DE69021159T2

DE69021159T2 - Verfahren zum immunochemischen Bestimmen von Haptenen.

Info

Publication number: DE69021159T2
Application number: DE69021159T
Authority: DE
Inventors: Michio Ito; Hideki Kohno; Minoru Ogura
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1989-10-06
Filing date: 1990-10-05
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2010-10-06
Also published as: DE69021159D1; CA2027035A1; EP0421478B1; US5202269A; JPH03123861A; EP0421478A2; EP0421478A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines in einer Probe vorliegenden Haptens durch Nutzen der Antigen-Antikörper-Reaktion. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Bestimmung eines Haptens, welches als eine klinische Analyse, wie eine Serumanalyse zur Bestimmung der Menge von Hormonen oder Wirkstoffen im Blut, auf einem Gebiet der medizinischen Diagnose angewendet werden kann.
Eine niedermolekulare Verbindung, welche die Antikörperproduktion in einem lebenden Körper nicht selbst induzieren kann, aber als Antigen wirkt, und welche die Antikörperproduktion induzieren kann, wenn sie an eine hochmolekulare Verbindung, wie ein Protein, gebunden ist, wird als Hapten bezeichnet. Auf dem Gebiet der klinischen Analyse wird die immunchemische Bestimmung der Konzentration von verschiedenen Substanzen, wie niedermolekularen Hormonen und Wirkstoffen im Blut, durch die Verwendung der Antikörper, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten wurden, unter Verwendung der Substanzen als Haptene durchgeführt.
Der Radioimmuntest (RIA), der Enzymimmuntest (EIA) und der Fluoreszenzpolarisationsimmuntest können als die wichtigsten Beispiele der immunchemischen Bestimmungstechniken für ein Hapten angeführt werden. Diese Einteilung der Techniken ist abhängig von den unterschiedlichen Markierungen, durch die das Ausmaß der Reaktion bestimmt wird. Vom Gesichtspunkt des Betriebsverfahrens können die Techniken in eine sogenannte B/F-Trennung, bei der die Bestimmung durch Trennen der reagierten (gebundenen) Form und der unreagierten (freien) Form des markierten Antigens oder des markierten Antikörpers ausgeführt wird, und in das sogenannte homogene Verfahren, bei dem keine solche Trennung erforderlich ist, eingeteilt werden.
Das B/F-Trennverfahren wird bei einem Teil der RIA- und EIA-Verfahren eingesetzt. Dieses Verfahren ist empfindlich und spezifisch, aber es weist den Nachteil auf, daß es bei der Durchführung langwierig ist und einen langen Zeitraum für die Bestimmung erfordert, da es Trennwaschschritte einschließt, die viel Zeit in Anspruch nehmen. Die Erhöhung der Häufigkeit eine Probe während den Arbeitsschritten, wie Trennung, Waschen, etc., zu handhaben, erhöht das Risiko einer Infektion von der Probe. Zusätzlich schließt der RIA viele schwierige Probleme der Handhabung ein, wie das Problem der Entsorgung von radioaktiven Abfällen und die Notwendigkeit für spezifische Geräte. Aufgrund der Verwendung eines Enzyms als Marker weist der EIA die Nachteile auf, daß für die Reaktionszeit und -temperatur eine strikte Kontrolle erforderlich ist und daß der Nachweis dazu neigt, durch Inhibierungsreaktionen beeinflußt zu werden.
Das homogene Verfahren wird beim Fluoreszenzpolarisationsimmuntest und bei einem Teil der EIA-Verfahren angewendet. Dieses Verfahren ist einfach in der Durchführung, erfordert einen verhältnismäßig kurzen Zeitraum für die Bestimmung und kann durch die Verwendung eines speziellen Geräts einfach automatisiert werden. Dieses Verfahren ist jedoch wegen der geringen Empfindlichkeit auf den Nachweis bestimmter Wirkstoffarten beschränkt und es ist schwierig Substanzen nachzuweisen, die in einer Menge im Bereich von ng/ml vorliegen, wie viele Hormonarten und Digoxin. Ferner erfordert die Fluoreszenzpolarisationsbestimmung eine teuere Apparatur. Der homogene EIA weist auch die Nachteile auf, welche einem Verfahren unter Verwendung eines Enzyms eigen sind, und man kann sagen, daß bei diesem Verfahren Inhibierungsreaktionen unvermeidbar sind, da die zu bestimmende Substanz im Reaktionssystem verbleibt.
Die Latexagglutination ist auch eine Art des homogenen Verfahrens. Dieses Verfahren wird zur Bestimmung eines bestimmten Haptentyps hauptsächlich in der Form des Objektträgerverfahrens angewendet, welches ein qualitatives oder semiquantitatives Verfahren ist. Zusätzlich zu den Vorteilen des homogenen Verfahrens, d.h. einfache Durchführung und ein kurzer Bestimmungszeitraum, besitzt dieses Verfahren den Vorteil, daß es hinsichtlich der Lagerstabilität der Reagenzien und der Stabilität des Reaktionssystems im Vergleich zu EIA und anderen Testverfahren ausgezeichnet ist. Jedoch ist die geringe Nachweisempfindlichkeit die größte Schwäche dieses Verfahrens (Japanische Patentanmeldung (Offenlegung) KOKAI Nrn. 53-104726(1978), 55-52945(1980), 55- 52946(1980), 55-156866(1980) und 61-265571(1986)).
Ein Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Haptens unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Latexagglutination, d.h. ein Verfahren, bei dem das Ausmaß der Inhibierung durch ein Hapten im Vergleich zur Agglutination von Latexteilchen über eine hochmolekulare Verbindung, an die ein Hapten gebunden ist, bestimmt wird, weist hinsichtlich der Empfindlichkeit Probleme auf. Ein Problem ist die Schwierigkeit einen hohen Antikörpertiter zu einem Hapten zu erhalten, insbesondere zu einem Hapten, welches aus einem lebenden Körper stammt, während ein Antikörper mit einem hohen Titer für das Bewirken der Latexagglutination notwendig ist. Ein anderes Problem ist, daß es aus im Verfahren eingeschlossenen methodischen Gründen schwierig ist die Inhibierungsempfindlichkeit zu erhöhen, d.h. die Notwendigkeit einen großen Teil eines Antikörpers mit einem Hapten zur Inhibierung der Agglutination abzuschirmen, während der nur in einem Teil auf der Latexteilchenoberfläche vorliegende Antikörper zur Agglutination ausreichend ist.
Die WO 89/01161 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Haptens in einer Probe, das die folgenden Schritte umfaßt:
Inkubieren eines Gemisches der Probe, welche das Hapten enthält, mit ersten magnetischen Teilchen, die das Hapten tragen, und zweiten Teilchen, welche einen Antikörper zu dem Hapten tragen;
Anlegen eines Magnetfeldes an das Gemisch, um unreagierte erste Teilchen und agglutinierte Teilchen der ersten und zweiten Teilchen abzutrennen, und
Messen der optischen Dichte des Gemisches, wodurch die Konzentration des Haptens in der Probe aus der Abnahme der Trübung bestimmt wird. Bei diesem Verfahren ist ebenfalls ein Antikörper mit einem hohen Titer zu dem Hapten erforderlich und deshalb wurde ein Verfahren gewünscht, das sehr empfindlich ist und das einen Antikörper mit einem niedrigeren Titer zu einem Hapten verwenden kann.
Die hier genannten Erfinder erfanden zusammen mit einem anderen Erfinder bereits ein Meßverfahren unter Verwendung von zwei Teilchenarten, unlöslichen Trägerteilchen und eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen, als eine Anwendung der Latexagglutinationstechnik (Japanische Patentanmeldung (Offenlegung) KOKAI Nr. 1-193647(1989)). Die hier genannten Erfinder führten weitere Untersuchungen durch und kamen zu dem Schluß, daß es möglich ist, die Inhibierungwirkung zu verbessern, indem ein anti-Hapten-Antikörper nur von einem der vorstehenden zwei Teilchenarten getragen wird, da es bei dem bereits erfundenen Verfahren möglich ist, den Typ des Antikörpers, welcher auf beiden Arten der unlöslichen Trägerteilchen getragen werden soll, auszutauschen. Die hier genannten Erfinder kamen weiter zu dem Schluß, auf die andere Teilchenart einen Antikörper zu einer antigenen Determinante in einer hochmolekularen Verbindung, an welche das Hapten gebunden ist, und die von dem Hapten verschieden ist, zu übertragen. Diese Idee ermöglichte die Verwendung eines Antikörpers mit einem hohen Titer als Antikörper zu einer antigenen Determinante, die von dem Hapten verschieden ist, durch geeignete Wahl einer hochmolekularen Verbindung mit einer hohen Antigenität, wodurch die Verwendung eines Antikörpers mit einem hohen Titer zu dem Hapten unnötig wird. Auf diese Weise wurde die Verbesserung in der Agglutinationsaktivität, die bei dem Stand der Technik ein Problem war, ebenfalls verwirklicht. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnis entwickelt.
Der spezifische Charakter der vorliegenden Erfindung liegt in einem Verfahren zur immunologischen Bestimmung der Konzentration eines Haptens in einer Probe, umfassend die Schritte:

