DE69020573T2

DE69020573T2 - Verfahren zur wachstumshemmung von stammzellen.

Info

Publication number: DE69020573T2
Application number: DE69020573T
Authority: DE
Inventors: Debra D. Cambridge Ma 02138 Donaldson; Gerald J. Glasgow G41 3Eh Graham; Ian B. Glasgow G12 Pragnell; Gordon G. Jamaica Plain Ma 02130 Wong
Original assignee: CRC Technology Ltd; Genetics Institute LLC
Current assignee: CRC Technology Ltd; Genetics Institute LLC
Priority date: 1989-09-25
Filing date: 1990-09-25
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2010-09-26
Also published as: DK0494268T4; ES2076378T5; US5674841A; CA2064558C; MX9203438A; EP0494268A1; CA2064558A1; WO1991004274A1; DK0494268T3; DE69020573T3; JPH05502443A; EP0494268B1; EP0494268B2; ES2076378T3; ATE124421T1; DE69020573D1

Description

Verfahren zur Wachstumshemmung von Stammzellen

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Behandlung von Menschen und Tieren, bevor diese durch Chemotherapeutika, Bestrahlung und andere Mittel belastet werden, die im Zellzyklus befindliche Stammzellen irreparabel schädigen, sowie ein Mittel zur Wachstumshemmung von Stammzellen, das sich für diese Behandlung verwenden läßt.

Querverweis auf damit im Zusammenhang stehende Patentanmeldungen

Die vorliegende Anmeldung ist eine CIP (continuation-in-part"- Anmeldung) der am 25. September 1989 eingereichten US-Patentanmeldung

