-2-Katalase-Rinderleber Aspergillus niger Rinderleberkatalase: 3000 U/mg Protein Aspergillus niger-Katalase: 5000 U/mg Protein Aktivität: Eine Einheit steht für eine Menge zur Zersetzung von 1,0 µmol H&sub2;O&sub2; bei einem pH-Wert von 7,0 und 25ºC während 1 min.
    • Testbeispiel 2
  • Die Antigenizität der PEG2-modifizierten Katalase wurde entsprechend Testbeispiel 1 untersucht. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 11. TABELLE 11 Immunologische Aktivität von PEG2-Katalase Sensibilisiertes Antigen Provoziertes Antigen ( µg Protein) Antigenizität (ausgedrückt durch den Antikörper-Verdünnungsfaktor) Katalase (A. niger) PEG2-Katalase-5
    • Testbeispiel 3 Einfluß auf ein ischämisches Pfotenödem bei der Maus (O&sub2;&supmin;-produzierender Test in der Hinterpfote nach einer Ischämie und Reperfusion)
  • Eine Maus vorn ddY-Stamm eines Alters von 8 Wochen wurde auf einem Fixierständer fixiert, worauf die rechte Hinterpfote mit Nahtzwirn unter Bildung einer Schlinge abgebunden wurde. Ein Ende wurde fixiert, an das andere Ende wurde ein Gewicht von 500 g gehängt, um für eine gegebene Zeit lang Ischämie hervorzurufen. Bei dem Test wurde die Dicke der Pfote mit einer Schieblehre vor und 60 min nach der Ischämie gemessen. Nach dem Abschneiden der Pfote wurde deren Gewicht bestimmt. Behandlungsgruppen waren die Kontrollgruppe (physiologische Kochsalzlösung wurde unmittelbar vor der Ischämie intravenös injiziert), die Gruppe, der SOD (Rinder-Erythrocyten) verabreicht wurde und die Gruppe, der PEG2-SOD verabreicht wurde. SOD und PEG2-SOD wurden intravenös in Dosen von 10 000 U/kg bzw. 500 U/kg 30 min vor der Ischämie und unmittelbar vor der Ischämie verabreicht. Katalase und PEG2-Katalase wurden in ähnlicher Weise verabreicht. Eine Gruppe umfaßte fünf (5) Mäuse. Der Effekt wurde bewertet durch [Pfotendicke (mm) der Ödempfote - Pfotendicke (mm) der Kontrollpfote] der Substanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der Effekt wurde auch durch [Pfotengewicht (mg) der Ödempfote - Pfotengewicht (mg) der Kontrollpfote] der Substanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe bewertet. Somit sind: Effekt A Unterdrückungsverhältnis A des isochämischen Pfotenödems Substanz (Pfotendicke der Ödempfote - Pfotendicke der Kontrollpfote (in mm)) Kontrolle (Pfotendicke der Ödempfote - Pfotendicke der Kontrollpfote (in mm))
  • Wenn der Wert 40% übersteigt, erfolgt die Bewertung "wirksam". Effekt B Unterdrückungsverhältnis B an isochämischem Pfotenödem Substanz (Pfotengewicht der Ödempfote - Pfotengewicht der Kontrollpfote (in mg)) Pfotengewicht der Ödempfote - Pfotengewicht der Kontrollpfote (in mg))
  • Wenn der Wert 60% übersteigt, erfolgt die Bewertung "wirksam".
  • Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 12. TABELLE 12 Wirkung von SOD (Rinder-Erythrocyt), PEG2-SOD-2, Katalase (A. niger), PEG2-Katalase-1 im Rahmen eines O)&sub2;&supmin;-Produktionstests in Mäusehinterpfoten nach Ischämie und Reperfusion Effekt Substanz und Injektionsdauer Kontrollversuch SOD ( U/kg) min vor der Ischämie SOD ( U/kg) unmittelbar vor der Ischämie PEG2-SOD-2 ( U/kg) min vor der Ischämie PEG2-SOD-2 ( U/kg) unmittelbar vor der Ischämie Katalase ( U/kg) min vor der Ischämie Katalase ( U/kg) unmittelbar vor der Ischämie PEG2-Katalase-1 (500 U/kg) min vor der Ischämie PEG2-Katalase-1 (500 U/kg) unmittelbar vor der Ischämie
    • Beispiel 32 PEG2-modifizierte, von Human-Erythrocyten herrührende Cu, Zn-SOD
  • Nach Zusatz von 2,5 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) zu 10,0 mg an von Human-Erythrocyten herrührender Cu, Zn-SOD wurden zu der Lösung bei 5ºC 70,0 mg von gemäß Beispiel 1 hergestelltem, hochreinem PEG2 zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde dann 22 h lang bei 5ºC stehengelassen. Anschließend wurde der pH-Wert des Gemischs mit 2 N wäßriger Essigsäurelösung auf 6,8 eingestellt. Anschließend wurde das Gemisch ent salzt und durch Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wurde durch Hindurchleiten durch eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 94 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) gereinigt. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 1,8 ml einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt erhalten. Das derart modifizierte Produkt besaß eine Enzymaktivität von 81% auf der Basis des nichtmodifizierten SOD [Cytochrome C-Methode gemäß "J. Biol. Chem.", 224, 6049 (1969)].
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 214 nm
  • Retentionszeit: 16.66 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SPW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 18.27 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 30.9 (36), Glx 24.1 (26), Ser 18.7 (20), Gly 47.1 (50), His 14.8 (16), Arg 8.4 (8), Thr 13.4 (16), Ala* 20.0 (20), Pro 11.1 (10), Val 24.2 (28), Ile 12.9 (18), Leu 19.7 (18), Phe 8.0 (8), Lys 19.4 (22)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Modifizierungsgrad: 20% (Trinitrobenzolsulfonsäuremethode).
