DE69010388T2

DE69010388T2 - Demethylallosamidin und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Info

Publication number: DE69010388T2
Application number: DE69010388T
Authority: DE
Inventors: Shohei Sakuda; Seiji Takayama; Yasuhiro Yamada
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2010-04-28
Also published as: US5104855A; EP0395106B1; US5070191A; EP0395106A1; DE69010388D1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Allosamidin-Derivat, eine fungizide Zusammensetzung, eine insektizide Zusammensetzung und einen Chitinase-Inhibitor, die dieses als Wirksubstanz enthalten.
Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des neuen Allosamidin-Derivats und einen Mikroorganismus Streptomyces sp. AJ 9463 (Ferm BP-2801), der zur Bildung dieser Verbindung befähigt ist.
Chitin ist der Hauptbestandteil der Zellwände von Pilzen (G.W. Gooday und A. Trinci, Symposia of the Society for General microbiology, 30, 207-251, 1980). Es wird davon ausgegangen, daß während der wiederholten Teilung und Vermehrung von Pilzen eine ausgewogene Synthese und Zersetzung von Chitin stattfindet (G.W. Gooday et al., "Chitin in Nature and Technology", Seiten 83-91, herausgegeben von R.A.A. Muzzarelli et al., Plenum Press, New York, 1986).
Weiter ist Chitin der Hauptbestandteil der Cuticula von Insekten, und es ist auch bekannt, daß Synthese und Zersetzung von Chitin während der Häutung und des Wachstums von Insekten genauestens gesteuert werden (K.J. Kramer et al., "Comprehensive Insect Physiology Biochemistry and Pharmacology", Bd. 3, S. 75, herausgegeben von G.A. Kerkut und L.I. Gilbert, Pergamon Press, Inc., New York, 1985).
Es ist bekannt, daß die Biosynthese und die Zersetzung von Chitin hauptsächlich durch zwei Enzyme, nämlich Chitinsynthase und Chitinase, gesteuert werden.
Demnach wird erwartet, daß Inhibitoren für diese Enzyme einen neuen Typ von fungiziden Mitteln oder Insekten-Wachstumsregulatoren (Insektiziden) darstellen können.
So ist in der Tat Polyoxin, ein Chitinsynthase-Inhibitor, für die Verwendung als Fungizid in der Landwirtschaft vorgeschlagen worden. Es wird auch über eine inhibitorische Aktivität bei der Häutung von Insekten in vivo berichtet (E. Cohen und J.E. Cashida, Pestic. Biochem. Physiol., 17, 301-306, 1982).
Bislang wurde nur Allosamidin als Chitinase-Inhibitor gefunden (S. Sakuda et al., J. Antibiotics, 40, 296-300, 1987), welches die von Insekten herstammende Chitinase vom Endo-Typ stark hemmt, so daß man sich einen Nutzen davon erwarten konnte, es als insektizides oder akarizides Mittel einzusetzen (japanische offengelegte Patentanmeldung No. 62-207294).
Allosamidin zeigt jedoch nur eine schwache inhibitorische Aktivität gegen von Pilzen stammende Chitinase, so daß nicht in Betracht gezogen wurde, es als Fungizid zu verwenden.
Deshalb wurden erfindungsgemäß ausgedehnte Forschungen durchgeführt, um Inhibitoren für von Pilzen stammmende Chitinase aus natürlichen Quellen zu schaffen. Als Ergebnis wurde gefunden, daß verschiedene Allosamidin produzierende Bakterien eine Verbindung produzieren, welche eine außerordentlich starke inhibitorische Aktivität aufweist.
Die Erfindung betrifft eine Verbindung, die durch die folgende Formel dargestellt ist:
sowie eine fungizide Zusammensetzung, eine Chitinase-Inhibitor- Zusammensetzung und eine insektizide Zusammensetzung, die diese Verbindung als Wirksubstanz enthalten.
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, das darin besteht, daß zur Bildung der Verbindung nach Anspruch 1 befähigte Bakterien einer Streptomyces-Species gezüchtet werden und die Verbindung aus der Kultur isoliert wird. Ferner ist ein Mikroorganismus, d.h. Streptomyces sp. AJ 9463 (Ferm BP-2801), Gegenstand der Erfindung.
Die Verbindung der Formel (I) wird als Demethylallosamidin bezeichnet, da die Verbindung dieselbe Struktur wie Allosamidin hat, mit der Ausnahme, daß eine Methylgruppe des Restes -N(CH&sub3;)&sub2; des Allosamidins entfernt ist. Die Verbindung der Formel (I) weist deshalb die Gruppe -NHCH&sub3; auf.