Technischer Hintergrund

Bei der Behandlung von Personen mit Carcinomen umfaßt die herkömmliche Chemotherapie die Anwendung von einem oder mehreren zellzyklusspezifischen, cytotoxischen Mittel(n), die den Nachteil haben, daß sowohl normale als auch Carcinomzellen, die sich in Teilung befinden, abgetötet oder irreparabel geschädigt werden. Diese Chemotherapeutika, wie z.B. Cytosin-Arabinosid (ara-C), werden mit dem Ziel verwendet, die sich teilenden Carcinomzellen zu zerstören oder so zu behindern, daß ein weiteres Wachstum der Carcinomzellen verhindert wird. Eine bisher nicht vermeidbare Wirkung der Chemotherapie ist jedoch die Zerstörung von anderen, sich normal teilenden Zellen, insbesondere von Stammzellen des Blutbildungssystems und der Epithel-Stammzellen, die das Oberflächengewebe von Kopfhaut und Darm-Trakt bilden. Die durch Chemotherapeutika verursachte Schädigung der Stammzellen führt zu den üblichen Nebenwirkungen, wie z.B. Haarausfall, Schädigung des Magen-Darm-Trakts, Hautschädigung, Knochenmarksuppression, Blutarmut, verminderter Funktion des Immunsystems oder der Immunreaktion sowie der sich daraus ergebenden erhöhten Anfälligkeit für Infektionen.
Eine charakteristische Eigenschaft der Stammzellen ist ihre Inaktivität innerhalb des Zellzyklus. Wenn das Knochenmark "angegriffen" wird, wie z.B. durch Behandlung mit Medikamenten, Strahlen, bei schwerem Blutverlust, Entzündungsreaktionen oder Infektionen, reagieren die Stammzellen durch einen Rückkopplungsmechanismus, indem sie in den Zellzyklus eintreten und sich zu reiferen Vorläuferzellen entwickeln, die sich ihrerseits in die benötigten reifen Zellen des Blutbildungs-, Immun- oder Epithelsystems differenzieren.
Da die Blut-Stammzellen für die Entwicklung aller reifen (differenzierten) Zellen der Blutbildungs- und Immunsysteme notwendig sind, ist ihr Überleben für die Wiederherstellung eines voll funktionsfähigen Wirtsabwehrsystems bei mit Chemotherapeutika behandelten Patienten lebensnotwendig. Das Überleben der Epithel-Stammzellen ist ferner für die Reparatur der Epithelauskleidungen von Organen, einschließlich der Haut, notwendig. Da hohe Dosen zellzyklusspezifischer Chemotherapeutika, wie z.B. ara-C, Stammzellen des Blutbildungssystems und der Epithelgewebe wirksam abtöten, leiden mit diesen Mitteln behandelte Patienten unter ernsten Nebenwirkungen und sind häufig von schweren Infektionskrankheiten bedroht.
Eine ähnliche Zerstörung der Stammzellen tritt bei Belastung mit verschiedenen Strahlendosen auf, gleichgültig, ob die Bestrahlung für therapeutische Zwecke verwendet wird oder ob sie das Ergebnis einer zufälligen bzw. unvermeidbaren Strahlenbelastung ist, wie sie z.B. Personen erfahren, die mit Räumungarbeiten beschäftigt sind oder sich am Ort eines nuklearen Unfalls in einem Kraftwerk oder an Bord eines Atom-U-Bootes befinden. Bei strahlenbelasteten Personen werden auch die Blut-Stammzellen zerstört, was zu vollständigem Versagen oder schwerer Schädigung der Blutbildungs- und Immunsysteme führt. Durch Strahlung werden auch sich teilende Epithelzellen abgetötet, wodurch viele Epithelgewebe geschädigt werden.
Bei Patienten, die mit Chemotherapeutika oder Strahlen belastet sind, werden gegenwärtig zur Stimulierung der Entwicklung bestimmter Blutzellfamilien Mittel, wie z.B. Koloniestimulierende Faktoren wie M-CSF, CSF- 1, GM-CSF und dergleichen, verwendet. Man kann aber davon ausgehen, daß diese Mittel das Blutbildungssystem nicht wiederherstellen können, wenn nach einer derartigen Belastung die Stammzellen beim Patienten nicht mehr in ausreichender Menge vorhanden sind.
Auf dem Fachgebiet besteht daher weiterhin Bedarf an anderen therapeutischen Mitteln, die Stammzellen vor den schädlichen Wirkungen von Chemotherapie oder Strahlung schützen können.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit der Deckung dieses auf dem Fachgebiet bestehenden Bedarfs durch Bereitstellung eines Arzneimittels, das eine wirksame Menge von Polypeptiden umfaßt, die eine Hemmwirkung auf Stammzellen ausüben, zur Behandlung von Personen, bevor diese mit einem Mittel behandelt werden, das sich teilende oder im Zellzyklus befindliche Stammzellen abtöten kann. Die durch dieses Verfahren geschützten Stammzellen können Blut-Stammzellen sein, die sich normalerweise im Knochenmark befinden und teilen. In einer anderen Ausführungsform kann es sich dabei um Epithel-Stammzellen handeln, die sich beispielsweise in den Eingeweiden, der Kopfhaut oder anderen Körperbereichen befinden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann wünschenswerterweise bei Menschen angewendet werden, obwohl das Verfahren auch die Behandlung von Tieren umfaßt.
Das in diesem Verfahren verwendete Mittel zur Hemmung von Stammzellen umfaßt eine wirksame Menge eines Polypeptids oder eines Proteinfragments, das in der vorliegenden Beschreibung als Stammzellen-hemmender Faktor (SCIF) bezeichnet und nachstehend genauer beschrieben ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Schutz und zur Wiederherstellung der Blutbildungs-, Knochenmarks- und Immunsysteme eines chemotherapeutisch behandelten Patienten bereit, das die Verabreichung einer wirksamen SCIF-Menge an den Patienten umfaßt. SCIF kann vor der Chemotherapie verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann SCIF während der Chemotherapie verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die SCIF- Verabreichung in einem bestimmten Zeitraum nach der chemotherapeutischen Behandlung. Nach der Chemotherapie kann der Patient mit anderen therapeutischen Mitteln behandelt werden, wie z.B. mit Koloniestimulierenden Faktoren oder anderen Lymphokinen, die die Stammzellen zur Teilung und ferner die Produktion reiferer Zellen der Blut- Zellfamilien anregen.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur unterstützenden Behandlung von beliebigen Carcinomen, einschließlich der durch feste Tumoren gekennzeichneten Carcinomarten, wobei Krebspatienten eine wirksame SCIF-Menge zum Schutz der Blut- Stammzellen des Knochenmarkes verabreicht wird, wodurch höhere Chemotherapeutika- oder Bestrahlungsdosen zur Carcinombehandlung eingesetzt werden können.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Leukämie und umfaßt die Behandlung von Knochenmarkszellen, die proliferierende Leukämiezellen enthalten, mit einer wirksamen SCIF-Menge zur Hemmung der Proliferation normaler Stammzellen und die Behandlung des Knochenmarks mit einem cytotoxischen Mittel zur Zerstörung von Leukämiezellen. Dieses Verfahren kann durch eine Nachbehandlung des Knochenmarks mit anderen Mitteln, die seine Proliferation stimulieren, z.B. Lymphokinen, verbessert werden. Dieses Verfahren kann in vivo durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Verfahren ex vivo durchgeführt werden, wobei die Leukämiezellen durch das Chemotherapeutikum aus dem entnommenen Knochenmark entfernt werden. Das Mark kann danach dem Patienten erneut injiziert werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Behandlung von Patienten, die an einer durch proliferierende Stammzellen verursachten Krankheit leiden. Derartige Krankheiten, wie z.B. Schuppenflechte, können behandelt werden, indem dem Patienten eine wirksame SCIF-Menge zur teilweisen oder vollständigen Hemmung der Proliferation der betreffenden Stammzellen verabreicht wird.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende genaue Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung deutlich.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum reversiblen Schutz von Stammzellen vor Schäden durch cytotoxische Mittel bereit, die in Teilung befindliche Stammzellen abtöten können. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Menge des Stammzellen-Hemmfaktors (SCIF) an einen Patienten, bevor dieser mit einem cytotoxischen Mittel behandelt wird. Zur Erhöhung der Schutzwirkung auf Stammzellen kann das Verfahren auch eine Verlängerung der SCIF-Behandlung über den gesamten Zeitraum der cytotoxischen Behandlung hinweg umfassen.