Dispergieren

(A) einer hochmolekularen Verbindung, an welche das Hapten gebunden ist (Reagens A), wobei die hochmolekulare Verbindung ein Molekulargewicht von nicht weniger als 5000 aufweist und eine Antigenität zeigt, indem sie fähig ist, Antikörper zu erzeugen, und in der Lage ist, das Hapten in ihrem Molekül einzuschließen oder eine funktionelle Gruppe besitzt, welche zur chemischen Bindung des Haptens fähig ist,
(B) unlöslicher Trägerteilchen, welche darauf einen Antikörper zu dem Hapten tragen (Reagens B), wobei die unlöslichen Trägerteilchen eine Zelle, eine Mikrokapsel, ein organisches Polymer, ein anorganisches feines Teilchen oder ein kolloidales Teilchen eines Metalls oder einer Metallverbindung sind, und
(C) eine magnetische Substanz enthaltender unlöslicher Trägerteilchen, welche darauf einen Antikörper zu einer antigenen Determinante in der hochmolekularen Verbindung tragen und die von dem Hapten verschieden ist (Reagens C), wobei das die magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerteilchen eine magnetische Substanz in einer Menge von mindestens 5 Gew.-% enthält und wobei die durchschnittliche Teilchengröße entweder des unlöslichen Trägerteilchens oder des die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens 0,1 bis 10 um beträgt, in der Probe, um eine Reaktion zu vervollständigen;
Anlegen eines Magnetfeldes, um von der Reaktionsmischung unreagiertes Reagens (C) und agglutinierte Teilchen, welche aus dem Reagens (B) und dem Reagens (C) über das Reagens (A) gebildet worden sind, abzutrennen; und
Messen der Menge des in der Reaktionsmischung dispergiert verbleibenden Reagens (B), wodurch das Ausmaß der konkurrierenden Inhibierung bezüglich der Agglutination des Reagens (B) und des Reagens (C) über das Reagens (A) durch die Reaktion zwischen dem Hapten in der Probe und dem Reagens (B) bestimmt wird.
Figur 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung des Meßergebnisses der Trübung bei 620 nm zur Thyroxinkonzentration in den Proben zeigt.
Figur 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung des Meßergebnisses der Trübung bei 620 nm zur Digoxinkonzentration in den Proben zeigt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Hapten" bezieht sich auf eine niedermolekulare Substanz mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 10 000, welche die Antikörperproduktion in einem menschlichen oder tierischen Körper nicht selbst induzieren kann, die aber die Antikörperproduktion induzieren kann, wenn sie an eine hochmolekulare Verbindung, wie ein Protein, gebunden ist. Dieser Begriff kann sich auch auf den Teil beziehen, welcher der niedermolekularen Substanz strukturell entspricht, wenn sie an die hochmolekulare Verbindung gebunden ist. Die in einer klinischen Untersuchung als Hapten bestimmte Substanz umfaßt ein niedermolekulares Hormon, wie ein Schilddrüsenhormon, einschließlich Thyroxin, ein Steroid und Adrenalin, ein kleines Peptidhormon, wie Gastrin, Vasopressin und Angiotensin, und verschiedene Arten von synthetischen Wirkstoffen, wie Digoxin.
Der Begriff "hochmolekulare Verbindung" bezieht sich in der vorliegenden Erfindung auf eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von nicht weniger als 5000, welche anders als Haptene eine Antigenität aufweist, indem sie fähig ist, die Antikörperproduktion zu induzieren, und welche in ihre Molekülstruktur ein Haptenmolekül aufnehmen kann oder eine funktionelle Gruppe besitzt, welche zur chemischen Bindung eines Haptenmoleküls fähig ist. Üblicherweise wird ein wasserlösliches Serumprotein mit einer hohen Antigenität verwendet, wie Rinderserumalbumin, Pferdeferritin und Hemocyanin, oder eine Substanz beispielsweise Polylysin, mit einem Molekulargewicht von mehreren Zehntausend bis zu mehreren Hunderttausend, welche in Wasser sehr gut löslich ist und überschüssige funktionelle Gruppen besitzt.
Als "unlösliche Trägerteilchen" wird eine Zelle, wie eine rote Blutzelle, eine Mikrokapsel, wie ein Liposom, ein organisches Polymer, ein anorganisches feines Teilchen, wie Ruß, oder ein kolloidales Teilchen verschiedener Arten von Metallen oder Metallverbindungen verwendet. Stärker bevorzugt wird ein synthetisches polymeres Latexteilchen, welches durch die Polymerisation einer aromatischen Vinylverbindung, wie Styrol, Divinylbenzol, Vinyltoluol, etc., und/oder eines Methacrylesterderivats erhalten wurde, verwendet. Außerdem werden jene Teilchen, welche eine ausgezeichnete Dispergierbarkeit in dem Reaktionsmedium aufweisen und sich nicht leicht absetzen, bevorzugt zur Erleichterung der optischen Bestimmung verwendet.
Die in den "eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen" enthaltene magnetische Substanz kann Eisen, ein magnetisches Eisenoxid wie Trieisentetraoxid und ein Gemisch oder eine Legierung von Eisen oder des magnetischen Eisenoxids mit einem anderen Metall oder Metalloxid umfassen. Die magnetische Substanz weist vorzugsweise keinen Restmagnetismus auf und die durchschnittliche Teilchengröße davon beträgt vorzugsweise 1 bis 20 nm (10 bis 200 Å). Die magnetische Substanz kann in einem Anteil von 5 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise von 20 bis 65 Gew.-%, des unlöslichen Trägerteilchen enthalten sein. Als Matrix des die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens kann ein Polysaccharid, wie Agarose, Dextran und Carboxymethylcellulose, ein Protein, wie Gelatine und polymerisiertes Albumin, und ein Proteinderivat verwendet werden. Jedoch wird die Verwendung eines durch die Polymerisation einer aromatischen Vinylverbindung, wie Styrol, Divinylbenzol, etc. und/oder eines Methacrylesterderivats erhaltenen synthetischen Polymers stärker bevorzugt.
