DE69012682T2

DE69012682T2 - Verfahren zur Entfernung von bakteriellen Endotoxinen aus gram-negativen Polysacchariden.

Info

Publication number: DE69012682T2
Application number: DE69012682T
Authority: DE
Inventors: Mark S Rienstra; Edgar M Scattergood; Robert D Sitrin
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1989-06-12
Filing date: 1990-06-08
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2010-06-09
Also published as: EP0407037B1; CA2018709C; CA2018709A1; HK8097A; DE69012682D1; JPH0395201A; EP0407037A1; CY1982A; JP2878788B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung des Bakterien-Endotoxins von gramnegativen Polysacchariden, ohne daß ein wesentlicher Polysaccharidverlust eintritt.
Das Bakterien-Endotoxin ist ein potentes Pyrogen, das oft zu fiebrigen Reaktionen führen kann, wenn es an Patienten verabreicht wird. Endotoxin ist eine integrale Komponente der äußeren Zelloberfläche von gramnegativen Bakterien. Es existiert in seinem natürlichen Zustand als Komplex von Lipid, Kohlehydrat und Protein. Wenn hochgereinigtes Endotoxin kein Protein enthält, wird es aufgrund seiner chemischen Zusammensetzung als Lipopolysaccharid bezeichnet (siehe Weary and Pearson, Bio. Pharm. April (1988), Ss. 22- 29).
Die äußere Zellwandschicht gramnegativer Bakterien dient als äußere Barriere, die die Materialien durchdringen müssen, wenn sie die Zelle erreichen sollen. Sie ist selektiv durchlässig. Im allgemeinen wird Endotoxin nur bei einer Lyse der Zellwand in großen Mengen freigesetzt.
Die Entfernung von verunreinigendem Endotoxin aus gramnegativen Polysacchariden ist wichtig, wenn das Polysaccharid an Menschen verabreicht werden soll. Endotoxine können in großen Mengen zu Schock, schwerer Diarrhöe, Fieber und Leukopenie mit anschließender Leukozytose führen und können das Schwartzman- und Sanarelli-Schwartzman-Phänomen auslösen.
In der USA-4 307 080 wird ein Impfstoff beschrieben, der gegen Haemophilus influenzae vom Typ B wirksam ist und ein hochmolekulares Kapselpolysaccharid von H. influenzae Typ B umfaßt, das gegen eine von dem Bakterium H. influenzae verursachte Infektionen wirksam sein soll.
Die EP-A-0 117 783 beschreibt und beansprucht außerdem einen Impfstoff, der gegen H. influenzae vom TYP B wirksam ist, der auf einem Polysaccharid/Protein-Konjugat basiert und im Vergleich zu dem nichtkonjugierten Polysaccharid eine verbesserte Antigenität und Immunogenität aufweisen soll. Das Konjugat umfaßt H. influenzae-Typ-B-Polysaccharid und ein T-Zellen-stimulierendes-Neisseria meningitidis-Serotyp- Außenprotein, bei dem Polysaccharid und Protein über 6- Aminocapronsäure gekuppelt sind.
Die U.S.-Patentschrift Nr. 4 695 624, ausgegeben an Marburg et al., beschreibt kovalent modifizierte polyanionische bakterielle Polysaccharide, stabile kovalente Konjugate dieser Polysaccharide mit immunogenen Proteinen und Verfahren zur Herstellung der Polysaccharide und Konjugate und zur Bestätigung der Kovalenz. In Beispiel 1 beschreibt die Patentschrift die Reinigung des Polysaccharids, beginnend in Spalte 14. Nach Fermentation, Inaktivierung und Zellentfernung durchläuft das resultierende Produkt eine Reihe von Fraktionierungen mit kaltem Ethanol. Auf eine Phenolextraktion folgen Diafiltration, Ethanolfällung, Ultrazentrifugation in Ethanol und Sammeln des fertigen Produkts.
Häufig ist die Menge des verunreinigenden Endotoxins, das nach dem oben beschriebenen Verfahren zurückbleibt, höher als erwünscht.
In der Technik bekannte Verfahren zur Entfernung von Endotoxin werden von Weary und Pearson (ibid) beschrieben: Spülen mit nichtpyrogener Lösung (Feldstine et al., J. Parenter. Drug Assoc., 33, S. 125 (1979) und Berman et al., J. Parenter. Sci. Technol., 41, S. 158 (1987)), Destillation, Ultrafiltration unter Verwendung von Membranen, die nach ihrer Molekulargewichtsgrenze eingeteilt sind (Sweadner et al., Appl. Environ. Microbiol., 34, S. 382 (1977) und Henderson et al., Kidny Int., 14, S. 522 (1978)), Umkehrosmose unter Verwendung dünner Celluloseacetat- oder Polyamidmaterialien (Nelson, Pharm. Technol. 2, S. 46 (1978)), elektrostatische Anziehung (Gerba et al., Pharm. Technol., 4, S. 83 (1980) und Hou et al., Appl Environ. Microbiol., 40, S. 892 (1980), hydrophobe Anziehung unter Verwendung aliphatischer Polymere (Robinson et al., in Depyrogenation (Parenteral Drug Association, Philadelphia (1985), S.54-69), Adsorption unter Verwendung von Aktivkohle (Berger et al., Adv. Chem. Ser., 16, S. 169 (1956), Gemmell et al., Pharm. J., 154, S. 126 (1945) und Brindle et al., Pharm. J., 157, S. 85 (1946) und Affinitätschromatographie (Soter, Bio/Technology, 12, S. 1035 (1984).
Sawada et al., Applied and Environmental Microbiology, April 1986, S. 813-820, beschreiben die Entfernung von Endotoxin aus Wasser durch Mikrofiltration durch eine mikroporöse Polyethylen-Hohlfasermembran. Gerba et al., Applied and Environmental Microbiology, Dezember 1985, S. 1375-1377, beschreiben die Endotxin-Entfernung aus verschiedenen Lösungen unter Verwendung geladender Nylon- und Cellulose-Diatomeenerde-Filter. Nolan et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, Band 149, S. 766-770 (1975), beschreiben die Bindung von Endotoxin an geladene und ungeladene Harze.
Sweadner, K. et al., Applied Environmental Microbiology, Band 34, S. 382-385 (1977), erläutern, daß Lipopolysaccharid oft in einem aggregierten Zustand vorkommt und daß die Dissoziation von Lipopolysaccharid mit Detergens oder mit Chelatbildnern seine Entfernung aus wäßrigen Lösungen durch Filtration erleichtern kann. Shands, J. et al., J. Biological Chemistry, Band 255, S. 1221-1226, zeigen, daß Lipopolysaccharid mit zweiwertigen Kationen assoziiert ist und daß die Dispersion von gramnegativen Lipopolysacchariden unter Verwendung von Desoxycholat erreicht werden kann.
McIntire, et al., Biochemistry, Band 8, Nr. 10, S. 4063-4066 (1969), beschreiben die reversible Inaktivierung durch Natriumdesoxycholat von Escherichia coli-Lipopolysaccharid. Ribi et al., Journal of Bacteriology, Band 92, Nr. 5, S. 1493-1509 (1966), beschreiben die physikalischen und biologischen Eigenschaften von Endotoxin, das mit Natriumdesoxycholat behandelt worden ist.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens, um gramnegative Polysaccharidgemische mit niedrigen oder vernachlässigbaren Endotoxinkonzentrationen zu erhalten, ohne daß es zu einem wesentlichen Polysaccharidverlust kommt.
Aufgabe der Erfindung ist es außerdem, ein Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus einer Lösung von baktierellem Polysaccharid bereitzustellen, währen die Entfernung von baktierellen Polysacchariden und weiteren gewünschten Spezies so gering wie möglich gehalten wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt gemäß einem Gesichtspunkt ein Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus einem gramnegativen Fermentationsprodukt, einschließlich Polysacchariden wie Polyribosylribitolphosphat (PRP), bereit, das die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Züchten von gramnegativen Bakterien in einem Fermentationsmedium, Freisetzen von Polysaccharid in das Medium und Zugeben von Alkohol (z.B. Ethanol) zu dem Medium, um Verunreinigungen durch Ausfällen zu entfernen,
(b) Isolieren der verbleibenden hochmolekularen Spezies und ihr Auflösen in Calciumchloridlösung, Entfernen weiterer Verunreinigungen, indem mindestens eine weitere Alkoholfraktionierung durchgeführt wird, Sammeln und Trocknen des zweiten Alkoholniederschlags, Auflösen des so erhaltenen, trockenen Pulvers in Natriumacetat und Extrahieren mit Phenol, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich Entfernen von Phenol aus der wäßrigen Lösung, die Polysaccharid enthält, durch Diafiltration mit Wasser,
(c) Zentrifugieren der restlichen hochmolekularen Spezies und Wiederauflösen in einer Gegenion-Lösung, und
(d) Zugeben von Alkohol zu der Lösung, Abkühlen der Lösung und danach schrittweises Zugeben von Alkohol, um eine Fällung von Lipopolysaccharid/Polysaccharid zu erzielen, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die folgende Stufe umfaßt:
(e) Vermischen des lipopolysaccharid- und polysaccharidhaltigen Materials, das aus der Alkoholzugabe stammt, mit einem nichtionischen Harz, einem Detergens und einem Chelatbildner bei einem basischen pH-Wert, um Lipopolysaccharid durch Entfernung des Harzes zu entfernen.
Vorzugsweise führt die erste Zugabe von Alkohol und die Temperatur nach dem Abkühlen in Stufe (d) zu einer Alkoholkonzentration bis zu 2 %, vorzugsweise zwischen 0,5 und 1 %, unterhalb der Alkoholkonzentration des Trübungspunktes. Eine Alkoholzugabe in kleinen Mengen bedeutet vorzugsweise eine stufenweise Zugabe von etwa 0,2 % gleichzeitig, bis eine zweifache Zunahme der Trübung auftritt, wonach der Trübungspunkt erreicht worden ist. Der Trübungspunkt entspricht dem Prozentsatz an Alkohol, bei dem Endotoxin und Polysaccharid auszufallen beginnen und die Trübung verursachen. Nach Erreichen des Trübungspunktes wird eine weitere Menge an Alkohol hinzugegeben, die zur Ausfällung des größten Teils des Endotoxins mit etwas Polysaccharid führt, und wobei eine vernachlässigbare Menge des Endotoxins in der Lösung zurückbleibt.
Das Gegenion ist vorzugsweise zweiwertig, kann jedoch auch einwertig sein.
Verschiedene Alkohole können während der Endotoxinentfernung erfolgreich verwendet werden. Geeignete Alkohole umfassen denaturiertes Ethanol (SDA3A, das 4,7 % MeOH, 88,1 % EtOH, 7,2 % H&sub2;O enthält), 95 % EtOH, absolutes EtOH, Isopropanol und weitere Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffen, die Endotoxin ausfällen.
Materialien, die mit Harz, Detergens und einem Chelatbildner vermischt sind, können in Pulverform vorliegen, das dem Vorgang von Stufe (d) entstammt. Ein solches Pulver wird durch Trocknen des Niederschlages aus Stufe (d) erhalten. Es besteht aus Polysaccharid und Lipolysaccharid.
Material, das mit Harz, Detergens und Chelatbildner gemischt ist, kann auch als Lösung vorliegen, die dem Vorgang in Stufe (d) entstammt, und umfaßt Polysaccharid und Lipopolysaccharid.