SCIF kann die Teilung verschiedener Stammzellen im menschlichen Körper reversibel hemmen. SCIF läßt sich insbesondere für die vorübergehende Hemmung sich teilender Blut-Stammzellen einsetzen. SCIF hemmt außerdem im Zellzyklus befindliche oder sich teilende Epithel-Stammzellen, die im ganzen Körper zu finden sind. Andere Stammzellpopulationen, auf die SCIF eine reversible Hemmwirkung ausüben kann, umfassen männliche und weibliche Keimzellen. SCIF kann daher zum Schutz männlicher oder weiblicher Patienten vor Keimzell-Aplasie eingesetzt werden, die nach Chemotherapie auftreten kann. Da Chemotherapeutika häufig Haarausfall und Schleimhautentzündungen verursachen, kann SCIF außerdem verwendet werden, um Haarfollikel und Epithel-Stammzellen der Mundhöhle bzw. des Verdauungstraktes vor nachteiligen, durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte Nebenwirkungen reversibel zu schützen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher zur Linderung von unerwünschten Nebenwirkungen der Chemotherapie auf die Blutbildungs-, Knochenmarks- und Immunsysteme des Patienten eingesetzt werden, indem Stammzellen vor Schäden geschützt werden, die durch Chemotherapeutika verursacht werden, wie z.B. normalerweise zur Zerstörung von Carcinomzellen verwendete cytotoxische Mittel oder Bestrahlungsdosen. Eine derartige Anwendung von SCIF kann auch dem Schutz der Epithel-Stammzellen während der Chemotherapie dienen. SCIF kann dem Patienten in einer Dosis verabreicht werden, die zur Hemmung der Stammzellteilung über einen Zeitraum ausreicht, der für die Wirkung des Chemotherapeutikums hinreichend lang ist. Nachdem das chemotherapeutische Mittel seine Funktion erfüllt hat, können die durch SCIF gehemmten Stammzellen ohne weitere Behandlung wieder in den Zustand der Zellteilung zurückkehren. Falls eine erhöhte Reversion der Blut- Stammzellen erwünscht ist, kann der Patient Dosen blutbildender Wachstumsfaktoren oder Cytokine erhalten, die zur Stimulierung des Wachstums und der Entwicklung von Blutzellen verwendet werden.
Die Mehrzahl der zur Krebs-Chemotherapie verwendeten Chemotherapeutika besitzt eine relativ kurze in vivo-Halbwertszeit, die meistens weniger als 24 Stunden beträgt. Gemäß der vorliegenden Erfindung bleibt die Hemmwirkung von SCIF zumindest für den größten Teil des Zeitraums erhalten, in dem das chemotherapeutische Mittel in vivo wirkt. Bei cytotoxischen Mitteln mit längeren Halbwertzeiten (z.B. länger als 24 Stunden) wird auch eine längere Behandlung mit SCIF erforderlich sein. Die normalen physiologischen Mechanismen im Patienten begrenzen wahrscheinlich die effektive Dauer der SCIF-Aktivität auf Stammzellen, die sich im Zellzyklus befinden.
Das Verfahren läßt sich auch verwenden, um Patienten gegen andere Strahlenbelastungen zu schützen, die ihre Knochenmarkszellen schädigen. Man kann einer Person SCIF verabreichen, wenn unbeabsichtigte oder durch einen Unfall bedingte Belastungen mit gefährlichen Strahlenwerten zu erwarten sind. Beispielsweise können Personen, die Gefahr laufen, einer kurzzeitigen Strahlenbelastung ausgesetzt zu sein, wenn sie Gebiete mit radioaktivem Niederschlag betreten oder Kernkraftwerke bzw. Atom-U-Boote und dergleichen nach dem Austritt gefährlicher Strahlung untersuchen und reinigen, mit diesem Verfahren behandelt werden, um eine bei der Strahlung auftretende Repiikationsteilung der Stammzellen zu hemmen. Sowohl während als auch vor der Strahlenbelastung kann eine SCIF-Verabreichung erhöhten Schutz bieten.
Im vorliegenden Verfahren kann SCIF außerdem als unterstützende Behandlung zur chemotherapeutischen Krebsbehandlung verwendet werden. Bei der Bestimmung der Strahlendosis oder der Dosis des cytotxischen Medikaments, die einem Patienten verabreicht werden kann, stellt das Knochenmark den limitierenden Faktor dar. SCIF kann daher zum Schutz der Knochenmarks-Blutzellen vor Strahlung oder Chemotherapeutika verwendet werden. Dadurch können größere Strahlen- oder Medikamentendosen zur Behandlung eines normalerweise mit Bestrahlung oder Chemotherapie behandelbaren Carcinoms angewendet werden. Da die toxische Wirkung der cytotoxischen Medikamente auf das Knochenmark auch ihre Dosierung während der Chemotherapie einschränkt, können dem Patienten bei Verabreichung von SCIF die Medikamente wahrscheinlich in höheren Dosen gegeben werden, ohne daß die schweren Nebenwirkungen auftreten, die normalerweise derart erhöhte Dosierungen begleiten würden.
Das Verfahren kann auch zur Behandlung fester Tumoren verwendet werden, indem während der chemotherapeutischen Behandlung die Teilung von Epithel-Stammzellen gehemmt wird.
SCIF kann auch in Verfahren zur Herstellung von autologem Knochenmark, das transplantiert werden soll, eingesetzt werden. Das Knochenmark kann ex vivo mit einer wirksamen SCIF-Menge zur Hemmung der Stammzellteilung behandelt und danach durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Chemotherapeutikums oder Bestrahlung von Krebszellen befreit werden. Das so behandelte Knochenmark kann erneut in den autologen Spender injiziert werden. Gegebenenfalls kann der Patient dann mit einem bekannten Mittel zur Stimulierung der Blutbildung behandelt werden.
SCIF kann auch im erfindungsgemäßen Verfahren in der Leukämiebehandlung unterstützend eingesetzt werden. Wenn beispielsweise die Leukämiezellen auf SCIF nicht reagieren, können die Knochenmarks- Leukämiezellen ex vivo mit SCIF behandelt werden. Die Proliferation normaler Stammzellen wird durch die Verabreichung von SCIF verhindert. Während der Behandlungszeit der proliferierenden Leukämiezellen mit einem cytotoxischen Mittel kann daher eine bestimmte Menge normaler Stammzellen vor Schädigung geschützt werden. Während der Behandlung mit Medikamenten oder Bestrahlung kann außerdem ein stimulierendes Cytokin, wie z.B. IL-3 oder GM-CSF, zur Induzierung des Zellzyklus in den Leukämiezellen verabreicht werden, während die normalen Stammzellen mit SCIF geschützt werden.
Zur ex vivo-Verwendung kann das Knochenmark mit SCIF behandelt werden, um die Teilung von Stammzellen zu hemmen. Die Stammzellen werden dadurch vor Zerstörung durch eine anschließende Chemotherapie geschützt, die am Knochenmark oder am Entstehungsort eines anderen Carcinoms ansetzt und auf die Zerstörung von im Zellzyklus befindlichen Zellen, z.B. Leukämiezellen, abzielt. Das resultierende gereinigte Knochenmark kann erneut dem Patienten injiziert werden. Im Körper des Patienten beginnen sich die Stammzellen normal zu teilen. Zur Verbesserung der Teilung von Blut- Stammzellen können auch die vorstehend erwähnten Lymphokine und Cytokine verabreicht werden. Das gleiche Verfahren kann durch Verabreichung von SCIF an den Patienten in vivo durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Behandlung von Krankheiten angewendet werden, die mit hyperproliferierenden Stammzellen im Zusammenhang stehen. Die Schuppenflechte ist beispielsweise eine Krankheit, die durch hyperproliferierende Epithelzellen der Haut verursacht und manchmal mit cytotoxischen Medikamenten behandelt wird. Die in situ- Dysplasie des Cervicalepithels hat ähnliche Ursachen und entwickelt sich zu Gebärmutterhalskrebs, wenn sie nicht behandelt wird. Beide Übergangszustände können mit SCIF prophylaktisch behandelt werden. Andere präneoplastische Schädigungen, an denen die Stammzellproliferation beteiligt ist, können wahrscheinlich auch mit SCIF-Mengen behandelt werden, die die Stammzellproliferation vollständig oder teilweise hemmen. Für diese Anwendungen können sowohl SCIF enthaltende topische oder transcutane Mittel als auch andere parenterale Mittel zur Verabreichung von SCIF eingesetzt werden.
Die SCIF-Polypeptide können auch in einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Mit Hilfe von Standardverfahren können gegen SCIF gerichtete monoclonale oder polyclonale Antikörper entwickelt werden. Die Antikörper oder die SCIF-Polypeptide können mit nachweisbaren Markierungen versehen werden, von denen auf dem Fachgebiet viele Typen bekannt sind. Für diagnostische Zwecke können die markierten SCIF- Polypeptide oder die gegen SCIF gerichteten Antikörper als Stammzellmarker zur Identifizierung und Isolierung von Stammzellen dem Patienten direkt verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform können die markierten Polypeptide oder Antikörper bei Knochenmarkspräparaten zur Identifizierung von Stammzellen ex vivo eingesetzt und somit vor den Reinigungsverfahren entfernt werden. In gleicher Weise können markierte Polypeptide oder Antikörper zur Isolierung und Identifizierung von Epithel- Stammzellen oder anderen Stammzellen eingesetzt werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben entdeckt, daß das in den folgenden Verfahren und Beispielen eingesetzte SCIF ein Maus-Protein ist, das zu bereits identifizierten Proteinfaktoren homolog ist. K. Obaru et al., I. Biochem., 99 (1986), 885-894, haben die Aminosäure- und DNA-Sequenz eines Gens bestimmt, von dem festgestellt wurde, daß es durch tumorfördernde Mittel, wie z.B. Phorbolester in menschlichen Tonsillenlymphocyten, induziert werden kann. Die Autoren machten die Voraussage, daß das Gen ein Protein produziert, daß als Signal zur T-Zell-Proliferation dienen kann. Vor kurzem berichteten P. F. Zipfel et al., J. Immunol., 142 (1989), 1582-1590, daß das gleiche Protein durch eine mitogene Aktivierung menschlicher T-Zellen produziert wird, und stellten die Hypothese auf, daß das Protein als Lymphokin oder Cytokin wirken kann.