Die durchschnittliche Teilchengröße eines jeden unlöslichen Trägerteilchens und des eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Tragerteilchens beträgt unter Berücksichtigung der Bestimmungsempfindlichkeit 0,1 bis 10 um, vorzugsweise 0,2 bis 3 um. Eine Kombination der unlöslichen Trägerteilchen mit durchschnittlichen Teilehengrößen von 0,5 bis 3 um und der eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen mit durchschnittlichen Teilchengrößen von 0,2 bis 2 um wird bevorzugt. Stärker bevorzugt wird eine Kombination der unlöslichen Trägerteilchen mit durchschnittlichen Teilchengrößen von 1 bis 2,5 um und der eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen mit durchschnittlichen Teilchengrößen von 0,5 bis 1,5 um. Wenn die durchschnittlichen Teilchengrößen der unlöslichen Trägerteilchen zu groß sind, würde in einem frühen Stadium der Bestimmung die spontane Sedimentation der Teilchen eintreten, und wenn die durchschnittlichen Teilchengrößen der eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen zu klein sind, wäre die Trennung durch Anlegen eines Magnetfeldes zu zeitraubend, beide Fälle sind ungeeignet.
Die physikalische Adsorption oder die kovalente Bindung über eine funktionelle Gruppe ist für das Tragen eines Antikörpers auf beiden Trägerteilchenarten anwendbar. Das Mengenverhältnis der Trägerteilchen zum Antikörper, welcher getragen werden soll, ist nicht entscheidend begrenzt, aber in vielen Fällen können gute Ergebnisse erhalten werden, wenn für alle Trägerteilchenarten in Hinsicht auf den Antikörper das 5 bis 200fache Gewicht der Trägerteilchen verwendet wird.
Die Bestimmung eines Haptens durch eine Agglutinationsinhibierung ist möglich, indem ein anti-Hapten-Antikörper entweder auf den unlöslichen Trägerteilchen oder den eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen getragen wird. Jedoch kann ein besseres Ergebnis erhalten werden, wenn der anti-Hapten-Antikörper von den unlöslichen Trägerteilchen getragen wird, welche direkt mit der optischen Bestimmung in Beziehung stehen, während der Antikörper zu einer antigenen Determinante in der hochmolekularen Verbindung, welche von dem Hapten verschieden ist, von den eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen, die besonders zur Agglutinationsaktivität beitragen, getragen wird.
Die unlöslichen Trägerteilchen (Reagens B), welche einen anti-Hapten-Antikörper tragen, und die eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen (Reagens C), welche einen Antikörper zu einer antigenen Determinante, welche von dem Hapten und der hochmolekularen Verbindung (Reagens A), an die das Hapten gebunden ist, verschieden ist, werden mit einer flüssigen Probe, von der man annimmt, daß sie das Hapten enthält und einer bestimmten Menge des Reagens (A) gemischt und man läßt die Substanzen miteinander reagieren. Zu Beginn der Reaktion ist ein ausreichendes Mischen notwendig. Nachdem eine gleichmäßige Durchmischung erzielt wurde, kann man das Gemisch jedoch ohne weiteres Mischen zum Voranschreiten der Reaktion stehen lassen. Die Reaktion kann wie bei üblichen immunchemischen Reaktionen bei einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise bei 7 bis 9, ausgeführt werden. Während die Reaktion bei einer Temperatur von 2 bis 50ºC ausgeführt werden kann, wird sie vorzugsweise in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 37-40ºC durchgeführt. Die Reaktionszeit kann aus einem großen Bereich von unmittelbar nach dem Start der Reaktion bis über Nacht gewählt werden. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit und die Durchführungsvorteile beträgt die Reaktionszeit üblicherweise 5 bis 60 Minuten. Diese Reaktionsbedingungen werden bei den folgenden Schritten angewendet.
Üblicherweise wird zur Aufrechterhaltung des gewünschten pH-Werts eine Pufferlösung verwendet. Als Pufferlösung kann ein Phosphorsäurepuffer, ein Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer, etc. verwendet werden. Jedoch werden praktisch alle Pufferlösungen bei einem pH-Wert im Bereich von neutral bis schwach basisch verwendet. In vielen Fällen werden zur Vermeidung von unspezifischen Reaktionen ein Salz wie Natriumchlorid und ein Protein wie Rinderserumalbumin zugegeben.
Wenn das Reagens (B) und das Reagens (C) in einer Lösung gemischt werden, welche eine bestimmte Menge des Reagens (A) enthält, erfolgt die Reaktion zwischen dem anti- Hapten-Antikörper auf der Oberfläche des Reagens (B) und dem Hapten auf dem Reagens (A) und die Reaktion zwischen der antigenen Determinante auf dem Reagens (A), welche von dem Hapten verschieden ist, und dem Antikörper zu der antigenen Determinante, welche auf dem Reagens (C) getragen wird, wodurch agglutinierte Teilchen des Reagens (B) und des Reagens (C) über das Reagens (A) gebildet werden.