    • Beispiel 33 PEG2-modifizierte, von Human-Erythrocyten herrührende Cu, Zn-SOD
  • Nach Zusatz von 2,5 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) zu 5,20 mg an von Human-Erythrocyten abgeleiteter Cu, Zn-SOD wurde die Lösung bei 5ºC mit 185 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 24 h lang bei 5ºC stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wurde der pH-Wert des Gemischs mit 2 N wäßriger Essigsäurelösung auf 6,7 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde dann - so wie sie war - auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 94 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben, um sie durch Gelfiltration zu reinigen. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 1,8 ml einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt erhalten. Das derart erhaltene modifizierte Produkt besaß eine Enzymaktivität von 59% auf der Basis der unmodifizierten SOD [Cytochrome C-Methode].
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 214 nm
  • Retentionszeit: 18.42 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 16.69 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 28.6 (36), Glx 21.8 (26), Ser 18.0 (20), Gly 45.0 (50), His 14.2 (16), Arg 7.9 (8), Thr 13.2 (16), Ala* 20.0 (20), Pro 10.8 (10), Val 23.4 (28), Ile 12.0 (18), Leu 18.5 (18), Phe 7.6 (8), Lys 17.8 (22)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Modifizierungsgrad: 52% (Trinitrobenzolsulfonsäuremethode).
    • Beispiel 34 PEG2-modifizierte, von Human-Erythrocyten herrührende Cu, Zn-SOD
  • Nach Zugabe von 5,0 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) zu 5,20 mg an von Human-Erythrocyten abgeleiteter Cu, Zn-SOD wurden zu der Lösung bei 5ºC 740 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem&sub1; hochreinem PEG2 zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde dann 14 h lang bei 5ºC stehengelassen. Nach Zugabe von weiteren 740 mg PEG2 wurde das Gemisch 5 h bei 5ºC stehenge lassen. Nach beendeter Umsetzung wurde das Gemisch mit 3 ml Wasser versetzt und durch Zusatz von 2 N wäßriger Essigsäurelösung auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde - so wie sie war - auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 94 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufge tragen, um sie durch Gelfiltration zu reinigen. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde gesammelt. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 1,8 ml einer das gewünschte Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten. Das erhaltene modifizierte Produkt besaß eine Enzymaktivität von 36% auf der Basis der unmodifizierten SOD [Cytochrome C- Methode].
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 15.91 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/rnin
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 18.13 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 26.4 (36), Glx 21.9 (26), Ser 17.2 (20), Gly 42.9 (50), His 13.6 (16), Arg 7.8 (8), Thr 12.5 (16), Ala* 20.0 (20), Pro 10.4 (10), Val 22.1 (28), Ile 11.5 (18), Leu 18.2 (18), Phe 7.3 (8), Lys 16.2 (22)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Modifizierungsgrad: 77% (Trinitrobenzolsulfonsäuremethode).
    • Beispiel 35 PEG2-modifizierte Rinder-Cu, Zn-SOD
  • In 1,875 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 7,5 mg Rinder-Cu, Zn-SOD gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 240 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Danach wurde das erhaltene Gemisch 2 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach Zugabe von 3 ml Wasser wurde das Gemisch mit Salzsäure neutralisiert. Dann erfolgte eine Gelfiltrationsreinigung unter Verwendung einer Sephacryl S-200- Säule (2,6 cm φ x 80 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung). Die produkthaltige Fraktion wurde einer Ultrafiltration unterworfen. Nach dem Entsalzen und Einengen wurden 10 ml einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt erhalten (Proteingehalt: 0,28 mg/ml).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 17.03 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 14.8 (17), Glx 10.9 (11), Ser 6.9 (8), Gly 22.4 (25), His 6.5 ( 8), Arg 3.7 (4), Thr 10.0 (12), Ala* 9 (9), Pro 6.2 (6), Tyr 1.4 (1), Val 11.7 (15), Met 1.4 (1), Ile 6.5 (9), Leu 7.9 (8), Phe 3.9 (4), Lys 7.7 (10), Cys - (3)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte; Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 36 PEG2-modifizierte Rinderleberkatalase
  • In 1,5 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 5 mg Rinderleberkatalase gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4 ºC mit 90 mg des gemäß Beispiel 1 hergestellten hochreinen PEG2 versetzt wurde. Danach wurde das erhaltene Gemisch 24 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure wurde das Gemisch auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 84 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben, um eine Reinigung durch Gelfiltration zu bewerkstelligen. Die produkthaltige Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurde der Rückstand gefriergetrocknet, wobei 4,7 mg des gewünschten Produkts erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.7 min.
    • Beispiel 37 PEG2-modifizierte Uricase
  • In 2 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 5 mg Uricase (Candida) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 100 mg PEG2 versetzt und dann 20 h lang bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 100 000) geschickt, um nichtumgesetztes PEG2 zu entfernen. Auf diese Weise erhielt man PEG2-modifizierte Uricase.
  • Modifizierungsgrad: 46,5%
  • Aktivität: 17,8% (wenn die Aktivität nichtmodifizierter Uncase mit 100 angesetzt wurde)
  • Molekulargewicht: 433 000
  • Reaktivität mit Antiserum gegen Uricase: 1/1000 der nichtmodifizierten Uricase.
    • Beispiel 38 PEG2-modifizierte Uricase
  • In 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 1 mg Uricase (Candida) gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 30 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem, hochreinem PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das erhaltene Gemisch 25 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure wurde das Gemisch zur Durchführung einer Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 84 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben. Die produkthaltige Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 200 µl einer das gewünschte Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.1 min.