Werden diese Materialien einer Behandlung mit Harz, Detergens und einem Chelatbildner unterzogen, so wird im wesentlichen das gesamte Lipopolysaccharid entfernt und die Gesamtausbeute an gereinigtem Polysaccharid verbessert, die anderweitig unter Verwendung von nur einer schrittweisen Fraktionierung mit Alkohol erhalten werden würde. Außerdem ermöglicht die Anwendung der Abtrennmethode durch Harz eine Manipulation der Mengen von Nicht-Polysaccharid- und Nicht- Lipopolysaccharid-Spezies in dem fertigen Produkt, während eine Endotoxin-Entfernung erreicht wird.
Nach der Behandlung des Materials in Stufe (e) wird das Harz entfernt und das Polysaccharid aus der Lösung mit Alkohol ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert, das Pellet mit Alkohol verrieben und das resultierende Produkt unter Bildung eines Pulvers getrocknet.
Die Entfernung von Lipopolysacchariden durch das Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung in Verbindung mit der Abtrennung durch Harz ist zur Veränderung der Mengen an Materialien, außer den Polysacchariden und Lipopolysacchariden, in dem Endprodukt geeignet. Die selektive Alkoholfraktionierung entfernt Materialien hauptsächlich auf der Grundlage des Molekulargewichts. Zunehmende Alkoholkonzentrationen führen zu einer Entfernung von Spezies mit abnehmendem Molekulargewicht. Die Entfernung von Lipopolysaccharid unter Verwendung von Harz hängt von der Fähigkeit des Harzes ab, die Lipopolysaccharid-Strukturen zu erkennen und Spezies dieser Art aus der Lösung zu entfernen.
Darum ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft, um unerwünschte Abtrennungen von Verbindungen, außer Polysacchariden und Lipopolysacchariden, so gering wie möglich zu halten. Die Mengen von Komponenten, außer Polysacchariden und Lipopolysacchariden, können unter Anwendung entweder der selektiven Alkoholfraktionierung oder der Abtrennung durch Harz in größerem Maße reguliert werden, wobei das erwünschte Ergebnis der wesentlichen Abtrennung von Endotoxin aus dem Endprodukt erreicht wird.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Entfernung von Endotoxinen aus der äußeren Zelle gramnegativer Bakterien bereit, das die folgenden Stufen umfaßt:
(a) Züchten von gramnegativen Bakterien in einem Fermentationsmedium, Freisetzen von Polysaccharid in das Medium und Zugeben von Alkohol, um Verunreinigungen durch Ausfällen zu entfernen,
(b) Isolieren der verbleibenden hochmolekularen Spezies und ihr Auflösen in Calciumchloridlösung, Entfernen weiterer Verunreinigungen, indem mindestens eine weitere Alkoholfraktionierung durchgeführt wird, Sammeln und Trocknen des zweiten Alkoholniederschlags, Auflösen des so erhaltenen, trockenen Pulvers in Natriumacetat und Extrahieren mit Phenol, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich Entfernen von Phenol aus der wäßrigen Lösung, die Polysaccharid enthält, durch Diafiltration mit Wasser, und
(c) Ausfällen und Entfernen von Verunreinigungen durch Zugabe von Ethanol zu dem Produkt aus (b),
dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die folgenden Stufen umfaßt:
(d) Trocknen der resultierenden Lösung aus (c) und Auflösen des resultierenden Pulvers in einer Lösung des Chelatbildners und des Detergens bei einem basischen pH-Wert und Vermischen des nichtionischen Harzes unter geeigneten Bedingungen, und
(e) Entfernen des Harzes, des Chelatbildners und des Detergens und Ausfällen des Polysaccharids aus der Lösung mit Ethanol, Zentrifugieren des Niederschlags, Verreiben des Pellets mit Ethanol und Trocknen des resultierenden Produkts unter Bildung eines Pulvers.
Die folgenden Abkürzungen werden in der Beschreibung der Erfindung verwendet:
PRP - Polyribosylribitolphosphat, ein H. influenzae-Typ B-Kapselpolysaccharid
LAL-Testwert - Königskrabben-Amöbozytzelllysat-Testwert, der einen Hinweis auf die Endotoxinkonzentration in dem Endprodukt darstellt.
LPS - Lipopolysaccharid, das die allgemeine Struktur von Endotoxin darstellt, wenn es getrennt von der äußeren Zelloberfläche gramnegativer Bakterien vorliegt.
EU/ug - Endotoxin-Einheiten (Maß für LPS) pro ug PRP.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Produktionsfermenter, der ein Haemophilus-Komplettmedium mit Antischaummittel enthält, mit der Stammkultur angeimpft. Der Fermenter wird wenigstens 12 Stunden lang unter mäßiger Belüftung und unter mäßigem Rühren bei 37 ± 3 ºC gehalten. Die H. influenzae-Typ-B-Kultur wird nach Beendigung der Fermentation durch Zugabe von Thimerosal unter Rühren inaktiviert. Zellabfall, Medienbestandteile und weitere Verunreinigungen werden durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt und verworfen. Der Kulturüberstand wird durch Ultrafiltration konzentriert, und weitere Verunreinigungen werden durch Alkoholfraktionierung entfernt.
Die hochmolekularen Spezies werden in einer Calciumchloridlösung aufgelöst, und wenigstens eine zusätzliche Alkoholfraktionierung wird wie oben beschrieben durchgeführt, um weitere Verunreinigungen zu entfernen. Der zweite Alkoholniederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, und ein trockenes Pulver wird durch Resuspendieren des Niederschlags in absolutem Ethanol und anschließende Filtration, Waschen mit Aceton und Trocknen erhalten.
Das Pulver wird in Natriumacetatlösung aufgelöst und mehrere Male mit Phenol extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die wäßrige Lösung, die das Polysaccharid enthält, wird mit Wasser diafiltriert, um Phenol zu entfernen. Eine Calciumchloridlösung wird zu der Lösung gegeben, und die hochmolekularen Spezies werden mit Alkohol ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das Nach- Phenol-Pulver wird wieder in Calciumchloridlösung aufgelöst und anschließend einer selektiven Fraktionierung mit Alkohol unterzogen.
Die selektive Fraktionierung mit Alkohol ist ein wirksames Verfahren, um die Endotoxinkonzentration bis zu dem Punkt zu verringern, an dem sie die Produkterfordernisse erfüllt, während der Verlust an Polysaccharid aus der Lösung so gering wie möglich gehalten wird. Durch Veränderung der Alkoholkonzentration werden die Spezies mit verschiedenem Molekulargewicht unlöslich und fallen aus der Lösung aus. Eine zunehmende Alkoholkonzentration fällt Spezies von abnehmendem Molekulargewicht aus. Ethanol wird in kleinen Mengen zugegeben, wodurch die Ethanolkonzentration bis zum Trübungspunkt zunimmt. Wenn der Trübungspunkt erreicht ist, fallen Polysaccharid und LPS aus. Da es vorteilhaft sein kann, das Polysaccharid, das mit dem Lipopolysaccharid ausfällt, wiederzugewinnen, wird die Mischung zu einem Niederfraktionspulver getrocknet und später gemäß dem Abtrennverfahren mit Harz behandelt. Das Lipopolysaccharid wird zusammen mit einem Teil des Polysaccharids ausgefällt, wobei in Lösung Polysaccharid im wesentlichen ohne Lipopolysaccharid zurückbleibt.
Das ausgefällte Material, das Lipopolysaccharide, Polysaccharide und weitere Spezies, wie Proteine und Lipide, enthält, wird mit einem Harz, einem Detergens und einem Chelatbildner zusammengebracht, um das Polysaccharid zu entfernen. Das Material wird zuerst mit dem Detergens und dem Chelatbildner unter basischem pH-Wert zusammengebracht, und die Harzperlen werden sodann hinzugegeben und mit der Lösung in einem Umlaufschüttler mehrere Stunden lang unterhalb von Raumtemperatur vermischt. Die Perlen werden anschließend aus der Lösung entfernt, das Filtrat wird diafiltriert, wobei Hohlfasermembranen verwendet werden, um das Detergens und den Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wird gewonnen und Calciumchlorid hinzugegeben. Das Polysaccharid wird aus der Lösung mit Alkohol ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und das Pellet mit Alkohol und Aceton verrieben. Das resultierende Produkt wird im Vakuum getrocknet. Dieses Verfahren verringert die Endotoxinkonzentration ohne einen deutlichen Verlust an Polysaccharid.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt darum zu einer Entfernung von Verunreinigungen, wie von Lipopolysacchariden, aus den Fermentationsprodukten gramnegativer Bakterien durch selektive Alkoholfraktionierung und anschließende Behandlung mit Harz, Detergens und Chelatbildner.
Obwohl Natriumcitrat ein bevorzugter Chelatbildner ist, sind weitere Chelatbildner, die in der Lage sind, auf zweiwertige, in der Lösung vorhandene Calciumionen einzuwirken und als Puffer zur Einhaltung des basischen pH-Wertes dienen können, geeignet. Weitere geeignete Chelatbildner umfassen Ethylendiamintetraessigsäure, wie Dinatriumethylendiamintetraessigsäure. Vorzugsweise liegt die Menge an Chelatbildner zwischen etwa 1 % und 10 %, mehr bevorzugt zwischen etwa 2 % und etwa 7 % und noch mehr bevorzugt bei etwa 6 %.
Obwohl Desoxycholat ein bevorzugtes Detergens ist, sind weitere Detergentien geeignet, die in der Lage sind, das aggregierte Lipopolysaccharid auf zubrechen. Geeignete Detergentien umfassen Triton X-100, CHAPS, Natriumdodecylsulfat und Natriumlaurylsulfat. Vorzugsweise liegt die Menge an Detergens zwischen etwa 0,1 % und etwa 2,0 %, mehr bevorzugt zwischen etwa 0,2 % und etwa 1,0 % und sogar noch mehr bevorzugt bei etwa 0,75 %.