Wenn eine Probe, von der man annimmt, daß sie das Hapten enthält, in diesem Reaktionssystem gleichzeitig vorliegt, reagiert das in der Probe vorliegende Hapten mit dem anti- Hapten-Antikörper, welcher auf dem Reagens (B) getragen wird, was einen Anstieg der Antikörpermenge des Reagens (B) zur Folge hat, welches mit dem an das Reagens (A) gebundene Hapten reagiert, wodurch die Agglutination von Reagens (B) und von Reagens (C) über das Reagens (A) inhibiert wird. So ist es durch die Bestimmung des Ausmaßes der Inhibierung der Agglutination möglich, die Menge des Haptens in der Probe zu bestimmen.
In diesem Fall, da das Ausmaß der Konkurrenz zwischen dem Hapten in der Probe und dem Hapten auf dem Reagens (A) im Vergleich zu dem anti-Hapten-Antikörper auf dem Reagens (B) bestimmt wird, ist es notwendig, eine solche Reihenfolge der Zugabe zu wählen, daß die Reaktion zwischen dem anti-Hapten-Antikörper auf dem Reagens (B) und dem Hapten auf dem Reagens (A) der Reaktion zwischen dem anti-Hapten-Antikörper auf dem Reagens (B) und dem Hapten in der Probe nicht vorausgeht. Jedoch kann bei der Bildung der Agglutination des Reagens (B) und des Reagens (C) über das Reagens (A) entweder die Bindung zwischen dem Reagens (B) und dem Reagens (A) oder die Bindung zwischen dem Reagens (C) und dem Reagens (A) der anderen vorausgehen. Deshalb kann bei der eigentlichen Durchführung der anti-Hapten-Antikörper auf dem Reagens (B) zuerst mit dem Hapten in der Probe und dem Hapten auf dem Reagens (A) umgesetzt werden und im Anschluß daran mit dem Reagens (C). Diese Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien kann umgekehrt werden. Außerdem ist es auch möglich alle Reagenzien gleichzeitig zu mischen und sie miteinander reagieren zu lassen.
Das zu verwendende Mengenverhältnis der unlöslichen Trägerteilchen und der eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen beträgt im Hinblick auf die Bestimmungsempfindlichkeit vorzugsweise 1:20 bis 20:1, stärker bevorzugt 1:4 bis 4:1.
Die verwendete Menge des Reagens (A) kann mit Bezug auf den Typ des zu bestimmenden Haptens, der Konzentration des Haptens in einer Probe und des in den Reagenzien (B) und (C) verwendeten Antikörpertiters geeignet bestimmt werden.
Die Stärke eines Magnetfeldes und die Anordnung und Form des Reaktionssystems werden vorzugsweise so gewählt, daß unreagiertes Reagens (C) und das Agglutinationsprodukt der Reagenzien (B) und (C) über das Reagens (A) in 5 bis 20 Minuten von der Reaktionsmischung abgetrennt werden können. Eine zu kurze Trennzeit kann eine Verringerung der Empfindlichkeit und der Reproduzierbarkeit bewirken, während eine zu lange Trennzeit die Durchführbarkeit beeinträchtigt. Aus diesen Gründen ist ein Reaktionssystem in einem verhältnismäßig kleinen Maßstab einfach zu bedienen. Beispielsweise wird bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen bevorzugt, da deren einzelne Vertiefungen klein sind und es möglich ist, wie bei einem EIA unter Verwendung einer Mikroplatte, die Bestimmung mit einem Mikroplattenlesegerät einfach durchzuführen, wenn kleine Magnete im Raum zwischen den Vertiefungen angeordnet sind.
Wenn das unreagierte Reagens (C) durch das Anlegen eines Magnetfeldes abgetrennt wird. wird auch das Reagens (B) abgetrennt, welches mit dem Reagens (C) agglutinierte, so daß die Menge des Reagens (B), das als Ergebnis der Bindung mit dem Hapten unagglutiniert verbleibt, durch die Messung der Trübung des Gemisches, welches das unreagierte Reagens (B) enthält, oder der Menge der in dem Reaktionsgemisch dispergierten Trägerteilchen einfach bestimmt werden kann. Je größer die Menge des Haptens in der Probe ist desto größer ist die Trübung (Extinktion). In einigen Fällen kann ein Teil des Reagens (C) ungetrennt verbleiben und zusammen mit dem unagglutinierten Reagens (B) nachgewiesen werden, aber das ist kein Problem, wenn das Ausmaß davon keine praktische Bedeutung hat.
Die einfachste Weise des optischen Nachweises ist die Beobachtung des Trübungsunterschieds, welcher abhängig ist von der verbleibenden Menge des Reagens (B), mit bloßem Auge auf einem schwarzen Hintergrund unter einer Lichtquelle. Quantitative Tests sind durch die Verwendung verschiedene Typen von Kolorimetern oder Trübungsmeßgeräten möglich. Im Hinblick auf die Wellenlänge des Meßlichts wird eine Wellenlänge in einem Bereich verwendet, der dem sichtbaren Licht oder dem Bereich nahe der Infrarotstrahlung, vorzugsweise 600 bis 1100 nm, entspricht. Die Anzahl der verbleibenden Teilchen kann direkt durch Durchflußcytometrie unter Verwendung eines Lasers gezählt werden.
Eine Kalibrierungskurve des Haptens kann durch Messen eines quantitativ nachweisbaren Parameters, wie die Trübung von Proben verschiedener bekannter Haptenkonzentrationen, erhalten werden. Im Anschluß daran wird der quantitative Wert des Parameters gegen die Haptenkonzentration aufgetragen. Mit Bezug auf die erhaltene Kalibrierungskurve kann die Menge des Haptens in einer Probe unbekannter Konzentration quantitativ bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, daß diese Beispiele die Erfindung nur veranschaulichen und nicht den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung begrenzen sollen.