    • Beispiel 39 PEG2-modifizierte Bilirubinoxidase
  • In 0,5 ml Wasser wurden 5 mg Bilirubinoxidase (Myrothecium verrucaria) gelöst. Unter Aufrechterhalten ihres pH-Werts von 6,0 wurde die Lösung mit 30 mg 1,6-Hexyldiaminhydrochlorid und 0,6 mg eines wasserlöslichen Carbodiimids (1-Ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid) versetzt und 20 h lang bei 4ºC reagieren gelassen. Nach Entfernen von überschüssigem 1,6-Hexyldiamin und des wasserlöslichen Carbodiimids durch Hindurchleiten durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 10 000) wurde die erhaltene wäßrige Lösung gefriergetrocknet. In 0,5 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 2,5 mg der erhaltenen Aminobilirubinoxidase gelöst, worauf die Lösung mit 12 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) geschickt. Auf diese Weise wurde PEG2-modifizierte Bilirubinoxidase erhalten.
  • Molekulargewicht: 113 000
  • Aktivität: 27,8% (wenn die Aktivität nichtmodifizierter Bilirubinoxidase mit 100 angesetzt wurde)
  • Halbwertszeit: 300 min (die Halbwertszeit nichtmodifizierter Bilirubinoxidase betrug 15 min).
    • Beispiel 40 PEG2-modifiziertes Rinderserumalbumin
  • In 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 9,20) wurden 10 mg Serumalbumin (vom Rind) gelöst, worauf die Lösung mit 100 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 durch eine Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 50 000) geschickt. Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Modifizierungsgrad: 42,0%
  • Reaktionsfähigkeit mit Antiserum gegen Rinderserumalbumin: 1/1000 von nichtmodifiziertem Rinderserumalbumin.
    • Beispiel 41 PEG2-modifizierte Urokinase
  • In 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 10 mg Urokinase (aus Menschenurin) gelöst, worauf die Lösung mit 200 mg PEG2 versetzt und dann 20 h lang bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Aktivität: 17,8% (wenn die Aktivität der nichtmodifizierten Urokinase mit 100 angesetzt wurde).
    • Beispiel 42 PEG2-modifizierte Hyaluronidase
  • In 20 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 100 mg Hyaluronidase (aus Stierhoden) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 2 g PEG2 versetzt und dann 20 h lang bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Modifizierungsgrad: 47,6%
  • Aktivität: 22,9% (wenn die Aktivität von nichtmodifizierter Hyaluronidase mit 100 angesetzt wurde).
    • Beispiel 43 PEG2-modifizierte Chondroidtin-ABC-Lyase
  • In 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurde 1 mg Chondroitin-ABC-Lyase (Proteus vulgaris) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 20 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Auf diese Weise wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Molekulargewicht: 220 000
  • Aktivität: 21,4% (wenn die Aktivität von nichtmodifizierter Chondroitin-ABC-Lyase mit 100 angesetzt wurde).
    • Beispiel 44 PEG2-modifiziertes Hausstaubmilbenallergen (PEG2-HDMA)
  • In 3 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 2 mg eines proteinhaltigen gereinigten Extrakts von Hausstaubmilben als Hauptbestandteil (Molekulargewicht: 17 000) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 63,5 mg PEG2 versetzt und dann 20 h lang bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde mit 0,015 M Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) auf das 10fache Volumen verdünnt. Das nichtumgesetzte PEG2 wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) entfernt, wobei PEG2-HDMA erhalten wurde. Modifizierungsgrad: 48,0% (Trinitrobenzolsulfonsäuremethode) Elektrophorese: Acetylcellulosemembran 0,069 M Veronalpuffer (pH-Wert: 8,6), 0,5 mA/cm, Coomassieblaufärbung.
  • Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in Fig. 7 dargestellt.
    • Beispiel 45 PEG2-modifizierter Human-CRF
  • Nachdem 11,6 mg von gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 zu 305 µl an 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,46 mg Human-CRF bei 4ºC zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei 4ºC stehengelassen. Weitere 7 h später wurde das Gemisch mit 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) sowie 23,5 bzw. 45,5 h später jeweils mit 5,8 mg PEG2 versetzt. Das Gemisch wurde insgesamt 72 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dern Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol; Fließrate: 0,6 ml/min]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen und entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert, wobei 200 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.5 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.3 (2), Glx 8.5 (9), Ser 3.4 (3), His 2.2 (2), Arg 2.9 (3), Thr 1.3 (1), Ala* 4 (4), Pro 2.5 (2), Val 1.1 (1), Met 0.7 (2), Ile 1.9 (3), Leu 7.0 (7), Phe 1.2 (1), Lys 1.1 (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 46 PEG2-modifizierter Human-IGF-I
  • Nachdem 5 mg Human-IGF-I in 2,5 ml 0,1 M Boratpuffer (pH Wert: 10) gelöst worden waren, wurden der erhaltenen Lösung innerhalb von 4 h 50 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 in vier Portionen zugegeben. Nach weiterem 1,5-stündigem Rühren bei 4ºC wurde das Gemisch mit 2 ml Wasser versetzt. Danach wurde der pH-Wert mit 1 N wäßriger Salzsäurelösung auf 7 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde zur Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 93 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben. Die produkthaltige Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 4,5 ml einer das gewünschte Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: µBONDASPHERE C&sub1;&sub8;, 3,9 mm φ x 150 mm (hergestellt von Waters Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 23.2 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 20.4 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 4.5 (5), Glx 5.3 (6), Ser 4.8 (5), Gly 7.7 (7), Arg 5.3 (6), Thr 2.8 (3), Ala 6.0 (6), Pro 4.9 (5), Tyr 2.9 (3), Val 2.6 (3), Met 0.4 (1), Ile 0.6 (1), Leu* 6 (6), Phe 4.2 (4), Lys 3.2 (3), Cys - (6)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 47 PEG2-modifizierter Human-IGF-I
  • In 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 5,0 mg Human-IGF-I gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 13,4 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem, hochreinem PEG2 versetzt wurde. Danach wurde das Gemisch 22 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Hindurchleiten (der Lösung) durch eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 94 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung). Die Produkt A und Produkt B enthaltenden Fraktionen wurden entsalzt und durch Ultrafiltration konzentriert, wobei jeweils 250 µl wäßriger Lösungen mit Produkt A bzw. Produkt B erhalten wurden (Proteingehalt: Produkt A, 753 µg/250 µl; Produkt B, 341 µg/µl).