Nichtionische Harze, die an Lipopolysaccharid und nicht an Polysaccharide binden und erfindungsgemäß geeignet sind, umfassen Borat Avidgel (Amicon), Amberlite XAd und Amberchrom (Roehm & Haas), Octylcellulose (Phoenix Chem.), Silicon C8 (Baker), SP207 und HP20 (Mitsubishi Chem.), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Von diesen Harzen wird HP20 aufgrund der Lipopolysaccharid- Verringerung, leichter Verwendung, Verfügbarkeit, der Kosten und seiner Neigung, die Bindung an Polysaccharide zu vermeiden, bevorzugt. Vorzugsweise wird das Harz vor der Verwendung mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen. Mehr bevorzugt wird das Harz vor der Verwendung mit Säurelösung, einer Alkalilösung oder einem polaren Lösungsmittel (z.B. Ethanol oder Methanol) und anschließend mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das durch Trocknen des Niederschlages, der sich aus Stufe H ergibt, erhaltene Pulver, das Polyribosylribitolphosphat des H. influenzae Typ B-Baktieriums, Lipopolysaccharid und verschiedene Lipide und Proteine enthält, mit HP20-Harz (hochporöses Styrol- und Divinylbenzol-Copolmer), Natriumcitrat und Desoxycholat unter geeigneten Bedingungen vermischt. Das Lipopolysaccharid bindet an das Harz, das anschließend entfernt wird. Das Filtrat wird diafiltriert, das Retentat gewonnen und das Polyribosylribitolphosphat aus der Lösung mit Alkohol ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert, das resultierende Pellet mit Ethanol und Aceton verrieben und die resultierende Lösung vakuumgetrocknet. Bei dem Verfahren bricht das Detergens die Assoziation des aggregierten Lipopolysaccharids auf. Der Chelatbildner bindet zweiwertige Calciumionen, so daß die Vesikelstruktur des Lipopolysaccharids nicht aufrechterhalten werden kann, und dient ferner als Puffer, um den pH oberhalb von etwa 8 zu halten, hauptsächlich um eine Detergensgelierung zu vermeiden. Das Lipopolysaccharid ist anschließend in der Lage, hydrophob an das Harz zu binden. PRP, das nicht an das Harz bindet, bleibt frei in Lösung und kann in dem Filtrat gewonnen werden. Die Membrandiafiltrationen, die folgen, entfernen Detergens und Chelatbildner aus der Lösung, und PRP wird anschließend ausgefällt und auf typische Weise getrocknet.
Polysaccharide oder Polysaccharidlösungen, aus denen Endotoxin erfindungsgemäß entfernt wird, können bakterielle Polysaccharide mit sauren Gruppen enthalten, es ist jedoch nicht beabsichtigt, sie auf bestimmte Typen zu beschränken. Beispiele für solche bakteriellen Polysaccharide umfassen Polysaccharid von Haemophilus influenzae (H. flu) Typ B, Polysaccharide von Neisseria meningitidis (meningoccocus) der Gruppen A, B, C, X, Y, W135 und 29E und Polysaccharide von Escherichia coli K1, K12, K13, K92 und K100. Besonders bevorzugte Polysccharide sind jedoch diejenigen Kapselpolysaccharide, die aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus H.-flu-b-Polysaccharid, wie beschrieben bei Rosenberg et al., J. Biol. Chem., 236, S. 2845-2849 (1961) und Zamenhof et al., J. Biol. Chem., 203, S. 695-704 (1953).
Das nachstehend gezeigte H. influenzae-Typ-B-Polyribosylribitolphoshat,
kann zur Verwendung in Protein-Polysaccharidkonjugaten, wie in denjenigen, die bei Marburg et al., United States Patentschrift Nr. 4 695 624 beschrieben sind, hergestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Pulver, das aus der Fermentationslösung von H. influenzae stammt und Polyribosylribitolphosphat, Lipopolysaccharide und verschiedene Lipide und Proteine enthält, in einem Gemisch von Detergens/Chelatbildner unter basischem pH-Wert aufgelöst. Die Harzperlen werden hinzugegeben und mit der PRP-Lösung in einem Umlaufschüttler mehrere Stunden lang unterhalb von Raumtemperatur vermischt. Die Perlen werden anschließend aus der Lösung entfernt, und das Filtrat wird diafiltriert, um Detergens und Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wird gewonnen und Calciumchlorid hinzugegeben. PRP wird mit Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und das Pellet mit Ethanol und Aceton verrieben. Das resultierende Produkt wird im Vakuum getrocknet. Das Verfahren unter Verwendung von Harzperlen führt zu geringen Konzentrationen des verunreinigenden Endotoxins ohne einen deutlichen Verlust von PRP. Die Endotoxinverringerung, die sich durch das erfindungsgemäße Verfahren ergibt, entspricht typischerweise dem 100- bis 21 000fachen zwischen Ausgangs- und Endpulver. Die PRP-Ausbeute beträgt typischerweise wenigstens 75 % und manchmal mehr als 90 % des Ausgangsmaterials.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Entfernung von Endotoxin und zur Herstellung von Endotoxin-freiem Polysaccharid ist besonders vorteilhaft, wenn Polysaccharide zur Konjugation mit Proteinen hergestellt werden. Unsere Studien haben gezeigt, daß die Konjugationswirksamkeit mit dem unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellten Polysaccharids dreimal besser ist als mit dem Polysccharid, das gemäß Marburg et al., U.S.-Patentschrift Nr. 4 695 624 hergestellt worden ist. Während der Herstellung lagert sich das Harz hydrophob an die Lipidstelle des zu entfernenden Lipopolysaccharid-Endotoxins an, jedoch nicht in beträchtlichen Mengen an weitere Lipide, die vorhanden sein können. Diese weiteren Lipide verbleiben in der Polysaccharidlösung und verbessern die Polysaccharid-Protein-Konjugationswirksamkeit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Lipopolysaccharid aus einer Lösung entfernt, die Polysaccharid enthält, das von einer H. influenzae Fermentationslösung stammt, indem es mit Harz, z.B. HP20-Harz (hochporöses Styrol- und Divinylbenzol-Copolymer), einem Chelatbildner, z.B. Natriumcitrat, und einem Detergens, z.B. Natriumdesoxycholat, unter geeigneten Bedingungen vermischt wird und das Harz durch Filtration entfernt wird. Das Filtrat wird diafiltriert, das Retentat gewonnen und PRP mit Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert, das resultierende Pellet mit Ethanol und Aceton verrieben und die resultierende Lösung im Vakuum getrocknet. Bei dem Verfahren bricht das Detergens die Assoziation des aggregierten Lipopolysaccharids auf. Der Chelatbildner bindet die zweiwertigen Calciumionen, so daß die vesikuläre Struktur des Lipopolysaccharids nicht aufrechterhalten werden kann, und dient ferner als Puffer, um den pH-Wert oberhalb von etwa 8 zu halten, hauptsächlich um eine Detergensgelierung zu verhindern. Das Vorhandensein sowohl von Detergens als auch Chelatbildner ist wesentlich, um die überlegenen Ergebnisse zu erhalten, die durch dieses Verfahren erreichbar sind. Das Lipopolysaccharid vermag sodann hydrophob an das Harz zu binden. PRP, das nicht an das Harz bindet, da es zu groß ist, um in die Poren einzudringen, und da es hydrophil ist, bleibt frei in Lösung und kann im Filtrat gewonnen werden. Die Membran-Diafiltrationen, die sich anschließen, entfernen Detergens und Chelatbildner aus der Lösung, und PRP wird anschließend ausgefällt und getrocknet.
Das Harz wird mit einem Chelatbildner, wie Natriumcitrat, und einem Detergens, wie Desoxycholat, vermischt. Das Detergens bricht das aggregierte Lipolysaccharid auf. Der Chelatbildner wirkt auf zweiwertige, in der Lösung vorhandene Calciumionen ein und dient als Puffer zur Beibehaltung des basischen pH-Wertes.
Ein Produktionsfermenter, der Haemothilus-Komplettmedium mit einem Antischaummittel enthält, wird mit der Stammkultur angeimpft. Der Fermenter verbleibt wenigstens 12 Stunden lang unter mäßigem Rühren und Schütteln bei 37±2 ºC. Die Kultur von H. influenzae-Typ-B wird nach Beendigung der Fermentation durch Zugabe von Thimerosal unter Rühren inaktiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt und verworfen. Der Kulturüberstand wird durch Ultrafiltration konzentriert, und weitere Verunreinigungen werden durch alkoholische Fraktionierung entfernt.
Der Niederschlag der hochmolekularen Spezies wird in Calciumchloridlösung aufgelöst, und wenigstens eine zusätzliche alkholische Fraktionierung wird, wie vorstehend beschrieben, zur Entfernung weiterer Verunreinigungen durchgeführt. Der zweite alkoholische Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, und ein trockenes Pulver wird erhalten, indem der Niederschlag in absolutem Ethanol resuspendiert, anschließend filtriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet wird.
Das Pulver wird in Natriumacetatlösung aufgelöst und mehrere Male mit Phenol extrahiert, um die Verunreinigungen zu entfernen. Die wäßrige Lösung, die Polysaccharid enthält, wird mit Wasser zur Entfernung von Phenol diafiltriert. Zu der Lösung wird Calciumchloridlösung gegeben, und die hochmolekularen Spezies werden mit Alkohol ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das Pulver nach der Phenolfällung wird wieder in Calciumchloridlösung aufgelöst und anschließend einer selektiven Alkoholfraktionierung unterzogen.
Die Alkoholzugabe in kleinen Mengen ist ein wirksames Verfahren zur Verringerung der Endotoxinkonzentration bis zu dem Punkt, an dem sie die Produktspezifikation erfüllt, während der Verlust an Polysaccharid in der Lösung so gering wie möglich gehalten wird. Dadurch daß die Alkoholkonzentration geändert wird, werden die Spezies mit unterschiedlichem Molekulargewicht unlöslich und fallen aus der Lösung aus. Eine zunehmende Alkoholkonzentration fällt Spezies von abnehmendem Molekulargewicht aus. Wenn der Trübungspunkt erreicht ist, beginnen Lipopolysaccharid und Polyribosylribitolphosphat auszufallen. Lipopolysaccharid wird zusammen mit einem Teil von Polysaccharid ausgefällt, wodurch Polysaccharid in Lösung im wesentlichen ohne Lipopolysaccharid zurückbleibt. Der Niederschlag bei niedriger Ethanolkonzentration, der große Mengen Lipopolysaccharide enthält, wird durch Zentrifugieren entfernt und verworfen. Weiteres Ethanol wird zugegeben, und der Polsaccharidniederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt. Durch das folgende erfindungsgemäße Verfahren kann der größte Teil des Lipopolysaccharids aus der Lösung entfernt werden, bevor ein untragbarer Verlust an Polysaccharid eintritt. Das resultierende Produkt ist anschließend zur wirksamen Herstellung von Protein-Polysaccharid- Konjugaten geeignet.
Protein-Poplysaccharid-Konjugate, die zur Impfung von Patienten gegen Infektionen, wie diejenigen, die durch das H. influenzae-Typ-B-Bakterium verursacht werden, geeignet sind, können unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden.
Die Endotoxinverringerung, die sich durch das erfindungsgemäße Verfahren ergibt, entspricht typischerweise dem 30- bis 100fachen zwischen Ausgangs- und Endpulver. Die Polyribosylribitolphosphat-Ausbeute beträgt typischerweise wenigstens 35 % der Konzentration in dem Ausgangsmaterial.
Der Königskrabben-Amöbozytzelllysat-Test (LAL), der beschrieben ist in "Guideline on validation of the LAL test as an end product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices", U.S. Departement of Health and Human Services, Dezember 1987, wird zur Bestimmung der Endotoxinkonzentrationen angewendet.