Beispiel 1: Bestimmung von Thyroxin

Thyroglobulin ist eine natürliche Thyroxin-bindende hochmolekulare Substanz, welche mehrere Molekülen von Thyroxinresten in einem Molekül aufweist. Zur Steigerung der Spezifität der Reaktion zwischen der antigenen Determinante, welche von dem Hapten auf der hochmolekularen Verbindung verschieden ist, und dem Antikörper zur antigenen Determinante, wurde Theophyllin mit einer starken Antigenität an Thyroglobulin gebunden und als antigene Determinante auf der hochmolekularen Verbindung verwendet.

Herstellung der Reagenzien

1) Herstellung von Latex, welcher den anti-Thyroxin-Antikörper F(ab')&sub2; trägt.

Kaninchen wurden gegen Thyroxin-bindendes Rinderserumalbumin immunisiert, welches gemäß dem Verfahren von Gharib H. et al. (J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971), 509) präpariert wurde. Das erhaltene Antiserum wurde an Rinderserumalbumin absorbiert und die anti-IgG-Antikörperfraktion wurde aus dem erhaltenen thyroxinspezifischen Antiserum gesammelt, mit Pepsin gespalten und einer Molekularsiebsäulenchromatographie unterzogen, um das F(ab')&sub2; zu erhalten. In 10 ml 0,1 M Tris-Puffer (pH 8) (nachstehend als "Tris-Puffer" bezeichnet) wurden 4 mg F(ab')&sub2; gelöst. Die erhaltene Antikörperlösung wurde unter Rühren während 30 Minuten mit einer 2%igen Suspension von Polyvinyltoluollatex (hergestellt von SERADYN, INC.) mit einer Teilchengröße von 2,02 um gemischt, welche unter Verwendung der Tris-Pufferlösung hergestellt worden war, wodurch der anti-Thyroxin-Antikörper F(ab')&sub2; auf die Latexoberfläche übertragen wurde.
Das Gemisch wurde bei 10 000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Danach wurde das Gemisch mit 20 ml des Tris-Puffers, welcher 0,3% Rinderserumalbumin enthielt, ergänzt und durch 30minütiges Rühren erneut dispergiert, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung, um zur Stabilisierung des Latexes eine feine Dispersion zu gewährleisten. Nach weiterem Zentrifugieren wurde der erhaltene Latex dispergiert, in 20 ml des Tris-Puffers, welcher 0,05% Natriumazid enthielt, suspendiert und bei 4 bis 10ºC aufbewahrt.