  • Das erhaltene Produkt B zeigte eine wachstumsfördernde Aktivität beim Wachsen auf Knorpeln entsprechend etwa 1/100 des nichtmodifizierten Human-IGF-I. Zur Bestimmung der wachstumsfördernden Aktivität diente der Gewichtszuwachs an Knorpelgewebe in einer Organkultur von Hühnerembryooberschenkelknochen (Knorpel).
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts A:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 20.76 min.
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 4.6 (5), Glx 5.3 (6), Ser 4.9 (5), Gly 7.3 (7), Arg 6.3 (6), Thr 2.8 (3), Ala 6.2 (6), Pro 5.2 (5), Tyr 3.1 (3), Val 2.4 (3), Met 0.5 (1), Ile 0.6 (1), Leu* 6 (6), Phe 3.9 (4), Lys 2.9 (3), Cys - (6)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts B:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 21.15 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 5.1 (5), Glx 6.0 (6), Ser 4.9 (5), Gly 7.3(7), Arg 6.3 (6), Thr 2.7 (3), Ala 6.3 (6), Pro 5.5 (5), Tyr 3.0 (3), Val 2.6 (3), Met 1.2 (1), Ile 0.8 (1) Leu* 6 (6), Phe 3.8 (4), Lys 3.2 (3), Cys - (6)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 48 PEG2-modifizierter Human-IGF-II
  • In 84 111 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 200 µg Human-IGF-II gelöst, worauf die Lösung mit 16 µl einer wäßrigen Lösung mit 2 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das Gemisch 16 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach Zugabe von weiteren 16 µl einer wäßrigen Lösung mit 2 mg PEG2 wurde das Gemisch nochmals 20 h bei 4ºC stehengelassen. Anschließend wurde mit 1 N Essigsäure neutralisiert und unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol] eine Gelfiltration durchgeführt. Nachdem die das gewünschte Produkt emthaltende Fraktion entsalzt und gefriergetrocknet worden war, wurden 80 µl Wasser zugegeben, wobei eine wäßrige Lösung mit dem Produkt (Proteingehalt: 73 µg/80 µl) erhalten wurde.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.51 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.7 (3), Glx 6.6 (7), Ser 6.7 (7), Gly 5.2 (5), Arg 6.7 (8), Thr 3.3 (4), Ala* 5 (5), Pro 2.9 (3), Tyr 2.8 (3) Val 3.3 (4), Ile 0.6 (1), Leu 5.4 (6), Phe 4.0 (4), Lys 1.1 (1), Cys - (6)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 49 PEG2-modifiziertes Human-GH
  • Nachdem 0,9 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 zu 15 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 25 µg Human-GH zugegeben worden war, wurde das Gemisch 22 h lang bei 3ºC stehengelassen. Danach erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung mit 5% Ethanol]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde entsalzt und konzentriert, wobei 100 µl einer wäßrigen Lösung mit dem Produkt (Proteingehalt: 7 µg/100 µl) erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 16.3 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 18.0 (20), Glx 26.9 (27), Ser 17.1 (18), Gly 13.5 (8), His 3.1 (3), Arg 8.6 (11), Thr 8.4 (10), Ala* 7 (7), Pro 7.6 (8), Tyr 7.9 (8), Val 6.7 (7), Met 2.6 (3), Ile 7.4 (8), Leu 25.5 (26), Phe 12.5 (13), Lys 8.2 (9), Cys - (4), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 50 PEG2-modifizierter Human-t-PA
  • Nachdem 9,6 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 9,5, enthaltend 1 M Kaliumthiocyanat) zu 340 µl einer Lösung mit Human-t- PA (29,3 mg t-PA/ml, pH-Wert: 3) zugegeben worden waren, wurde die Lösung bei 4ºC mit 164,2 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 19 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wurde der pH-Wert des Gemischs mit 1N wäßriger Salzsäurelösung auf 3 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand zur Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200- Säule (2,6 cm φ x 84 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung, pH-Wert: 3) aufgegeben. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 100 µl einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt (Proteingehalt: 3,53 mg/ml) erhalten.
  • Von dem derart erhaltenen modifizierten Produkt wurde die amidolytische Aktivität unter Verwendung von S-2288 (Ile-Pre- Arg-PNA) als Substrat bestimmt. Die Aktivität betrug 4,0 x 10&sup5; IU/ml).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 20%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 214 nm
  • Retentionszeit: 26.0 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 20.8 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 53.0 (50), Glx 53.4 (52), Ser 46.5 (48), Gly 45.3 (43), His 16.9 (16), Arg 31.5 (35), Thr 23.4 (25), Ala* 32 (32), Pro 27.4 (29), Tyr 23.2 (24), Val 22.4 (25), Met 7.5 (5), Ile 16.3 (19), Leu 36.9 (39), Phe 14.9 (19), Lys 17.8 (16), Cys - (35), Trp - (13)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 51 PEG2-modifiziertes Ubiquitin
  • Nachdem 6 mg Ubiquitin (menschlichen Ursprungs) in 3 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) gelöst worden waren, wurde die erhaltene Lösung bei 4ºC innerhalb von 1,5 h mit in drei Pertionen unterteilten 520 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem, hochreinem PEG2 versetzt. Nach weiterem 2-stündigem Verrühren bei 4ºC wurden 2 ml Wasser zu dem Gemisch zugesetzt. Danach wurde der pH-Wert mit 1 N wäßriger Salzsäurelösung auf 7 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde - so wie sie war - zur Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 93 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Konzentrieren durch Ultrafiltration wurden 4,5 ml einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: µBONDASPHERE C&sub4;, 3,9 mm φ x 150 mm (hergestellt von Waters Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 23.5 min
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 20.3 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 6.9 (7), Glx 12.3 (12), Ser 3.1 (3) Gly 7.2 (4), His 1.1 (1), Arg 3.8 (4), Thr 6.8 (7), Ala 3.2 (3), Pro 3.6 (3), Tyr 1.1 (1), Val 4.3 (4), Met 0.6 (1), Ile 6.6 (7), Leu* 9 (9), Phe 1.7 (2), Lys 5.0 (7)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 52 PEG2-modifizierter Mäuse-GM-CSF
  • Nachdem 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 36 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 zu 500 µl einer wäßrigen Lösung mit 500 µg Mäuse-GM-CSF zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 2,5 h lang stehengelassen. Die Reinigung erfolgte durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [µBONDASPHERE C&sub1;&sub8;, 3,9 mm φ x 15 cm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 0%; 30% 15 min später und 90% 75 min später); Fließrate: 1 ml/min]. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde erneut durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [µBONDASPHERE C&sub1;&sub8;, 3,9 mm φ x 15 cm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 36%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min] gereinigt. Nach dem Gefriertrocknen der das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktion wurden 200 µl Wasser zugegeben, um eine wäßrige Lösung mit dem gewünschten Produkt (Proteingehalt: 85 µg/200 µl) herzustellen.
