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DE68929479T2 - Heilungsverfahren unter Verwendung katalytischer Antikörper - Google Patents

Heilungsverfahren unter Verwendung katalytischer Antikörper Download PDF

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Anthony R. Rockville Rees
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Erzielung von Änderungen der biologischen Funktion durch Fördern der Spaltungsrate oder Bildungsrate spezifischer Bindungen in Biomolekülen in vivo. Genauer betrifft die Erfindung die Förderung der Spaltungs- oder Bildungsrate spezifischer Amid-, Peptid- oder Esterbindungen in Proteinen, indem man in ein Tier einen Antikörper einführt, der diese Spaltungs- oder Bildungsrate fördern kann, oder indem man in ein Tier ein Immunogen einführt, das den gewünschten die Geschwindigkeit fördernden Antikörper auslöst.
  • In der Anmeldung wird mit Hilfe arabischer Zahlen in Klammem auf zahlreiche Veröffentlichungen Bezug genommen. Vollständige bibliographische Angaben dieser Literaturstellen finden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen. Die Literaturstellen beschreiben sowohl der Stand der Technik, auf den sich die Anmeldung bezieht, als auch bestimmte Aspekte der Erfindung selbst.
  • Stand der Technik
  • Bekanntermaßen gibt es zahllose Enzyme, die verschiedene chemische Reaktionen katalysieren können. Gleichermaßen wurde entdeckt, daß Antikörper zum Katalysieren verschiedener chemischer Reaktionen induziert werden können (US-Anmeldung Nr. 674 253). Es ist bekannt, daß Antikörper und Enzyme in der Hinsicht grundsätzliche Gemeinsamkeiten aufweisen, als sie beide spezialisierte Proteine darstellen, die andere Moleküle binden. Andererseits bestehen jedoch wichtige physiologische Unterschiede zwischen Antikörpern und Enzymen.
  • Antikörper binden typischerweise an ein Molekül oder Antigen, um dieses Antigen für den Antikörper produzierenden Organismus als "fremd" zu markieren. Die Bindung des Antikörpers an das Antigen ermöglicht die Entfernung des Antigens aus dem Organismus. Enzyme sind dagegen Biokatalysatoren, die ein Molekül so binden, daß die Aktivierungsenergie für eine das Molekül oder Substrat involvierende Reaktion gesenkt wird, wodurch wiederum die Geschwindigkeit der Reaktion erhöht wird.
  • Linus Pauling hat angenommen, daß es zwei Arten von Wechselwirkungen zwischen Proteinen und den an sie bindenden Molekülen gibt. Antikörper binden Moleküle im Grundzustand am stärksten, während Enzyme Moleküle in ihren energetisch höheren Zuständen am stärksten binden.
  • Auf diesem Bindungsverhalten aufbauend hat Pauling versucht, den Mechanismus der enzymatischen Katalyse zu erklären. Im Verlauf der chemischen Reaktion vollziehen die Reaktanden einen oder mehrere Umwandlungen über Intermediatstrukturen oder Übergangszustände, die energetisch ungünstiger als der Reaktand selbst oder das Produkt sind. Die Hydrolyse einer Peptid- oder Esterbindung verläuft im wässrigen Medium über den Übergangszustand eines tetraedrischen Kohlenstoffs. Im Übergangszustand ist das Kohlenstoffatom gebunden an: das Kohlenstoffatom des Säureanteils der Peptid- oder Esterbindung, zwei Sauerstoffatome, von denen eines der Carbonylgruppe und das andere einem Hydroxylion oder einem Wassermolekül des Mediums entspricht, sowie entweder ein Sauersoffatom des Alkoholbestandteils des Esters oder das Stick stoffatom des Aminbestandteils der Peptidbindung. Der Übergangszustand läßt sich weder isolieren noch nachweisen, da er lediglich für 10–13 Sekunden besteht.
  • Auf molekularer Ebene spiegeln diese Übergangszustände Veränderungen der Bindungslängen und -winken sowie die Bindung und den Bruch von Bindungen wider. Die zum Erreichen eines Übergangszustandes erforderliche Energie wird als Aktivierungsenergie bezeichnet, die auch als der Energieunterschied zwischen der Energie des Übergangszustandes und derjenigen der Reaktanden betrachtet werden kann. Nach der Hypothese von Pauling bindet ein Enzym vorzugsweise den Übergangszustand einer Reaktion, wodurch es diesen relativ zum Substrat bzw. den Produkten stabilisiert, die Aktivierungsenergie der Reaktion verringert und so die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht.
  • Durch Erweiterung dieser Erklärung sagte Pauling weiterhin voraus, daß stabile Analoga des Übergangszustands fest an das Enzym gebunden würden. Im Rahmen einer Diskussion über Verformung des Substrats als eine der vielen Möglichkeiten zur Geschwindigkeitserhöhung durch Enzyme wurde angeregt, daß man den Ausdruck "Analogon des Übergangszustands" zur Beschreibung eines Inhibitors dieses Typs verwenden könne (1).
  • Paulings Hypothese ist zur Basis für das nunmehr anerkannte Vorgehen zum Design von Enzyminhibitoren geworden. Die Strategien zum Design von Enzyminhibitoren hat wiederum die Strategie zur Erzeugung katalytischer Antikörper angeregt, bei der Antigene aufgrund von mechanistischen Prinzipien so konstruiert werden, daß als Reaktion auf solche Antigene gebildete
    Antikörper eine chemische Reaktion katalysieren, indem sie den durch das Design des Antikörpers implizierten Reaktionsmechanismus durchführen. Diese Strategie ist in zahlreichen Ansätzen verfolgt worden.
  • Beispielsweise wurde ein Analogon des Übergangszustands, das den Übergangszustand für die Spaltung einer Esterbindung nachahmt, zur Erzeugung monoklonaler Antikörper verwendet, die als katalytische Esterase fungierten (2). Genauer beschleunigte der erzeugte Antikörper die Hydrolyse eines Essigsäurearylesters um einen Faktor 15.000.
  • In einem anderen Beispiel wurde ein den Übergangszustand einer intramolekularen Zyklisierung eines 6-gliedrigen Ringes nachahmendes Analogon dieses Übergangszustandes verwendet, um die Bildung eines monoklonalen Antikörpers anzuregen, der als stereospezifischer, enzymvermittelter Katalysator wirkte (3). Genauer beschleunigte der so erzeugte Antikörper die Bildung eines einzigen Enantiomeren des δ-Lactons aus dem entsprechenden δ-Hydroxyester-Racemat um etwa einen Faktor 800.
  • Ebenso wurden Monoarylphosphonamidatester als Analoga des Übergangszustands der Hydrolyse von Arylamiden synthetisiert und als Haptene zum Anregen der Bildung von spezifischen monoklonalen Antikörpern verwendet, welche die Hydrolyse von Arylamiden katalysieren können (4). Entsprechend den Angaben wirkten einige der erzeugten Antikörper katalytisch und waren spezifisch für die Hydrolyse spezieller Arylester, und zwar mit einer Geschwindigkeitserhöhung von 250.000.
  • Phosphonamidat- oder Phosphonatanaloga-Liganden mit der Konformation des Hydrolyse-Übergangszustands eines Amid- oder Esterliganden, die zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt wurden, sind in dem an Tramontano et al. erteilten US-Patent 4 659 567 (Tramontano) beschrieben. Die auf diese Weise erzeugten Antikörper schließen den Angaben zufolge ein Paratop ein, das das tetraedrische Kohlenstoffatom des Esterhydrolyse-Übergangszustands des Liganden bindet und stabilisiert, um den Liganden an einer bestimmten Stelle zu hydrolysieren.