2) Herstellung von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex, welcher einen monoklonalen Maus-anti-Theophyllin-Antikörper trägt.

Ein Gemisch von 1 ml eine magnetische Substanz enthaltendem Latex (Estapor SML266, Teilchengröße: 0,7 um, 10%, hergestellt von Rhone poulenc chimie) mit 19 ml destilliertem Wasser wurde nach gründlichem Mischen bei 10 000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand entfernt, um die gewaschenen Latexpellets zu erhalten. Den Pellets wurde zum Redispergieren eine Antikörperlösung zugegeben, welche 4 mg eines monoklonalen anti-Theophyllin-Antikörpers (hergestellt von Cambridge Medical Diagnostic Co., Ltd.) gelöst in 10 ml Tris-Puffer enthielt, gefolgt von Rühren während einer Stunde, wobei der Antikörper auf die Oberfläche von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex übertragen wurde. Die Dispersion wurde erneut zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, gefolgt von erneutem Dispergieren und Suspendieren in 10 ml des Tris-Puffers, welcher zur Stabilisierung 0,3% Rinderserumalbumin enthielt. Die erhaltene Dispersion wurde weiter zentrifugiert, in 10 ml des Tris- Puffer, welcher 0,05% Natriumazid enthielt, suspendiert und bei 4 bis 10ºC aufbewahrt.

3) Herstellung von Theophyllin-bindendem Rinderthyroglobulin

Gemäß dem Verfahren von Cook C.E. et al. (Res. Comm. Chem. Path. Pharm. 13 (1976), 497) wurde ein Theophyllinderivat synthetisiert. 5 mg des Theophyllinderivats wurden mit 100 mg Rinderthyroglobulin umgesetzt und das unreagierte Theophyllinderivat wurde durch eine Molekularsiebgelchromatographie entfernt, wobei Theophyllin-bindendes Rinderthyroglobulin erhalten wurde.

Bestimmungsverfahren

Eine Thyroxinlösung (33,3 ug/dl) wurde aufeinanderfolgend mit einem 0,1 M Tris-Salzsäure-Puffer, welcher 0,1% Rinderserumalbumin und 0,9% herkömmliches Salz enthielt (pH 8,2, nachstehend als "TBS-Puffer" bezeichnet), dreimal verdünnt, um eine Verdünnungsreihe von Proben herzustellen, wobei die niedrigste Konzentration 0,137 ug/dl betrug. Jede Probe der Verdünnungsreihe wurde in zwei Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 50 ul aufgeteilt. Der gleiche Vorgang wurde mit TBS-Puffer als Kontrolle erneut ausgeführt. Im Anschluß daran wurden 100 ul TBS- Puffer, welcher 10 ng/ml Theophyllin-bindendes Thyroglobulin und 0,06% Ammonium- 8-anilino-1-naphthalinsulfonat enthielt, auf jede der Vertiefungen aufgeteilt, in denen die Proben bereits aufgeteilt worden waren. Dann wurden 25 ul einer Suspension, welche durch vierfaches Verdünnen von Latex, der den Anti-Thyroxin-Antikörper F(ab')&sub2; trägt, mit dem Tris-Puffer hergestellt wurde, auf jede Vertiefung aufgeteilt und unmittelbar danach wurde eine Seite der Mikroplatte für etwa 10 Sekunden leicht geklopft, um die Inhalte in den Vertiefungen zu mischen. Das Gemisch ließ man bei Raumtemperatur während 60 Minuten stehen, um die Reaktion zu beenden. Im Anschluß daran wurden 25 ul einer Suspension, welche durch fünffaches Verdünnen von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex, welcher einen anti-Theophyllin-Antikörper trägt, mit dem Tris- Puffer hergestellt wurde, auf jede Vertiefung aufgeteilt und eine Seite der Mikroplatte wurde zum Mischen der Inhalte in den Vertiefungen leicht geklopft. Man ließ das Gemisch dann bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen, um die Reaktion zu beenden. Im Anschluß daran wurde mit Hilfe von kleinen Stabmagneten von 3 mmφ ein Magnetfeld während 10 Minuten an vier Seiten einer jeden Vertiefung der Mikroplatte angelegt, um den eine magnetische Substanz enthaltenden Latex an die Seitenwand jeder Vertiefung zu ziehen. Die Trübung des Gemisches in jeder Vertiefung, die Latex enthielt, welcher den anti-Thyroxin-Antikörper F(ab')&sub2; trägt, und der mit dem eine magnetische Substanz enthaltenden Latex unagglutiniert in jeder Vertiefung verblieb, wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (NJ-2000, hergestellt von Nippon Intermed Co., Ltd.) bei einer Wellenlänge von 620 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 1 in Hinsicht auf die Beziehung zwischen der Thyroxinkonzentration einer jeder Probe und der Trübung dargestellt (Kalibrierungskurve). Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine signifikant hohe Bestimmungsempfindlichkeit von Thyroxin bei einer Menge von viel weniger als 6 ug/dl aufweist, welche die untere Grenze des normalen Bereichs von Thyroxin im Blut ist.