Beim vorliegenden Verfahren wird daher für die Behandlung von Menschen wünschenswerterweise der menschliche SCIF-Faktor eingesetzt. Dieser SCIF-Faktor kann das menschliche Polypeptid sein, das von Sequenzen codiert wird, die dem Stand der Technik entsprechen. Die SCIF-Sequenz von Obaru/Zipfel ist nachstehend in Tabelle I gezeigt. In einer anderen ausführungsform kann der Faktor wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen werden. Das menschliche SCIF-Analog wurde aus einer menschlichen T-Zellinie unter Verwendung von Oligodesoxyribonucleotiden gewonnen, die auf der vorstehend erwähnten, von Obaru et al. veröffentlichten LD-78-Sequenz beruhen. Das menschliche SCIF-Polypeptid zeigt im Menschen eine Wirksamkeit, die mit der Wirksamkeit des Maus- Proteins in den nachstehend beschriebenen SCIF-Untersuchungen identisch ist.
Der menschliche SCIF-Clon in Beispiel 1 ist weitgehend sequenziert worden. Es ist festgestellt worden, daß sich der Clon sowohl in der Nucleotid- als auch in der Aminosäuresequenz von der veröffentlichten Sequenz unterscheidet, obwohl er die erforderliche Wirksamkeit zeigt. Die alternativen DNA- und Aminosäuresequenzen von menschlichem SCIF sind nachstehend in Tabelle II aufgeführt. Die Sequenz in Klammern ist bisher noch nicht bestimmt worden. Die Sequenz, die in Tabelle II in Klammern gezeigt ist, stammt aus der von Obaru et al. veröffentlichten LD-78-Sequenz. Sie kann, muß aber nicht, mit der Sequenz des menschlichen SCIF-Clons identisch sein. Die Nucleotidsequenz- Unterschiede zwischen der clonierten SCIF-Sequenz von Beispiel 1 und der veröffentlichten Sequenz von Obaru sind in Tabelle II durch Sternchen gezeigt, die sich oberhalb der modifizierten oder zusätzlichen Aminosäuren bzw. unterhalb der modifizierten Nucleotide befinden. Striche zeigen nichtcodierende Sequenzen, die in der Sequenz von Beispiel 1 nicht vorkommen. Die beiden SCIF-Sequenzen unterscheiden sich in 18 Nucleotiden und 4 Aminosäuren. Im Gegensatz zur veröffentlichten Sequenz umfaßt der menschliche Clon außerdem 3 zusätzliche Nucleotide und eine zusätzliche Aminosäure.
Als SCIF-Molekül lassen sich in der vorliegenden Erfindung jedoch auch andere Proteine verwenden, die von anderen, mit den Sequenzen des Standes der Technik nicht identischen DNA-Sequenzen codiert werden. Solche DNA- Sequenzen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), (1982), Seiten 387-389, Cold Spring Harbor Laboratory] mit den menschlichen SCIF-DNA-Sequenzen (oder der Sequenz von Obaru et al.) hybridisieren können und bei der Expression Polypeptide oder Proteine codieren, welche die in der vorliegenden Erfindung beschriebene SCIF- Wirksamkeit zeigen können. Ein Beispiel für stringente Bedingungen ist die Hybridisierung in 4 x SSC bei 65ºC, der ein einstündiges Waschen in 0,1 x SSC bei 65ºC folgt. Ein Beispiel für stringente Bedingungen in einer anderen Ausführungsform ist die Hybridisierung in 50% Formamid, 4 x SSC bei 42ºC.
Weitere menschliche SCIF-Proteine oder -Polypeptide können von anderen DNA-Sequenzen codiert werden, die mit den menschlichen SCIF-Sequenzen (der Sequenz von Obaru et al. sowie der aus dem Clon von Beispiel 1 gewonnenen Sequenz) unter nichtstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und bei der Expression Peptide mit biologischen SCIF-Eigenschaften codieren. Beispiele für nichtstringente Bedingungen stellen Hybridisierungen in 4 x SSC bei 50ºC oder in 30 - 40% Formamid bei 42ºC dar. Das vor kurzem als menschliches MIP-beta bestimmte Molekül läßt sich z.B. im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden, wenn es auf Stammzellen eine durch das nachstehend angegebene Testverfahren definierte Hemmwirkung zeigen kann.
In ähnlicher Weise können weitere SCIF-Polypeptide mit Hilfe von Aminosäuresequenzen charakterisiert werden, die sich von der Sequenz von Obaru et al. oder der aus dem Clon von Beispiel 1 gewonnenen Sequenz aufgrund von Allelvariationen (natürlich auftretende Basenveränderungen in der Population einer Art, die zu einer Aminosäureänderung oder auch nicht führen kann) unterscheiden. In der vorliegenden Erfindung dürften sich auch SCIF-Polypeptide verwenden lassen, die von DNA-Sequenzen codiert werden, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder aufgrund von Allelvariationen Unterschiede in der Codonsequenz aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Variationen in der SCIF-DNA-Sequenz, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifizierungen zur Erhöhung der Wirksamkeit, der Halbwertszeit oder der Produktion der durch sie codierten Polypeptide verursacht werden. Diese Sequenzen dürften sich im offenbarten Verfahren verwenden lassen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann auch der Maus-Faktor (auch als Makrophagen-Entzündungsprotein 1-alpha oder MIP- 1 alpha bekannt) eingesetzt werden. Das Mausprotein MIP-1 beta besitzt keine Hemmwirkung auf Stammzellen. Über die Sequenz des hier als Maus-SCIF bestimmten Moleküls wird in Davatelis et al., J. Exp. Med., 167 (1988), 1939-1944, berichtet. Der Artikel wird durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. In diesem Artikel wurde keine Hemmfunktion des Moleküls auf Stammzellen festgestellt. Unter der Voraussetzung, daß er nicht die Erzeugung von Antikörpern durch das menschliche Immunsystem auslöst, kann auch der Maus-Faktor in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.
Selbstverständlich können auch SCIF-Analoge von anderen Arten für die verschiedensten tiermedizinischen Anwendungen der vorstehend beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. Tabelle I Tabelle II
Trotz der umfangreichen Untersuchungen, die Wissenschaftler mit diesem Faktor durchgeführt haben, ist die Stammzellen-Hemmfunktion des in den vorstehend erwähnten Artikeln identifizierten LD78- oder Maus-MIP-alpha- Proteins bisher noch nicht als eine Funktion dieses Proteins identifiziert worden. Vgl. beispielsweise Obaru et al. und Zipfel et al., vorstehend.
Der Stammzellen-Hemmfaktor wirkt auf im Zellzyklus befindliche Stammzellen dergestalt, daß diese in einen reversiblen "ruhenden" Zustand versetzt werden und sich nicht teilen. Wenn die Stammzellen im Anfangsstadium auf diese Weise behandelt werden, werden sie durch anschließende Chemotherapie oder Bestrahlung nicht abgetötet, da sich die Zellen nicht teilen. Nach chemotherapeutischer Behandlung oder Bestrahlung können die Stammzellen daher durch Abbruch der SCIF-Verabreichung "erneut aktiviert" werden, wobei sie sich teilende Vorläuferzellen erzeugen.
Eine zusätzliche Möglichkeit, ruhende Stammzellen zur Teilung anzuregen, kann auch darin bestehen, dem Patienten nach der Behandlung mit Chemotherapie oder Bestrahlung andere koloniestimulierende Faktoren, z.B. M- CSF, CSF-1, GM-CSF, G-CSF, Meg-CSF, oder andere Cytokine, wie z.B. IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11 und Erythropoietin, zu verabreichen.
SCIF-Polypeptide oder wirksame Fragmente davon mit hemmender Wirkung auf Stammzellen können mit Hilfe bekannter herkömmlicher chemischer Syntheseverfahren oder DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden, wobei die vorstehend in Tabelle I oder Tabelle II gezeigten Aminosäure- und DNA-Sequenzen verwendet werden. SCIF-Polypeptide können beispielsweise durch Züchtung einer geeigneten Zelle oder Zellinie hergestellt werden, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, welche bei der Expression unter der kontrolle bekannter Regulationssequenzen ein SCIF-Polypeptid oder ein aktives Fragment davon codiert. Das resultierende Protein kann mit Hilfe üblicher Verfahren aus den Zellen, Zellysaten oder dem Medium isoliert werden. Geeignete Verfahren für die Herstellung von rekombinanten SCIF- Polypeptiden sind beispielsweise in T. Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben.