  • Zur Erzeugung von Antikörper-Katalysatoren für die Hydrolyse von Estern und Amiden verwendbare Analoga als Liganden sind auch in der EP-A-0 251 093 der Kollmorgen Corp. (Kollmorgen) beschrieben.
  • Analoga als Liganden sind gemäß einem rationalen Designansatz konstruiert worden, der die Stabilisierung des Übergangszustands maximiert und die atomaren Beziehungen im Analogon des proteolytischen Überganszustands optimiert, wodurch die Erzeugung von Antikörpern möglich wird, welche die beiden wesentlichen Effekte der enzymatischen Katalyse, d.h. die molekulare Erkennung sowie die Geschwindigkeitserhöhung, hervorbringen können. Antigene, Immunogene und immunologische Verfahren zur Erzeugung katalytischer Antikörper sind beschrieben in der allgemein angeführten Stammanmeldung Nr. 190 271, eingereicht am 4. Mai 1988.
  • Bekanntermaßen können gegen Peptide hervorgerufene Antikörper an dieselbe Sequenz binden, wenn diese sich in einem intakten Protein befindet. Beispielsweise können Antikörper gegen ein Peptid, das die Aminosäuren 1–15 des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF) enthält, an den nativen Tumor-Nekrose-Faktor binden und dadurch dessen Wechselwirkung mit dem Zelloberflächen-Rezeptor unterbinden (1). Gleichermaßen kreuzreagieren Antikörper gegen ein Aminosäuren des gp120-Hüllproteins aus HIV enthaltendes Peptid mit dem intakten Virus und verhindern die Interaktion des Virus mit dessen zellulären Rezeptor CD4 (2). In einem weiteren Beispiel konnten gegen ein die Aminosäuren 67–83 des Hühnerei-Lysoryms enthaltendes Peptid hervorgerufene Antikörper mit dem intakten Protein kreuzreagieren und können auch Lysozyme anderer Vogelarten erkennen, deren Sequenzen im Epitop im wesentlichen vergleichbar sind (3).
  • Obwohl Verfahren zur Herstellung katalytischer Antikörper sowie Verfahren zur Bindung nichtkatalytischer Antikörper an jeweils interessierende Antigene oder Substrate beschrieben worden sind, hat der Stand der Technik noch kein therapeutisches Verfahren bereitgestellt, bei dem man geschwindigkeitserhöhende Antikörper gegen zuvor als Zielobjekte bestimmte Biomoleküle richtet. Darüber hinaus hat der Stand der Technik weder ein Verfahren zur Verringerung oder anderweitigen Steuerung der biologischen Wirkungen unerwünschter Proteine wie dem Tumor-Nekrose-Faktor bereitgestellt noch hat er für Verfahren zum Abmildern der Symptome von Allergien, zum Verringern der Infektiosität des HIV-Virus, zum Abschwächen der Wirkungen des Bluthochdrucks und anderer Erkrankungen und physiologischer Zustände gesorgt, die sich durch die Spaltung oder Bildung bestimmter Biomoleküle steuern lassen.
  • Der Scientific American (Bd. 258 (1988) S. 42–50) legt die Verwendung von katalytischen Antikörpern zur Spaltung von viralen Hüllproteinen nahe.
  • Ebenso schlägt die EP-A-0 260 939 katalytische Antikörper zur Spaltung von Proteinen wie z.B. über Spaltung von Ester- oder Amidbindungen vor.
  • Andere Anwendungsmöglichkeiten für katalytische Antikörper, insbesondere der Abbau von Kohlenhydraten, die Behandlung von Krankheiten oder die Krebstherapie, werden in der EP-A-0251 093 allgemein erwähnt.
  • Der Stand der Technik hat jedoch keine verläßlichen Verfahren für die Aktivierung eines Prodrugs unter Verwendung von Katalysatoren zur Verfügung gestellt, um den aktiven Wirkstoff aus dem Prodrug freizusetzen.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Es ist eine Hauptaufgabe dieser Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Fördern der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder glykosidischen Bindung in Biomolekülen in vivo bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zubereitung zum Fördern der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung solcher spezifischer Bindungen in vivo durch einen die Geschwindigkeit fördernden Antikörper bereitzustellen, der in ein Tier eingeführt werden soll, wobei der Antikörper über ein rationales Designverfahren gemäß der Erfindung hergestellt wird.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zubereitung zum Fördern der Spalt- oder Bildungsrate einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder glykosidischen Bindungen in Biomolekülen in vivo durch eine wirksame Menge eines Antigens bereitzustellen, das in ein Tier eingefügt werden soll, wobei das Antigen über die Einwirkung auf das Immunsystems des Tieres Antikörper auslöst, die die Spaltungs- oder Bildungsrate dieser Bindungen erhöhen.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine biologische Funktion in einem Tier zu aktivieren oder zu desaktivieren, indem die Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung spezifischer Bindungen in vivo über rationale Designverfahren erhöht wird, die das Identifizieren des Biomoleküls umfassen, das gebildet oder gespalten werden soll, so daß die gewünschte biologische Aktivierung oder Desaktivierung erzielt werden kann, und danach Wählen des geeigneten Antigens, so daß der gewünschte, die Geschwindigkeit erhöhende Antikörper ausgelöst werden kann.
  • Es ist noch eine Aufgabe und ein verwandtes Ziel der Erfindung, Algorithmen bereitzustellen und bestimmte Aminosäuresequenzen in Biomolekülen zu identifizieren, worin die gewünschte Spaltung oder Bildung erzielt werden kann.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Antigene bereitzustellen, die Vaccinen analog sind und die das Immunsystem des Tieres dazu veranlassen, einen gewünschten katalytischen Antikörper zu entwickeln, der dann auf ein Biomolekül einwirkt, um die Spaltungsgeschwindigkeit desselben zu erhöhen und die gewünschte Aktivierung oder Desaktivierung einer biologischen Funktion zu erzielen.
  • Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Aktivierung oder Desaktivierung bestimmter biologischer Funktionen zu verursachen, beispielsweise die Verringerung allergischer Symptome, die Verringerung der Infektionswirksamkeit eines Virus, die Entgiftung von Lipopolysaccharid, die Linderung der Wirkungen des Tumornekrosefaktors und die Verringerung des Bluthochdrucks, indem man die Menge an menschlichem Renin in vivo verringert.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Aktivierung eines Prodrugs zu verursachen.
  • Die Erfindung stellt somit bereit die Verwendung einer wirksamen Menge eines die Geschwindigkeit erhöhenden Antikörpers in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, wobei dieser Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Auswahl der zu spaltenden oder zu bildenden spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält und das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dadurch Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit die Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zum Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, von einer wirksamen Menge eines Antigens, das fähig ist Antikörper in einem Tier hervorzurufen, die die Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung dieser Bindung erhöhen, wobei der Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Auswahl der zu spaltenden oder zu bildenden spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält und das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dadurch Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  • Die Erfindung stellt weiterhin bereit die Verwendung einer wirksamen Menge eines die Geschwindigkeit erhöhenden Antikörpers für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Aktivieren oder Deaktivieren einer biologischen Funktion in einem Tier durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, wobei dieser Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren: a) Identifizieren eines Biomoleküls, dessen Bildung oder Spaltung zu der Aktivierung oder Deaktivierung der gewünschten biologischen Funktion führt, wobei dieses Biomolekül eine zugängliche zu spaltende oder zu bildende Bindung aufweist; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält, das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dabei Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  • Die Erfindung stellt außerdem bereit die Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zum Aktivieren oder Deaktivieren einer biologischen Funktion durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, von einer wirksamen Menge eines Antigens, das fähig ist, Antikörper in diesem Tier hervorzurufen, die die Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung dieser Bindung erhöhen, wobei dieses Antigen hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Identifizierung eines Biomoleküls, dessen Bildung oder Spaltung zu der Aktivierung oder Deaktivierung der gewünschten biologischen Funktion führt, wobei dieses Biomolekül eine zugängliche oder oberflächenlokalisierte, zu spaltende oder zu bildende Bindung aufweist; und b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält, das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Erfindung wie auch andere Aufgaben, Merkmale und Vorzüge derselben werden klarer und vollständiger aus der folgenden genauen Beschreibung verstanden werden, wenn diese unter Bezugnahme auf die angefügten Zeichnungen gelesen wird, worin:
  • 1 die dosisabhängige Inhibition der HIV-I p 24 gag-Produktion in infizierten H9-Zellen durch den Klon AHIV 1.3 zeigt; und
  • 2 die dosisabhängige Inhibition der HIV-I-induzierten Zellfusion durch die Klone AHIV 1.3, AHIV 1.6 und AHIV 2.0 zeigt.