Fig. 1 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von Demethylallosamidin. Der zum Produzieren von Demethylallosamidin befähigte Bakterienstamm ist auf der Grundlage seiner bakteriologischen Eigenschaften als zur Streptomyces-Species zugehörig identifiziert worden. Dies bedeutet, daß er unter aeroben Bedingungen in einem ISP-3-Medium wächst, wie es für die Identifizierung von Actinomyces verwendet wird, daß er Luftmyzelien bildet, kein Sporangium bildet und Substratmyzelien bildet, die jedoch nicht geteilt werden. Sein Substratmyzel bildet eine lange Sporenkette. Der Sporenträger ist nicht verwirbelt. In den Zellwänden ist LL-Diaminopimelinsäure enthalten, es ist kein charakteristischer Zucker vorhanden, und das Phospholipid ist vom Typ PII. Als Beispiel für einen Stamm der Streptomyces-Species, der zum Produzieren von Demethylallosamidin nach der Erfindung befähigt ist, wird Streptomyces sp. AJ 9463 (FERM P-10642, FERM BP-2801) genannt.
Zum Produzieren von Demethylallosamidin werden hierzu befähigte Bakterien, beispielsweise Streptomyces sp. FERM P-10642 (FERM BP-2801) in einem geeigneten Medium gezüchtet und das Demethylallosamidin aus diesem isoliert.
Das Züchtungsverfahren kann auf jede beliebige, für das Züchten von Mikroorganismen geeignete Weise durchgeführt werden. Jedoch wird im allgemeinen die Submerskultur in einem flüssigen Medium bevorzugt. Für die Kultur kann jedes beliebige Medium verwendet werden, so lange es Nährstoffquellen enthält, die durch die produzierenden Bakterien ausgenutzt werden können. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Glucose, Fructose, Stärke, Dextrin usw. Beispiele für Stickstoffquellen sind Fleischextrakt, Casein, Gluten, Hefeextrakt, Sojabohnenpulver, Maiseinweichflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw. Außerdem können, falls erforderlich, auch anorganische Salze, wie Natriumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat usw. verwendet werden. Weiter können auch kleine Mengen von Siliconverbindungen, höheren Alkoholen, pflanzlichen Ölen usw. zugefügt werden, falls während des Züchtens eine starke Schaumbildung auftritt.
Die Temperatur für die Kultur kann vorteilhaft im Bereich von 20 bis 35ºC, am meisten bevorzugt bei etwa 27ºC, liegen. Die Zeitdauer für die Kultur kann vorteilhaft etwa 1 bis 10 Tage betragen, jedoch kann dies in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen in geeigneter Weise variieren.
Das durch das Züchten produzierte Demethylallosamidin wird hauptsächlich innerhalb der Zellen angereichert. Deshalb wird esim allgemeinen durch Zentrifugieren, Filtration usw. auf jede beliebige für die Isolierung von Antibiotika gebräuchliche Weise aus den Zellen isoliert und gereinigt. Die Isolierung und Reinigung kann durch Lösungsmittelextraktion mit einem niederen Alkohol, wie Methanol, n-Butanol usw., durch Adsorptions- Säulenchromatographie unter Verwendung von Silicagel, Diatomeenerde, Avicel, Aluminiumoxid usw., durch Gelfiltration unter Verwendung von TOYO PEARL HW 40 (Träger für die Gelfiltration, hergestellt von Toyo Soda Mfg. Co., Ltd.), durch verschiedene Ionenaustausch-Chromatographieverfahren, durch Umkehrphasenchromatographie und durch HPLC unter Verwendung von octadodecyliertem Silicagel (ODS) als Träger sowie auch durch Gegenstromverteilung durchgeführt werden, wobei die Reinigung durch Kristallisation, Umkristallisation usw. vorgenommen werden kann. Diese Verfahren können nacheinander oder in geeigneter Kombination durchgeführt werden.
Das so isolierte und gereinigte Demethylallosamidin weist eine starke inhibitorische Aktivität gegenüber von Pilzen herstammender Chitinase auf, die pro Gewichtseinheit Demethylallosamidin 100-mal so stark ist wie die von Allosamidin.
Außerdem ist die Cytotoxizität von Demethylallosamidin niedrig. So wurde bei einer Dosis von 1 mg/ml keine Wachstumshemmung von aszitischen Brustkrebszellen bei Mäusen oder von Leukämiezellen beim Menschen beobachtet.
Das Demethylallosamidin nach der Erfindung wird als Wirksubstanz in Fungizidzusammensetzungen, in Chitinase-Inhibitor- Zusammensetzungen oder in Insektizidzusammensetzungen verwendet. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche Maßnahmen und Verfahren und unter Verwendung gebräuchlicher Bestandteile und Additive hergestellt werden.
Das Präparat kann jede beliebige Form haben, wie als Lösung, Emulsion, Suspension, Paste, Pulver und dergleichen vorliegen. Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf ein Beispiel erläutert.

