DE69006931T2

DE69006931T2 - Ghilanten: antimetastatischer Wirkstoff aus dem südamerikanischen Blutegel Haementeria Ghilianii.

Info

Publication number: DE69006931T2
Application number: DE69006931T
Authority: DE
Inventors: Alan D Cardin; Sai Prasad Sunkara
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2010-06-20
Also published as: KR0185973B1; EP0404055B1; AU5753890A; IE63540B1; AU624962B2; JPH03128326A; US5447911A; JP2947882B2; EP0404055A1; ES2052105T3; DK0404055T3; KR910000172A; IE902212L; ATE102041T1; IE902212A1; DE69006931D1

Description

Diese Erfindung betrifft die Entdeckung, daß der proteinähnliche Stoff mit Faktor Xa-Hemmwirkung, der aus dem Speichel oder den Speicheldrüsen des Blutegels Haementeria ghilianii isoliert wird, eine antimetastatische Aktivität aufweist.
Die Ausbreitung von Krebszellen von einem primären Tumorort aus zu entfernten Organen ist als Metastasenbildung bekannt. Die Metastasenbildung ist als einer der faszinierensten Gesichtspunkte der Pathogenese von Krebs angesehen worden. Dies ist sicherlich in soweit richtig, als die Metastasenbildung eines Krebstumors für einen Mißerfolg in den meisten Therapien bei der Behandlung der Krankheit verantwortlich ist, da die Patienten dem vielfachen Tumorwachstum erliegen. Das Ausmaß der Metastasenbildung hängt von der individuellen Art des Tumors ab. Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs neigen besonders zur Bildung von Metastasen.
Wenn sich Metastasen bilden, können sich sekundäre Tumore an einer Vielzahl von Orten im Körper bilden, wobei die Lunge eine der häufigeren Orte ist.
Daher wurde die Hemmung der Tumor-Metastasen in jedem Ausmaß vorteilhaft sein, und dies wäre auch richtig, wenn der an der Hemmung beteiligte Wirkstoff keine Wirkung auf den primären Tumor aufweisen würde. Wenn der Wirkstoff auch den primären Tumor hemmen würde, wäre dies natürlich ein weiterer Vorteil des Wirkstoffs.
Blutegel sind seit der Antike in der Medizin verwendet worden. Die medizinische Verwendung von Blutegeln im frühen 19. Jahrhundert verursachte beinahe die Ausrottung der Art Hirudo medicinalis und veranlaßte Rußland, Quoten auf seine Exporte zu verhängen. Kürzlich sind die Blutegel- Sekrete wissenschaftlicher untersucht worden, und es wurde festgestellt, daß sie eine Vielzahl von biologischen Produkten mit einem breiten Spektrum von biochemischen und pharmakologischen Aktivitäten aufweisen, beispielsweise solche gegen Blutgerinnung und gegen Metastasen und Anästhetika, Antibiotika und Vasodilatatoren. Das aus der Speicheldrüse des Blutegels Hirudo medicinalis isolierte Hirudin ist beispielsweise der spezifischste und potenteste bekannte Thrombin-Inhibitor. Ferner ist das aus der Speicheldrüse des Blutegels Haementeria ghilianii isolierte Hementin ein fibrin(ogen)olytisches Enzym von bekannt hohem Molekulargewicht. Es ist bekanntermaßen der die Blutgerinnung hemmende Wirkstoff dieses Blutegels. Dieses Enzym baut Fibrinogen und Fibrin ab, und aktiviert nicht das fibrinolytische System des Wirts oder inhibitiert nicht das Blutgerinnungssystem.
Die US-PS 4 588 587 beschreibt den Extrakt der Speicheldrüse des Blutegels, von dem angenommen wird, daß er eine bedeutende Antikoagulans- und Proteasen-hemmende Wirkung aufweist. Es können auch noch weitere signifikante Bestandteile in diesem Speicheldrüsen-Extrakt des Blutegels vorhanden sein, die zur Entwicklung einer antimetastatischen Wirkung möglicherweise synergistisch wirken. Der Speicheldrüsen-Extrakt von Haementeria ghilianii wird unter anderem erwähnt.
Die EP-A-263 608 beschreibt ein biochemisch reines Protein mit der Bezeichnung Antistasin, das sowohl antimetastatische als auch antikoagulierende Eigenschaften zeigt. Antistasin soll ein Molekulargewicht von etwa 17 000 aufweisen und einen isoelektrischen Punkt von 9,5. Es wird aus der Speicheldrüse des mexikanischen Blutegels Haementeria officinalis durch ein die Heparin-Affinitätschromatographie einschließendes Verfahren extrahiert.
Die Anmelder stellten fest, daß der proteinähnliche Stoff mit Antikoagulans-Aktivität, der aus dem Speichel oder den Speicheldrüsen des Blutegels Haementeria ghilianii isoliert wird, auch eine wertvolle und nützliche antimetastatische Aktivität aufweist.
Der proteinähnliche Stoff mit Faktor Xa-Hemmwirkung, der aus der Speicheldrüse des Blutegels Haementeria ghilianii stammt und daraus isoliert wird, ist ein nützlicher antimetastatischer Wirkstoff und wird nachstehend als Ghilanten bezeichnet. Der Name Ghilanten zeigt, daß dieser proteinähnliche Stoff von Haementeria ghilianii (Ghil-) und von der Anti-Faktor Xa (-anten)-Aktivität stammt. Dieser antimetastatische Faktor wird isoliert, indem der Speichel des Blutegels oder der Speicheldrüsen-Extrakt des Blutegels Haementeria ghilianii einer chromatographischen Trennung unter Verwendung eines anionischen Austauscherharzes unterworfen und mit einem sich erhöhenden Salz-Gradienten eluiert wird. Die Fraktionen mit einer hohen Faktor Xa-Hemmwirkung und Antikoagulans-Aktivität werden anschließend einer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) unterworfen, um den Stoff mit Faktor Xa-Hemmwirkung und antimetastatischer Aktivität weiter zu reinigen.
Die vorliegende Erfindung betrifft genauer proteinähnliche Stoffe mit Faktor Xa-Hemmwirkung, die aus dem Speichel des Blutegels Haementeria ghilianii erhalten werden, indem ein Speicheldrüsen-Extrakt von Haementeria ghilianii den nachstehend beschriebenen Reinigungsschritten unterworfen wird:
- Chromatographie an einer DEAE Anionen-Austauschersäule,
- Chromatographie an Heparin-Agarose,
- Affinitätschromatographie unter Verwendung von Rinder-FXa und
- Umkehrphasen-HPLC;
mit den nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften:
- einem Molekulargewicht von etwa 18 000,
- nicht stark glycosyliert,
- mit den nachstehend beschriebenen
Aminosäure-Zusammensetzungen: Aminosäure
die ferner zur Hemmung der Tumor-Metastasen-Bildung nützlich sind, und einen solchen Stoff zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Tumor-Metastasen-Bildung in einem Patienten mit Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs oder Prostatakrebs.
Figur 1. Hemmung von FXa durch einen Rohextrakt der Speicheldrüsen von Haementeria ghilianii. Etwa 11 ug des Speicheldrüsen-Extrakts (lösliches Protein) wurden 16 ng gereinigter FXa zugesetzt. Die Probe wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die amidolytische Aktivität nach Zusatz von Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-glycyl- arginin-p-nitroanilidacetat bestimmt; die Bildung von p- Nitroanilin wurde durch Aufnahmen in Abständen von 1 Minute bei 405 nm spektrophotometrisch überwacht. Obere Kurve: Rinder-FXa und chromogenes Substrat; untere Kurve: Rinder- FXa, Extrakt der Speicheldrüse und chromogenes Substrat. Bildeinsatz: (obere Kurve) menschlicher FXa und chromogenes Substrat; (untere Kurve) menschlicher FXa, Extrakt der Speicheldrüse und chromogenes Substrat. Der Extrakt der Speicheldrüse von H. ghilianii hemmte nicht die Hydrolyse von H-D-Hexahydrotyrosyl-L-alanyl-L-arginin-p-nitroanilidacetat durch Rinderthrombin oder menschliches Thrombin (nicht dargestellt).