BEISPIEL 1

Endotoxinentfernung unter Verwendung der alkoholischen Fraktionierung und Harzabtrennung

Eine schematische Darstellung des in diesem Beispiel befolgten Verfahrens ist nachstehend gezeigt. Fermentation Inaktivierung Zentrifugieren Zellen verwerfen geklärter Überstand Konzentrieren ROMICON-Pool Ethanol Ethanol Fraktionierung Pasten-Abfall Überstand-Abfall CaCl&sub2;-Zugabe CaCl&sub2;-Extrakt Ethanol Fraktionierung Vor-Phenol-Pulver Phenol 4 Phenol-Extraktionen Phenol-Abfall 4. wäßr. Extrakt Verdünnung Konzentrieren CaCl&sub2;-Zugabe Fällung Permeat-Abfall Ethanol Nach-Phenol-Pulver selektive Ethanolfraktionierung Niederfraktionspulver Harz-Entfernung fertiges Pulver
In der Stufe der selektiven Ethanolfraktionierung wurde das Lipopolysaccharid bei zunehmender Alkoholkonzentration zusammen mit einem Teil des Polysaccharids ausgefällt, wodurch Polysaccharid mit weniger Lipopolysaccharid in Lösung zurückblieb. Der Niederschlag, der Lipopolysaccharid zusammen mit Polysaccharid enthält, ist als "Niederfraktion" oder "Vorfraktion" bekannt. Das Vorfraktionsmaterial wird einer weiteren Endotoxinentfernung unter Anwendung von Harz, Detergens und Chelatbildner (wie später beschrieben) unterzogen.
Die Zugabe von Alkohol in kleinen Mengen ist ein wirksames Verfahren zur Verringerung der Endotoxinkonzentration bis zu dem Punkt, an dem sie die Produktspezifikation erfüllt, während der Verlust an Polysaccharid aus der Lösung so gering wie möglich gehalten wird. Durch Veränderung der Alkoholkonzentration werden Spezies von unterschiedlichem Molekulargewicht unlöslich und fallen aus der Lösung aus. Eine zunehmende Alkoholkonzentration fällt Spezies mit abnehmendem Molekulargewicht aus.
Somit wird die Lösung, aus der Endotoxin entfernt werden soll, abgekühlt, und ein Salz, wie CaCl&sub2; oder NaCl, wird zugegeben. Gekühlter Alkohol, wie SDA3A wird zugegeben, um eine Konzentration etwas unterhalb (etwa 0,5 bis 1,0 %) des Trübungspunktes (siehe Diagramm 2) zu erhalten. Die anschließende Zugabe in kleinen Schritten von etwa 0,2 % Alkohol auf einmal wird durchgeführt, bis eine zweifache Zunahme in der Trübung auftritt, wonach der Trübungspunkt erreicht worden ist.
Produkte, die aus dem Test a, c, d und e in Tabelle 1 erhalten worden sind, zeigen eine dramatische Verringerung der Endotoxinkonzentration, wenn das erfindungsgemäße Verfahren befolgt wird. Test e, der eine nicht hinnehmbar hohe Endotoxinkonzentration aufwies, wurde ein zweites Mal durch selektive Fraktionierung mit Ethanol behandelt, deren Ergebnisse in Test f angegeben sind. TABELLE 1 Endotoxinverringerung unter Anwendung der selektiven Fraktionierung mit Alkohol Test (EU/ug) Vor-Phenol-Pulver Nach-Phenol-Pulver Niederfraktionspulver Pulver nach selektiver Alkoholfraktionierung
Um die selektive Fraktionierung mit Alkohol durchzuführen, wurde das Nach-Phenol-Pulver zu 2,5 g/l in einer 0,05 M CaCl&sub2;-Lösung aufgelöst, um ein zweiwertiges Gegenion sowohl für Endotoxin als auch PRP bereitzustellen. Alkohol wurde anschließend zu 26 % (Vol./Vol.) hinzugegeben. Nachdem sich die Temperatur auf einen konstanten Wert im Bereich von 2 bis 4 ºC eingependelt hatte, wurde Alkohol in kleinen Mengen zugegeben, bis PRP auszufallen begann (Trübungspunkt), wodurch es zu einer Trübung kam, wie sie von einer Trübungsmeßsonde aufgezeichnet wurde.
Diagramm 1 ist eine Auftragung von % Alkohol am Trübungspunkt gegen die Temperatur einer PRP-Pulverlösung. Der Prozentsatz Alkohol, der benötigt wird, um den Trübungspunkt bei 6ºC zu erreichen, betrug 27,4 %, jedoch waren bei 4 ºC nur 26,7 % erforderlich. Diese anscheinend kleine Zunahme entspricht 700 ml für einen 100-Liter-Versuch. Die Ausbeute an fertigem Pulver nahm ab, wenn der Unterschied zwischen dem niederfraktionären Alkhohlprozentsatz und dem Prozentsatz am Trübungspunkt zunahm. Diagramm 2 zeigt, daß eine Zunahme des Alkoholgehaltes um 1 % der Alkoholkonzentration am Trübungspunkt 50 % PRP entfernte. Die Endotoxinverringerung, gemessen durch LAL, war etwa 10fach. Darum genügte eine Alkoholzugabe von 1 % nicht, um Endotoxin bis zu einer Konzentration von 3 EU/ug zu verringern, wenn bei dem Ausgangs-LAL mehr als 30 EU/ug vorhanden waren.
Nachdem Alkohol für die Niederfraktion zugegeben worden war, wurde die Lösung sofort zentrifugiert, um den Niederfraktionsniederschlag zu entfernen. Zusätzlicher Alkohol wurde bis 38 % (Vol./Vol.) zu dem Überstand gegeben. Der gewünschte Niederschlag wurde durch Absetzen und/oder Zentrifugieren und Trocknen des Endpulvers gesammelt. Typische Ausbeuten in dieser Stufe, 1,2-2,0 % oberhalb des Trübungspunktes, betrugen 30-40 % des Nach-Phenol-Pulvers oder 13-18 % der Menge in dem Fermenter.
Das Verfahren der selektiven Fraktionierung mit Alkohol kann wiederholt werden, wenn das Endpulver nicht den Pyrogenspezifikationen entspricht. Für die Wiederaufarbeitung wurde die Alkoholkonzentration um 0,2 % über den Alkoholprozentsatz der Niederfaktion erhöht. Die Ausbeute betrug 78 %, und die Endotoxinkonzentration wurde von 2,8 auf 0,09 EU/ug verringert. DIAGRAMM 1 PRP-FÄLLUNG: % SDA3A AM TRÜBUNGSPUNKT VS. TEMPERATUR VON PRP/SDA3A-LÖSUNG % SDA3A AM TRÜBUNGSPUNKT TEMPERATUR (ºC) (CaCl&sub2;-H&sub2;O-PRP-SDA3A-LÖSUNG) DIAGRAMM 2 REDUKTION UM LAL & % AUSBEUTE (NACH-PHENOL-PULVER BIS PULVER-PRODUKT) VS. SDA3A ÜBER TRÜBUNGSPUNKT REDUKTION UM LAL ODER % AUSBEUTE % AUSBEUTE REDUKTION UM LAL % ÜBER TRÜBUNGSPUNKT