Beispiel 2: Bestimmung von Digoxin

Digoxin ist ein starkes Herzmittel, aber wegen der geringen effektiven Konzentration im Blut und dem kleinen Unterschied zwischen therapeutischer Konzentration und toxischer Konzentration wird es als typisches Beispiel von Wirkstoffen angesehen, welche eine exakte Bestimmung mit hoher Empfindlichkeit erfordern.

Herstellung der Reagenzien

1) Herstellung von Latex, welcher einen monoklonalen Maus-anti-Digoxin-Antikörper trägt.

In 10 ml 0,1 M Tris-Puffer (pH 8) (nachstehend als "Tris-Puffer" bezeichnet) wurden 4 mg eines monoklonalen Maus-anti-Digoxin-Antikörpers (hergestellt von Cambridge Medical Diagnostic Co., Ltd.) gelöst. Die erhaltene Antikörperlösung wurde unter Rühren während 30 Minuten mit einer 2%igen Suspension von Polyvinyltoluollatex (hergestellt von SERADYN, INC,) mit einer Teilchengröße von 2,02 um gemischt, welche unter Verwendung der Tris-Pufferlösung hergestellt worden war, wodurch der monoklonale Maus-anti-Digoxin-Antikörper auf die Latexoberfläche übertragen wurde. Das Gemisch wurde bei 10 000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Danach wurde das Gemisch mit 20 ml des Tris-Puffers, welcher 0,3% Rinderserumalbumin enthielt, ergänzt und durch Rühren während 30 Minuten erneut dispergiert, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung, um zur Stabilisierung des Latexes eine feine Dispersion zu gewährleisten. Nach einer weiteren Zentrifugation wurde der erhaltene Latex dispergiert, in 20 ml Tris-Puffer, welcher 0,05% Natriumazid enthielt, suspendiert und bei 4 bis 10ºC aufbewahrt.

2) Herstellung von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex, welcher einen Maus- anti-Pferdeferritin-Antikörper F(ab')&sub2; trägt.

Eine anti-IgG-Antikörperfraktion wurde aus dem Kaninchen-anti-Pferdeferritin-Antikörper (hergestellt von DAKO JAPAN CO., LTD.) gesammelt, mit Pepsin gespalten und einer Molekularsiebsäulenchromatogaphie unterzogen, um das F(ab')&sub2; zu erhalten. Ein Gemisch aus 1 ml eine magnetische Substanz enthaltenden Latex (Estapor SML266, Teilchengröße: 0,7 um, 10%, hergestellt von Rhone poulenc chimie) mit 19 ml destilliertem Wasser wurde nach gründlichem Mischen bei 10 000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert und anschließend wurde der Überstand entfernt, um gewaschene Latexpellets zu erhalten. Den Pellets wurde zur erneuten Dispergierung eine Antikörperlösung zugegeben, welche 4 mg des vorstehend hergestellten anti-Pferdeferritin-Antikörpers F(ab')&sub2; gelöst in 10 ml Tris-Puffer enthielt, gefolgt von Rühren während einer Stunde, wobei der Antikörper auf die Oberfläche von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex übertragen wurde. Die Dispersion wurde erneut zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, gefolgt von erneutem Dispergieren und Suspendieren in 10 ml Tris-Puffer, welcher zur Stabilisierung 0,3% Rinderserumalbumin enthielt. Die erhaltene Dispersion wurde weiter zentrifugiert, in 10 ml Tris-Puffer, welcher 0,05% Natriumazid enthielt, suspendiert und bei 4 bis 10ºC aufbewahrt.

3) Herstellung von Digoxin-bindendem Pferdeferritin

Das Digoxin wurde gemäß dem Verfahren von Smith T.W. et al. (Biochemistry 9 (1970), 331) einer Periodidoxidation unterzogen, um das Ende der Saccharidkette in ein Aldehyd umzuwandeln, welches dann mit Pferdeferritin umgesetzt wurde, gefolgt von einer Reduktion. Die unreagierten Substanzen wurden durch Dialyse entfernt, wobei Digoxin- bindendes Pferdeferritin erhalten wurde.

Bestimmungsverfahren

Eine Digoxinlösung (328 ng/ml) wurde aufeinanderfolgend mit einem 0,1 M Tris-Salzsäurepuffer, welcher 0,1% Rinderserumalbumin und 0,9% herkömmliches Salz enthielt (pH 8,2, nachstehend als "TBS-Puffer" bezeichnet), dreimal verdünnt, um eine Verdünnungsreihe der Proben zu erhalten, wobei die niedrigste Konzentration 1,35 ng/ml betrug. Jede Probe der Verdünnungsreihe wurde in zwei Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 100 ul aufgeteilt. Der gleiche Vorgang wurde mit TBS- Puffer als Kontrolle erneut durchgeführt. Dann wurden 100 ul TBS-Puffer, welcher 10 ng/ml Digoxin-bindendes Pferdeferritin enthielt, auf jede der Vertiefungen aufgeteilt, in welchen die Proben schon aufgeteilt worden waren. Dann wurden 25 ul einer Suspension, welche durch vierfaches Verdünnen von Latex, welcher den anti-Digoxin-Antikörper trägt, mit Tris-Puffer hergestellt wurde, auf jede Vertiefung aufgeteilt und unmittelbar danach wurde eine Seite der Mikroplatte für etwa 10 Sekunden leicht geklopft, um die Inhalte in den Vertiefungen zu mischen. Man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur während 60 Minuten stehen, um die Reaktion zu beenden. Dann wurden 25 ul einer Suspension, welche durch fünffaches Verdünnen von eine magnetische Substanz enthaltendem Latex, welcher einen anti-Pferdeferritin-Antikörper trägt, mit Tris-Puffer hergestellt wurde, auf jede Vertiefung aufgeteilt und eine Seite der Mikroplatte wurde zum Mischen der Inhalte in den Vertiefungen leicht geklopft. Man ließ das Gemisch dann bei Raumtemperatur für 20 Minuten stehen, um die Reaktion zu beenden. Mit Hilfe von kleinen Stabmagneten von 3 mmφ wurde ein Magnetfeld an vier Seiten einer jeder Vertiefung der Mikroplatte während 10 Minuten angelegt, um den eine magnetische Substanz enthaltenden Latex an die Seitenwand einer jeder Vertiefung zu ziehen. Die Trübung des Gemisches in jeder Vertiefung, welche Latex enthielt, der den anti-Digoxin-Antikörper trägt und welcher zusammen mit dem eine magnetische Substanz enthaltenden Latex in jeder Vertiefung unagglutiniert verblieb, wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (NJ-2000, hergestellt von Nippon Intermed Co., Ltd.) bei einer Wellenlänge von 620 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren ausreichend auf den Digoxinkonzentrationsbereich anwendbar ist, welcher 2,2 ng/ml einschließt, die untere Grenze des therapeutischen Bereichs der Digoxinkonzentration.