Figur 2. Fraktionierung von rohem Extrakt der Speicheldrüse (25 mg lösliches Protein) auf einer 0,46 x 7,5 cm DEAE-Anionen-Austauschersäule. Die Proteine wurden mit einem linearen NaCl-Gradienten in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,8, eluiert (wegen Einzelheiten siehe Verfahren). Die Fließrate war 1 ml/Minute, und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Tafel A: Die Antikoagulans-Aktivität (leere Kreise) wurde als Verlängerung der Prothrombin-Zeit durch einen Ein-Schritt- Gerinnungstest bestimmt. Die Hemmung von FXa wurde bei 405 nm als Hemmung der p-Nitroanilin-Bildung (leere Quadrate) unter Verwendung des chromogenen Substrats Methoxycarbonyl- D-cyclohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat gemessen. Tafel B: Diese Tafel zeigt das Elutionsprofil der H. ghilianii-Proteine, das durch Absorption bei 280 nm aufgenommen wurde. Die fibrinogenolytische Aktivität (Hementin) ist durch den schraffierten Bereich dargestellt. Die Hementin-Aktivität eluiert nicht gemeinsam mit den Anti-FXa- oder den Haupt-Antikoagulans-Aktivitäten.
Figur 3. Die Fraktionierung des teilweise gereinigten FXa-Inhibitors durch Heparin-Agarose-Chromatographie. Die DEAE-Fraktionen mit den gemeinsam eluierenden Antikoagulans- und Anti-FXa-Aktivitäten wurden vereinigt und auf eine 0,5 x 5 cm Heparin-Agarose-Säule aufgetragen. Die Proteine wurden mit einem linearen Gradienten aus NaCl bis 1 M in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,8, eluiert. Die Fließrate war 1 ml/Minute und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Antikoagulans- Aktivität (leere Kreise) wurde als Verlängerung der Prothrombin-Zeit durch einen Ein-Schritt-Gerinnungstest bestimmt. Die Hemmung von FXa wurde bei 405 nm als Hemmung der p-Nitroanilin-Bildung (leere Quadrate) unter Verwendung des chromogenen Substrats Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl- glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat gemessen.
Figur 4. Fraktionierung des FXa-Inhibitors durch Affinitätschromatographie auf einem Rinder-FXa-Affi-Gel-15. Proteine wurden mit 0,1 M Benzamidin von der Säule eluiert. Die Fließrate war 4 ml/Stunde, und 1,2 ml Fraktionen wurden gesammelt; 1/500 Verdünnungen der chromatographischen Fraktionen wurden auf Antikoagulans- (leere Kreise) und Anti- FXa-Aktivitäten (ausgefüllte Kreise), wie beschrieben, getestet.
Figur 5. Reinigung des (der) Anti-FXa-Wirkstoff(e)s (Ghilantene) von H. Ghilianii durch Umkehrphasen-HPLC. Die Peak-Fraktionen mit den vorstehend beschriebenen gemeinsam eluierenden Antikoagulans- und Anti-FXa-Aktivitäten wurden durch eine Kapillar-Umkehrphasen-HPLC auf einer 2,1 x 30 mm Aquapore RP-300-Säule fraktioniert. Der eingeschwärzte Bereich zeigt die Antikoagulans-Aktivität, die über die Peak-Fraktionen verteilt ist. Der Bildeinsatz stellt die erneute Chromatographie der anfänglichen Umkehrphasen-Trennung auf der gleichen Säule dar. Bei der erneuten Chromatographie wurden diskrete, nicht-überlappende Peaks erhalten. Die hauptsächliche FXa-Hemmwirkung wurde bei den Ghilantenen P&sub4; und P&sub5; (starke Schwärzung) festgestellt; Aktivität wurde auch bei den Ghilantenen P&sub1;, P&sub2; und P&sub3; (geringere Schwärzung) nachgewiesen.
Figur 6. Kapillar-Umkehrphasen-HPLC von P&sub5;. Die Absorption wurde bei 214 nm für das H. ghilianii-Protein P&sub5; überwacht. Der Bildeinsatz stellt eine SDS-PAGE (12 % Acrylamid) von P&sub5; dar, das durch Kapillar-Umkehrphasen-HPLC isoliert wurde. Bahn a stellt die Standardproteine zur Bestimmung des Molekulargewichts dar und Bahn b gereinigtes P&sub5;. Die Proteine wurden gemäß dem Verfahren von Oakley et al., Anal. Biochem. 105 (1980), 361-363, durch Silberfärbung nachgewiesen.
Figur 7. Stöchiometrische Hemmung von FXa durch die H.-ghilianii-Antikoagulans-Proteine P&sub1;-P&sub5;. Rinder-Faktor Xa (35 nM) wurde mit der angezeigten Konzentration von jedem Inhibitor inkubiert, und die Rate der p-Nitroanilin-Bildung aus Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat wurde bei 405 nm als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Die Konzentrationen des Inhibitors und des gehemmten Enzyms waren: [P&sub1;] = 24 nM, [FXa]i = 20 nM; [P&sub2;] = 16 nM, [FXa]i = 11 nM; [P&sub3;] = 14 mM, [FXa]i = 10 nM; [P&sub4;] = 60 nM, [FXa]i = 35 nM; [P&sub5;] = 40 nM, [FXa]i = 35 mM. Bildeinsatz: Dosis-abhängige Hemmung des Rinder-Faktors Xa durch P&sub5;.
Figur 8. Wirkung des rekombinanten Hirudins und der H.-ghilianii-Faktor Xa-Inhibitor-Proteine (Ghilantene) auf die metastatische Ausbreitung der B16-F10-Melanom-Zellen in die Lungen von C57/BL-Mäusen.
Figur 9. Wirkung von höher dosiertem Ghilanten auf die metastatische Ausbreitung der B16-F10-Melanom-Zellen in die Lungen von C57/BL-Mäusen. Die Kontrolle (C) erhielt nur Tumor-Zellen; V, Träger (wie in Tabelle 1 definiert), erhielt nur Tumor-Zellen; Ghilanten, ebenso wie die Kontrolle (links) und der Träger (rechts), erhielt jedoch 5 ug Ghilanten in den Stunden -2, +2 und +4 bezogen auf die Impfung mit Tumor-Zellen.
Der Begriff Speichel, wie er hier verwendet wird, schließt nicht nur Speichel (oder Speichelabsonderungen) ein, sondern auch homogenisiertes Gewebe vom ganzen Blutegel sowie jeden Teil des Blutegels, besonders die Speicheldrüsen. Der Begriff Speichel schließt außerdem jedes isolierte Produkt des Speichels ein, sofern natürlich das isolierte Produkt oder das Gewebehomogenat den erfindungsgemäßen antimetastatischen Faktor mit Faktor Xa-Hemmwirkung enthält.
Der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor mit Faktor Xa-Hemmwirkung und antimetastatischer Aktivität umfaßt mehrere Sequenz-verwandte Proteine mit Faktor Xa- Hemmwirkung und antimetastatischer Aktivität. Zu dieser Erfindung gehören sämtliche Proteine/Peptide aus dem Speichel des Blutegels Haementeria ghilianii, die eine wesentliche Faktor Xa-Hemmwirkung und antimetastatische Aktivität aufweisen, das heißt, die einen IC&sub5;&sub0; im Hinblick auf den Faktor Xa von mindestens 1000 mM, einzeln oder in Kombination besitzen. Der Anmelder hat insbesondere die Absicht, daß der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor Stoffe von beliebiger Herkunft einschließt, wobei sie durch eine schrittweise durchgeführte Synthese und eine Blocksynthese oder durch Clonierung von Genen, einschließlich synthetischer Genkonstruktion und Expression hergestellt sein können.
Während die vollständige Aminosäuresequenz des antimetastatischen Faktors noch nicht vollständig bekannt ist, ist die im wesentlichen vollständige Sequenz eines der Proteine wie nachstehend dargestellt:
Ferner ist bekannt, daß die den erfindungsgemäßen antimetastatischen Faktor umfassenden Peptide ein Molekulargewicht von etwa 18 kDal aufweisen und nicht stark glycosyliert sind. Während einige Zuckergruppen vorhanden sein können, stellte der Anmelder fest, daß sich beim SDS-PAGE- Nachweis das relative Molekulargewicht nicht wesentlich mit der Konzentration des Polyacrylamidgels verändert, was auf einen Mangel an bedeutsamen Glycosyl-Gruppen auf den Peptiden hinweist. Der Anmelder hat bei der Durchführung einer Analyse der Aminosäuren auch festgestellt, daß jedes Peptid etwa 3 Alanin-Reste, 3 Methionin-Reste, 7-9 Lysin- Reste, 9-10 Arginin-Reste und 8-9 Prolin-Reste und einen geringen Überschuß an aromatischen Resten aufwies, beispielsweise 3 Phenylalanin- und 3 Tyrosyl-Reste. Für eine genauere Information über die Zusammensetzung, beispielsweise die Zahl der Cystein-/Cystin- und Tryptophan- Reste, sind die Verfügbarkeit größerer Peptid-Mengen und eine abschließende Sequenzanalyse erforderlich.
Die nachstehend dargestellten üblichen Abkürzungen der Aminosäuren werden in der Patentschrift verwendet:
Ala (oder A) - Alanin
Arg (oder R) - Arginin
Asx - Asparagin (N) (Asn) und/oder Asparaginsäure (D) (Asp)
Cys (oder C) - Cystein
Gly (oder G) - Glycin
Glx - Glutaminsäure (E) (Glu) und/oder Glutamin (Q) (Gln)
His (oder H) - Histidin
Ile (oder I) - Isoleucin
Leu (oder L) - Leucin
Lys (oder K) - Lysin
Met (oder M) - Methionin
Phe (oder F) - Phenylalanin
Pro (oder P) - Prolin
Ser (oder S) - Serin
Thr (oder T) - Threonin
Tyr (oder Y) - Tyrosin
Val (oder V) - Valin
Der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor kann wie viele Proteine/Peptide pharmazeutisch verträgliche Salze mit jeder nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säuren bilden. Geeignete Salze bildende anorganische Säuren schließen beispielsweise Chlorwasserstoff-,Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und saure Metallsalze, beispielsweise Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat ein. Geeignete Salze bildende organische Säuren schließen beispielsweise Mono-, Di- und Trikarbonsäuren ein. Beispiele solcher Säuren sind Essigsäure, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Apfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2- Phenoxybenzoe- und Sulfonsäuren, beispielsweise Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Salze der carboxyterminalen Aminosäure-Einheit schließen die nicht-toxischen Salze der Carbonsäuren ein, die mit jeder geeigneten anorganischen oder organischen Base gebildet werden. Diese Salze schließen beispielsweise Alkalimetalle, beispielsweise Natrium und Kalium, Erdalkalimetalle, beispielsweise Calcium und Magnesium, Leichtmetalle der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium, und organische primäre, sekundäre und tertiäre Amine, beispielsweise Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabiethylamin, N-(kleineres)Alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin ein.
Die nachstehend beschriebenen Experimente zeigen die Fähigkeit des proteinähnlichen Stoffs, der aus dem Blutegel Haementeria ghilianii isoliert wurde, oder seiner Zusammensetzungen zur Hemmung der Metastasen von Tumor-Zellen und besonders der Metastasen von Tumor-Zellen in der Lunge. Die Lungen stellen ein zweckmäßiges Organ zur Untersuchung von Metastasenbildung im Tierkörper dar. Die Wirkung des erfindungsgemäßen antimetastatischen Faktors auf bestimmte Tumor- Zellen wird nachstehend auch gezeigt.
Zur Bestätigung der antimetastatischen Aktivität der erfindungsgemäßen proteinähnlichen Stoffe wurden 1 x 10&sup5; lebensfähige B16-Melanom-Zellen der F10-Linie intravenös in die Schwanz-Vene von C57/BL-Mäuseninjiziert. Der antimetastatische Faktor wurde anschließend an den Stunden -2, +2, +4 und +6 bezogen auf die Impfung mit dem Tumor zur Stunde t = 0 intravenös verabreicht. Nach 15 Tagen wurden die Tiere geopfert und die Zahl der metastatischen Foci in den Lungen wurde gezählt. Die beobachteten Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengefaßt, wobei n die Zahl der im Test verwendeten Tiere angibt. Tabelle 1 Antimetastatische Aktivität von Hirudin und des Faktor Xa- Inhibitors aus (Ghilanten) Haementeria ghilianii Behandlung Zahl metastat. Foci (Durchschnitt: + S.A.; n=6) % Hemmung % Potenzierung&spplus; Vehikel-Kontrolle Hirudin Ghilanten * Signifikant bei p < 0,02 verglichen mit der Kontrolle + Signifikant bei p < 0,05 B16-Melanom-F10-Zellen (1 x 10&sup5; Zellen/Tier) wurden am Tag 0 intravenös in die Schwanz-Vene der C57/BL-Mäuse injiziert. Vehikel: 10 mM Hepes, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,4, das 10 mg/ml BSA enthielt. Das rekombinante Hirudin (25 Antithrombin- Einheiten) und der FXa-Inhibitor (1-2 ug) wurden an den Stunden -2, +2, +4 und +6 nach der Tumor-Zellen-Impfung intravenös injiziert. Die Tiere wurden 14 Tage nach der Impfung mit den Tumor-Zellen geopfert. Die Lungen wurden seziert, fixiert und die Zahl der Metastasen in der Lunge wurde unter einem Sezier-Mikroskop bestimmt. Tabelle 2 Wirkung von höher dosiertem Ghilanten auf Metastasen von B16-F10-Melanom-Zellen in C57/BL-Mäusen Behandlung Zahl metastat. Foci % Hemmung Vehikel-Kontrolle Ghilanten * Durchschnittswert + S. A. ** Durchschnittswerte der Foci von 15 und 26. In diesem Experiment wurde Ghilanten (5 ug) an den Stunden -2, +2 und +4 relativ zur Impfung mit den Tumor-Zellen in Mäuse intravenös injiziert. Die Versuchsbedingungen sind die gleichen wie in Tabelle 1 beschrieben.
Es geht aus den vorstehend in Tabelle 1 beschriebenen Ergebnissen hervor, daß der antimetastatische Faktor die Metastasen in den Tieren nach einer einzigen täglichen Behandlung signifikant hemmte, wenn er an den Stunden -2, +2, +4 und +6 relativ zur Impfung mit den Tumor-Zellen zur Zeit = 0 verabreicht wurde. Dieser antimetastatische Faktor ist außerdem sehr spezifisch in seiner Wirkung wie Hirudin, ein potenter Thrombin-Inhibitor. Anders als Hirudin hatte Ghilanten eine geringe Erniedrigung der metastatischen Foci (Tabelle 1) zur Folge.
Die erfindungsgemäßen proteinähnlichen Stoffe können alleine oder in Kombination als Teil eines Behandlungsplans eines Tiers oder von menschlichen Patienten, die einen zu Metastasen neigenden Krebs aufweisen, besonders Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs, verwendet werden. Die Behandlung zur Hemmung der Metastasen-Bildung sollte am besten so bald wie möglich nach dem Nachweis der Krebserkrankung erfolgen. Durch die Anwendung des Behandlungsplans in Patienten in einem frühen Stadium maximiert der behandelnde Arzt die Chancen, daß noch keine signifikante Metastasenbildung aufgetreten ist. Dies maximiert die Chancen für eine erfolgreiche Behandlung. In einem solchen Behandlungsplan können der antimetastatische Faktor oder seine Salze in Kombination mit einer anderen Therapieform, die den primären Tumor kontrolliert, verabreicht werden und werden üblicherweise auch so verabreicht. Die andere Therapie in einer solchen Kombination kann eine Strahlentherapie oder die Verabreichung von verträglichen Antitumor- oder antineoplastischen Wirkstoffen einschließen, sie ist jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele solcher antineoplastischer Wirkstoffe schließen Melphalan, Lomustin- Kapseln, Cyclophosphamid, Fluoruracil und auch Ornithin- Decarboxylase-Inhibitoren, beispielsweise Difluormethylornithin (DFMO), 6-Heptin-2,5-diamin und (E)-2,5-Diamino-2-(fluormethyl)-3-pentensäuremethylesterdihydrochlorid ein. Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Behandlung kann auch gemeinsam mit (d. h., entweder vor oder nach) einem chirurgischen Eingriff zur Entfernung des primären Tumor- Materials aus dem Körper verwendet werden. Häufig werden chirurgische Eingriffe zur Entfernung von Tumor-Material aus dem Körper aufgrund der Furcht vermieden, daß sich als Folge des damit verbundenen physischen Eingriffs Metastasen von Tumor-Zellen bilden. Wenn jedoch der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor oder seine Salze vor dem chirurgischen Eingriff dem Patienten verabreicht werden, kann das Risiko von durch die Operation entstehenden Metastasen verringert werden, und die Operation würde eine attraktivere Behandlungsoption sein.