Endotoxinentfernung unter Verwendung von Harz, Detergens und Chelatbildner

Das Vorfraktions- oder Niederfraktionsmaterial, das nach der Durchführung der selektiven Fraktionierungsstufe mit Ethanol erhalten worden war und ausgefallenes Lipopolysaccharid, Polyribosylribitolphosphat enthielt, wurde noch durch Vermischen mit HP20-Harz, Desoxycholat und Natriumcitrat behandelt. Diese Behandlung entfernt wesentliche Mengen von Lipopolysaccharid, ohne im wesentlichen die Konzentration des gewünschten Polyribosylribitolphosphats, das in dem Niederfraktionsmaterial enthalten ist, zu beeinflussen. Das Filtrat wird mit einer Hohlfasermembran diafiltriert, das Retentat gewonnen und Polyribosylribitolphosphat mit Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und das resultierende Pellet mit Ethanol und Aceton verrieben. Die resultierende Lösung wird sodann im Vakuum getrocknet. NIEDERFRAKTIONSPULVER Citrat DOC IN PFW HP-20-Harzbehandlung verbrauchtes Harz Citrat PFW Amicon-Membran-Diafiltration Citrat-Diafiltration Wasser-Diafiltration Ethanol Ethanol-Fällung, Zentrifugieren Überstand-Abfall Pulver-Produkt
0,5 % Natriumdesoxycholat und 3 % Natriumcitrat wurden mit dem Lipopolysaccharid-Polysccharidgemisch bei pH 8-9 vermischt. HP20 -Harz wurde mit 30 g Harz pro Gramm Polysaccharid hinzugegeben (das Harz wurde vor der Verwendung mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen). Die losen Perlen wurden in einem Umlaufschüttler mit der Lösung etwa 3 Stunden lang bei 4 ºC vermischt. Nach dem Mischen werden die Perlen mit einem Edelstahl-Filtrationstrichter aus der Lösung entfernt. Das Filtrat wird anschließend in einer Amicon-H1P30-20-Hohlfaserpatrone (0,06 m² spezifische Oberfläche) gegen 5 Volumina 1,5 % Citrat und anschließend 10 Volumina pyrogenfreies Wasser diafiltriert, wobei eine geschätzte Polysaccharidkonzentration von ≤ 2,5 mg/ml eingehalten wurde, um Detergens und Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wird gewonnen, und 2 M Calciumchlorid wird hinzugegeben, um eine endgültige Calciumchloridkonzentration von 0,05 M zu erreichen. Polysaccharid wird mit einem Überschuß an 95%igem Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird bei 13 000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert, das Pellet mit absolutem Ethanol und Aceton verrieben und sodann im Vakuum getrocknet. Das fertige Pulver wird in einen Probenbehälter übergeführt und bei -70 ºC eingefroren.
Material, das mit Harz behandelt worden ist, zeigte die folgenden Verringerungen der Endotoxin- und Polysaccharidkonzentrationen: LAL-Testwert EU/ ug Beginn Endpulver Polysaccharidkonzentration (%) Anfang Endpulver

BEISPIELE 2, 3, 4, 5, 6, 7 und 8

Unter Befolgung des Verfahrens zur Endotoxin-Entfernung, das in Beispiel 1 beschrieben worden ist, und indem eine Natriumdesoxycholatkonzentration von 0,5 % eingehalten wird und mit dem Pulver begonnen wird, das im LAL 60EU/ug aufweist, erhielten wir mit diesen variierenden Mengen Natriumcitrat eine beträchtliche Verringerung von LPS: LAL (EU/ug) % Natriumcitrat Start Ende Beispiel

BEISPIELE 9, 10 und 11

Unter Befolgung des Verfahrens zur Endotoxin-Entfernung, das in Beispiel 1 beschrieben worden ist, Einhalten einer Natriumcitratkonzentration von 6 % und ausgehend von einem Pulver mit 60EU/ug LPS, erhielten wir eine beträchtliche Verringerung von LPS mit diesen variierenden Mengen Desoxycholat: LAL (EU/ug) % Natriumdesoxycholat Start Ende BeispielBEISPIELE 12, 13, 14, 15 und 16
Unter Befolgen der allgemeinen Verfahren aus Beispiel 1 umfassen diese Beispiele die Beschreibung oder Verfahrensabänderungen innerhalb des Umfangs der Erfindung.

Verfahrensabänderung

Beispiel 12 Nach Behandlung gemäß Beispiel 1 wird das Verfahren wiederholt.
Beispiel 13 Nach Behandlung gemäß Beispiel 3 wird das Filtrat mit 3 % Natriumcitrat diafiltriert, Natriumdesoxycholat wird zugegeben und die Lösung noch 3 Stunden lang mit dem ursprünglichen HP20-Harz behandelt.
Beipsiel 14 Nach 3 Stunden HP20-Behandlung gemäß Beispiel 3 wurde ein gleiches Volumen von 3 % Citrat mit 0,5 % Natriumdesoxycholat zu dem Gemisch gegeben und die Behandlung mit Harz noch 3 Stunden lang fortgesetzt.
Beispiel 15 Nach 3 Stunden gemäß Beispiel 3 wurde Natriumcitrat mit 0,5 % Natriumdesoxycholatpulver zugegeben und die Behandlung mit Harz noch 3 Stunden lang weitergeführt.
Beispiel 16 a,b (a) 6 % Natriumcitrat mit 0,5 % Natriumdesoxycholat oder (b) 6 % Natriumcitrat mit 1 % Natriumdesoxycholat wurde 3 Stunden lang verwendet.

BEISPIEL 17

Alle Verfahrensstufen von Beispiel 1 werden angewendet, außer daß das Harz in eine Säule gepackt wird, statt es batchweise mit PRP zu vermischen. Somit wird PRP in einer Lösung von Natriumcitrat und Natriumdesoxycholat aufgelöst, und die resultierende Lösung wird über die Säule gegeben. Das resultierende Produkt entspricht demjenigen, das in Beispiel 1 erhalten wurde.

BEISPIEL 18

Alle Verfahrensstufen aus Beispiel 1 werden wiederholt, außer daß das Harz in eine Patrone gepackt wird, statt batchweise mit PRP vermischt zu werden. Somit wird PRP in einer Lösung von Natriumcitrat und Natriumdesoxycholat aufgelöst, und die resultierende Lösung wird über die Patrone gegeben. Das resultierende Produkt entspricht demjenigen, das in Beispiel 1 erhalten wurde.

BEISPIEL 19

Herstellung von H. influenzae-Typ-B-Kapselpolysaccharid (PRP)

Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist unten angegeben: Fermentation Inaktivierung Zentrifugieren Zellen verwerfen geklärtes Medium Konzentrieren Permeat-Abfall ROMICON-Pool Ethanol Ethanol Fraktionierung Pasten-Abfall Überstand-Abfall Produktpaste CaCl&sub2;-Zugabe CaCl&sub2;-Extrakt Vor-Phenol-Pulver Phenol 4 Phenol-Extraktionen Phenol-Abfall 4. wäßr. Extrakt Verdünnung Konzentrieren CaCl&sub2;-Zugabe Fällung Permeat-Abfall Nach-Phenol-Pulver* Citrat, DOC HP-20-Harz-behandlung, trocken verbrauchtes Harz Pulver-Produkt*

Fermentation

Stufe A: Entwicklung von Inokulum- und Stammedium

Ein lyophilisiertes Röhrchen von Haemophilus influenzae Typ B (gezüchtet von Ross 768, erhalten von der State University von New York) wurde in 1 ml sterilem Haemophilus-Inokulummedium (siehe nachstehend) suspendiert. Die Suspension wurde auf 19 Cholat-Agarplatten (BBL) ausgestrichen. Nach 20stündiger Inkubation bei 37 ºC in einem hohen Gefäß wurde die Anzucht einer jeden Platte in 1-2 ml Haemophilus- Inokulummedium resuspendiert und vereinigt. Haemophilus-Inokulummedium* Sojapepton destilliertes Wasser auf Volumen
* Der pH-Wert der Lösung wird auf einen Zielwert von 7,2 ± 0,1 (ein typischer Wert war pH 7,23) eingestellt, und die Lösung wurde durch Autoklavieren bei 121 ºC 25 Minuten lang sterilisiert.

Stufe B: 2-Liter-Erlenmeyerkolben ohne Sperre

Ein Drittel der Portionen der resuspendierten Bakterien aus Stufe A (vorstehend) wurde verwendet, um drei 2-Liter-Kolben anzuimpfen, die jeweils etwa 1,0 l Haemophilus Komplett- Stammlösung und Produktionsmedium (siehe nachstehend) enthielten. Die Kolben wurden anschließend bei 37 ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 Upm etwa 5 Stunden lang inkubiert. Ein typischer OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert am Ende der Inkubationszeit betrug 0,37. Haemophilus-Komplett-Stamm- und Komplett-Produktionsmedium Sojapepton Hefeextraktdiafiltrat (1) Glucose (2) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) (3) Hämin (4)
Die Salze und Sojapepton wurden in kleinen Volumina heißem pyrogenfreiem Wasser aufgelöst und mit zusätzlichem heißem pyrogenfreiem Wasser auf das genaue Endvolumen gebracht. Die Fermenter oder Kolben wurden sodann etwa 25 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert, und nach dem Abkühlen wurden Hefeextraktdiafiltrat (1), Glucose (2), NAD (3) und Hämin (4) vor dem Animpfen aseptisch zu den Kolben oder Fermentern gegeben.
(1) Hefextraktdiafiltrat: 100 g Bierhefeextrakt (Amber) wurden in 1 l destilliertem Wasser aufgelöst und über eine Amicon-DC30-Hohlfaser mit H10X50-Patronen zur Entfernung von Molekülen mit MW 50 000 ultrafiltriert. Das Filtrat wurde gesammelt und über eine 0,22-M-Membran als steriles Produkt gegeben.
(2) Glucose wurde als sterile 25%ige Lösung in glasdestilliertem Wasser hergestellt.
(3) Eine Stammlösung von NAD, die 20 mg/ml enthielt, wurde durch Filtration über einen Millipore-Filter (0,22 M) sterilisiert und unmittelbar vor dem Animpfen aseptisch hinzugegeben.
(4) Eine Stammlösung von Hämin 3X wurde durch Auflösen von 200 mg in 10 ml 0,1 M NaOH hergestellt und das Volumen mit destilliertem sterilisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt. Die Lösung wurde 20 Minuten lang bei 121 ºC sterilisiert und vor dem Animpfen aseptisch zu dem fertigen Medium gegeben.

Stufe C: 70-Liter-Anzuchtfermenter

Drei Liter des Produkts aus "Stufe B" wurden zum Animpfen eines 70-Liter-Fermenters verwendet, der 41,4-l-Haemophilus- Stammlösung- und Produktions-Komplettmedium (hergestellt wie oben beschrieben) und 17 ml UCON B625-Antischaummittel enthielt. Der pH-Wert startete bei 7,4.
Die Fermentation wurde unter Schütteln mit 100 Upm bei 37 ºC gehalten und anhand der optischen Dichte (O.D.) und der Bestimmung des pH-Wertes kontrolliert, bis eine typische O.D. von 0,39 erreicht war (nach etwa 5,5 Stunden).

Stufe D: 800-Liter-Produktionsfermenter

Etwa 40 l des Produkts aus "Stufe C" wurden zum Animpfen eines 800-Liter-Fermenters verwendet, der 570 l Produktionsmedium (hergestellt wie oben beschrieben), eingestellt auf das notwendige Volumen, und 72 ml UCON LB625-Antischaummittel enthielt.
Die Fermentation wurde unter Rühren bei 100 Upm bei 37 ºC gehalten, wobei die O.D.- und pH-Niveaus etwa alle 2 Stunden überprüft wurden, bis die O.D. für einen Zeitraum von 2 Stunden gleich blieb, worauf die Fermentation beendet wurde (ein typischer O.D.-Endwert betrug nach 12 Stunden 0,54)

Ernte und Inaktivierung

Etwa 600 l der Charge wurden durch Ernten in einem "Abtötungstank", der 12 l 1 % Thimerosal enthielt, inaktiviert.