  • Genauere Erfindungsbeschreibung
  • Definitionen von Ausdrücken:
  • In weitesten Sinne läßt sich der Ausdruck "Antigen" als ein Molekül definieren, das die Bildung von Antikörpern anregt. Wie er hier verwendet wird, meint der Begriff "Antigen" ein Molekül, das inhärent immunogen wirkt, ein erfindungsgemäßes Hapten oder ein Immunogen, das ein erfindungsgemäßes Hapten enthält, das mit Hilfe einer geeigneten Kupplungseinheit an ein Trägermolekül gekuppelt ist. Die Trägermoleküle schließen beispielsweise das Haemocyanin der Muschel Fissurella, Thyreoglobulin, Hühner-Immunoglobulin, Ovalbumin, Rinderserumalbumin (BSA), T-Helferpeptide usw ein. Der Begriff "Kupplungseinheiten", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf in der Fachwelt bekannte biotechnologische Vernetzungsmittel (z.B. die von Pierce, Rockford, Illinois im Handel erhältlichen) und schließt beispielsweise das Trout'sche Reagens, Disuccinylsuberat u.a. ein.
  • Der Begriff "Antikörper" umfaßt vollständige Immunglobuline und deren Fragmente, soweit sie die Bindungstelle für das Antigen enthalten.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Analogon des Übergangszustands (Übergangszustandsanalogon)" meint eine Anordnung von Atomen, die sich der Konfiguration einer Amid- oder Esterbindung, wie sie im hydrolytischen Übergangszustand vorliegt, annähern oder diese nachahmen soll.
  • Der Ausdruck "Dipeptidanaloga" meint, wie er hier verwendet wird, eine ein Analogon des Übergangszustands oder eines unter Spannung stehenden Grundzustands oder von beidem aufweisende Struktur mit Seitenketten der beiden Aminosäuren, die in ihren Positionen denjenigen des nachgeahmten Peptids entsprechen. In anderen Worten wird in einem Dipeptidanalogon die normale Amidbindung (d.h. -CO-NH-) zwischen den beiden Aminosäuren durch eine wie oben definierte Anordnung von Atomen ersetzt. Weitere Aminosäurereste können um das Dipeptidanalogon zum Erhalt eines Polypeptids herum enthalten sein. So ersetzt das Dipeptidanalogon die zur Spaltung im Substratmolekül angepeilte Peptidbindung. Die Einheiten um das Dipeptidanalogon herum enthalten Peptidbindungen, die in der Weise abgewandelt sein können, daß die natürlicherweise auftretende C=O-Gruppe durch NH, O, S, CH2, CF2 oder C=S und/oder die natürlicherweise auftretende NH-Gruppe durch O, S, CH2, CF2, C=O oder C=S ersetzt ist. Beispielsweise können die Einheiten Retropeptide darstellen, in denen die C=O und NH-Gruppen der Amidbindungen vertauscht sind.
  • Der Ausdruck "einiges oder alles" meint einen Teil des Zielmoleküls, einschließlich mindestens der zu spaltenden Ester-, Amid- oder glycosidischen Bindung, oder das gesamte Zielmolekül. Beispielsweise muß nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform in einem Hapten, welches zum Zweck der Erzeugung von Antikörpern zur Katalyse der Spaltung einer spezifischen Peptidbindung in einem Proteinmolekül aus einem Polypeptid aus vielen Aminosäuren besteht, das der Peptidbindung im Zielprotein entsprechende Dipeptidanalogon von nicht mehr als acht Aminosäureresten umgeben sein. Handelt es sich bei dem Zielmolekül jedoch um ein relativ kurzes Molekül, ist es vorteilhaft, das Dipeptidanalogon mit allen Aminosäureresten des Zielmoleküls zu umgeben. Der mit üblichem Fachwissen ausgestattete Fachmann erkennt, daß die erwünschte Spezifität, die Natur des Zielmoleküls und andere Faktoren die zur Umgebung des Dipeptidanalogons erforderliche, ideale Anzahl an Aminosäureresten diktieren.
  • Der Ausdruck "entspricht im wesentlichen" meint Einheiten, die in bezug auf Ladung und/oder Größe den Einheiten im das Analogon der zu spaltenden Bindung enthaltenden Antigen gleichen. Vorzugsweise stimmen die Einheiten in bezug auf Ladung und Größe überein, obwohl Identität keine Notwendigkeit für das erfindungsgemäße Hapten darstellt. Haptene können ein oder mehrere asymmetrische Zentren enthalten und somit in enantiomerer oder diastereomerer Form vorliegen. Im allgemeinen werden die Haptene in Form von Racematen oder Gemischen von Diastereomeren erhalten. Falls gewünscht, können bekannte Verfahren zur Auftrennung der Gemische in ihre sterisch homogenen Bestandteile angewandt werden. Die Herstellung der optischen Isomere in reiner Form ist auch unter Verwendung sterisch homogener Ausgangsmaterialien möglich.
  • Der Ausdruck "Hapten", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das als Epitop wirken kann. Die Haptene enthalten eine zu spaltende Amid-, Peptid-, Ester- oder glycosidische Bindung.
  • Physiologisch geeignete Salze umfassen Salze von Mineralsäuren, z.B. der Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dergleichen, von monobasischen Carbonsäuren wie beispielsweise Essigsäure, Propionsäure usw, von dibasischen Carbonsäuren wie z.B. Maleinsäure, Fumarsäure und dergleichen und von tribasischen Carbonsäuren wie Citronensäure und dergleichen.
  • Der hier verwendete Ausdruck "natürlich auftretende Aminosäuren" schließt die 20 essentiellen α-Aminosäuren sowie andere α-Aminosäuren ein, die sich ggf. in Proteinen finden. Diese Aminosäuren umfassen Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, ε-N-Methyllysin, 3-Methylhistidin, β-Alanin, γ-Aminobuttersäure, Homocystein, Homoserin, Citrullin, Ornithin, Canaverin, Djenkolsäure und B-Cyanoalanin. Eine Aminosäure besteht aus einem Kohlenstoffatom, an das eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe, ein Wasserstoffatom und eine kennzeichnende Gruppe, die als "Seitenkette" bezeichnet wird, gebunden sind. Der hier benutzte Ausdruck "Analogon einer Seitenkette" ist als die Seitenkette einer natürlich auftretenden Aminosäure definiert, in der eine oder mehrere Gruppen der natürlichen Seitenkette durch eine oder mehrere andere Gruppen ersetzt sind, die der natürlichen Gruppe im wesentlichen entsprechen. Die Hydroxylgruppen enthaltenden Seitenketten können glycosyliert, phosphoryliert, sulphoniert oder mit Hilfe einer Hydroxylschutzgruppe geschützt sein. Die Hydroxygruppen jeder Seitenkette können mit einer beliebigen Anzahl der im Stand der Technik bekannten, geeigneten Schutzgruppen geschützt sein. Diese schließen beispielsweise t-Butylethergruppen ein.