Beispiel

(1) Herstellung von Demethylallosamidin

Es wurde ein Medium (pH-Wert 7,2), bestehend aus Glucose (12 g), Fleischextrakt (1,2 g), Pepton (2,4 g), Hefeextrakt (1,2 g) und Wasser (1,2 l), hergestellt, wonach jeweils 100 ml des Mediums separat in 12 Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von jeweils 500 ml gegeben wurden.
Nachdem 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert worden war, wurde jedes Medium mit einer Platinschlinge mit Schrägkultur erhaltenen Zellen von Streptomyces sp. AJ 9463 (FERM P-10642 (FERM BP-2801)) beimpft. Es wurde 3 Tage bei 28ºC eine Schüttelkultur durchgeführt, um eine Keimmutterlauge zu erhalten. Außerdem wurden 60 l eines Mediums mit der oben beschriebenen Zusammensetzung hergestellt und in einen Kulturbehälter mit einem Volumen von 100 l gegeben, wonach 30 Minuten bei 120ºC sterilisiert wurde. Dem Medium wurden 1,2 l der oben beschriebenen Keimmutterlauge zugesetzt, wonach 5 Tage bei 27ºC gezüchtet wurde. Während des Züchtens betrug die Rührrate 200 Umdrehungen/min und die Luftströmungsgeschwindigkeit 60 l/min. Nachdem zu der erhaltenen Kultur Celite zugesetzt worden war, wurde die Kultur durch einen Trichter filtriert, wodurch ein Gemisch von Zellen und Celite erhalten wurde. Das Gemisch wurde mit Methanol (8 l) versetzt. Nach gründlichem Rühren ließ man das Gemisch über Nacht absitzen. Das Gemisch wurde filtriert, wodurch ein methanolischer Extrakt erhalten wurde. Nachdem der Extrakt unter vermindertem Druck auf etwa 1 l konzentriert worden war, wurde dem Rückstand destilliertes Wasser in einer Menge zugegeben, daß insgesamt ein Volumen von 6 l erhalten wurde. Die Gesamtmenge wurde zur Adsorption durch eine Aktivkohlesäule (Volumen 600 ml) gegeben. Nachdem die Säule mit destilliertem Wasser (1,8 l) gewaschen worden war, wurde nacheinander mit 10 %igem Ethanol (3 l), 25 %igem Ethanol (3 l) und 50 %igem Ethanol (3 l) eluiert. Die Aktivität wurde hauptsächlich in der mit 25 %igem Ethanol eluierten Fraktion beobachtet. Nachdem die Fraktion unter vermindertem Druck auf etwa 2 l konzentriert worden war, wurde zu dem Konzentrat Essigsäure zugesetzt, um den pH-Wert der Flüssigkeit auf 3,8 einzustellen. Die Flüssigkeit wurde an einer SP-Sephadex-C-25- Kationaustauschersäule (Volumen 160 ml), die mit 50 mMol Ammoniumacetat/Essigsäure (pH-Wert 5,0) äquilibriert worden war, adsorbiert. Es wurde mit demselben Puffer eine einstufige Eluierung durchgeführt, wobei Fraktionen von jeweils 8 ml entnommen wurden. Es wurde die Aktivität jeder Fraktion ermittelt und in zwei Fraktionen eingeteilt: Fraktionen Nr. 55 bis 64 mit schwacher spezifischer Aktivität und Fraktionen Nr. 65 bis 75 mit starker spezifischer Aktivität. Von diesen wurde die Komponente von Nr. 