Dem Fachmann sind auch chemische Syntheseverfahren zur Herstellung von SCIF-Polypeptiden bekannt, die sich in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen. Vgl. beispielsweise Merrifield, I. A. C. S., 85 (1963), 2149-2154, oder ''Peptide Synthesis" von Bodanszky et al., zweite Ausgabe (1976), John Wiley and Sons.
Die rekombinant oder synthetisch hergestellten SCIF-Polypeptidsequenzen können aufgrund von Primär-, Sekundär- oder Tertiärstrukturen und Konformationseigenschaften, die sie mit SCIF-Polypeptiden gemeinsam haben, dieselbe biologische Eigenschaft zur Hemmung der Stammzellteilung wie der vorstehend in Tabelle I oder II bestimmte menschliche Faktor besitzen.
Peptide oder DNA-Sequenzen, die SCIF oder aktive Fragmente davon codieren, können auch modifiziert werden. Man kann davon ausgehen, daß sich die modifizierten SCIF-Peptide oder Fragmente davon im erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen, wenn sie die gewünschte biologische Aktivität zur Hemmung der Stammzellen besitzen. Zu den an den SCIF-Sequenzen vorgenommenen Modifizierungen, die von Interesse sind, gehören Austausch, Insertion oder Deletion eines ausgewählten Aminosäurerestes in den codierenden Sequenzen. Mutageneseverfahren für Austausch, lnsertion oder Deletion sind dem Fachmann wohl bekannt [vgl. beispielsweise US-Patent 4,518,584].
Spezielle Sequenzmutationen des SCIF-Polypeptids umfassen die Insertion einer mit Asparagin verbundenen Glycosylierungsstelle in die Sequenz, wobei die Glycosylierungsstelle entweder Asp-X-Thr oder Asp-X-Ser bedeutet und X eine beliebige Aminosäure sein kann, oder eine Sequenzmodifizierung an einer beliebigen Stelle des Moleküls durch Hinzufügen von O-gebundenen Kohlehydraten.
Vom Fachmann können ohne weiteres andere Analoge oder Derivate der SCIF-Sequenz hergestellt werden, von denen erwartet werden kann, daß sie insgesamt oder teilweise die SCIF-Wirksamkeit behalten und sich deshalb in den erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lassen.
Derzeit ist die Herstellung von SCIF mit Hilfe von DNA- Rekombinationsverfahren bevorzugt. Menschliche cDNA kann isoliert und in geeignete Zellen oder Zellinien so eingebaut werden, daß sie unter der Kontrolle geeigneter Regulationssequenzen stehen. Geeignete Wirtszellen zur Proteinproduktion können Säugerzellen sein, wie z.B. Ovarialzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) oder 3T3-Zellen. Die Auswahl geeigneter Säuger- Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifizierung, Untersuchung sowie Herstellung und Reinigung des Produkts sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. beispielsweise Gething und Sambrook Nature 293 (1981), 620-625. Andere Ausführungsformen finden sich bei Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7) (1985), 1750-1759, oder Howley et al., US-Patent 4,419,446. Andere geeignete Säuger-Zellinien sind die Affen-Zellinie COS-1 und die CV-1- Zellinie.
Als Wirtszellen, die sich zur SCIF-Produktion eignen und sich daher in der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, sind bakterielle Zellen ähnlich nützlich. In der Biotechnologie sind beispielsweise die verschiedenen E. coli- Stämme (z.B. HB101, MC1061 und die in den folgenden Beispielen verwendeten Stämme) als Wirtszellen wohl bekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas und ähnlichen Mikroorganismen können im vorliegenden Verfahren auch eingesetzt werden.
Dem Fachmann sind viele Hefestämme bekannt, die als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verfügbar sind. Falls gewünscht, können im erfindungsgemäßen Verfahren außerdem Insektenzellen als Wirtszellen verwendet werden. Vgl. beispielsweise Miller et al., Genetic Engineering, 8 (Plenum Press 1986), 277-298, und darin angegebene Literaturstellen.
In den erfindungsgemäßen Verfahren zum Schutz der Stammzellen eines Patienten vor Zerstörung durch ein Mittel, das sich teilende Stammzellen abtöten kann, können auch ein oder mehrere SCLF-Peptidfragmente verwendet werden, die die Fähigkeit des vollständigen SCIF-Moleküls, eine Hemmwirkung auf Stammzellen auszuüben, behalten haben.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zum Schutz von Stammzellen kann eine therapeutisch wirksame Menge des SCIF-Proteins oder ein therapeutisch wirksames Fragment davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel verwendet werden. Falls gewünscht, kann eine systemische Verabreichung des SCIF-Mittels in parenteraler Form erfolgen. Bei klinischen Anwendungen kann es wünschenswert sein, SCIF gezielt dem blutbildenden Gewebe, z. B. Knochenmark, zuzuführen. Diese zielgerichtete SCIF-Zuführung kann durch Injektion von SCIF erreicht werden, normalerweise durch Infusion oder intravenöse Injektion. In einer anderen Ausführungsform kann SCIF durch Veränderungen der pharmazeutischen Formulierung des Medikaments zielgerichtet zugeführt werden, z.B. indem SCIF an Mittel gebunden wird, die nachweislich auf das Knochenmark gerichtet sind. Diese Präparate können intravenös verabreicht werden. Auf Wunsch kann das Mittel auch subcutan verabreicht werden.
Bei systemischer Verabreichung stellt das therapeutische Mittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eine zur parenteralen Verabreichung geeignete wäßrige Lösung dar, die keine fiebererzeugenden Stoffe enthält. Die Herstellung einer solchen pharmazeutisch verträglichen Proteinlösung mit einem entsprechenden pH-Wert, die u.a. isotonisch und stabil ist, gehört zum allgemeinen Fachwissen. Im Verfahren zur Behandlung von hyperproliferierenden Stammzellen kann das SCIF enthaltende Mittel topisch oder transcutan mit einem Pflaster verabreicht werden, wodurch seine Wirkung auf den Bereich der Hyperproliferation lokalisiert wird.
Das Verfahren zur Behandlung einer Person, bevor diese mit cytotoxischen Mitteln behandelt wird, oder zur Behandlung hyperproliferierender Stammzellen, umfaßt ein Dosierungsschema, das durch den behandelnden Arzt ermittelt wird. Dabei werden verschiedene Faktoren in Erwägung gezogen, die die Medikamentenwirkung verändern, z.B. körperliche Verfassung, Körpergewicht, Geschlecht oder Ernährung des Patienten, die Schwere einer Infektion, Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte die tägliche Dosis im Bereich von 1-1000 Mikrogramm SCIF- Protein oder SCIF-Fragment pro Kilogramm Körpergewicht liegen.
Nach Behandlung des Patienten mit einem cytotoxischen Mittel oder Bestrahlung können ihm im Rahmen des erfindungsgemäßen Therapieverfahrens auch ein oder mehrere Lymphokine, koloniestimulierende Faktoren oder andere Cytokine, Haemotopoitine, Interleukine oder Wachstumsfaktoren verabreicht werden, um eine allgemeine Stimulierung des Wachstums und der Teilung der durch die vorangegangene SCIF-Behandlung gehemmten Stammzellen zu erreichen. Diese therapeutischen Mittel, die die Blutbildung fördern, umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF, M-CSF, CSF-1, GM-CSF, G-CSF oder Erythropoietin. Die Dosen dieser Mittel können im gleichen Bereich wie die vorstehend angeführten SCIF-Dosen liegen. Die Dosierungen werden in ähnlicher Weise so eingestellt, daß Veränderungen ausgeglichen werden, die sich aus dem physischen Zustand des Patienten bzw. aus der Menge oder Art des Chemotherapeutikums oder der Bestrahlung, mit dem/der die Person behandelt wurde, ergeben. Mit üblichen Verfahren kann die Aufhebung der Stammzellen-Hemmung kontrolliert werden, die durch SCIF- Verabreichung an den behandelten Patienten verursacht wurde.
Bei der Leukämiebehandlung kann es vorteilhaft sein, während der Behandlung mit cytotoxischen Medikamenten oder Bestrahlung gleichzeitig SCIF zur Hemmung des normalen Stammzellzyklus und ein Stimulierungsmittel für das Wachstum von Leukämiezellen, wie z.B. IL-3 oder GM-CSF, zu verabreichen. Mit diesem Verfahren sollte es möglich sein, die größten Unterschiede zwischen normalen und Leukämiezellen hinsichtlich ihres Zellzyklus-Zustandes zu erzielen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Verwendung von Maus-SCIF in einem in vitro-Stammzellentest. Diese Beispiele dienen der Erläuterung und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.