Innerhalb des Spielraums einer fundierten medizinischen Beurteilung wird sich die Dosierung des antimetastatischen Faktors oder seiner Salze und das in der Erfindung verwendete Verabreichungsverfahren mit der Schwere und der Natur des jeweils behandelten Zustandes, der Behandlungsdauer, der verwendeten Zusatztherapie, dem Alter und dem physischen Zustand des Patienten und ähnlichen Faktoren im Rahmen der Fachkenntnisse und des Könnens des behandelnden Arztes verändern. Einzelne Dosierungen können jedoch üblicherweise im Bereich von 0,01 bis 2000 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht liegen, vorzugsweise von 1 bis 200 Milligramm pro Kilogramm (die Einheit mit der Bezeichnung "mg/kg", wie hier verwendet, betrifft Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, sofern nicht anders angegeben). Bis zu vier Dosierungen pro Tag können routinemäßig verwendet werden, dies kann sich jedoch entsprechend einem soliden Vorteil/Risiko-Verhältnis gemäß den Bedürfnissen des Patienten ändern. Unterschiede in der Reaktion des Patienten können zwar erwartet werden, die höheren Dosierungen innerhalb des angegebenen Bereichs sind jedoch üblicherweise bei einer oralen Verabreichung erforderlich, während die niedrigeren angegebenen Dosierungen für eine intravenöse Verabreichung gelten.
Zum Zweck der oralen Verabreichung können der antimetastatische Faktor oder seine Salze in Form von Kapseln, Tabletten oder Kügelchen formuliert werden, während zur intravenösen Verabreichung der aktive Stoff in einer geeigneten Lösung formuliert werden kann. In jedem Fall wird die aktive Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger gemischt.
Obwohl der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor den Durchtritt durch den Darm nach der oralen Verabreichung möglicherweise übersteht, ziehen die Anmelder eine nicht- orale Verabreichung vor, beispielsweise eine subcutane, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale, die Verabreichung durch eine Depotinjektion oder durch Herstellung eines Implantats.
Zur parenteralen Verabreichung kann der erfindungsgemäße antimetastatische Stoff als injizierbare Dosierungen einer Lösung oder einer Suspension des Stoffs in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger, der eine sterile Flüssigkeit sein kann, beispielsweise Wasser und Öle mit oder ohne Zusatz eines grenzflächenaktiven Mittels, und weiteren pharmazeutisch verträglichen Adjuvanzien verabreicht werden. Beispiele für Öle, die in diesen Präparationen verwendet werden können, sind Petroleum-, tierische, pflanzliche Öle oder solche, die einen synthetischen Ursprung aufweisen, beispielsweise Erdnußöl, Soyabohnenöl und Mineralöl. Bevorzugte flüssige Träger, besonders für injizierbare Lösungen, sind üblicherweise Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, Ethanol und Glycole, beispielsweise Propylenglycol oder Polyethylenglycol.
Der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor kann in Form einer Depotinjektion oder eines Implantatpräparats verabreicht werden, die in der Weise formuliert werden können, daß sie eine verzögerte Freisetzung des aktiven Bestandteils erlauben. Der aktive Bestandteil kann zu Kügelchen oder kleinen Zylindern gepreßt und als Depotinjektionen oder Implantate subcutan oder intramusculär implantiert werden. Für die Implantate können inerte Materialien verwendet werden, beispielsweise biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, beispielsweise Silastic, Silicon-Gummi oder andere Polymere, die von der Dow-Corning Corporation hergestellt werden.
Der erfindungsgemäße antimetastatische Faktor wird aus dem Speichel des Blutegels hergestellt. Der Speicheldrüsenextrakt entweder der vorderen oder hinteren Speicheldrüsen von H. ghilianii oder von beiden, der zum Erhalt und zur Reinigung des erfindungsgemäßen antimetastatischen Faktors verwendet wird, kann auf mehrere Weisen erhalten werden, beispielsweise durch eine operative Entfernung der Drüsen und ihre Homogenisierung, die Extraktion des Gewebehomogenats mit beispielsweise einer Ammoniumsulfat-Lösung oder anderen Salzen, beispielsweise Natriumchlorid oder Puffern, oder mit Aceton, und Konzentrierung oder Dehydratation des Extrakts oder durch Ultrazentrifugation des Gewebehomogenats. Mit dem erhaltenen rohen Speicheldrüsen- Extrakt wird anschließend eine übliche Chromatographie durchgeführt, um die Fraktionen mit den Anti-FXa- und Antikoagulans-Aktivitäten zu isolieren. Der Anmelder verwendete die Chromatographie an DEAE-Cellulose, ein anionisches Austauscherharz und die Chromatographie an ein Heparin-Agaroseharz, wobei mit einem linear steigenden Salzgradienten aus Natriumchlorid eluiert wurde. Andere Harze können natürlich auch verwendet und mit anderen Salzen mit verschiedenen Gradienten oder mit organischen Lösungsmitteln oder Gemischen und unter Verwendung von verschiedenen Fließraten in den Säulen eluiert werden, wobei die Fraktionen in der üblichen Weise isoliert werden, die eine Faktor Xa-Hemmwirkung und Antikoagulans-Wirkung aufweisen.
Mit dem erhaltenen gereinigten Extrakt der Speicheldrüsen wird anschließend ein affinitätschromatographischer Schritt unter Verwendung des Faktors Xa durchgeführt, beispielsweise des Faktors Xa vom Rind, der an das Chromatographieharz gebunden ist, beispielsweise an die verfügbare chemische Gruppen zur Bindung des Faktors Xa aufweisenden Harze, die üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet werden. Der Anmelder verwendete Affi-Gel-15, ein einen N-Succimidylester enthaltendes und von der Bio-Rad- Corporation erhältliches Harz. An dieses Harz kann der Faktor Xa gebunden werden, indem das Harz zusammen mit dem Faktor Xa mit 4-Morpholinpropansulfonsäure und anschließend mit Ethanolamin inkubiert wird. Der gereinigte Extrakt der Speicheldrüsen wird unter Verwendung dieses Harzes chromatographiert, wobei mit HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)-1- piperazinethansulfonsäure, das den Proteinkinase-Inhibitor, der das aktive Zentrum reversibel bindet, und Benzamidin enthält, eluiert und die Fraktion mit der Antikoagulans- und der amidolytischen Aktivität gesammelt wird. Benzamidin ist durch Dialyse oder anschließende Chromatographie-Schritte leicht zu entfernen. Verschiedene übliche Variationen dieses Affinitätschromatographie-Verfahrens sind den Durchschnittsfachleuten ohne weiteres naheliegend.
Der erhaltene rohe proteinähnliche Stoff mit Faktor Xa-Hemmwirkung wird anschließend weiter gereinigt. Diese Reinigung kann in jeder üblichen Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Umkehrphasen-Chromatographie, einem Chromatographie-Typ, in dem die stationäre Phase nicht-polar und die Elutionsphase polar ist. Die stationäre Phase ist üblicherweise eine Kohlenwasserstoff-Kette, die chemisch an die inerte Oberfläche gebunden ist, beispielsweise Glas, und die Elutionsphase ist wäßriges Methanol, Acetonitril oder Propanol. Bei der hydrophoben Austauschchromatographie ist die stationäre Phase nicht-polar und die Elutionsphase polar, beispielsweise Wasser oder ein wäßriger Puffer. Der Anmelder verwendete ein Harz vom C-18-Typ, das heißt, ein Harz, in dem der an das feste Harz gebundene Kohlenwasserstoff im wesentlichen ein 18 Kohlenstoffatome enthaltender Kohlenwasserstoff ist, beispielsweise das Aquapore RP-300-C-18-Harz, das mit einem linear steigenden Gradienten aus wäßrigem, Trifluoressigsäure-enthaltendem Acetonitril eluiert wird. Andere geeignete Säulen können jedoch C&sub3;, C&sub4;, C&sub6;, C&sub8; etc. einschließen.
Diese Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von Ghilanten, dem FXa-Hemmstoff aus dem Speicheldrüsenextrakt von H. ghilianii, und seine Charakterisierung