55 bis 64 auf der Grundlage ihrer verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die durch FABMS, NMR usw. gemessen wurden, als Allosamidin identifiziert. Die Fraktionen Nr. 65 bis 75 wurden mit einer kleinen Menge Aktivkohle entsalzt, dann unter vermindertem Druck konzentriert und schließlich unter Verwendung einer schwach kationischen Austauschsäule (Asahipak ES-502C) durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt (bewegliche Phase: 10 mMol Ammoniumacetat/Ammoniak (pH-Wert 8,9), Fließrate: 1,0 ml/min). Die Messung erfolgte durch UV- Absorption bei 220 nm, wobei zwei Spitzen, die eine Retentionszeit (tR) von 7,0 Minuten und 8,8 Minuten zeigten, beobachtet wurden. Die jeweiligen Fraktionen wurden gefriergetrocknet. Von diesen wurde die Substanz mit tR = 8,8 Minuten aufgrund ihrer verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften als Allosamidin identifiziert. Die andere Substanz mit tR = 7,0 Minuten wurde auf der Grundlage des HPLC unter Verwendung verschiedener ionenaustauschsäulen, in dem sie nur eine einzige Spitze zeigte, und auf der Grundlage ihrer verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie nachfolgend erläutert, als Demethylallosamidin identifiziert.
(1) Aussehen: weißes Pulver
(2) Summenformel: C&sub2;&sub4;H&sub4;&sub0;N&sub4;O&sub1;&sub4;
(3) FABMS: m/z 609 (M+H)&spplus;, Glycerin-Matrix
(4) UV-Absorptionsspektrum: Terminal-Absorptionsmaximum (in 0,1 n Essigsäure)
(5) ¹H-NMR-Spektrum: wie in Fig. 1 gezeigt (600 MHz, D&sub2;O + AcOD) (2) Messung der Chitinase-Inhibitor-Aktivität von Demethylallosamidin
Demethylallosamidin der Formel (I), das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, weist eine starke inhibitorische Aktivität gegenüber von Pilzen stammender Chitinase auf.
(i) Herstellung einer Chitinaselösung
In einen Sakaguchi-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 2 l wurden 1 l eines 25 mM MES-Puffers (Nakarai Chemical Co., Ltd.), der 0,1 % ß-Mercaptoethanol und 200 g Bäckerhefe (Kanegafuchi Chemical Industry Co.1 Ltd.) enthielt, eingebracht, wonach 2 Stunden bei 30ºC und einer Schüttelfrequenz von 120/min geschüttelt wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt (0ºC, 10 min, 12 000 g). Die erhaltene überstehende Lösung wurde durch Ultrafiltration (TOYO ULTRAFILTER UP-20) auf 200 ml konzentriert. Nach dem Konzentrieren wurden dem Konzentrat 400 ml Citratpuffer (0,15 m Citronensäure + 0,15 m Natriumcitrat, pH-Wert 3,0) zugesetzt. Nachdem die gebildeten Niederschläge abzentrifugiert worden waren (0ºC, 10 min, 12 000 g), wurde die erhaltene überstehende Lösung erneut durch Ultrafiltration auf 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde bei 4ºC gelagert und für den Versuch als Chitinaselösung verwendet.