Beispiel 1 - Gewinnung einer menschlichen SCIF-cDNA

Aus der menschlichen T-Zellinie C10-MJ2 isolierte polyadenylierte RNA wurde als Matritze zur Synthese einer komplementären einzelsträngigen DNA mit Hilfe von Standardverfahren verwendet [vgl. Maniatis et al., vorstehend]. Die Gegenwart von menschliches SCIF-Protein codierenden cDNAS wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter stringenten Bedingungen [R. K. Saiki et al., Science 230 (1985), 1350] nachgewiesen, wobei die folgenden, auf der Sequenz von Tabelle I beruhenden Oligodesoxyribonucleotide verwendet wurden:
5'-AGCTCGAGAT CATGCAGGTC TCCACTG-3'
5'-GAATTCCC TCAGGCACTC AGCTCCA-3'.
Doppelsträngige SCIF-DNA, die als PCR-Produkt erhalten und mit (alpha ³²P)dCTP durch das Zufallsprimer-Verfahren markiert worden war, wurde zum Nachweis von SCIF-cDNAS in einer zuvor konstruierten C10-MJ2-cDNA- Expressionsgenbank verwendet [J. F. Moreau et al., Nature. 336 (1988), 690].
Mit SCIF-cDNAs voller Länge und richtiger Insertions-Orientierung wurden COS-Zellen transfiziert. Durch diese Zellen konditioniertes Medium wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Testverfahren untersucht. Die Sequenzierung ausgewählter Clone, die als pXMT2.A1 bzw. pXMT2.A3 bis pXMT2.A9 bezeichnet wurden, ist derzeit noch in Arbeit.
Die menschliche SCIF-Sequenz von Tabelle II unterscheidet sich wesentlich von der in Tabelle I gezeigten LD 78-Sequenz von Obaru et al., von der die Oligodesoxyribonucleotide abgeleitet wurden. Sie unterscheiden sich in 18 Basen, 4 Aminosäuren, 3 zusätzlichen Basen und 1 zusätzlichen Aminosäure.

Beispiel 2 - In-vitro-Stammzellentest

Zum Nachweis der Stammzellen in vitro wurden 10&sup4; Maus- Knochenmarkszellen aus der Maus-Makrophagen-Zellinie J774.2 [P. Ralph et al., I. Immunol., 114 (1975), 898-905] in 4ml alpha-modifiziertem Minimalgrundmedium (MEM), enthaltend 25% foetales Kälber- oder Pferdeserum und 0,3% Agar, in einer Petrischale mit 6 cm Durchmesser auf eine Schicht des gleichen Mediums aufgebracht, das 0,6% Agar, 10% durch L929-Zellen konditioniertes Medium (L929 CM, eine Quelle für den Wachstumsfaktor CSF- 1) und 10% durch AFl-19T-Zellen konditioniertes Medium (AFl-19T CM, eine Quelle für die Wachstumsfaktoren GM-CSF und andere nichtcharakterisierte Stammzellen-Wachstumsfaktoren) enthielt. Die Kulturen wurden 11 Tage bei 37ºC in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre aus 10% CO&sub2;, 5% O&sub2; und 85% N&sub2; bebrütet. Die Kolonien können mit INT [2-(p- Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchloridhydrat] über Nacht angefärbt werden.
Nach der Durchführung von Vorversuchen unter Verwendung von Cytosinarabinosid wurde ein Koloniedurchmesser von 2 mm als brauchbarer Grenzwert ausgewahlt, obwohl einige der im CFU-A-Test vorhandenen Kolonien einen Durchmesser von weniger als 2 mm aufwiesen. Es wurde festgestellt, daß in den einzelnen Petrischalen Kolonien mit einem Durchmesser < 2 mm hauptsächlich von im Zellzyklus befindlichen Zellen abstammten, während Kolonien mit einem Durchmesser > 2 mm von kaum proliferierenden Zellen abstammten. Bei diesen Tests wurden nur Kolonien mit Durchmessern > 2 mm ausgewertet.
Der auch in I. B. Pragnell et al., Blood. 72 (1988), 196-201, beschriebene Test zeigt, daß eine SCIF-Behandlung bei reiferen Vorläuferzellen keine Auswirkung hat, während Zellen, die sich im Zellzyklus befinden, nach SCIF- Behandlung gegen die Wirkung von Cytosinarabinosid resistent werden. Nach Waschen der behandelten Stammzellen mit gepufferter Kochsalzlösung, um das cytotoxische Mittel und SCIF zu entfernen, proliferieren die überlebenden Stammzellen in Kultur normal, wie nachstehend erläutert.