Koagulation, chromogene und fibrin(ogen)olytische Tests

Die Prothrombin-Zeiten wurden in Ein-Schritt-Gerinnungstests mit einem automatischen Electra-800-Gerinnungs- Zeitmeßgerät (Medical Laboratory Automation, Inc.) unter Verwendung der Standardprogramme und der vom Hersteller empfohlenen Reagenzien bestimmt. Kurz gesagt, verschiedene Mengen entweder von (i) einem Gewebe-Rohextrakt der Speicheldrüsen von Haementeria ghilianii in 20 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 2,5 mM CaCl&sub2;, pH-Wert 7,4, (ii) chromatographischen Fraktionen des Speicheldrüsen-Extrakts von H. ghilianii in einem Säulen-Elutionspuffer oder (iii) gereinigtem FXa- Inhibitor (Ghilanten) aus den Speicheldrüsen von H. ghilianii in 20 mM HEPES, 0,15 M NaCl, 2,5 mM CaCl&sub2;, pH-Wert 7,4, wurden 100 ul mit Citrat versetztem normalem menschlichem Plasma zugesetzt. Die Gerinnungs-Zeiten wurden im Anschluß an die Zugabe von 200 ul 11,6 mM CaCl&sub2; enthaltendem Thromboplastin-Reagenz (DADE ) bestimmt. Die chromogenen Tests mit FXa und die amidolytischen Aktivitäten von Thrombin wurden mit Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-glycyl-arginin-p-nitroanilidacetat bzw. H-D-Hexahydrotyrosyl-L- alanyl-L-arginin-p-nitroanilidacetat in Mikrotitterplatten mit 96 Vertiefungen (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY) durchgeführt. In diesen Tests wurden 0,15 bis 350 ng Enzym in 25 ul 20 mM HEPES, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,4 (Testpuffer) 25 ul Testpuffer zugesetzt, worauf 50 ul der geeigneten Inhibitorprobe zugesetzt wurden. Die Lösungen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und der Test wurde durch Zugabe von 100 ul chromogener Substanzen zu einer Endkonzentration von 2,5 x 10&supmin;&sup4; M begonnen. Die amidolytischen Aktivitäten wurden in Abwesenheit und Gegenwart des Inhibitors spektrophotometrisch bei 405 nm auf p-Nitroanilin-Absorption mit einem EL309-Microplate-Autoreader (BIO-TEK Instruments) durch Aufnahmen im Abstand von einer Minute aufgezeichnet.
¹²&sup5;I-markiertes (menschliches) Fibrinogen wurde, wie von Knight et al., Thromb. Haemostas (Stuttgart) 46 (1981), 593-596, beschrieben, hergestellt. Das Fibrinogen (5 mg) in 5 ml 50 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,025 M Natriumcitrat, pH- Wert 7,9, wurde mit 500 uCi Na¹²&sup5;I (New England Nuclear, Boston, MA) mit 5 ul eines 0,045 % NaI-Trägers in einem Kulturröhrchen aus Plastik vermischt und auf Eis gekühlt. Zur Initiierung der Umsetzung wurde das Gemisch in ein gekühltes, mit 100 ug Iodogen beschichtetes Röhrchen übertragen und 1 Stunde in einem Eisbad langsam gerührt. Zur Beendigung der Umsetzung zur Radioiodierung wurde die Proteinlösung in ein Kulturröhrchen aus Plastik dekantiert, um das Iodogen von den Reaktionspartnern zu trennen. BSA (5 mg) wurde anschließend der Probe zugesetzt und die Lösung danach auf einer 0,5 x 12 ml BioGel P-2-Säule, die mit 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,9, äquilibriert war, fraktioniert, um sämtliche Rückstände von freiem ¹²&sup5;I vom ¹²&sup5;I- markierten Fibrinogen zu trennen. Die spezifische Radioaktivität beträgt 1,9 x 10&sup8; dpm/mg.
Der fibrinogenolytische Test beruhte auf der Fähigkeit von Hementin in chromatographischen Fraktionen (Malinconico, S. M. et al., J. Lab. Clin. Med. 103 (1984), 44-58) zum Abbau von ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen zu in Trichloressigsäure löslichen ¹²&sup5;I-markierten Peptiden . In diesem Test wurden 100 ul der chromatographischen DEAE-5PW-Fraktionen mit 50 ug ¹²&sup5;I-markiertem Fibrinogen in 227 ul 50 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,9, inkubiert; die Probe wurde auf 10 mM in CaCl&sub2; eingestellt und anschließend über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dazu wurden 100 ul BSA (3 mg/ml) in Inkubationspuffer zugesetzt, woran sich die Zugabe von 427 ul eiskalter 20 % Trichloressigsäure (TCA) anschloß. Die Proben wurden 2 Stunden auf Eis gegeben, zentrifugiert, und die Radioaktivität in den Pellets und Überständen wurde durch Gammazählung bestimmt. Die fibrinogenolytische Aktivität wird als Verhältnis der TCA-löslichen Zerfälle zu den TCA-unlöslichen Zerfällen (TCA-lös./TCA-ppt) ausgedrückt.