  • Der Ausdruck "terminale Aminoschutzgruppe" meint jede Schutzgruppe, die die terminale Aminogruppe eines Peptids oder einer Aminosäure schützen kann. Somit schließen terminale Aminoschutzgruppen Acetyl, Succinyl, Biphenylcarbonyl, Benzoyl, t-Butyloxycarbonyl, Carbobenzyloxy, Tosyl, Dansyl, Isovaleryl, Phthalyl, 1-Adamantansulfonyl, Acetimido, Benzimido, Aminino, Carbamyl und deren funktionalen Äquivalente ein.
  • Der Ausdruck "terminale Carboxyschutzgruppe" meint jede Gruppe, die die terminale Carboxyleinheit eines Peptids oder einer Aminosäure schützen kann. Solche terminalen Carboxylschutzgruppen umfassen (C1-C9)-Alkyl, Phenyl, substituierte Methylester wie Methoxymethyl und Phenoxyacylester, 2-substituierte Ethylester wie Cyclohexyl und Allyl, substituierte Benzylester wie p-Methoxybenzyl und p-Brombenzyl, Amide wie Piperidinyl und Hydrazid und deren funktionalen Äquivalente ein.
  • Der Begriff "Biomolekül" ist als ein Molekül definiert, das in vivo oder in vitro ein biologisches System beeinflußt. Biomoleküle können von Zellen oder auch chemisch synthetisiert werden. Beispiele für solche Biomoleküle schließen Proteine, Glycoproteine, Peptide, Steroide, Nukleinsäuren und Oligo- und Polysaccharide ein. Ebenso umfaßt sind die synthetischen Peptid-, Steroid- und Nukleinsäureanaloga usw. Pharmazeutisch aktive Verbindungen wie Theophyllin, Capoten, Cyclosporin usw werden ebenfalls als Biomoleküle betrachtet.
  • Der Ausdruck "zugänglich" meint die Fähigkeit mit der Kombinierungsstelle eines Antikörpers kombinieren zu können.
  • Ein katalytischer Antikörper ist ein Antikörper, der die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion verändern kann, wobei alle anderen Bedingungen (z.B. Temperatur, Reaktand-/ Substratkonzentrationen usw) gleich bleiben, der nicht an der Reaktion teilnimmt und deshalb in dieser nicht verbraucht wird und eine Vielzahl von Molen an Reaktand/Substrat pro Mol katalytischem Antikörper umsetzen kann. Mechanistisch gesehen, bindet er den Reaktand/das Substrat, bewirkt die beschleunigte Umwandlung des Reaktanden/Substrats in das Produkt und setzt das Produkt frei, wobei er die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion verändert, ohne die Lage des Gleichgewichts zu verändern. Die oben genannten Eigenschaften stellen Eigen schaften eines idealen Katalysators dar. In der Praxis wird jedoch auch der beste Katalysator durch Verunreinigungen im Reaktionssystem oder in Folge chemischer oder physikalischer Zerstörung während des Reaktionsablaufs vergiftet oder desaktiviert. Aus wohlbekannten Gründen kann die tatsächliche Wirkung eines Katalysators durch Komponenten des Reaktionssystems oder durch die Bedingungen des Reaktionsmilieus vereitelt werden.
  • Ein stöchiometrischer Antikörper ist ein Antikörper, der die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion stöchiometrisch beschleunigt, d.h. er steigert die Geschwindigkeit einer Reaktion, wird jedoch, anders als der katalytische Antikörper, während der Reaktion stöchiometrisch verbraucht.
  • Identification von Biomolekülen sowie darin enthaltenen Sequenzen als Zielobjekte der therapeutischen Wirkung
  • In den beschriebenen Beispielen für katalytische monoklonale Antikörper wird die Spezifität dieser Antikörper erreicht, weil das kontaktierte Molekül, das Substrat, im wesentlichen mit dem Immunogen übereinstimmt, jedoch mit der Ausnahme der Struktur des Übergangszustands, die nur im Immunogen vorhanden ist. Es hat sich nun herausgestellt, daß sich dieser Ansatz auf das Design von Immunogenen oder Haptenen zum Erzeugen katalytischer Antikörper erweitern läßt, die eine Reaktion in einem Substrat katalysieren können, wenn dieses Substrat einen Teil eines größeren, komplexeren biologischen Moleküls darstellt.
  • Beispielsweise liegt beim Design eines Oligopeptids als Hapten das Analogon des Übergangszustands irgendwo in der Sequenz, was zur Induktion eines katalytischen Antikörpers mit Peptidaseaktivität führt. Die Spezifität des Antikörpers ist durch die die Struktur des Übergangszustandsanalogons flankierenden Aminosäuren definiert. Der auf diese Weise erzeugte Antikörper hydrolysiert das Peptid spezifisch, während Peptide mit ähnlichen, jedoch nicht identischen Sequenzen oder Strukturen nicht hydrolysiert werden. Derartige katalytische Antikörper hydrolysieren das Peptid auch dann, wenn es einen Teil eines Proteins bildet, vorausgesetzt, (a) die fragliche Peptidsequenz steht, wenn sie in einem nativen Protein vorliegt, für die Bindung an den katalytischen Antikörper zu Verfügung, d.h. das Epitop befindet sich auf der Oberfläche, und (b) die fragliche Sequenz kann, wenn sie zur Verfügung steht, im Protein die Konformation annehmen, die das vollständige Oligopeptid in seiner freien, als Substrat aktiven Form einnimmt.
  • Es hat sich nunmehr herausgestellt, daß Peptid-, Ester- oder gylcosidische Bindungen in einem Biomolekül als "zugänglich" oder "nicht zugänglich" bzw. als "auf der Oberfläche befindlich" oder "nicht auf der Oberfläche befindlich" identifizierende Algorithmen zur Unterstützung des Designverfahrens für den Antikörper eingesetzt werden können. Solche Informationen stehen in vielfältiger Form und in unterschiedlicher Präzision zur Verfügung. Erstens lassen sich, ist die dreidimensionale Struktur eines Biomoleküls bekannt, bekanntermaßen auf der Oberfläche befindliche Regionen durch Untersuchung der Struktur als mögliche Antigene identifizieren. Die dreidimensionalen Strukturen aller veröffentlichten Proteinstrukturen sind in der Brookhaven-Datenbank (4) gespeichert und leicht zugänglich, während die dreidimensionalen Strukturen von anderen Biomolekülen in der Camebridge-Datenbank erfaßt sind.
  • Steht keine Struktur zur Verfügung, können vergleichbare, wenn auch weniger präzise Informationen durch Bezugnahme auf ein Computermodell oder eine vorhergesagte Struktur des Biomoleküls erhalten werden. Dies ist besonders dann hilfreich, wenn das interessierende Biomolekül ein Mitglied einer Familie homologer Biomoleküle darstellt, wobei in diesem Fall "auf Vorkenntnissen beruhende" Vorhersagen getroffen und so auf der Oberfläche befindliche Sequenzen identifiziert werden können.
  • Auf einem noch niedrigerem Maß an Präzision können Algorithmen verwendet werden, die ein Hydrophilitätsprofil des Biomoleküls ergeben. Bereiche auf dem Biomolekül, die einen hohen Anteil an hydrophilen oder geladenen Resten enthalten, stellen sehr wahrscheinlich Kandidaten für eine Lokalisation auf der Oberfläche dar.