Beispiel 3 - Beweis der Wirkung von SCIF auf CFU-A

Knochenmarkszellen wurden jeweils in zwei Röhrchen inkubiert, die 5 x 10&sup6; Zellen in 1 ml Fischer-Medium enthielten, das mit 20% Pferdeserum ergänzt worden war. Jedem Röhrchen wurde SCIF oder alpha-MEM zugesetzt, während Kontrollröhrchen Fischer-Medium zugegeben wurde. Die Gemische wurden 5 Stunden bei 37ºC inkubiert (Hemmtests). In ein Röhrchen wurden in den letzten 60 Minuten der Inkubation 10&supmin;³ M Cytosinarabinosid gegeben, während in das andere Röhrchen Medium in gleicher Menge gegeben wurde. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, bevor sie im vorstehend beschriebenen CFU-A- Test untersuchten wurden. Es wurde festgestellt, daß SCIF die Zahl der im Zellzyklus befindlichen Stammzellen von durchschnittlich mehr als 30% auf durchschnittlich weniger als 10% vermindert. Im Gegensatz zu den mit dem Hemmstoff behandelten Stammzellen wurden die unbehandelten Zellen durch die Behandlung mit dem cytotoxischen Mittel abgetötet.
Bei in vivo-Untersuchung im vorstehend erwähnten, von Pragnell et al. beschriebenen CFU-S-Test unter Verwendung von ara-C werden auch multipotente Stammzellen durch SCIF-Reinpräparate aus dem Zellzyklus reversibel heraus gelöst.
Das gereinigte und sequenzierte erfindungsgemäße SCIF-Polypeptid ist ein Cytokin, das speziell den Anteil der Blut-Stammzellen vermindern kann, in denen DNA-Synthese stattfindet, wodurch die Zellen vor Cytosinarabinosid geschützt werden, einem zellzyklusspezifischen cytotoxischen Medikament. Im Gegensatz dazu beeinflußt SCIF die Proliferation reiferer Vorläuferzellen nicht und scheint daher ein spezifischer Regulator des Stammzellkompartiments zu sein. SCIF ist in einem Konzentrationsbereich von 200-500 pM wirksam, wie in direkten CFU-A-Zugabetests gemessen.

Beispiel 4 - Expression von rekombinantem menschlichem SCIF-Protein

Zur Herstellung von SCIF wird die das Protein codierende cDNA mit Hilfe von molekularbiologischen Standardverfahren in einen geeigneten Expressionsvektor übertragen, wobei zahlreiche Vektortypen zur Expression in Säuger-, Insekten-, Hefe-, Pilz- und Bakterienzellen auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. beispielsweise Y. C. Yang et al., Cell, 47 (1986), 3-10. Ein solcher Vektor ist der Expressionsvektor pXM für COS-Zellen, enthaltend das ISV40-Enhancerelement, einen späten Hauptpromotor vom Adenovirus, eine DHFR codierende Sequenz, eine PolyA-Anheftungsstelle von später SV40-mRNA und das VaI-Gen. Der Vektor kann mit der Endonuclease (Restriktionsenzym) XhoI linearisiert und mit äquimolaren SCIF-cDNA-Mengen ligiert werden, wobei die cDNA vorher durch Zugabe synthetischer Oligodesoxyribonucleotide modifiziert wurde, die komplementäre überhängende XhoI-Enden erzeugen. Die Oligodesoxyribonucleotide sind im Handel erhältlich [Collaborative Research, Lexington, MA]. Der Vektor wird danach mit Hilfe üblicher gentechnologischer Verfahren in geeignete Wirtszellen eingeführt.

a. Expression in Säugerzellen

Der die SCIF-DNA-Sequenz enthaltende Vektor pXM wird beispielsweise in COS-Zellen transfiziert, um das SCIF-Polypeptid bei Verwendung in den nachstehend beschriebenen Tests zu exprimieren. Das durch die transfizierten COS-Zellen konditionierte Medium enthält biologische SCIF-Aktivität, wie in dem in Beispiel 2 beschriebenen Test ermittelt.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Expressionsvektoren für Säugerzellen können mit Hilfe von Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Die Bestandteile der Vektoren, z.B. Replikationsstartpunkte, Selektionsgene, Enhancer (Verstärkerelemente), Promotoren und dergleichen, können aus natürlichen Quellen gewonnen oder mittels bekannter Verfahren synthetisiert werden. Vgl. Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159 (1982), 511-521; sowie Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (1985), 689-693. Beispiele von Säuger-Wirtszellen sind insbesondere Primaten- Zellinien und Nagetier-Zellinien, einschließlich transformierter Zellinien. Normale diploide Zellen und Zellinien, die aus einer in vitro-Kultur von Primärgewebe abstammen, sind ebenso wie Primarexplantate geeignet. Sofern das Selektionsgen dominant ist, ist es nicht notwendig, daß das Selektionsgen im Genotyp der zur Verwendung vorgesehenen Zellen fehlt. Zur stabilen Integration der Vektor-DNA und anschließenden Amplifizierung der integrierten Vektor-DNA können CHO-Zellen eingesetzt werden, wobei beide Schritte mittels üblicher Verfahren durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Vektor-DNA das Genom des Rinder-Papillomvirus [Lusky et al., Cell, 36 (1984), 391-401] vollständig oder teilweise umfassen und kann in Zellinien, wie z.B. C127-Zellen der Maus, als stabiles episomales Element enthalten sein. Andere geeignete Säuger-Zellinien umfassen Heia-Zellen, die Affen-Zellinie COS-1, die Maus-Zellinie L-929, die aus Schweizer-, Balb-c- oder NIH-Mäusen abstammenden 3T3-Zellinien sowie die Hamster-Zellinien BHK oder HaK, sind aber nicht darauf beschränkt.
Stabile Transformanten werden dann mit Immun- oder Enzymstandardtests auf die Expression des Produkts hin untersucht. Die Gegenwart der die SCIF- Polypeptide codierenden DNA kann mit Hilfe von Standardverfahren, wie z.B. Southern-Blot-Hybridisierung, nachgewiesen werden. Eine kurzzeitige Expression der die Polypeptide codierenden DNA während mehrerer Tage nach Einführung der Expressionsvektor-DNA in geeignete Wirtszellen, wie z.B. die Affen-Zellinie COS-1, wird ohne Selektion mittels Proteinaktivitätstest oder Immuntest im Kulturmedium gemessen.
Ein Fachmann kann auch andere, mit dem pXM/SCIF-Vektor vergleichbare Expressionsvektoren für Säugerzellen konstruieren, indem beispielsweise die SCIF-DNA-Sequenz mit Hilfe von XhoI in die jeweiligen Plasmide eingebaut wird, wobei wohl bekannte Rekombinationsverfahren der Gentechnolgie sowie andere bekannte Vektoren eingesetzt werden, wie pJL3 und pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4 (1985), 645-653] oder pMT2 (beginnend mit pMT2-VWF, ATCC #67122; vgl. PCT-Anmeldung PCT/US-87/00033). Die Transformation geeigneter Wirtszellen mit diesen Vektoren führt zur Expression der SCIF-Polypeptide.

b. Bakterielle Expressionssysteme

Ein Fachmann kann genauso die SCIF-Sequenz verändern, indem er alle Regulationssequenzen des Säugers, die die codierenden Sequenzen flankieren, entfernt und Bakteriensequenzen inseriert, wobei bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen SCIF- Polypeptide durch bakterielle Zellen geschaffen werden. Die den Faktor codierende DNA kann wie auf dem Fachgebiet bekannt, weiterhin so modifiziert werden, daß sie zur bakteriellen Expression benötigte unterschiedliche Codons enthält. Vorzugsweise wird die Sequenz, wie auch auf dem Fachgebiet bekannt, im richtigen Leseraster mit einer Nucleotidsequenz funktionell verbunden, die ein Leader-Polypeptid zur Sekretion codiert, was die bakterielle Expression, Sekretion und Prozessierung des veränderten reifen Proteins ermöglicht. Die in bakteriellen Wirtszellen exprimierten Verbindungen können dann gewonnen, aufgereinigt und/oder hinsichtlich ihrer physikalischchemischen, biochemischen und/oder klinischen Parameter charakterisiert werden. Diese Schritte werden jeweils mit Hilfe bekannter Verfahren durchgeführt.

c. Expression in Insekten- oder Hefezellen

Zur Expression in Insektenzellen können ähnliche Manipulationen für die Konstruktion eines Insekten-Vektors durchgeführt werden [solche Verfahren sind beispielsweise in der veröffentlichten EP-A 155,476 beschrieben]. Zur intrazellulären oder extrazellulären Expression der erfindungsgemäßen Proteine durch Hefezellen kann auch ein Hefevektor unter Verwendung von Hefe-Regulationssequenzen konstruiert werden. [Solche Verfahren sind beispielsweise in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/00639 und in EP- A 123,289 beschrieben.]