  • Das erhaltene modifizierte Produkt zeigte bei dem ³H- Thymidineinbautest in Mäuseknochenmarkzellen eine Aktivität von 8 x 10&sup7; U/mg. Weiterhin führte eine intraperitoneale Verabreichung des modifizierten Produkts an C3H/He-Mäuse zu einer Entfernung aus dem Plasma mit einer Halbwertszeit von etwa 7 h (etwa 40 min bei Mäuse-GM-CSF).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: µBONDASPHERE C&sub1;&sub8;, 3,9 mm φ x 150 mm (hergestellt von Waters Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 36%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 13.63 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 9.8 (11), Glx 13.0 (15), Ser 3.8 (5), Gly 3.0 (3), His 0.7 (1), Arg 3.5 (4), Thr 13.6 (16), Ala* 6 (6), Pro 8.5 (9), Tyr 3.5 (4), Val 8.1 (9), Met 1.0 (3), Ile 4.5 (5), Leu 10.5 (11), Phe 6.2 (7), Lys 10.0 (11), Cys - (4), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 53 PEG2-modifiziertes Peptid T
  • In 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,56 mg Peptid T gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit 19,6 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt wurde. Anschließend wurde das erhaltene Gemisch 25 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugegeben, um eine das gewünschte Produkt enthaltende wäßrige Lösung her zustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 25.1 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 0.9 (1), Ser 0.9 (1), Thr 3.1 (4), Ala* 1 (1), Tyr 1.0 (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 54 PEG2-modifizierter STF
  • In 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 0,58 mg STF gelöst, worauf die Lösung mit 20,3 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das erhaltene Gemisch 25 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC- ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluier mittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugegeben, um eine wäßrige Lösung mit dem gewünschten Produkt herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 24.4 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 0.8 (1), Glx 1.6 (2), Ser 1.8 (2), Gly 2.0 (2), Ala* 1 (1), Lys 1.0 (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte.
    • Beispiel 55 PEG2-modifiziertes Human-ACTH (1-24)
  • Nachdem 48,0 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 bei 4ºC zu 305 111 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,47 mg Human-ACTH (1-24) zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei 4ºC stehengelassen. Weitere 7 h später wurde das Gemisch mit 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) und dann 27 h bzw. 45,5 h später mit jeweils 24,0 mg PEG2 versetzt. Das Gemisch wurde insgesamt 72 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol; Fließrate: 0,6 ml/min]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen, entsalzt und durch Ultrafiltration eingeengt, wobei 200 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 17.4 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Glx 0.8 (1), Ser 1.9 (2), Gly 2.1 (2), His 1.0 (1), Arg 2.9 (3), Pro 2.9 (3), Tyr 1.4 (2), Val 3.2 (3), Met 0.4 (1), Phe* 1 (1), Lys 3.1 (4), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 56 PEG2-modifiziertes Human-PTH (1-34)
  • Nachdem 28,4 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 bei 4ºC zu 305 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,49 mg Human-PTH (1-34) zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei 4ºC stehengelassen. Weitere 7 h später wurde das Gemisch mit 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) und nach 23,5 h bzw. 45,5 h mit jeweils 14,2 mg PEG2 versetzt. Das Gemisch wurde insgesamt 72 h bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol; Fließrate: 0,6 ml/min]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen, entsalzt und durch Ultrafiltration eingeengt, wobei 200 µl einer wäßrigen Lösung mit dem Produkt erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.2 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.9 (4),Glx 4.8 (5), Ser 2.8 (3), Gly 1.3 (1), His 2.8 (3), Arg 2.0 (2), Val 3.1 (3), Met 1.4 (2), Ile 1.0 (1), Leu* 5 (5), Phe 1.0 (1), Lys 2.4 (3), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 57 PEG2-modifiziertes Human-Glucagon
  • Nachdem 17,7 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 bei 4ºC zu 305 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,51 mg Glucagon (menschlichen Ursprungs) zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei 4ºC stehengelassen. Nach weiteren 7 h wurde das Gemisch mit 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) versetzt. 23,5 h bzw. 45,5 h später wurden jeweils 8,9 mg PEG2 zugegeben. Das Gemisch wurde insgesamt 72 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol; Fließrate: 0,6 ml/min]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen, entsalzt und durch Ultrafiltration eingeengt, wobei 200 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung + 5% Ethanol
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.8 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 3.5 (4), Glx 2.4 (3), Ser 3.8 (4), Gly 1.2 (1), His 0.8 (1), Arg 1.9 (2), Thr 2.8 (3), Ala 1.3 (1), Tyr 2.1 (2), Val 1.1 (1), Met 0.5 (1), Leu* 2 (2), Phe 2.0 (2), Lys 0.8 (1), Trp - (1),
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 58 PEG2-modifiziertes Human-CCK-Octapeptid (26-33)
  • Nachdem 24,2 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 bei 4ºC zu 305 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) mit 0,46 mg Human-CCK-Octapeptid (26-33) (Sulfatform) zugegeben worden waren, wurde das Gemisch bei 4 ºC stehengelassen. Weitere 7 h später wurde das Gemisch mit 100 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) versetzt. Nach 23,5 h bzw. 45,5 h wurden jeweils 12,1 mg PEG2 zugegeben. Das Gemisch wurde insgesamt 72 h lang bei 4 ºC stehengelassen. Nch dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase- Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 200 µl Wasser zugesetzt, um eine wäßrige Lösung mit dem gewünschten Produkt herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 26.7 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zerset zungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 2.1 (2), Gly 1.1 (1), Tyr 1.1 (1), Met 1.0 (2), Phe* 1 (1), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 59 PEG2-modifiziertes α-Globulin
  • In 20 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 100 mg α-Globulin-Fraktion IV (vom Schwein) gelöst, worauf die Lösung mit 2000 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetzten PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Hierbei wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Modifizierungsgrad: 44,7%.