(ii) Herstellung des Enzymsubstrats

Nachdem 10 ml 10 %ige Essigsäure langsam zu 0,5 g Chitosan (PFANSTIEHL LABORATORIES INC.) zugesetzt worden waren, wurde das Gemisch in einem Mörser verknetet, bis es gelartig wurde. Nach Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur wurden unter gründlichem Rühren des Gemisches 45 ml Methanol zugefügt. Danach wurde das Gemisch durch Gaze filtriert, wonach dem erhaltenen Filtrat 0,75 ml ³H-markiertes Essigsäureanhydrid (NET 018A10 ACETIC ANHYDRIDE 5 mCi) zugegeben wurde. Das gebildete agar-ähnliche Chitin wurde mit einem Homogenisator homogenisiert, auf einem Glasfilter (Whatman GF/B) gesammelt und in 10 ml Citratpuffer (pH-Wert 3,0) suspendiert. Diese Chitinsuspension (2,3 uCi/ml, Chitinsuspension) wurde als Substrat für den Versuch verwendet.

(iii) Verfahren zur Messung der Chitinase-Inhibitor- Aktivität

90 ul der Chitinaselösung und 10 ul der ³H-Chitinsuspension wurden in ein Eppendorf-Rohr gegeben und 3 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Als Blindprobe wurden in diesem Fall 90 ul Citratpuffer (pH-Wert 3,0) anstelle der 90 ul der Enzymlösung verwendet und auf gleiche Weise umgesetzt. Nach der Reaktion wurden 100 ul 10 %ige Trichloressigsäure zugesetzt und die Reaktionslösung durch ein Glasfilter gegeben (Whatman GF/B). Nachdem dem erhaltenen Filtrat 10 ml Szintillationssubstanzlösung zugesetzt worden waren, wurde seine Radioaktivität (dpm) gemessen. Die Differenz zwischen dem so gemessenen Wert und der Radioaktivität der Blindprobe wurde als Chitinase-Aktivität definiert.
Die Szintillationssubstanzlösung wurde hergestellt, indem 4 g Ominiflour (Daiichi Chemical) in 500 ml Toluol gelöst und der Lösung 500 ml Triton X-100 (Nakarai Chemical Co., Ltd.) zugesetzt wurden.
Allosamidin und Demethylallosamidin wurden jeweils in 0,1 n Essigsäurelösungen gelöst, wonach je 10 ul der Lösungen mit den jeweiligen Konzentrationen zu dem oben beschriebenen Reaktionssystem zugesetzt wurden. Zusätzlich wurden zu der Blindprobe sowie zu einem System, dem kein Inhibitor zugesetzt worden war, 10 ul 0,1 n Essigsäure zugesetzt, wonach wie oben beschrieben umgesetzt wurde.
Die inhibitorische Aktivität wurde nach der folgenden Gleichung berechnet:
Inhibitorische Aktivität (%) =
A: Chitinase-Aktivität (dpm), wenn kein Inhibitor zugesetzt wird
B: Chitinase-Aktivität (dpm), wenn Inhibitor zugesetzt wird
Bei allen Messungen wurden 3 Durchläufe durchgeführt und der Mittelwert ermittelt.

(iv) Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle l Inhibitionsrate (%) Demethylallosamidin (ug) Allosamidin (ug)