Beispiel 5 - Konstruktion von CHO-Zellinien, die hohe SCIF-Mengen exprimieren

Ein Verfahren zur Herstellung hoher Mengen erfindungsgemäßer SCIF- Polypeptide in Säugerzellen umfaßt die Konstruktion von Zellen, die mehrere Kopien des heterologen SCIF-Gens enthalten. Das heterologe Gen kann mit einem amplifizierbaren Marker verbunden werden, z.B. dem Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen. Dadurch können mehrere Genkopien enthaltende Zellen auf Vermehrung in zunehmenden Methotrexat (MTX)- Konzentrationen nach dem Verfahren von Kaufman & Sharp, J. Mol. Biol., (1982), vorstehend, selektiert werden. Dieser Weg kann bei einer Anzahl verschiedener Zelltypen verwendet werden.
Der Vektor pXM, der die Genexpression regulierende Plasmidsequenzen in funktioneller Verbindung mit einem SCIF-Gen enthält, kann gemeinsam mit dem DHFR-Expressionsplasmid pAdD26SV(A)3 (Kaufman & Sharp, Mol. Cell Biol, 3(9) (1983), 1598-1608) mittels Calciumphosphat-Copräzipitierung und Transfektion in die CHO-Zellen DUKX-BII eingeführt werden, denen das DHFR- Gen fehlt.
In einer anderen Ausführungsform kann das SCIF-Gen in den vorstehend erwähnten Vektor pMT2 eingebaut werden. Der sich daraus ergebende Vektor wird dann anstelle von pXM/SCIF und pAdD26SV(A)3 verwendet. DHFR exprimierende Transformanten werden auf Wachstum in alpha-Medium mit dialysiertem foetalem Kälberserum selektiert. Wie in Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5 (1983), 1750, beschrieben, wird anschließend auf Zellvermehrung in zunehmenden MTX-Konzentrationen selektiert (aufeinanderfolgende Schritte mit 0,02, 0,2, 1,0 und 5 uM MTX). Von den Transformanten werden Clone hergestellt. Die Expression von biologisch aktivem SCIF-Polypeptid wird mit Hilfe des Tests in Beispiel 2 kontrolliert. Die Expression des SCIF-Polypeptids dürfte sich mit zunehmender MTX-Resistenz erhöhen.

Claims

1. Arzneimittel, umfassend eine wirksame Menge eines Polypeptids oder eines Fragments davon mit einer hemmenden Wirkung auf Stammzellen, codiert von einer DNA-Sequenz, die eine DNA mit der in Tabelle II wiedergegebenen codierenden Sequenz oder ein Fragment davon umfaßt.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei die DNA Allelvariationen, Basenveränderungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, Funktmutationen und/oder induzierte Modifikationen der codierenden Sequenz von Tabelle II oder mit der DNA hybridisierende Nucleotidsequenzen umfaßt.

3. Arzneimittel, das sich zur Hemmung der Zellteilung von Stammzellen in einem Menschen verwenden läßt, der mit einem Mittel behandelt wird oder werden soll, das in Teilung befindliche Stammzellen schädigen oder zerstören kann, umfassend eine wirksame Menge eines menschlichen Stammzellen-Hemmfaktors im Gemisch mit einem geeigneten Trägerstoff, wobei der Faktor ein Polypeptid oder ein Fragment davon ist, das von einer DNA-Sequenz der Tabelle I codiert wird und eine hemmende Wirkung auf Stammzellen besitzt.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, wobei die DNA-Sequenz Allelvariationen, Basenveränderungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, Funktmutationen und/oder induzierte Modifikationen der codierenden Sequenz von Tabelle I oder mit der DNA hybridisierende Nucleotidsequenzen umfaßt.

5. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das sich zur Behandlung van Menschen verwenden läßt, die mit einem Mittel oder Strahlen behandelt werden sollen, das/die in Teilung befindliche Stammzellen schädigt/schädigen oder zerstört/zerstören.

6. Verfahren zur Herstellung einer autologen Knochenmarksprobe zur Transplantation, umfassend die Behandlung des Knochenmarks ex vivo mit einer wirksamen Menge eines die Aminosäuresequenz von Tabelle II umfassenden menschlichen Stammzellen-Hemmfaktors zur Hemmung der Teilung von Stammzellen; und die Entfernung von Krebszellen aus dem Knochenmark durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Chemotherapeutikums oder Bestrahlung.

7. Verwendung eines Polypeptids oder eines Fragments davon, das hemmende Wirkung auf Stammzellen besitzt und von einer DNA-Sequenz codiert wird, die eine DNA mit der in Tabelle II wiedergegebenen codierenden Sequenz oder ein Fragment davon umfaßt, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Menschen, bevor diese mit Mitteln behandelt werden, die in Teilung befindliche Stammzellen schädigen.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die DNA Allelvariationen, Basenveränderungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, Punktmutationen und/oder induzierte Modifikationen der codierenden Sequenz in Tabelle II oder mit der DNA hybridisierende Nucleotidsequenzen umfäßt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend eine wirksame Menge eines Polypeptids oder eines Fragments davon mit einer hemmenden Wirkung auf Stammzellen, codiert von einer DNA-Sequenz, die eine DNA mit der in Tabelle II wiedergegebenen codierenden Sequenz oder ein Fragment davon umfaßt, oder codiert von einer DNA-Sequenz umfassend eine DNA-Sequenz, die Allelvariationen, Basenveränderungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, Punktmutationen und/oder induzierte Modifikationen der codierenden Sequenz von Tabelle II oder eine Nucleotidsequenz, die mit der DNA hybridisieren kann, umfaßt, wobei das Polypeptid oder ein Fragment davon mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff formuliert wird.

10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das sich zur Hemmung der Zellteilung von Stammzellen in einem Menschen verwenden läßt, der mit einem Mittel behandelt wird oder werden soll, der in Teilung befindliche Stammzellen schädigen oder zerstören kann, umfassend eine wirksame Menge eines menschlichen Stammzellen-Hemmfaktors, wobei der Faktor ein Polypeptid oder ein Fragment davon ist, das von einer DNA-Sequenz der Tabelle I codiert wird, wobei das Polypeptid oder das Fragment davon eine hemmende Wirkung auf Stammzellen besitzt, oder der von einer DNA-Sequenz codiert wird, die Allelvariationen, Basenveränderungen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, Punktmutationen und/oder induzierte Modifikationen der codierenden Sequenz von Tabelle I oder eine Nucleotidsequenz, die mit der DNA hybridisieren kann, umfapt, wobei der Faktor mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff formuliert wird.