  • Wenn die Spaltung der Proteinkette beabsichtigt ist, stellen bestimmte Aminosäuresequenzen bevorzugte Zielobjekte dar. Beispielsweise sind die folgende Aminosäurekombinationen enthaltenden Sequenzen, wenn sie in einem Protein oder einer Peptidkette enthalten sind, bevorzugte Stellen der katalytischen Spaltung: Asn-Gly, Asn-Pro, Asp-Gly und Asp-Pro.
  • Gleichermaßen sind Glutaminsäure und Glutamin enthaltende Sequenzen, d.h. Gln-X und Glu-X, wobei X eine Aminosäure ist, bevorzugte Spaltstellen.
  • Eine weitere Alternative zum Design der Spaltung eines Proteins besteht, wenn keine andere Informationen zur Verfügung stehen, darin, einem reinen Zufallsansatz zu folgen, bei dem solange Antikörper gegen verschiedenste Peptide entlang der Proteinsequenz erzeugt werden, bis ein kreuzreaktiver Bereich zwischen Antikörper und Protein lokalisiert ist.
  • Um die Technologie der monoklonalen Antikörper zur therapeutischen Anwendung zu bringen, muß der monoklonale Antikörper an das Antigen binden und darf von diesem nicht abdissoziieren. Bei dem Antigen kann es sich um ein lösliches Protein, einen Virus oder ein anderes toxisches Molekül oder auch um die Oberfläche einer Zelle handeln. Nach der Bindung setzt der Antikörper-Antigen-Komplex entweder die Aktivierung einer lytischen Enzymkaskade in Gang oder wird von phagozytotischen Zellen entfernt.
  • Auf der anderen Seite arbeiten katalytische Antikörper nach einem grundsätzlich anderen Mechanismus. Da ein katalytischer Antikörper, beispielsweise eine Protease, das Protein an der Bindungsstelle schneiden kann, muß die Lokalisation und das Design des Epitops so beschaffen seein, daß durch Proteolyse und abschließendes Abdissoziieren des katalytischen Antikörpers vom Zielobjekt, die biologische Funktion dieses Zielobjektes vollständig verloren geht. Somit kann ein gegen ein Epitop in der Bindungsregion des gp120 des HIV gerichteter nichtkatalytischer Antikörper die Bindung des Virus an seinen CD4-Rezeptor verhindern (4). Diese Inhibition kommt deshalb zustande, weil die Hauptmasse des Antikörpers den Kontakt zwischen Virus und Rezeptor verhindert.
  • Dagegen muß, obwohl ein gegen dieselbe Virusregion gerichteter katalytischer Antikörper als Protease zum selben Verlust an Wechselwirkung mit dem Rezeptor führen kann, eine andere Kette von Ereignissen eintreten, damit der Verlust der Infektiosität sichergestellt ist. Nach dem Zerschneiden der viralen Proteinkette bleibt die Protease nicht gebunden; somit muß, um Wirksam zu sein, das Zerschneiden selbst zum Verlust der Bindung führen. Dieses muß nicht zwangsläufig auftreten. Beispielsweise könnte die Spaltung einer speziellen Peptidbindung zu einer Zerstörung der dreidimensionalen Struktur führen, die zum Zerstören der Rezeptorbindungsaktivität nicht ausreicht. Dagegen kann die Proteolyse einer Peptidbindung in einem vom Bereich der Rezeptorbindung entfernten Epitop zum Verlust der Infektiositzät des Virus führen, allein durch deren destabilisierende Wirkung auf die Proteinstruktur. Da katalytische Antikörper nicht ausschließlich durch den einfachen Effekt der sterischen Behinderung wirken, muß deshalb ein gänzlich anderes Designverfahren für die als Zielobjekt dienenden Sequenzen etabliert werden. Spezifische Beispiele, wie ein solches Verfahren ausgeführt werden kann, sind unten dargestellt.
  • Diese Verfahren der Erfindung können auch benutzt werden, um eine Spaltung zu bewirken, die zur Aktivierung einer biologischen Funktion führt. Solche Reaktionen schließen die Spaltung von Peptidbindungen ein, können jedoch ebenso Esterbindungen, glycosidische Bindungen oder andere Bindungstypen involvieren.
  • Ein Beispiel für die Spaltung eines Biomoleküls, die zur Aktivierung der biologischen Funktion führt, ist die Behandlung von Insulin-abhängigem Diabetes. Die Patienten verabreichen sich Insulin über Injektionen selbst. Die Fachwelt hat nach Insulinzubereitungen gesucht, deren Freisetzung in den Blutkreislauf die Pharmakokinetik der Freisetzung des natürlichen Insulins aus dem Pankreas nachahmt. Insulin liegt im Pankreas in einer Vorläuferform vor, dem Proinsulin, dessen Aktivität um mehrere Größenordnungen geringer ist als diejenige von Insulin selbst. Eine für die Peptidbindung, die zur Umwandlung von Proinsulin zu Insulin führt, spezifische Antikörperprotease läßt sich so konstruieren, daß ihre kinetischen Eigenschaften eine in-vivo-Freisetzung von Insulin nach Injektion von Proinsulin zusammen mit Antikörperprotease gestatten. Dies ist ein Beispiel für die Aktivierung eines Prodrugs, wobei der Wirkstoff in diesem Fall ein natürliches Proteinhormon ist. Die Prodrugs können jedes therapeutisch wirksame Molekül umfassen, das zur Aktivierung einer biologischen Funktion führt. Die Vorläuferform kann dabei entweder die Vorteile einer natürlich vorkommenden Modifikation des Wirkstoffes oder jeder geeigneten synthetischen Modifikation desselben ausnutzen. Geeignete Wirkstoffderivate mit niedriger Aktivität (sowohl therapeutisch wirksamer als auch toxischer), werden bei der Modifikation mit einem geeigneten katalytischen Antikörper in die aktive Form überführt. Ein spezifisches Beispiel für ein solches Verfahren ist im folgenden dargestellt.
  • Herstellung und Verwendung von geschwindigkeitserhöhenden Antikörpern
  • Die Erzeugung von geschwindigkeitserhöhenden Antikörpern, d.h. stöchiometrischen oder katalytischen Beschleunigern der Geschwindigkeit, kann über in-vivo- oder in-vitro-Verfahren angeregt werden. Der hier verwendete Ausdruck "erzeugt" (auch "Bildung angeregt") bezieht sich auf die Erzeugung katalytischer Antikörper mittels der erfindungsgemäßen Antigene sowohl über in-vivo- als auch in-vitro-Verfahren. Für den Fachmann ist jedoch offensichtlich, daß bei der in-vitro-Erzeugung die erfindungsgemäßen Haptene selbst verwendet werden können, um die Bildung der katalytischen Antikörper anzuregen. Bei der Erzeugung über in-vivo-Verfahren, sei vorausgesetzt, daß zur Erzeugung der katalytischen Antikörper Immunogene verwendet werden, die im Komplex mit einem geeigneten Trägermolekül angeordnete Haptene enthalten. Das Antigen enthält ein Hapten, welches die geeignete, hypervariable Bindungsregion im Antikörpermolekül erzeugen soll, um die intrinsische Bindungsenergie für den Übergangszustand einer chemischen Reaktion, insbesondere einer Hydrolysereaktion, darzustellen. Die im aktiven Zentrum hervorgerufene Anordnung der Aminosäureseitenketten ist dabei zur Durchführung der chemischen Modifikation des interessierenden Epitops geeignet. Weitere Verbesserungen der katalytischen Effizienz können durch Punkt spezifische Mutagenese (site-dvected mutagenesis) erzielt werden.