Herstellung des Speicheldrüsen-Extrakts

Speicheldrüsen von H. ghilianii, die einer Hementin- Aktivität von 50 Einheiten/mg Protein entsprachen (Malinconico, S. M. et al., J. Lab. Clin. Med. 103 (1984), 44-58), wurden mit einem Glasstab in einem 3 ml Reacti-Gefäß aus Glas (Pierce Chemical Co.) aufgeschlossen, das 2 ml 20 mm HEPES, pH-Wert 7,8, (Extraktionspuffer) enthielt. Das Gefäß wurde auf Eis gegeben und der Inhalt einer Ultraschallbehandlung mit der Spitze einer Microsonde (Branson Sonic Power Supply) mit vier 30 Sekunden dauernden Energiestößen unter Verwendung eines"30 % Arbeitszyklus (30 % duty cycle)" und der Energiestärke 3 unterworfen. Das Gefäß wurde 5 Minuten mit 3750 UpM zentrifugiert, der Überstand gesammelt und anschließend in einer Eppendorf-Tischzentrifuge mit 8500 UpM erneut zentrifugiert. Das Pellet vom ersten Zentrifugierungsschritt wurde in 2 ml Extraktionspuffer resuspendiert und das vorstehend beschrieene Verfahren wiederholt. Die aus den beiden Ultraschall-Extraktionen erhaltenen Überstände wurden anschließend vereinigt und sofort zur Reinigung verwendet.

Herstellung der Rinder-FXa-Affi-Gel-15-Affinitäts-Matrix

Rinder-FXa wurde durch Inkubation von 2 mg gereinigtem Enzym in 2 ml 4-Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), pH- Wert 7,5 (Kupplungspuffer) mit 2,5 ml Harz über Nacht bei 4ºC an das Affi-Gel-15 gekuppelt. Die Kügelchen wurden ausgiebig gewaschen und anschließend in 3 ml Kupplungspuffer resuspendiert. Die Kügelchen wurden anschließend über Nacht bei 4ºC mit 0,3 ml 1 M Ethanolamin, pH-Wert 8,0, umgesetzt und anschließend ausgiebig mit 0,05 M HEPES, 0,1 M NaCl, pH- Wert 7,5, das 0,1 % Tween-20 enthielt, gewaschen.

Reinigung des FXa-Antikoagulans

Der Extrakt der Speicheldrüsen, der 25 mg lösliches Protein in 4 ml Extraktionspuffer enthielt, wurde auf eine DEAE-5PW (Waters Associates)-Anionen-Austauschersäule (0,46 x 7,5 cm) aufgetragen, die in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,8 (Puffer A), äquilibriert worden war. Die Proteine wurden anschließend 60 Minuten mit einem linearen NaCl-Gradienten eluiert, der im Bereich von 100 % Puffer A (Anfangsbedingungen) bis 100 % Puffer B (Puffer A, der 0,5 M NaCl enthielt) lag. Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml/Minute. Die zwischen 0,1-0,20 M NaCl eluierenden Fraktionen, die sowohl die Antikoagulans- als auch die Anti-FXa-Aktivitäten enthielten, wurden vereinigt (vgl. Fig. 2), bis zu einer Leitfähigkeit ≤ 10 mS/cm mit Puffer A verdünnt und anschließend auf eine 0,5 x 5 cm Heparin-Agarose-Säule (Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc.) aufgetragen. Die weitere Reinigung der DEAE-Fraktionen mit einer Antikoagulans-Aktivität auf Heparin-Agarose ist in Figur 3 dargestellt. Die Säule wurde ausgiebig mit Puffer A gewaschen und anschließend 75 Minuten mit einem linearen Salzgradienten eluiert; der Gradient lag im Bereich von 100 % Puffer A bis 100 % Puffer B (Puffer A + 1 M NaCl). Die Fließgeschwindigkeit war 1 ml/Minute. In einigen Anmeldungen wurde die Anti-FXa-Aktivität durch Fraktionierung der Proteine an einer Rinder-FXa-Affi-Gel-15-Säule (Figur 4) gewonnen. Die Rohextrakte oder die chromatographischen Fraktionen mit einer Antikoagulans-Aktivität wurden auf 0,1 % Tween-20 eingestellt und durch Affinitätschromatographie auf einer Säule mit 2 ml Bettvolumen aus Rinder-FXa-Affi-Gel-15 fraktioniert. Die Säule wurde ausgiebig mit 0,05 M HEPES, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,5, das 0,1 % Tween -20 enthielt, gewaschen und die Proteine mit 0,05 M HEPES, 0,1 % Tween - 20, pH-Wert 7,5, das 0,1 M Benzamidin enthielt, eluiert. Die Gerinnungs- und amidolytischen Tests wurden mit 1/500-Verdünnungen der gesammelten Fraktionen durchgeführt. Die Säule wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/Stunde eluiert. Die abschließende Fraktionierung der Antikoagulans- und amidolytischen Aktivitäten wurde auf einer 2,1 x 30 mm Aquapore RP-300-C-18 Umkehrphasen-Säule mit dem Modell 130- Protein/Peptid-Trennungssystems von Applied Biosystems durchgeführt. Die Proteine wurden 40 Minuten mit einem linearen Acetonitril-Gradienten eluiert; der Gradient lag im Bereich von 100 % Puffer A (0,1 % Trifluoressigsäure in H&sub2;O) bis 100 % Puffer B (0,07 % Trifluoressigsäure/70 % Acetonitril/29,93 % H&sub2;O). Die Protein enthaltenden Fraktionen (vgl. Fig. 5) wurden über Nacht in einem Savant "Speed-Vac"- System getrocknet. Die Proben wurden in 0,1 % Trifluoressigsäure/H&sub2;O erneut gelöst und verschiedene Aliquots durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Gasphasen-Microsequenzierung, Aminosäure-Analyse und auf Antikoagulans- und amidolytische Aktivitäten analysiert.

Analytische Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Polyacrylamidgele (8 x 8 cm und 1 mm dick), 20 % und 12 % Acrylamid, die ein 3 % Sammelgel enthielten, wurden in eine "Mighty-Small"-Elektrophorese-Einheit (Hoefer Scientific Co.) gegeben, und es wurde ein konstant bleibender Strom von 10 mA/Gel angelegt. Die Gele enthielten 0,25 M Tris-HCl, pH-Wert 9,0, und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Elektrophorese wurde in 25 mM Tris-HCl, 0,2 M Glycin und 0,1 % SDS, pH-Wert 8,4, durchgeführt. Die getrockneten Proben wurden in 35 ul 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8, 1 % SDS, 20 % Saccharose, 1 mM EDTA, 6 M Harnstoff, 1 % 2-Mercaptoethanol und 0,03 % Bromphenolblau solubilisiert; vor der Elektrophorese wurden die Proben 15 Minuten auf 60ºC erwärmt. Die Gele wurden fixiert und die Proteine durch das Silber-Färbungsverfahren von Oakley et al., Anal. Biochem. 105 (1980), 361-363, nachgewiesen. Die relativen Molekulargewichte der Proteine wurden durch Extrapolation aus einer Standardkurve des Logarithmus der Molekulargewichte, aufgetragen gegen die elektrophoretische Beweglichkeit von Standardproteinen ermittelt. Die Proteinstandards waren Phosphorylase B (98 000), Rinder-Serumalbuinin (67 000), Ovalbumin (43 000), Carboanhydrase (30 000), Soyabohnen-Trypsin-Inhibitor (20 000) und α-Lactalbumin (14 400)

Sequenzanalyse

Das automatische Edman-Abbau-Verfahren wurde mit einem Modell 470A des Protein-Peptid-Sequenziergeräts von Applied Biosystems, Inc. mit den vom Hersteller gelieferten Reagenzien, Anleitungen und Standardprogrammen durchgeführt. Die Phenylthiohydantoin-Derivate der Aminosäuren wurden in jedem Zyklus auf einem Modell 120-PTH-Analysegerät (Applied Biosystems, Inc.) analysiert, das direkt mit dem 470A- Gaspha-sen-Sequenziergerät verbunden war.