    • Beispiel 60 PEG2-modifiziertes γ-Globulin
  • In 20 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 100 mg γ-Globulin-Fraktion II (vom Schwein) gelöst, worauf die Lösung mit 2000 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetzten PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Hierbei wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Modifizierungsgrad: 38,9%.
    • Beispiel 61 PEG2-modifiziertes Transferrin
  • In 1 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 5 mg Transferin, teilweise eisengesättigt (von der Maus) gelöst, worauf die Lösung mit 100 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 100 000) behandelt. Hierbei wurde das gewünschte Produkt erhalten.
  • Modifizierungsgrad: 33,9%.
    • Beispiel 62 PEG2-modifiziertes Lipoprotein
  • Zu 10 ml (etwa 100 mg) Lipoproteincholesterinlösung (Lipoprotein: 50%) wurden 10 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) und dann 2 g PEG2 zugegeben, worauf das Gemisch 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt. Modifizierungsgrad: 21,4%.
    • Beispiel 63 PEG2-modifiziertes Endotoxin
  • In 20 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) wurden 10 mg Endotoxin (E. coli 0111:B) gelöst, worauf die Lösung mit 200 mg PEG2 versetzt und dann 20 h bei 4ºC reagieren gelassen wurde. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 mit einer Ultrafiltrationsmembran (Molekulargewichtsschnitt: 300 000) behandelt. Modifizierungsgrad der Ethanolamingruppe: 38,7%
  • Endotoxinaktivität (mit dem Limulustestreagenz im Rahmen einer kolorimetrischen Bestimmung):
  • 1/100 von Endotoxin (E. coli 0111:B)
    • Beispiel 64 PEG2-modifizierte Elastase
  • In 20 ml Wasser wurden 100 mg Elastase (vom Schwein) gelöst, worauf die Lösung mit 2 g PEG2 versetzt wurde. Unter schrittweisem Erhöhen des pH-Werts mit 0,1 N Natriumhydroxid bei 4ºC aufletztendlich 10,0 wurde das Gemisch bei 4ºC 20 h lang reagieren gelassen. Die Reaktionslösung wurde zur Entfernung von nichtumgesetztem PEG2 (Molekulargewichtsschnitt: 30 000) behandelt.
  • Modifizierungsgrad: 39,9%
  • Aktivität: 27,8% (wenn die Aktivität von nichtmodifizierter Elastase mit 100 angesetzt wurde).
    • Beispiel 65 PEG2-modifizierter Human-t-PA
  • Nachdem 547 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10, enthaltend 1 M Kaliumthiocyanat) zu 171 µl einer Lösung mit Human-t-PA (29,3 mg t-PA/ml, pH-Wert: 3) zugegeben worden waren, wurde die Lösung bei 4ºC mit 16,4 mg von gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde 24 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wurde das Gemisch mit 0,1 M Essigsäure neutralisiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand zur Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 84 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben. Die Produkt A und Produkt B enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt. Nach dem Entsalzen und Einengen durch Ultrafiltrieren wurden 150 µl einer wäßrigen Lösung mit Produkt A (Proteingehalt: 5,63 mg/ml) bzw. 200 µl einer wäßrigen Lösung mit Produkt B (Proteingehalt: 3,46 mg/ml) erhalten.