  • Grob gesagt, besteht das Verfahren darin, Zellen, die Antikörper produzieren können, dem Antigen auszusetzen und dadurch Antikörper produzierende Zellen zu erzeugen, die Antikörper produzierenden Zellen mit Myelomzellen zu hybridisieren und so eine Vielzahl von Hybridomzellen zu erzeugen, die monoklonale Antikörper produzieren, und die Vielzahl der monoklonalen Antikörper durchzutesten, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die interessierende chemische Reaktion katalysiert. Der so identifizierte monoklonale Antikörper kann wiederum über in-vivo- oder in-vitro-Verfahren zum Erhalt einer für die Katalyse der interessierenden chemischen Reaktion ausreichenden Menge repliziert werden.
  • Der Nachweis von Antikörpern mit der gewünschten katalytischen Aktivität und Spezifität erfolgt mit Hilfe des Durchtestens der Hybridomen, sobald diese erzeugt worden sind. Beispielsweise kann dieses Testen mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder spektrophotometrischer Methoden (ELISA) erfolgen. Monoklonale katalytische Antikörper werden in-vivo durch Modifikation des von Koprowski et al. in der US-A-4 196 265, erteilt am 1. April 1980, die durch Bezugnahme einbezogen wird, offenbarten Verfahrens erzeugt. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind bekannt. Eine Serie gegen ein bestimmtes Molekül gerichteter Antikörper wird unter geeigneten Bedingungen hergestellt. Dies umfaßt zunächst die Immunisierung von Balb/C-Mäusen mit einem geeigneten Antigen. Das Antigen weist ein erfindungsgemäßes Hapten auf, welches an ein Peptid oder anderes Trägermolekül gebunden ist.
  • Danach werden Antikörper produzierende Lymphozyten aus der Milz der immunisierten Mäuse entnommen und mit Myelomzellen wie SP2/0-Zellen zur Herstellung von Hybridomzellen hybridisiert. Diese Hybridomzellen werden anschließend in den Näpfen von Mikrotiterplatten ausplatiert. Die von den Hybridomzellen erzeugte Serie von monoklonalen Antikörpern wird dann zur Identifikation derjenigen Antikörper, welche die gewünschte Reaktion unter geeigneten Bedingungen katalysieren, durchgetestet. Alternativ dazu kann das Medium auf Antikörper getestet werden, die an das Immunogen binden; die diese Antikörper produzierenden Hybridomen können dann in Gewebskulturen expandiert oder in-vivo herangezogen werden. Das Testen erfolgt bequemer Weise dadurch, daß man eine standardisierte Lösung des Reaktanden mit einem aus dem Mikrotiternapf entnommenen Aliquot behandelt und die Anwesenheit des gewünschten Produkts mittels konventioneller instrumenteller Methoden mißt. Eine solche Messung läßt sich beispielsweise leicht mit Hilfe spektrophotometrischer Verfahren oder mit Hilfe der Gas-Flüssigkeits- oder der Hochdruckflüssigkeitschromatographie durchführen. Durch den Vergleich mit standardisierten Proben des gewünschten Produkts oder des Reaktanden lassen sich die Reaktionsgeschwindigkeiten quantifizieren. Auf diese Weise identifiziert man monoklonale katalytische Antikörper produzierende Hybridomzellen enthaltende Näpfe. Die selektierten Hybridomen werden anschließend zum Erhalt von Kolonien kultiviert.
  • Die Kolonien können in in-vitro- oder in-vivo-Systemen weiterpropagiert werden. In letzterem Fall werden Mäuse wie syngene Balb/C-Mäuse intraperitoneal mit den selektierten Hybridomzellen inokuliert; im allgemeinen bringen sie innerhalb von 2 oder 3 Wochen Tumoren hervor. Mit diesen Tumoren geht die Produktion von Ascitesflüssigkeit einher, die die gewünschten monoklonalen Antikörper enthält. Anschließend werden die monoklonalen Antikörper mit Hilfe üblicher Verfahren wie der Ultrafiltration, der Ultrazentrifugation, der Dialyse und der Immunaffinitätschromatographie separat aus der Ascitesflüssigkeit gewonnen.
  • Die separat gewonnenen monoklonalen Antikörper werden unter geeigneten Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes aus dem Antikörper und dem Zielmolekül gestatten, in vivo in ein Tier eingebracht. Im allgemeinen liegt die eingesetzte Konzentration des katalytischen Antikörpers unter der Äquivalentkonzentration des Zielmoleküls und kann im picomolaren Bereich liegen. Die Antikörper sollten in vivo unter normalen physiologischen Bedingungen arbeiten. Der Fachmann wird hierbei anstreben, daß sich die für die Komplexbildung geeigneten Bedingungen je nach betrachtetem Molekül und Antikörper unterscheiden.
  • Die gemäß einem der obigen Verfahren hergestellten Antikörper können über immortalisierte Zellinien in vitro erzeugt werden. Eine geeignete Form dieses Antikörpers (z.B. ein "humanisierter" monoklonaler Maus-Antikörper) würde dann als therapeutischer "Wirkstoff" verabreicht.
  • Während des Ablaufs der chemischen Reaktion durchlaufen die Reaktanden einen oder mehrere Übergänge durch Strukturen die energetisch ungünstiger als der Zustand des Reaktanden oder Produkts sind. Auf molekularer Basis betrachtet, handelt es sich bei diesen Übergangszuständen (oder Zwischenstrukturen) um Veränderungen in Bezug auf Bindungslänge und -winkel sowie auch um die Bildung und den Bruch von Bindungen. Die zum Erreichen des Übergangszustands erforderliche Energie wird als Aktivierungsenergie bezeichnet, die auch als der Energieunterschied zwischen der Energie des Übergangszustands und der Energie der Reaktanden betrachtet werden kann.
  • Katalysatoren erhöhen die chemischen Reaktionsgeschwindigkeiten, indem sie die Aktivierungsenergie der Reaktion senken. Gegen ein Hapten oder Antigen erzeugte Antikörper, wobei diese Antigene unter anderem deshalb ausgewählt wurden, weil sie der angenommenen Struktur des Übergangszustands ähneln (d.h. Analoga des Übergansgzustands, eines unter Spannung stehenden Grundzustands oder beidem darstellen), können Reaktionen katalysieren. Die auf diese Weise hergestellten Antikörper sollten die Energie des Übergangszustands relativ zu Reaktanden und Produkt stabilisieren. Dieser Ansatz ist erfolgreich bei der Erzeugung zahlreicher katalytischer monoklonaler Antikörper bewiesen worden.
  • Mit rational konstruierten Haptenen erzeugte katalytische Antikörper sind "Punkt-spezifisch", in dem Sinne, daß sie bewußt nur zur Katalyse der Spaltung von Bindungen mit spezifischer struktureller Konformation an bestimmten Stellen innerhalb eines Biomoleküls entworfen wurden. Gleichermaßen wurden diese katalytischen Antikörper so entworfen, daß sie nur die Ausbildung von Bindungen zwischen Enden von Einheiten katalysieren, die bestimmte strukturelle Konformationen an diesen Enden aufweisen. Dementsprechend können die erfindungsgemäßen, rational entworfenen Haptene zum Erzeugen Punkt-spezifischer katalytischer Antikörper verwendet werden, die Bindungen an spezifischen Stellen in einem Biomolekül spalten können, um zwei oder mehr Spaltprodukte zu erzeugen. Derselbe katalytische Antikörper kann auch die Ausbildung von Bindungen katalysieren, wobei diejenigen Spaltprodukte, welche die richtige Konformation aufweisen, miteinander verknüpft werden.