Claims

1. Verfahren zur immunochemischen Bestimmung der Konzentration eines Haptens in einer Probe, umfassend die Schritte:

Dispergieren

(A) einer hochmolekularen Verbindung, an welche das Hapten gebunden ist (Reagens A), wobei die hochmolekulare Verbindung ein Molekulargewicht von nicht weniger als 5000 aufweist und eine Antigenität zeigt, indem sie fähig ist, Antikörper zu erzeugen, und in der Lage ist, das Hapten in ihrem Molekül einzuschließen oder eine funktionelle Gruppe besitzt, welche zur chemischen Bindung des Haptens fähig ist,

(B) unlöslicher Trägerteilchen, welche darauf einen Antikörper zu dem Hapten tragen (Reagens B), wobei die unlöslichen Trägerteilchen eine Zelle, eine Mikrokapsel, ein organisches Polymer, ein anorganisches feines Teilchen oder ein kolloidales Teilchen eines Metalls oder einer Metallverbindung sind, und

(C) eine magnetische Substanz enthaltender unlöslicher Trägerteilchen, welche darauf einen Antikörper zu einer antigenen Determinante in der hochmolekularen Verbindung tragen und die von dem Hapten verschieden ist (Reagens C), wobei das die magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerteilchen eine magnetische Substanz in einer Menge von mindestens 5 Gew.-% enthält und wobei die durchschnittliche Teilchengröße entweder des unlöslichen Trägerteilchens oder des die magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens 0,1 bis 10 um beträgt, in der Probe, um eine Reaktion zu vervollständigen;

Anlegen eines Magnetfeldes, um von der Reaktionsmischung unreagiertes Reagens (C) und agglutinierte Teilchen, welche aus dem Reagens (B) und dem Reagens (C) über das Reagens (A) gebildet worden sind, abzutrennen; und

Messen der Menge des in der Reaktionsmischung dispergiert verbleibenden Reagens (B), wodurch das Ausmaß der konkurrierenden Inhibierung bezüglich der Agglutination des Reagens (B) und des Reagens (C) über das Reagens (A) durch die Reaktion zwischen dem Hapten in der Probe und dem Reagens (B) bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Hapten ein niedermolekulares Hormon, ein kleines Peptidhormon oder ein synthetisches Medikament ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das niedermolekulare Hormon ein Schilddrüsenhormon, ein Steroid oder Adrenalin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das kleine Peptidhormon Gastrin, Vasopressin oder Angiotensin ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hochmolekulare Verbindung Rinderserumalbumin, Pferdeferritin, Hemocyanin oder Polylysin ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das organische Polymer ein durch die Polymerisation einer aromatischen Vinylverbindung und/oder eines Methacrylesterderivats erhaltenes ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das eine magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerteilchen die magnetische Substanz in einer Menge von 20 bis 65 Gew.-% enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die durchschnittliche Teilchengröße der in dem eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchen enthaltenden magnetischen Substanz 1 bis 20 nm (10 bis 200 Å) beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das die magnetische Substanz enthaltende unlösliche Trägerteilchen ein Polysaccharid, ein Protein, ein abgeleitetes Protein oder ein synthetisches Polymer ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das synthetische Polymer ein durch die Polymerisation einer aromatischen Vinylverbindung und/oder eines Methacrylesterderivats erhaltenes ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die durchschnittliche Teilchengröße 0,2 bis 3 um beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des unlöslichen Trägerteilchens 0,5 bis 3 um beträgt und die durchschnittliche Teilchengröße des eine magnetische Substanz enthaltenden Trägerteilchens 0,2 bis 2 um beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des unlöslichen Trägerteilchens 1 bis 2,5 um beträgt und die durchschnittliche Teilchengröße des eine magnetische Substanz enthaltenden Trägerteilchens 0,5 bis 1,5 um beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis der Mengen des unlöslichen Trägerteilchens und des eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens, welcher der Probe zuzugeben sind, 1:20 bis 20:1 beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verhältnis 1:4 bis 4:1 beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des unlöslichen Trägerteilchens 1 bis 2,5 um beträgt, die durchschnittliche Teilchengröße des eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens 0,5 bis 1,5 um beträgt und das Verhältnis der Mengen des unlösliche Trägerteilchens und des eine magnetische Substanz enthaltenden unlöslichen Trägerteilchens, welche der Probe zuzugeben sind, 1:(0,8 bis 2) beträgt.