Klärung

Nach 8 Stunden Inaktivierung bei 4 ºC wurde die Charge in 4 in.-(101,6 mm)-Sharples-Schalenzentrifugen mit einer Fließgeschwindigkeit zentrifugiert, die so eingestellt war, daß die Produktklarheit beibehalten wurde (variabel zwischen 1,3 und 3,0 l/min.). Der nach der Zentrifugation erhaltene Überstand (15 000 Upm) wurde zur Produktgewinnung verwendet.

Isolierung und Konzentration durch Ultrafiltration

Der flüssige Überstand aus zwei Produktionsfermentationen wurde vereinigt und bei 2 ºC-8 ºC in einer Romicon-Ultrafiltrationseinheit mit 10 (50 000 Dalton Ausschlußgrenze) Hohlfaserpatronen (275 ft² [25,55 m²] Membranfläche) konzentriert, so daß nach etwa 4,5 Stunden 1 200 l auf 32,5 l konzentriert waren. Das Filtrat wurde verworfen.

Fällung bei 48 % und 61 % Ethanol

Zu den 32,5 l des Romicon-Retentats wurden 30 l 95 % Ethanol tropfenweise im Verlauf von 1 Stunde unter Rühren bei 4 ºC bis zu einer Endkonzentration von 48 Volumen-% Ethanol gegeben. Das Gemisch wurde noch 2 Stunden lang bei 4 ºC gerührt, um eine vollständige Fällung zu gewährleisten, und der flüssige Überstand wurde mittels einer einzigen 4 in.-(101,6 mm)-Sharples-Zentrifuge bei 15 000 Upm (Fließgeschwindigkeit = 0,27 1/min.) gesammelt. Das unlösliche Pellet wurde verworfen, und das geklärte Fluid wurde mit einer Zugabe von 20,8 l 95 % Ethanol im Verlauf von 1 Stunde auf 61 % Ethanol gebracht. Das Gemisch wurde noch 3 Stunden lang gerührt, um eine vollständige Fällung zu gewährleisten.

Gewinnung des zweiten Pellets

Der resultierende, in 48%igem Ethanol lösliche, in 61%igem Ethanol unlösliche Niederschlag wurde durch Zentrifugieren in der 4 in.-(101,6 mm)-Sharples-Zentrifuge bei 15 000 Upm (Fließgeschwindigkeit = 0,62 1/min.) gesammelt, und der flüssige Überstand von 61 % Ethanol wurde verworfen. Die Rohproduktausbeute betrug 0,377 kg nasse Paste.

Calciumchloridextraktion

Die 377 g des in 61%igem Ethanol unlöslichen Materials wurden in einem Daymax-Dispersionsgefäß bei 2 ºC-8 ºC mit 6,5 l kaltem glasdestilliertem Wasser vermischt. Zu diesem Gemisch wurden 6,5 l kaltes 2 M CaCl&sub2; H&sub2;O gegeben, und das Gemisch (Endkonzentration = 1,0 M CaCl&sub2;) wurde bei 4 ºC 15 Minuten lang extrahiert. Das Gefäß wurde anschließend mit 2 l 1 M CaCl&sub2;-H&sub2;O-gespült, wobei sich 15 l Endvolumen ergaben.

Niederschlag bei 23 % Ethanol

15 l des CaCl&sub2;-Extrakts von oben wurden durch Zugabe von 4,4 l 95%igem Ethanol tropfenweise unter Rühren bei 4 ºC im Verlauf von 30 Minuten auf 23 % Ethanol gebracht. Nach weiterem Rühren für 17 Stunden wurde das Gemisch über eine K2-Ultrazentrifuge bei 25 000 Upm (Fließgeschwindigkeit 165 ml/min.) 6,5 Stunden lang bei 4 ºC zentrifugiert. Der flüssige Überstand wurde durch ein Baumwolltuch abdekantiert, um lipidartiges Schwebematerial zu entfernen, und das unlösliche Pellet wurde verworfen.

Fällung bei 37 % Ethanol und Sammeln der Rohproduktpaste

Der in 23 % Ethanol lösliche flüssige Überstand wurde durch Zugabe von 4,33 l 95 % Ethanol tropfenweise unter Rühren im Verlauf von 30 Minuten auf 37 % Ethanol gebracht. Das Gemisch wurde anschließend unter Rühren 1 Stunde lang, sodann ohne Rühren 14 Stunden lang stehen gelassen, um eine vollständige Fällung zu garantieren. Das resultierende Gemisch wurde anschließend in einer 4 in.-(101, 6 mm)- Sharples-Einheit bei 15 000 Upm (Fließgeschwindigkeit = 0,2 1/min.) zentrifugiert, um das pelletisierte rohe Polysaccharid (im folgenden als Vor-Phenol-Pulver bezeichnet) gesammelt.

Verreiben

Das Pellet aus der Zentrifugation wurde in einen Waring- Mischer von einer Gallone (3,8 l), der 1 l absoluten Alkohol enthielt, übergeführt und 30 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit vermischt. Der Mischer wurde 30 Sekunden lang eingeschaltet und 30 Sekunden ausgeschaltet und weitergeführt, bis sich ein hartes weißes Pulver ergab. Das Pulver wurde auf einem Büchner-Trichter mit einer Teflon- Filterscheibe gesammelt und nacheinander in situ mit zwei l-Liter-Portionen absolutem Ethanol und zwei 2-Liter- Portionen Aceton gewaschen. Das Material wurde anschließend in vacuo bei 4 ºC 24 Stunden lang getrocknet, wobei sich 68 g (Trockengewicht) Produkt ergaben.

Phenolextraktion

Die 68 g des trockenen Materials aus der Verreibestufe wurden in 12 l 0,488 M Natriumacetat, pH 6,9, mit Hilfe eines Daymax-Dispersionsgefäßes resuspendiert. Die Natriumacetatlösung wurde sofort init 4,48 l einer frischen wäßrigen phenolischen Lösung extrahiert, die wie folgt hergestellt wurde. 900 ml 0,488 M Natriumacetat, pH 6,9, wurden in eine 5-Pfund-Flasche Phenol (Mallinckrodt, kristallin) in ein 20-Liter-Druckgefäß gegeben und vermischt, bis eine vollständige Lösung eintrat. Jeder Phenolextrakt wurde 2 1/2 Stunden lang bei 30 000 Upm und 4 ºC in der K2-Ultrazentrifuge (Elektronucleonics) zentrifugiert, um die Emulsion zu brechen. Der wäßrige Überstand wurde noch dreimal mit 3,2 l frischer wäßriger phenolischer Lösung auf ähnliche Weise extrahiert. Die Phenolphasen wurden verworfen.

Diafiltration

Die wäßrige Phase aus den vorstehenden Phenolextraktionen (17,6 l) wurde mit 300 l kaltem glasdestilliertem Wasser verdünnt und bei 4 ºC auf einer Amicon-DC-30-Ultrafiltrationsapparatur unter Verwendung von 3 H10P10-Patronen diafiltriert. Die Amicon-Einheit wurde ausgespült und das Spülwasser zu dem Retentat gegeben, so daß das Endvolumen 17,5 l betrug. Das Ultrafiltrat wurde verworfen.

Fällung bei 67 % Ethanol

0,438 l 2,0 M CaCl&sub2; wurde zu 17,5 l Dialysat aus der vorhergehenden Stufe (Endkonzentration an CaCl&sub2; betrug 0,05 M) gegeben und die Lösung unter tropfenweiser Zugabe im Verlauf von 1 Stunde von 35,88 l 95 % Ethanol zu der schnell gerührten Lösung auf 67 % Ethanol gebracht. Nach 4 Stunden Rühren und anschließendem Stehen für 12 Stunden bei 4 ºC wurde der klare flüssige Überstand abgesaugt und der Niederschlag durch Zentrifugieren in der 4 in.-(101,6 mm)- Sharples-Zentrifuge (15 000 Upm) bei 4 ºC 45 Minuten lang gesammelt. Das resultierende Polysaccharidpellet wurde in einem 1-Gallonen-(3,8 l)-Waring-Mischer unter Anwendung des Verfahrens von 30 Minuten eingeschaltet und 30 Minuten ausgeschaltet, mit 2 l absolutem Ethanol verrieben, auf einen Büchner-Trichter, der mit einer Teflon-Filterscheibe ausgestattet war, gesammelt und in situ mit vier 1-Liter- Portionen absolutem Ethanol und anschließend mit zwei 1-Liter-Portionen Aceton gewaschen. Die Probe wurde anschließend in einer austarierten Schale in vacuo bei 4ºC 20 Stunden lang getrocknet. Die Ausbeute betrug 39 g trockenes Pulver (im folgenden als Nach-Phenol-Pulver bezeichnet).