Aminosäure-Analyse

Die als Hydrolyse-Röhrchen verwendeten Microgefäße des automatischen Probennehmers (Hewlett Packard) wurden in Methanol mit Ultraschall behandelt und anschließend in einem Ofen 4 Stunden bei 500ºC erhitzt. Die Peptide wurden durch Gasphasen-Hydrolyse in einer "Picotag-Workstation" (Waters Associates) 20 Stunden bei 105ºC mit 200 ul konstant siedendem HCl (Pierce Chemical Co.), das einige Microliter verflüssigtes Phenol (MCB) enthielt, hydrolysiert. Die hydrolysierten Proben wurden in einem "Speed-Vac"-Konzentrierer (Savant) getrocknet, in einem kleinen Volumen (üblicherweise 15-30 ul) 0,1 N HCl gelöst und in den automatischen Probennehmer vom Modell 1090 HPLC (Hewlett Packard) gegeben. Die Aminosäure-Analyse wurde unter Verwendung des "Aminoquant"-Analysiergeräts von Hewlett Packard in der Hochempfindlichkeits-Einstellung (Fluoreszenz-Nachweis) durchgeführt. Die Aminosäuren wurden bestimmt, nachdem sie vor dem Durchtritt durch die Säule zunächst mit o-Phthalaldehyd (OPA) bei primären Aminosäuren und anschließend mit 9- Fluorenylmethylchloroformat (FMOC) bei sekundären Aminosäuren derivatisiert worden waren; Blankenship et al., Anal. Biochem. 178 (1989), 227-232. Die Aminosäure-Derivate wurden durch Umkehrphasen-HPLC mit vom Hersteller gelieferten Säulen, Reagenzien und Anleitungen getrennt. Dieses System quantifiziert genau 1 bis 500 pmol Aminoacyl-Masse.
Figur 1 stellt die Anti-FXa-Aktivität in den Rohextrakten der Speicheldrüsen von H. ghilianii dar. Der aktive Wirkstoff hemmt sowohl menschliches (vgl. Einsatzbild) als auch Rinder-FXa, jedoch keine menschlichen und keine Rinder- Thrombine (Daten nicht dargestellt).
Figur 2 stellt die Chromatographie von 25 mg des löslichen Proteinextrakts durch Anionen-Austausch auf DEAE dar. Die Antikoagulans-Aktivitäten und die FXa-Hemmwirkung eluieren gemeinsam zwischen 0,1-0,16 M NaCl (Tafel A) zwischen den Fraktionen 30 bis 35. Die fibrinogenolytische Aktivität, ohne Anti-FXa-Aktivität, eluiert oberhalb von 0,20 N NaCl (Tafel B) zwischen den Fraktionen 37 bis 44 (schraffierter Bereich). Dieses Material förderte die Lyse des Gerinsels (Fibrin) und baute ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen (Figur 2, Tafel B) ab, und es wurde durch SDS-PAGE (nicht dargestellt) festgestellt, daß es die α-, β- undγ-Ketten des gereinigten Fibrinogens abbaut. Die fibrin(ogen)olytische Wirkung dieser Fraktion ist auf Hementin zurückzuführen. Ferner zeigten die Fraktionen mit Anti-FXa-Aktivität keine fibrin(ogen)olytische Aktivität. Ausgehend von den Ergebnissen der Figuren 1 und 2 ist der Inhibitor, der zwischen 0,1 - 0,16 M NaCl eluiert, nicht Hirudin von Hirudo medicinalis (Dodt, J. et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 (1985), 379-385) oder Hementin, der fibrin(ogen)olytische Bestandteil von Haementeria ghilianii (Malinconico, S. M. et al., J. Lab. Clin. Med. 103 (1984), 44-58). Wie in Figur 2 dargestellt, verlängerten 25 ul der Fraktionen mit einer Peak-Aktivität die Prothrombin-Zeit um 16 Sekunden und hemmten im amidolytischen Test 17 ng FXa vollständig. Auf der Grundlage der Tests mit dem DEAE-fraktionierten Extrakt ist die FXa- Hemmwirkung für die Haupt-Antikoagulans-Aktivität verantwortlich.
Die Antikoagulans-Fraktionen mit Anti-FXa-Aktivität aus der DEAE-Säule wurden vereinigt und anschließend durch Heparin-Agarose-Chromatographie (Fig. 3) fraktioniert. Die Antikoagulans- und amidolytischen Anti-FXa-Aktivitäten eluierten zwischen 0,45 - 0,55 M NaCl gemeinsam. Ferner verlängerten 25 ul der Fraktionen mit Peak-Antikoagulans-Aktivität die Prothrombin-Zeit um etwa 17 Sekunden und hemmten die Hydrolyse des chromogenen Stoffs durch 16 ng gereinigten FXa vollständig.
Die Fraktionierung der Antikoagulans-/Anti-FXa-Aktivitäten durch Affinitäts-Chromatographie auf FXa-Affi-Gel-15 ist in Figur 4 dargestellt. Die Antikoagulans- und die Anti- FXa-Aktivitäten wurden mit 0,1 M Benzamidin, einem Proteinkinase-Inhibitor, der das aktive Zentrum reversibel bindet, gemeinsam von der Säule eluiert.
Die weitere Fraktionierung des Inhibitors durch Kapillar-Umkehrphasen-HPLC ist in Figur 5 dargestellt. Wie daraus entnommen werden kann, wurden vier kleinere und zwei größere Peaks erhalten, wobei die Antikoagulans-Aktivität über die Mehrfachlinie von Peaks verteilt ist. Die erneute Fraktionierung ergab sechs diskrete Peaks mit der Bezeichnung P&sub0;-P&sub5; (vgl. Bildeinsatz). Von diesen zeigten P&sub4; und P&sub5; die Haupt-Antikoagulans- und Anti-FXa-Aktivitäten, wobei P&sub1;- P&sub3; auch Aktivität zeigten, jedoch nur in geringerer Stärke. In P&sub0; wurde keine Aktivität nachgewiesen.
Die SDS-PAGE (20 % Acrylamid) der Fraktionen P&sub1;-P&sub5; bestätigte, daß diese Proteine ähnliche Beweglichkeiten mit einem relativen Molekulargewicht von etwa 18 000 (nicht dargestellt) aufwiesen. Figur 6 stellt das chromatographische Profil von P&sub5; auf einer Kapillar-Umkehrphasen-HPLC dar. Der Bildeinsatz stellt eine 12 % SDS-PAGE (12 % Acrylamid) von P&sub5; dar. Dieser reine Bestandteil weist ein relatives Molekulargewicht von 18 000 auf, d. h., das relative Molekulargewicht des gereinigten FXa-Inhibitors verändert sich mit der Polyacrylamidgel-Konzentration zwischen 12 % und 20 % nicht wesentlich, was darauf hinweist, daß er nicht stark glycosyliert ist.
Figur 7 zeigt, daß jedes Peptid eine Faktor Xa- Hemmung von mehr als 70 % bei stöchiometrischen Inhibitor- Konzentrationen aufweist, wodurch angezeigt wird, daß sich die spezifischen Aktivitäten von P&sub1;-P&sub5; wenig unterscheiden. Die Dosis-abhängige Hemmung von FXa durch P&sub5; ist im Einsatzbild mit einer halb-maximalen Hemmung bei 20 nanomolar dargestellt.
Tabelle 3 stellt die Aminosäure-Zusammensetzungen der Fraktionen P&sub0;-P&sub5; dar. Die Aminosäure-Gehalte von P&sub1;-P&sub5; waren im Hinblick auf die meisten Reste sehr ähnlich, mit der Ausnahme, daß P&sub4; und P&sub5; geringfügig mehr Asx, Glx, Lys und Pro zeigten. P&sub0; unterschied sich wesentlich von P&sub1;-P&sub5; hinsichtlich des Gehalts an Asx, Glx, Thr, Arg, Val, Met, Ile, Lys und Pro. Die Ähnlichkeit der Zusammensetzungen zeigt an, daß P&sub1;-P&sub5; Sequenz-verwandte Varianten des gleichen Proteins sind. Tabelle 3 Aminosäure-Analysena der Fraktionen P&sub0;-P&sub5;, die aus den Extrakten der Speicheldrüsen von Haementeria ghilianii durch Kapillar-Umkehrphasen-HPLC erhalten wurden Aminosäure a Angegeben als Reste pro Mol Protein. Die Werte wurden auf einen Ala-Gehalt von 3 Molekülen/Mol normalisiert.