  • Von den erhaltenen modifizierten Produkten wurde die amidolytische Aktivität unter Verwendung von S-2288 (Ile-Pre- Arg-PNA) als Substrat bestimmt. Das Produkt A besaß eine Aktivität von 1,2 x 10&sup6; IU/ml, das Produkt B von 9,3 x 10&sup5; IU/ml.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts A:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 19.1 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 46.9 (50), Glx 49.9 (52), Ser 39.8 (48), Gly 44.1 (43), His 14.1 (16), Arg 32.2 (35), Thr 21.5 (25), Ala* 32 (32), Pro 26.6 (29), Tyr 21.5 (24), Val 21.8 (25), Met 2.9 (5), Ile 17.1 (19), Leu 37.0 (39), Phe 14.9 (19), Lys 18.0 (16), Cys - (35), Trp - (13)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts B:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 20.6 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 48.3 (50), Glx 52.7 (52), Ser 46.5 (48), Gly 46.5 (43), His 14.8 (16), Arg 33.5 (35), Thr 20.2 (25), Ala* 32 (32), Pro 29.0 (29), Tyr 23.5 (24), Val 22.8 (25), Met 2.9 (5), Ile 17.2 (19), Leu 39.8 (39), Phe 16.0 (19), Lys 20.4 (16), Cys - (35), Trp - (13)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 66 PEG2-modifiziertes Humanendothelin
  • In 150 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 250 µg Humanendothelin gelöst, worauf die erhaltene Lösung bei 4ºC mit 6 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem, gereinigtem PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das Gemisch 5 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 1 N Essigsäure erfolgte eine Reinigung durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000SW [7,5 mm φ x 600 mm, 0,1 M wäßrige Natriumchlorid lösung mit 5% Ethanol]. Die das gewünschte Produkt enthaltende Fraktion wurde entsalzt und eingeengt, wobei 60 µl einer das Produkt enthaltenden wäßrigen Lsöung erhalten wurden.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000SW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,1 M wäßrige Natriumchloridlösung (mit 5% Ethanol)
  • Fließrate: 0,7 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 19.1 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 1.9 (2), Glx 100 (1), Ser 2.8 (3), His 0.9 (1), Tyr 1.0 (1), Val 1.0 (1), Met 0.4 (1), Ile 1.2 (2), Leu 2.2 (2), Phe* 1 (1), Lys 0.9 (1), Cys - (4), Trp - (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 67 PEG2-modifiziertes Oxytocin
  • In 40 µl Wasser wurde 0,46 mg Oxytocin gelöst, worauf die Lösung mit 210 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) versetzt wurde. Danach wurden zu dem Gemisch 22,6 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 zugegeben. Das nunmehr erhaltene Gemisch wurde 17,5 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach Zugabe von 200 µl Wasser wurde das Gemisch mit 9 N Essigsäure neutralisiert. Anschließend erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 4,6 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA), (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 1 ml/min]. Nachdem die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 100 µl Wasser zugegeben, um eine das gewünschte Produkt enthaltende wäßrige Lösung herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 27.5 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 1.0 (1), Glx 1.0 (1), Gly 1.1 (1), Pro 1.0 (1), Tyr 1.0 (1), Cys - (2), Ile 1.0 (1), Leu* 1 (1)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 68 PEG2-modifiziertes [His¹, Lys&sup6;]-GHRP (H-His-D-Trp-Ala-Trp-D- Phe-Lys-NH&sub2;)
  • In 1 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurden 3 mg [His¹, Lys&sup6;]-GHRP gelöst, worauf die Lösung mit 206 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt wurde. Dann wurde das erhaltene Gemisch bei 4ºC 6,5 h lang stehengelassen. Nach Zugabe von 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) und 50 mg PEG2 wurden 20,5 h später 500 µl Acetonitril, 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) und 50 mg PEG2 und weitere 24 h danach 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) und 50 mg PEG2 zugegeben. Nochmals 24 h später wurden 50 mg PEG2 zugesetzt. Das Gemisch wurde dann 21 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach Zugabe von 3 ml Wasser wurde das Gemisch mit 9 N Essigsäure neutralisiert. Anschließend erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC- ODS, 10 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA), (anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 3 ml/min]. Nachdern die das Produkt enthaltende Fraktion gefriergetrocknet worden war, wurden 500 µl Wasser zugegeben, um eine wäßrige Lösung mit dem gewünschten Produkt herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 28.6 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • His 0.9 (1), Ala* 1 (1), Phe 1.0 (1), Lys 1.0 (1), Trp - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 69 PEG2-modifizierte [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P
  • In 500 µl 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10) wurde 1 mg [D-Arg¹, D-Pro², D-Trp7,9, Leu¹¹]-Substanz P gelöst, worauf die Lösung mit 40,1 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt wurde. Das erhaltene Gemisch wurde dann 30 h lang bei 4 ºC stehengelassen. Nach Zugabe von 500 µl Wasser wurde das Gemisch mit 9 N Essigsäure neutralisiert. Anschließend erfolgte eine Reinigung durch Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie [YMC-ODS, 10 mm φ x 250 mm; Gradient unter Verwendung von Eluiermittel A = Wasser, enthaltend 0,1% TFA, und Eluiermittel B = Acetonitril (0,1% TFA) (anfängiche Konzentration an Eluiermittel B: 25%; Gradient: 1%/min); Fließrate: 3 ml/min]. Die Produkt A bzw. Produkt B enthaltenden Fraktionen wurden aufgefangen. Nach dem Gefriertrocknen wurden jeweils 100 µl Wasser zugesetzt, um wäßrige Lösungen mit Produkt A bzw. Produkt B herzustellen.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts A:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 31.2 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Glx 1.9 (2), Arg 1.0 (1), Pro 2.3 (2), Leu* 2 (2), Phe 1.0 (1), Lys 0.8 (1), Trp - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
  • Physikalische Eigenschaften des Produkts B:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 25%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 31.5 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Glx 1.6 (2), Arg 1.1 (1), Pro 2.3 (2), Leu* 2 (2), Phe 0.9 (1), Lys 0.9 (1), Trp - (2)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
    • Beispiel 70 PEG2-modifizierte Asparaginase
  • Nachdem 975 mg Asparaginase in 195 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) gelöst worden waren, wurde die erhaltene Lösung bei 4ºC innerhalb von 60 min mit in drei Portionen unterteilten 29,0 g an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochgereinigtem PEG2 versetzt. Nach weiterem 22-stündigem Verrühren bei 4 ºC wurde das Gemisch mit Wasser auf 4,5 l aufgefüllt. Nach dern Neutralisieren mit 5%iger wäßriger Essigsäurelösung wurden durch Ultrafiltration 6,5 l des gewünschten Produkts als wäßrige Lösung eines Proteingehalts von 0,14 mg/ml erhalten.
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G4000PWXL [(7,8 mm φ x 30 mm) x 2, Schutzsäule, TSK-Schutzsäule PWXL (6,0 mm φ x 4 cm) (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)]
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 254 nm
  • Retentionszeit: 24.3 min.