Endotoxinentfernung

Ein Schema des Verfahrens ist unten angegeben. Nach-Phenol-Pulver Citrat DOC in PFW HP-20-Harzbehandlung verbrauchtes Harz Citrat PFW Amicon-Membran-Diafiltration Citrat-Diafiltration Wasser-Diafiltration Ethanol Ethanol-Fällung, Zentrifugieren Überstand-Abfall Pulver-Produkt

Endotoxinentfernung

Ein Schema des Verfahrens ist unten angegeben. Nach-Phenol- PRP-Pulver wurde zu 2 mg/ml in einer Lösung von 3 % Natriumcitrat und 0,5 % Natriumdesoxycholat bei pH 8-9 aufgelöst. HP20 -Harz wurde zu 30 g Harz pro g PRP hinzugegeben (das Harz wurde vor der Verwendung mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen). Die losen Perlen wurden mit der PRP- Lösung in einem Umlaufschüttler 3 Stunden lang bei 4 ºC vermischt. Nach dem Vermischen wurden die Perlen aus der Lösung in einem Edelstahl-Filtertrichter entfernt. Das Filtrat wird anschließend in einer Amicon-H1P30-20-Hohlfaserpatrone (0,06 m² spezifische Oberfläche) gegen 5 Volumina 1,5 % Citrat und anschließend 10 Volumina pyrogenfreies Wasser diafiltriert, wobei eine geschätzte PRP-Konzentration von ≤2,5 mg/ml eingehalten wurde, um Detergens und Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wird gewonnen, und 2 M Calciumchlorid wird hinzugegeben, um eine Calciumchlorid-Endkonzentration von 0,05 M zu erzielen. PRP wird mit einem Überschuß an 95 % Ethanol aus der Lösung ausgefällt. Der Niederschlag wird bei 13 000 x g 30 Minuten lang zentrifugiert, das Pellet mit absolutem Ethanol und Aceton verrieben und anschließend im Vakuum getrocknet. Das fertige Pulver wird in einen Probenbehälter übergeführt und bei -70 ºC eingefroren.
Die Endotoxinkonzentration wurde zwischen Ausgangs- und Endpulver zwischen 100- und 21 000fach verringert. Die PRP-Ausbeute von Ausgangs- zu Endpulver liegt zwischen 75 und > 90 %.
900 mg Nach-Phenol-Pulver wurden verarbeitet. Die quantitative Bestimmung von Endotoxin erfolgte unter Anwendung des gut bekannten Königskrabben-Amöbozytzelllysat-Tests (LAL-Test). Wie nachstehend gezeigt, verringerte sich der LAL-Wert nach den verschiedenen Verfahrensstufen (1 EU/ug Polysaccharid = 100 ppm):

LAL-Testwert (ppm)

Beginn - 18 000
nach Behandlung mit HP20 -Harz -12
nach Behandlung mit Hohlfaser - 12
fertiges Pulver - 6
Der durch das Verfahren herbeigeführte PRP-Verlust war unwesentlich. Die PRP-Mengen, die bei den verschiedenen Stufen des Verfahrens zurückblieben, entsprachen dem Prozentsatz der Ausgangsmenge und sind nachstehend angegeben:
Beginn - 100 %
nach Behandlung mit HP20 -Harz - 93
nach Behandlung mit Hohlfaser - 90
fertiges Pulver - 75

BEISPIELE 20, 21, 22, 23, 24 und 25

Im Anschluß an das Verfahren zur Endotoxin-Entfernung, das in Beispiel 19 beschrieben worden ist, wobei eine Natriumdesoxycholatkonzentration von 0,5 % eingehalten wird und mit Pulver begonnen wird, das einen LPS-Wert von 260 EU/ug besitzt, erhielten wir hinsichtlich LAL mit diesen variierenden Mengen an Natriumcitrat die folgende Verringerung: % Natriumcitrat Beispiel

BEISPIELE 26, 27 und 28

Unter Befolgen des Verfahrens zur Endotoxin-Entfernung, das in Beispiel 19 beschrieben worden ist, wobei eine Natriumcitratkonzentration von 6 % beibehalten und mit einem Pulver begonnen wurde, das einen LPS-Wert von 260 EU/ug aufwies, erhielten wir hinsichtlich LAL mit diesen variierenden Mengen an Desoxycholat die folgende Verringerung. % Natriumdesoxycholat Beispiel

BEISPIELE 29, 30, 31, 32 und 33

Unter Befolgung des allgemeinen Verfahrens in Beispiel 19 umfassen diese Beispiele die Beschreibung der Verfahrensabänderungen und des resultierenden LPS-Wertes, der aus einem Pulver erhalten wurde, das ursprünglich 260 EU/mg aufwies. Verfahrensabänderung LPS EU/ug, Durchschnitt Beispiel 29 Nach Behandlung gemäß Beispiel 3 wird das Verfahren wiederholt. Beispiel 30 Nach Behandlung gemäß Beispiel 3 wird das Filtrat mit 3 % Natriumcitrat diafiltriert, Natriumdesoxycholat wird-zugegeben und die Lösung noch 3 weitere Stunden lang mit dem ursprünglichen HP-20-Harz behandelt. Beispiel 31 Nach 3 Stunden Behandlung mit HP-20 gemäß Beispiel 3 wurde ein gleiches Volumen von 3 % Citrat mit 0,5 % Natriumdesoxycholat zu dem Gemisch gegeben und die Harzbehandlung noch 3 Stunden lang fortgesetzt. Beispiel 32 Nach 3 Stunden gemäß Beispiel 3 wurden Natriumcitrat- und Natriumdesoxcycholatpulver hinzugegeben und die Behandlung mit Harz noch 3 Stunden lang fortgesetzt. Beispiel 33 a, b (a) 6 % Natriumcitrat mit 0,5 % Natriumdesoxycholat oder (b) 6 % Natriumcitrat mit 1 % Natriumdesoxycholat wurden 3 Stunden lang eingesetzt.

BEISPIEL 34

Sämtliche Verfahrensstufen aus Beispiel 1 werden angewendet, außer daß das Harz in eine Säule gepackt wird, anstatt batchweise mit PRP vermischt zu werden. Somit wird PRP in einer Lösung von Natriumcitrat und Natriumdesoxycholat aufgelöst, und die resultierende Lösung wird über die Säule gegeben. Das resultierende Produkt entspricht demjenigen, das in Beispiel 19 erhalten wurde.

BEISPIEL 35

Sämtliche Verfahrensstufen aus Beispiel 1 werden wiederholt, außer daß das Harz in eine Patrone gepackt wird, statt batchweise mit PRP vermischt zu werden. Somit wird PRP in einer Lösung von Natriumcitrat und Natriumdesoxycholat aufgelöst, und die resultierende Lösung wird durch die Patrone zirkuliert. Das resultierende Produkt entspricht demjenigen, das in Beispiel 19 erhalten worden war.

BEISPIEL 36

In diesem Beispiel werden sämtliche Verfahrensstufen von Beispiel 19 befolgt. Gemäß diesem Verfahren wird 1 g PRP verarbeitet. Die Ergebnisse sind unten angegeben.

LAL-Testwert (ppm)

Beginn - 11 000
nach Behandlung mit HP20-Harz - 15
nach Behandlung mit Hohlfaser- 11,2
fertiges Pulver - 6
Der durch das Verfahren verursachte PRP-Verlust war nicht wesentlich. Die PRP-Mengen, die zu verschiedenen Stadien des Verfahrens zurückblieben und durch den Prozentsatz der Anfangsmenge dargestellt sind, sind unten angegeben:
Anfang - 100 %
nach Behandlung mit HP-20 -Harz - 96
nach Behandlung mit Hohlfaser - 93
fertiges Pulver - 91
Das durch dieses Verfahren erhaltene Material entsprach allen derzeitigen chemischen Anforderungen.

BEISPIEL 37

In diesem Beispiel wurde das Verfahren aus Beispiel 19 befolgt, außer daß 6 % Natriumcitrat und 0,75 % Natriumdesoxycholat anstelle von 3 % Natriumcitrat und 0,5 % Natriumdesoxycholat verwendet wurden. Das Verfahren wurde auf vier verschiedene Chargen des Nach-Phenol-Pulvermaterials (a, b, c und d) angewendet. Die Verringerungen des LAL-Testwertes (EU/ug), die erzielt wurden, sind unten angegeben. LAL-Testwert (EU/ug) Anfang Ende

BEISPIEL 38

Isolierungsverfahren für H. influenzae-Polysaccharid mit selektiver Ethanolfraktionierung