Beispiel 2

Bestimmung der Aminosäure-Sequenz

Pyridylethylierung und Bromcyan-Abbau

Der gereinigte Inhibitor wurde zur Verwendung bei kleinen Mengen Protein gemäß dem Verfahren von Freidman et al., J. Biol. Chem. 245 (1970), 3868-3871, das gemäß Hawke und Yuam, Applied Biosystems Incorporated User Bulletin 28 (1987) modifiziert worden war, pyridylethyliert. Kurz gesagt, getrocknetes Protein (etwa 1 nanomol) wurde in 44 ul 6 M Guanidin-HCl, 0,25 M Tris-HCl, pH-Wert 8,5, gelöst und anschließend nacheinander 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 3 ul 10 % β-Mercaptoethanol und 3 ul 4-Vinylpyridin umgesetzt. Das pyridylethylierte Protein wurde anschließend durch Kapillar-Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Aquapore RP-300-Säule (2,1 x 30 mm) in einem Protein/Peptid-Trennungssystems, Modell 130 von Applied Biosystems Inc. entsalzt. Der Gradient war linear und reichte von 100 % Puffer A (0,1 % TFA in H&sub2;O) bis 100 % Puffer B (0,085 % TFA und 70 % Acetonitril in H&sub2;O); er lief 150 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul/Min. Zur Herstellung von Fragmenten wurde das pyridylethylierte Protein (etwa 1 nanomol) in 330 ul 70 % Ameisensäure gelöst und mehrere Kristalle CNBr wurden zugesetzt. Die Proben wurden anschließend mit Stickstoff durchspült, versiegelt und 24 Stunden bei Raumtemperatur dunkel gestellt. Die Proben wurden auf einer "Speedvac"-Zentrifuge (Savant) getrocknet, in 50 ul 0,1 % TFA in H&sub2;O erneut gelöst und unter Verwendung des gleichen, vorstehend beschriebenen Gradienten durch Kapillar-Umkehrphasen-HPLC erneut gereinigt.

Enzymatische Spaltungen

Anfängliche Versuche zur Sequenzierung des intakten Proteins zeigten einen blockierten Amino-(N-)-Terminus an. Das blockierte N-terminale Bromcyan-Fragment wurde aufgrund des vergeblichen Versuchs seiner Sequenzierung identifiziert; die Aminosäure-Analyse bestätigte, daß genügend Peptid vorhanden war. Die Aufhebung der Blockierung des CNBr- Fragments wurde durch eine 24 Stunden lange Inkubation des Peptids (3,6 ug) mit Pyroglutamataminopeptidase (Sigma) in 40 ul Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 8,0) bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:10 (Gew./Gew.) erreicht. Das Reaktionsgemisch wurde durch Umkehrphasen-(RP)-Kapillar-HPLC entsalzt und das nicht mehr blockierte CNBr-Fragment in 20 Zyklen [CNBr-1(PYR)] sequenziert.
Eine begrenzte Trypsin-Spaltung wurde vor der Pyridylethylierung an dem intakten Protein durchgeführt. Das Antikoagulans-Protein (20 4g) wurde in 200 ul 1 % NH&sub4;CO&sub3; (pH-Wert 9,00) gelöst und 24 Stunden bei Raumtemperatur bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:20 (Gew./Gew.) mit Trypsin (Sigma-TPcK-behandelt) umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch RP-Kapillar-HPLC entsalzt, wobei ein einzelner Peak erhalten wurde. Die anschließende Reduktion, Pyridylethylierung und erneute Chromatographie ergab vier Peaks, von denen einer die aus 36 Resten bestehende, die Sequenz CNBr-2 überlappende Sequenz TY-1 darstellte.

Analyse der Aminosäure-Sequenz

Der automatische Edman-Abbau wurde auf einem Modell 470A-Protein-Peptid-Sequenziergerät (Applied Biosystems, Inc.) mit vom Hersteller gelieferten Reagenzien, Anleitungen und Standardprogrammen durchgeführt. Die Phenylthiohydantoin-Derivate der Aminosäuren wurden bei jedem Zyklus auf einem Modell 120-PTH-Analysiergerät (Applied Biosystems, Inc.) analysiert, das direkt mit dem 470A-Gasphasen-Sequenziergerät verbunden war. N-terminale Sequenz Interne Sequenzen

Claims

1. Proteinähnliche Stoffe mit Faktor Xa-Hemmwirkung, erhältlich aus den Speicheldrüsen des Blutegels Haementeria ghilianii, indem ein Extrakt aus der Speicheldrüse von Haementeria ghilianii den folgenden Reinigungsschritten unterworfen wird:

- Chromatographie an einer DEAE-Anionenaustauschersäule,

- Chromatographie an Heparin-Agarose,

- Affinitätschromatographie unter Verwendung von Rinder- FXa und

- Umkehrphasen-HPLC;

mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

- ein Molekulargewicht von etwa 18 000;

- nicht stark glycosyliert,

- mit den folgenden Aminosäurezusammensetzungen: Aminosäure

2. Proteinähnlicher Stoff nach Anspruch 1 oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Bildung von Tumormetastasen in einem Patienten mit Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs oder Prostatakrebs.

3. Proteinähnlicher Stoff nach Anspruch 1 oder 2 mit der folgenden Teilaminosäuresequenz:

4. Verwendung eines proteinähnlichen Stoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Arzneimittels, das zur Hemmung der Bildung von Tumormetastasen in einem Patienten mit Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs oder Prostatakrebs eingesetzt werden soll.

5. Verfahren zur Herstellung der proteinähnlichen Stoffe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Durchführung der folgenden Reinigungsschritte an einem Extrakt aus der Speicheldrüse von Haementeria ghilianii:

- Chromatographie an einer DEAE-Anionenaustauschersäule,

- Chromatographie an Heparin-Agarose,

- Affinitätschromatographie unter Verwendung von Rinder- FXa und

- Umkehrphasen-HPLC.

6. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Hemmung der Bildung von Tumormetastasen in einem Patienten mit Melanom, Brustkrebs, Lungenkrebs oder Prostatakrebs eingesetzt werden soll, umfassend die Kombination eines proteinähnlichen Stoffes nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.