  • Demnach sollen die Haptene die Übergangszustände für eine Reihe von chemischen Reaktionen nachahmen. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Reaktionen um die Spaltung oder Ausbildung einer Peptid-, Ester-, Amid- oder glycosidischen Bindung. Beispielsweise besteht ein wie unten abgebildetes Hapten
    Figure 00210001
    nicht nur aus dem Dipeptidanalogon [CD], sondern enthält außerdem die Aminosäurereste A, B, E und F als Teilbestandteile. Diese Aminosäurereste als Teilbestandteile können ihrerseits Teile einer zyklischen oder auch linearen Struktur darstellen. Die optimale Anzahl der Teilbestandteilsreste ist die Größe des aktiven Zentrums des Antikörpers vorgegeben. Wahrscheinlich besteht das einzige wesentliche Kriterium für eine effektive Bindung eines Antikörpers an ein Peptid darin, daß die Komplemetarität zwischen dem aktiven Zentrum des Antikörpers und der molekularen Oberfläche des bindenden Peptids im Hinblick auf sowohl Form als auch Ladung gewahrt bleibt.
  • Die Haptene werden so entworfen, daß die gegen diese Haptene hervorgerufenen Antikörper selektiv eines oder alle der hochenergetischen Intermediate oder der Übergangszustände bei der Spaltung oder Ausbildung einer Amid-, Peptid-, Ester oder glycosidischen Bindung stabilisieren können. Die Haptene lassen sich in drei Klassen einteilen: erstens diejenigen, bei denen die Hybridisierung des dem Carbonylkohlenstoff der zuspaltenden Bindung entsprechenden Atoms der Amid- der Esterbindung von sp2- zu sp3-Hybridisierung umgewandelt wird, zweitens diejenigen, bei denen ein der Amid-, Ester- oder glycosidischen Bindung entsprechendes Atom durch ein anderes Atom ersetzt wird, und drittens diejenigen, bei denen die der Amid-, Ester- oder glycosidischen Bindung entsprechenden Atome einen Teil eines mono- oder bizyklischen Systems darstellen.
  • Peptidsequenzen, die an der durch die erfindungsgemäßen katalytischen Antikörper zu spaltenden Bindung Dipeptidanaloga enthalten, definieren eine Sequenz, die der katalytische Antikörper in einem nativen Protein hydrolysiert. Die Bindungsenergie des Antikörpers wird solchermaßen verteilt, daß sowohl eine Sequenz-spezifische Erkennung als auch chemische Reaktivität gegenüber dem interessierenden nativen Protein oder Peptid möglich sind.
  • Berichten zufolge soll es zum Nachweis aller kontinuierlichen Epitope nicht erforderlich sein, Peptide herzustellen, die mehr als acht Aminosäurereste enthalten (Octapeptide) (5). Ebenso wurde nachgewiesen, daß Antikörper auf reproduzierbare Weise an Peptide binden (6). Weiterhin ist anerkannt, daß die optische Isomerie der verwendeten Aminosäuren einen starken Einfluß auf die Stärke und Spezifität der Antikörperbindung durch Dipeptide ausübt. Infolgedessen hat die Bedeutung der L- und D-Aminosäurereste im immunisierenden Antigen deutlichen Einfloß auf die Chiralität des erzeugten aktiven Zentrums des Antikörpers. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen katalytischen Antikörper mit vorbestimmter Spezifität für bestimmte sequenzielle (kontinuierliche) oder angeordnete Epitope in einem nativen Protein sind die Beziehungen zwischen meßbaren Eigenschaften eines Proteins und seinen immunogenen Stellen wesentlich (7). Aufgrund der einfachen Zugänglichkeit der Proteinsequenzen beruht der am weitest verbreitete Algorithmus auf der Wahrscheinlichkeit des Auffindens eines sequentiellen Epitops am Ort eines lokalen Maximums im Hydrophilitätsprofil (8). Profile der Oberflächenzugänglichkeit (9) sowie der Flexibilität (10) des Proteins ergeben ebenfalls Informationen über die antigenen Stellen in einer nativen Proteinsequenz. Aufgrund der Kenntnis dieser Stellen und der Bedeutung dieser Epitope bei rezeptorvermittelten Wechselwirkungen oder anderen mit der Erkrankung verbundenen Mechanismen, können Peptidhaptene erfindungsgemäß konstruiert werden, die Dipeptide in diesen wichtigen "bioaktiven" Epitopen aufweisen. Die mit Hilfe dieser Haptene erzeugten katalytischen Antikörper können dann beispielsweise verwendet werden, um Epitope auf vialen Proteinen oder von Tumoren stammenden Wachstumsfaktoren oder anderen, an lebensbedrohlichen Situationen beteiligten Peptiden (z.B. Tumor-Nekrose-Faktor bei der bakteriellen Sepsis usw.) anzudauen.
  • Somit sind die Haptene auf der Kenntnis mechanistischer Merkmale der enzymatischen Katalyse rational konstruiert und stellen geeignete Matrizen für aktive Zentren von Antikörpern mit katalytischen Eigenschaften zur Verfügung. Infolgedessen umfassen sie alle Merkmale, die notwendig sind, um der molekularen Erkennung sowie der katalytischen Wirkung befähigte Antikörper zur Verfügung zu stellen. Demnach stellt ein ryklisches Kohlenhydrathapten der Formel [1] eine gute Nachahmung des hypothetisierten Übergangszustands [2] (11) für die Hydrolyse einer glycosidischen Bindung in einem typischen O-Glycosid [3] dar, wie unten gezeigt:
    Figure 00230001
    Figure 00240001
  • Katalytische Antikörper zeichnen sich z.B. bei der Immuntherapie viraler Infektionen durch Punkt-spezifische Fähigkeit zur Proteolyse aus. Viren benutzen ihre äußere Hülle, um sich an zelluläre Rezeptoren anzuheften, und dringen nach der Anheftung in die Zelle ein. Beispielsweise nutzt das Human-Immunschwächevirus (HIV) einen Teil des gp120-Proteins auf seiner Oberfläche, um sich an den CD4-Rezeptor auf Lymphozyten anzuheften. Die Sequenz für diese Anheftung an die Zelle ist einer Region auf dem viralen Protein zugeordnet worden. Mit dieser Information können nach dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren Antikörper erzeugt werden, die an diese Peptidsequenz binden und sie Punkt-spezifisch spalten. Solche Antikörper binden jedoch bevorzugt an die native Sequenz im Protein gegenüber der linearen Sequenz (wie sie in einem denatuierten Protein auftreten würde). Demnach stellen die antigenen Determinanten oder Epitope in den nativen Proteinen häufig eher Konformationen (d.h. dreidimensionale Anordnungen) als zufällige lineare Anordnungen dar. Hier ist wiederum die Kenntnis der Epitope auf dem Protein für das Design von Antikörpern mit Paratopen, die Modifikationen solcher Epitope induzieren können, von wesentlicher Bedeutung. Deshalb sollten die Haptene eher so konstruiert werden, daß sie dieselben strukturellen Merkmale wie die Epitope aufweisen, als daß sie Zufallskonformationen annehmen. Diese Konformationen können von einfachen linearen Peptiden eingenommen werden, wobei das Konformer mit der niedrigsten Energie die in Lösung bevorzugte Struktur darstellt. Merkmale der Sekundärstruktur können durch Quervernetzen von Aminosäureseitenketten oder die Verwendung von -Turn-Nachbildnern eingeführt werden. In bezug auf die Konformation unter Spannung stehende Haptene, die mit dem Epitop im nativen Protein kompatible Strukturen enthalten, können für die Induktion des richtigen Motivs in der Tertiärstruktur der hypervariablen Bindungsregion des katalytischen Antikörpers von entscheidender Bedeutung sein. Die Vorteile dieser in bezug auf die Konformation unter Spannung stehenden Haptene besteht darin, daß sie die native Struktur im Protein nachahmen und tendenziell auch die für die Spaltung empfindlichen Bereiche des Proteins simulieren.