Eine schematische Darstellung des in diesem Beispiel befolgten Verfahrens ist unten gezeigt. ISOLIERUNGSVERFAHREN FÜR H. INFLUENZAE-POLYSACCHARID MIT SELEKTIVER ETHANOLFRAKTIONIERUNG Fermentation Inaktivierung Zentrifugieren Zellen verwerfen geklärter Überstand Konzentrieren Permeat-Abfall ROMICON-Pool Ethanol Ethanol Fraktionierung Pasten-Abfall Überstand-Abfall Produktpaste CaCl&sub2;-Zugabe CaCl&sub2;-Extrakt Vor-Phenol-Pulver Phenol 4 Phenol-Extraktionen Phenol-Abfall 4. wäßr. Extrakt Verdünnung Konzentrieren CaCl&sub2;-Zugabe Fällung Permeat-Abfall Überstand-Abfall Nach-Phenol-Pulver selektive Ethanolfraktionierung Niederfraktionspulver Pulver-Produkt
H. influenzae Typ B wurde in einem 800-Liter-Fermenter (640 l Arbeitsvolumen) gezüchtet. Eine Probe zur Kulturreinheit wurde erhalten und die Kultur in einen Abtötungstank übergeführt, wo sie mit Thimerosal behandelt wurde. Nach Beendigung des Abtötungscyclus (10 Stunden bei 37 ºC) wurde die Temperatur abgesenkt, und die Nährlösung wurde dort gehalten, bis sie für den Lebensfähigkeitstest der Kultur entnommen wurde (30 Stunden). Die inaktivierte Vollösung wurde sodann aus dem Behältnis entnommen, die Zellen und weiteres Abfallmaterial durch eine Sharples-Zentrifugation entfernt und die geklärte Lösung bei 2-8 ºC aufbewahrt. Da PRP in die Kulturmedien abgegeben wurde, wurden die gesammelten Zellen nach dem Wiegen verworfen. Die verdünnte zellfreie Nährlösung wird konzentriert und eine erste Ethanolfraktionierung wird durchgeführt, um verunreinigendes Protein, Nucleinsäure und Endotoxin zu entfernen. Eine zweite Ethanolfraktionierung wird anschließend durchgeführt, um die konzentrierte Nährlösung weiter zu reinigen, worauf eine Reihe von Phenolextraktionen zur Entfernung von restlichem Protein, Endotoxin und Pigmenten folgt. Diese Fraktionierungen und Extraktionen führen zu einem Material, das unerwünschte Mengen an Endotoxin enthält.
In der Stufe der selektiven Ethanolfraktionierung wurde das Lipopolysaccharid mit zunehmender Alkoholkonzentration zusammen mit etwas Polysaccharid ausgefällt, wobei Polysaccharid in der Lösung zurückblieb, das weniger war als die Lipopolysaccharidkonzentration. Der Niederschlag, der wesentliche Mengen Lipopolysaccharid mit Polysaccharid enthält, ist als "Niederfraktion" bekannt.
Somit wurde die Lösung, aus der Endotoxin entfernt werden sollte, abgekühlt, und ein Salz, wie CaCl&sub2; oder NaCl, wurde hinzugeben. Der gekühlte denaturierte Alkohol wurde zugegeben, um eine Konzentration zu erreichen, die leicht unterhalb (etwa 0,5-1 % unterhalb) des Trübungspunktes (siehe Diagramm 1) lag. Die anschließende stufenweise Zugabe von etwa 0,2 % Alkohol auf einmal wurde durchgeführt, bis eine zweifache Zunahme der Trübung eintrat, worauf der Trübungspunkt erreicht war.
Die aus dem Test a, c, d und e in Tabelle 1 erhaltenen Produkte zeigen dramatische Reduktionen der Endotoxinkonzentrationen, wenn das erfindungsgemäße Verfahren befolgt wird. Die Verringerung der Endotoxinkonzentration wird durch Messung der Werte in dem Königskrabben-Amöbozytzelllysat (LAL-Tests) bestimmt. Der Test ist in "Guideline on validation of the LAL test as an end product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products and medical devices" beschrieben, U.S. Departement of Health an Human Services, Dezember 1987. Das Produkt aus Test e, das eine unerwartet hohe Endotoxinkonzentration zeigte, wurde ein zweites Mal durch eine selektive Ethanolfraktionierung behandelt, deren Ergebnisse bei dem Produkt von Test f angegeben sind.
Um die selektive ethanolische Fraktionierung zu erzielen, wurde das Nach-Phenol-Pulver zu 2,5 g/l in einer 0,05 M CaCl&sub2;-Lösung solubilisiert, um ein zweiwertiges Gegenion sowohl für Endotoxin als auch PRP zu liefern. Alkohol wurde anschließend zugegeben, um eine Konzentration von 26 % (Vol./Vol.) zu erreichen. Nachdem sich die Temperatur auf einen konstanten Wert im Bereich von 2 bis 4 eingependelt hatte, wurde Alkohol in kleinen Mengen zugegeben, bis PRP auszufallen begann (Trübungspunkt), wodurch eine Trübung erzeugt wurde, wie durch eine Trübungsmeßsonde aufgezeichnet.
Diagramm 1 ist eine Auftragung von % Alkohol am Trübungspunkt gegen die Temperatur einer PRP-Pulverlösung. Der Prozentsatz an Alkohol, der benötigt wird, um den Trübungspunkt bei 6 ºC zu erreichen, betrug 27,4 %, jedoch waren für 4 ºC nur 26,7 % erforderlich. Diese anscheinend kleine Zunahme entspricht 700 ml für einen 100-Liter-Versuch. Bekannte Daten wurden eingesetzt, um zu entscheiden, wieviel zusätzlicher Alkohol nach dem Erreichen des Trübungspunktes zugegeben werden sollte, um das Lipopolysaccharid zu verringern, daß es der Anforderung entspricht. Die Ausbeute an fertigem Pulver nahm ab, als der Unterschied zwischen niederfraktionärem Alkoholprozentsatz und Prozentsatz am Trübungspunkt zunahm. Diagramm 2 zeigt, daß eine Zunahme des Alkoholgehalts um 1 % der Alkoholkonzentration am Trübungspunkt 50 % des PRP entfernte. Die Verringerung von Endotoxin, wie gemessen durch LAL, war etwa 10fach. Darum genügte die Alkoholzugabe von 1 % nicht, um das Endotoxin auf eine Konzentration von 3 EU/ug zu verringern, wenn der Wert des Ausgangs-LAL größer als 30 EU/ug war.
Nachdem der Alkohol für die Niederfraktion zugegeben worden war, wurde die Lösung sofort zentrifugiert, um die Niederfraktion zu entfernen. Zu dem Überstand wurde noch Alkohol bis 38 % (Vol./Vol.) hinzugegeben. Der gewünschte Niederschlag wurde über Absetzen und/oder Zentrifugieren gesammelt und bis zu dem fertigen Pulver getrocknet. Typische Ausbeuten in dieser Stufe unter Verwendung von 1,2 bis 2 % Alkohol oberhalb des Trübungspunktes betrugen 30-40 % am Nach-Phenol-Pulver oder 13-18 % der Menge des Fermenters.
Das Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung kann wiederholt werden, wenn das fertige Pulver nicht die Pyrogenanforderung erfüllt. Für die erneute Bearbeitung des Produkts aus Test e wurde die Alkoholkonzentration um 0,2 % über den niederfraktionären Alkoholprozentsatz angehoben. Die Ausbeute betrug 78 %, und der Endotoxingehalt wurde von 2,8 auf 0,09 EU/ug verringert.
Das Polysaccharidprodukt, das sich durch das erfindungsgemäße Verfahren der Endotoxin-Entfernung ergibt, ist insbesondere geeignet, wo Endotoxin-freies Polysaccharid- Polyribosylribitolphosphat erwünscht ist. Es konjugiert leicht mit Proteinen, z.B. immunogenen Proteinen, wie in der von Marburg et al. (ibid) beschriebenen Weise. Die Konjugate sind stabile Polysaccharid-Proteinkonjugate, die über Spacer mit zwei Enden gekuppelt sind, die eine Thioethergruppe und ein primäres Amin enthalten, das mit dem Polysaccharid und dem Protein hydrolysestabile kovalente Bindungen bildet. Beispielhafte Konjugate sind diejenigen, die durch die Formel Ps-A-E-S-B-Pro oder Ps-A'-S-E'-B'-Pro dargestellt sind, worin Ps ein Polysaccharid darstellt, Pro für ein Bakterienprotein steht und A-S-E-B und A'-S-E'-B' Spacer mit zwei Enden bedeuten, die hydrolysestabile kovalente Thioetherbindungen enthalten, und kovalente Bindungen (wie hydrolyselabile Ester- oder Amidbindungen) mit den Makromolekülen Pro und Ps bilden. Die speziellen Definitionen für A, E, S, B, A' und B' sind bei Marburg et al. angegeben. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden und Proteinen zur Konjugation, zur Durchführung einer Konjugation und zur Bestimmung von einer Konjugation sind in der Patentschrift beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur Entfernung von Endotoxin aus einem Fermentationsprodukt gramnegativer Bakterien, welches die Stufen umfaßt:

(a) Zuchten von gramnegativen Bakterien in einem Fermentationsmedium, Freisetzen von Polysaccharid in das Medium und Zugeben von Alkohol zu dem Medium, um Verunreinigungen durch Ausfällen zu entfernen;

(b) Isolieren der verbleibenden hochmolekularen Spezies und ihr Auflösen in Calciumchloridlösung, Entfernen weiterer Verunreinigungen, indem mindestens eine weitere Alkoholfraktionierung durchgeführt wird, Sainmeln und Trocknen des zweiten Alkoholniederschlags, Auflösen des so erhaltenen, trockenen Pulvers in Natriumacetat und Extrahieren mit Phenol, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich Entfernen von Phenol aus der wäßrigen Lösung, die Polysaccharid enthält, durch Diafiltration mit Wasser;

(c) Zentrifugieren der restlichen hochmolekularen Spezies und Wiederauflösen in einer Lösung zweiwertiger Gegenionen; und

(d) Zugeben von Alkohol zu der Lösung, Abkühlen der Lösung und danach schrittweises Zugeben von Alkohol, um eine Fällung von Lipopolysaccharid/Polysaccharid zu erzielen;

dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die folgende Stufe umfaßt:

(e) Vermischen des lipopolysaccharid- und polysaccharidhaltigen Materials, das aus der Alkoholzugabe stammt, mit einem nichtionischen Harz, einem Detergens und einem Chelatbildner bei einem basischen pH-Wert, um Lipopolysaccharid zu entfernen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die anfängliche Zugabe des Alkohols und die Temperatur nach dem Abkühlen in Stufe (d) zu einer Alkoholkonzentration führen, die bis zu 2 % unter der Alkoholkonzentration am Trübungspunkt liegt, die als der Prozentsatz von Alkohol definiert ist, bei dem Endotoxin und Polysaccharid auszufallen beginnen und eine Trübung verursachen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Polysaccharid Polyribosylribitolphosphat ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Chelatbildner Natriumcitrat ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Detergens Desoxycholat ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Harz ein hochporöses Styrol- und Divinylbenzol-Copolymer ist.

7. Verfahren zur Entfernung von Endotoxinen aus der äußeren Zelle gramnegativer Bakterien, das die Stufen umfaßt:

(a) Züchten von gramnegativen Bakterien in einem Fermentationsmedium, Freisetzen von Polysaccharid in das Medium und Zugeben von Alkohol zu dem Medium, um Verunreinigungen durch Ausfällen zu entfernen;

(b) Isolieren der verbleibenden hochmolekularen Spezies und ihr Auflösen in Calciumchloridlösung, Entfernen weiterer Verunreinigungen, indem mindestens eine weitere Alkoholfraktionierung durchgeführt wird, Sammeln und Trocknen des zweiten Alkoholniederschlags, Auflösen des so erhaltenen, trockenen Pulvers in Natriumacetat und Extrahieren mit Phenol, um Verunreinigungen zu entfernen, und schließlich Entfernen von Phenol aus der wäßrigen Lösung, die Polysaccharid enthält, durch Diafiltration mit Wasser; und

(c) Ausfällen und Entfernen von Verunreinigungen durch Zugabe von Ethanol zu dem Produkt aus (b);

dadurch gekennzeichnet, daß es ferner die folgenden Stufen umfaßt

(d) Trocknen der resultierenden Lösung aus (c) und Auflösen des resultierenden Pulvers in einer Lösung des Chelatbildners und des Detergens bei einem basischen pH-Wert und Vermischen des nichtionischen Harzes unter geeigneten Bedingungen; und

(e) Entfernen des Harzes, des Chelatbildners und des Detergens und Ausfällen des Polysaccharids aus der Lösung mit Ethanol, Zentrifugieren des Niederschlags, Verreiben des Pellets mit Ethanol und Trocknen des resultierenden Produkts unter Bildung eines Pulvers.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Polysaccharid Polyribosylribitolphosphat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Chelatbildner Natriumcitrat ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Detergens Natriumdesoxycholat ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das Harz ein hochporöses Styrol- und Divinylbenzol-Copolymer ist.

12. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Alkoholkonzentration, die sich aus der anfänglichen Zugabe von Alkohol ergibt, zwischen etwa 0,5 und 1 % unterhalb der Alkoholkonzentration des Trubungspunktes, wie in Anspruch 2 definiert, für diese Temperatur liegt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dein die Alkoholkonzentration wiederholt um 0,2 % vergrößert wird, wobei die Temperatur konstant gehalten wird, bis der Trübungspunkt erreicht ist, wie in Anspruch 2 definiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das ausgefallene Material, nachdem der Trübungspunkt erreicht ist, entfernt wird, wie in Anspruch 2 definiert ist, und das Polysaccharid, das in der Lösung verbleibt, getrocknet wird.