(3) Einfluß von Demethylallosamidin auf das Schimmelpilzwachstum

Demethylallosamidin wurde einem Schimmelpilz-Nährmedium zugesetzt, um seinen Einfluß festzustellen. Zunächst wurde Fusarium nivale (ATCC 42308) in PDA-Medium (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) vorgezüchtet, um Sporen zu bilden. Die so erhaltenen Sporen wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wurde durch Watte filtriert, um eine von Hyphen befreite Sporensuspension zu erhalten.
Mit einer festgelegten Menge der erhaltenen Suspension wurden Medien, die mit Demethylallosamidin (0,80 ug/ml bzw. 0,16 g/ml) ergänzt worden waren, sowie ein von Demethylallosamidin freies Medium (Vergleich) beimpft. Im Verlauf der Zeit wurde die Änderung der nachfolgenden Inkubation beobachtet. Die Beobachtung wurde wie folgt durchgeführt: Nach definierten Zeiträumen wurden Proben entnommen, von denen Mikrophotographien angefertigt wurden, wonach Länge und Verzweigungsgrad der Hyphen bestimmt wurden. Der Verzweigungsgrad der Hyphen ist der Mittelwert der Verzweigungsabstände der Hyphen. In jedem Fall wurde die Inkubation bei 28ºC und bei einer Schüttelfrequenz von 120/min durchgeführt, wobei jeweils 1 ml Medium (0,03 % Hefeextrakt, 0,03 % Malzextrakt (beide hergestellt von Difco Co., Ltd.), 0,05 % Polypepton (hergestellt von Daigo Nutrient Co., Ltd.) und 0,1 % Glucose) in Reagensgläser mit Wattestopfen (Durchmesser 11 mm) gegeben wurde.
Die Länge und der Verzweigungsgrad der Hyphen nach 32 Stunden sind in Tabelle 2 gezeigt. Durch Zusatz von Demethylallosamidin wird die Länge der Hyphen offensichtlich vergrößert und der Verzweigungsgrad herabgesetzt. Insbesondere an der Spitze der Hyphen ist die Abnahme des Verzweigungsgrades bemerkenswert. Tabelle 2 Konzentration von Demethylallosamidin (ug/ml) Länge der Hyphen (um) Verzweigungsgrad der Hyphen (um)

(4) Cytotoxizität von Demethylallosamidin

i) Mit aszitischen Brustkrebszellen FM3A von Mäusen in einer Menge von 1 x 10&sup5;/ml wurde ein Dulbecco-modifiziertes MEM- Medium beimpft, das mit 10 % Kalbsfoetus-Serum ergänzt war, und Demethylallosamidin wurde in einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt, wonach 4 Tage bei 37ºC stationär gezüchtet wurde. Die Beobachtung der gezüchteten aszitischen Brustkrebszellen FM3A von Mäusen unter dem Mikroskop ergab, daß überhaupt keine Wachstumshemmung beobachtet wurde.
ii) Mit menschlichen Leukämiezellen K562 in einer Menge von 1 x 10&sup5;/ml wurde ein FRMI-1640-Medium, das mit 10 % Kalbsfoetus-Serum ergänzt war, beimpft, wonach Demethylallosamidin in einer Konzentration von 1 mg/ml zugesetzt und 4 Tage bei 37ºC stationär gezüchtet wurde. Die Beobachtung der gezüchteten menschlichen Leukämiezellen K562 unter dem Mikroskop ergab, daß überhaupt keine Wachstumshemmung beobachtet wurde.
Die Verbindung nach der Erfindung hat eine außerordentlich starke inhibitorische Aktivität gegen von Pilzen herstammende Chitinase. Folglich können fungizide Mittel und Chitinase-hemmende Mittel mit ausgezeichneten pharmazeutischen Wirkungen bereitgestellt werden. Außerdem kann die Verbindung durch Fermentation und somit in großen Mengen hergestellt werden.

Claims

1. Verbindung, die durch die folgende Formel dargestellt ist:

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, das darin besteht, daß zur Bildung der Verbindung gemäß Anspruch 1 befähigte Bakterien einer Streptomyces- Species gezüchtet werden und die Verbindung aus der Kultur isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Streptomyces- Species Streptomyces-AJ 9463 (Ferm P-10642, Ferm BP-2801) ist.

4. Streptomyces sp. AJ 9463 (Ferm P-10642, Ferm BP-2801)

5. Fungizide Zusammensetzung oder Chitinase-Inhibitor- Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 als Wirksubstanz.

6. Insektizide Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1.