    • Beispiel 71 PEG2-modifizierte, von Humanerythrocyten herrührende Cu, Zn-SOD
  • Nachdem 40 ml 0,1 M Boratpuffer (pH-Wert: 10,0) zu 100 mg von Humanerythrocyten herrührender Cu, Zn-SOD zugegeben worden waren, wurde das Gemisch auf 5ºC gekühlt und bei 5ºC mit 7,0 g an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt. Nach kräftigem Rühren wurde das erhaltene Gemisch 9 h lang bei 5ºC stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wurde der pH-Wert des Gemischs mit 2 N wäßriger Essigsäurelösung auf 6,2 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Ultrafiltrieren (unter Verwendung einer YM-30 Membran von Amicon Co., Ltd.) gereinigt. Die erhaltene wäßrige Lösung (40 ml) wurde in vier aliquete Teile unterteilt. Diese wurden zur Reinigung durch Gelfiltration auf eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 81 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) aufgegeben. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Einengen durch Ultrafiltrieren (unter Verwendung einer YM-30 Membran von Amicon Co., Ltd.) wurden 25 ml einer wäßrigen Lösung mit dem gewünschten Produkt erhalten. Das erhaltene modifizierte Produkt besaß eine Enzymaktivität von 61% auf der Basis von nichtmodifiziertem SOD (Cytochrome C-Methode).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Hochleistungsgelfiltrationschromatographie:
  • Säule: TSK-Gel G3000PW, 7,5 mm φ x 600 mm (hergestellt von TOSO Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung
  • Fließrate: 0,6 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 220 nm
  • Retentionszeit: 18.55 min
  • Aminosäureanalyse in den Säurezersetzungsprodukten (Zersetzungsprodukte nach 24-stündiger Behandlung mit 6 N Salzsäure- Phenol bei 110ºC)
  • Asx 33.0 (36), Glx 24.3 (26), Ser 17.4 (20), Gly 45.2 (50), His 13.8 (16), Arg 6.53 (8), Thr 14.7 (16), Ala* 20.0 (20), Pro 10.7 (10), Val 21.2 (28), Ile 10.5 (18), Leu 15.7 (18), Phe 6.99 (8), Lys 14.2 (22)
  • *Standardaminosäure; die Daten in Klammern sind berechnete Werte. Symbol "-" bedeutet, daß keine Daten ermittelt wurden.
  • Modifizierungsgrad: 65% (TNBS-Methode).
    • Beispiel 72 PEG2-modifiziertes Humanurinerythropoietin
  • 50 µl 0,05 M Boratpuffer (pH-Wert: 9,5) mit 0,1 mg Erythropoietin wurde bei 4ºC mit 2 mg an gemäß Beispiel 1 hergestelltem hochreinem PEG2 versetzt, worauf das erhaltene Gemisch bei 4ºC stehengelassen wurde. 2 h später wurde das Gemisch mit 1 mg PEG2 versetzt und dann 18 h lang bei 4ºC stehengelassen. Nach dem Neutralisieren mit 0,1 M Essigsäure wurde das Gemisch entsalzt und durch Ultrafiltration eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Gelfiltration durch Hindurchlaufenlassen durch eine Sephacryl S-200-Säule (2,6 cm φ x 94 cm; 0,2 M wäßrige Natriumchloridlösung) gereinigt. Die das Produkt enthaltende Fraktion wurde aufgefangen. Nach dem Entsalzen und Einengen durch Ultrafiltration wurde 1,0 ml einer das gewünschte Produkt enthaltenden wäßrigen Lösung erhalten. Das erhaltene modifizierte Produkt besaß eine 65%ige Aktivität des nichtmodifizierten Erythropoietins (in vitre- Test von Erythropoietin in einer fötalen Mäuseleberkultur, vgl. "British Journal of Haematology", 1981, 47, 461-468).
  • Physikalische Eigenschaften:
  • Umkehrphase-Hochleistungsflüssigchromatographie:
  • Säule: YMC-ODS AM303, 4,6 mm φ x 250 mm (hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.)
  • Eluiermittel: Gradient
  • Eluiermittel A: Wasser (0,1% Triflueressigsäure)
  • Eluiermittel B: Acetonitril (0,1% Triflueressigsäure)
  • Anfängliche Konzentration an Eluiermittel B: 30%
  • Konzentrationsgradient: 1%/min
  • Fließrate: 1 ml/min
  • Nachweiswellenlänge: 214 nm
  • Retentionszeit: 15.02 min.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolderivats der Formel (I):
worin R für eine Alkylgruppe steht und n einer positiven ganzen Zahl entspricht, durch Umsetzen einer Polyethylenglykolmonoalkyletherverbindung der Formel (II):
R - (OCH&sub2;CH&sub2;)n - OH (II)
worin R und n die angegebene Bedeutung besitzen, mit Cyanursäurechlorid in Gegenwart einer Verbindung eines zur Gruppe IIB gehörenden Metalls.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polyethylenglykolderivat eine Reinheit, bestimmt durch Hochleistungsgelfiltrationschromatographie, von mindestens 75% aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Alkylgruppe 1 bis 18 Kohlenstoffatom(e) enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Alkylgruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatom(e) enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die positive ganze Zahl im Bereich von 10 bis 700 liegt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die positive ganze Zahl im Bereich von 50 bis 350 liegt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Metallverbindung aus einem Oxid eines zur Gruppe IIB gehörenden Metalls besteht.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Metalloxid aus der Gruppe Zinkoxid, Cadmiumoxid und Quecksilberoxid ausgewählt ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines mit einem Polyethylenglykolderivat der Formel (I):
worin R für eine Alkylgruppe steht und n einer positiven ganzen Zahl entspricht, modifizierten Proteins in folgenden Stufen:
i) Herstellen des Polyethylenglykolderivats der Formel (I) durch Umsetzen einer Polyethylenglykolmonoalkyletherverbindung der Formel (II):
R - (OCH&sub2;CH&sub2;)n - OH (II)
worin R und n die angegebene Bedeutung besitzen, mit Cyanursäurechlorid in Gegenwart einer Verbindung eines zur Gruppe IIB gehörenden Metalls und
ii) Umsetzen eines Proteins mit dem hierbei erhaltenen Polyethylenglykolderivat.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Metallverbindung aus einem Oxid eines zur Gruppe IIB gehörenden Metalls besteht.
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