  • Oligopeptide mit variablen Längen mit Sequenzen aus den Rezeptorbindungsbereichen von Viren, die einen spezifischen zellulären Rezeptor für die Durchdringung der Wirtszelle nutzen, und mit einem dem Übergangszustand analogen Dipeptid, das einem kritischen Bereich der Sequenz isoster ist, induzieren bei Immunisierung, wahlweise nach Kuppeln an ein geeignetes Trägerprotein, katalytische Antikörper, die das virale Hüllprotein spalten und den Virus am Eindringen in die Zelle hindern. Die dreidimensionale Struktur der Rhino 14- und Polio 1-Viruspartikel ist mittels Röntgenbeugung kartiert worden. Bereiche sind identifiziert worden, die Bindungsstellen für zelluläre Rezeptoren darstellen. Der Bereich des humanen Immunschwächevirus vom Typ 1 (HIV I), der für die Interaktion mit dem CD4-Rezeptor auf T-Lymphozyten kritisch ist, ist lokalisiert und kartiert worden auf Sequenzen im gp120-Hüllprotein. Somit werden in einer Ausführungsform der Erfindung Oligopeptide genutzt, die Teilsequenzen der Hüllproteine von Viren enthalten, die für die Anheftung an die Wirtszelle kritisch sind, und ein isosteres Übergangszustandsdipeptid enthalten, ausgewählt unter den Haptenen gemäß der Erfindung. Die resultierenden Peptidanaloga werden genutzt, um katalytische Antikörper zu induzieren, die Viren durch Proteolyse von Segmenten (Epitopen) auf dem viralen Hüllprotein inaktivieren, die für die Infektiösität kritisch sind. Vorzugsweise werden Oligopeptide mit Sequenzen aus dem Rezeptorbindungsbereich von Retroviren, beispielsweise HIV I, HIV II und Picornaviren, beispielsweise Rhino 14, viralen Polypeptiden, inflammatorischen Proteinen, anaphylaktischen Proteinen, Lymphokinen, Cytokinen und anderen Polypeptidmediatoren der Wirtsinfektion oder von toxischen Syndromen genutzt.
  • Die mit den Antigenen der Erfindung ausgelösten katalytischen Antikörper können bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Krebs und thrombolytischen Erkrankungen nützlich sein. Die katalytischen Antikörper können auch für die Behandlung einer cardiovaskulären Erkrankung nützlich sein, wobei sie Lipoproteine hoher Dichte (HDL) eliminieren, und für die Entgiftung bakterieller Endotoxine.
  • Herstellung und Verwendung von Antigenen als Vakzine
  • Weiterhin hat sich herausgestellt, daß sich aus der Ausnutzung der körpereigenen Fähigkeit, als Reaktion auf einen bestimmten Antigenstimulus Antikörper in-vivo zu erzeugen, Vorteile erlangen lassen. Es sind Verfahren bekannt, bei denen die Immunantwort gegen ein bestimmtes Pathogen durch die Gabe entweder der inaktiven Form des Pathogens oder eines Peptids in Gang gesetzt werden kann, gegen das gerichtete Antikörper mit dem Pathogen kreuzreagieren. Wird nun das reale Pathogen angetroffen, sind Antikörper produzierende B-Zellen mit der richtigen Antikörper-Spezifität bereits vorhanden. Solche auslösenden Mittel werden üblicherweise Vakzine genannt ( ). Ein vergleichbares Verfahren kann für die Induktion katalytischer Antikörper in Betracht gezogen werden. In einem Verfahren, bei dem der zu induzierende Antikörper ein Teil eines systemischen Verfahrens darstellt, wird ein Hapten so konstruiert, daß es ein Analogon des Übergangszustands für die Spaltung an einer spezifischen Stelle enthält. Die Immunisierung mit diesem Hapten aktiviert anschließend bestimmte B-Zellen, von denen einige Antikörper mit katalytischer Wirkung produzieren. Setzt man die bereits aktivierten Zellen dem "normalen" Antigen (Substrat) aus, würden diese im Tier anschließend darauf reagieren, indem sie in vivo katalytische Antikörper erzeugen und so die Notwendigkeit der parenteralen Verabreichung überwinden würden. Diese katalytischen Vakzine könnten sehr breite Anwendung bei der Aktivierung katalytischer Antikörper mit Wirkung gegen Viren und andere Pathogene, gegen toxische Wirkstoffe, abhängigmachenden Drogen, natürlich auftretende Proteine und therapeutisch geeignete Prodrugs finden.
  • Die Erfindung ist anhand des folgenden veranschaulichenden Beispiels besser zu beschreiben und zu verstehen.
  • Beispiel 1
  • Methodik für die Produktion, das Screenen und die Isolierung monoklonaler katalytischer Antikörper, die den „Flap"-Bereich des humanen Renins spalten
  • Die Inhibition von Renin, einer Asparaginproteinase, deren Wirkung die Renin-Angiotension-Kaskade initiiert, war das Ziel intensiver Forschungen der letzten Jahre. Die Möglichkeit der Behandlung des Bluthochdrucks durch die Inhibition des Renins hat zur Synthese einer Vielzahl von potenten Renininhibitoren geführt, auf der Basis der Peptidsequenz des natürlichen Substrats Angiotensinogen. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung eines proteolytischen Antikörpers für Renin.
  • Es ist berichtet worden, dass der „Flap"-Bereich des menschlichen Renins eine Haarnadelschlaufe mit einem Loopbereich von 4 Aminosäureresten ist, der dazu führt, dass die Carbonylgruppe des Tyr 83 mit der Aminogruppe von Thr 85 und Gly 86 wechselwirkt (12). Das cyclische Decapeptid
    Figure 00270001
    aus humanem Renin nimmt Berichten zufolge dieselbe Haarnadelschlaufenstruktur an.
  • In diesem Beispiel werden monoklonale Antikörper ausgelöst mit einem Difluoroketon enthaltenden Immunogen gemäß der Erfindung. Die monoklonalen Antikörper werden die Spaltung der Peptidsequenz
    Figure 00270002
    im menschlichen Reninmolekül zwischen den Resten 85 und 86 katalysieren. Die Spaltung verursacht das Aufbrechen der katalytischen Maschinerie des Enzyms, da die Reste 85 und 86 den „Flap"-Bereich aufbauen, der das Substrat in der katalytischen Stelle hält (13). Es ist zuvor belegt worden, dass ein polyklonales Antiserum aus Kaninchen, gezogen gegen ein synthetisches Peptidfragment (Sequenz 81–90), die menschliche Reninaktivität zu 40% inhibieren konnte, gemessen über dessen Reaktion mit einem synthetischen humanen Tetradekapeptid als Substrat (14).
  • Um einen katalytischen Antikörper gegen diesen „Flap"-Bereich des menschlichen Renins zu ziehen, wird das zyklische Peptid
    Figure 00280001
    als Hapten synthetisiert, worin (TS) das Übergangszustandsanalogon (transition state analogon) darstellt. In diesem Beispiel folgt die Synthese des zyklischen Peptidhaptens
    Figure 00280002
    dem Festphasenansatz (15), worin ST(TS)G einem Tripeptid als Übergangszustandsanalogon gemäß der Erfindung entspricht und in das zusammengesetzte Peptid über sein Anhydrid inkorporiert wird (15). Das vollständige Peptid wird vollständig entschützt und von dem festen Träger unter Anwendung von Trifluoressigsäure abgespalten.
  • Die Zyklisierung des Peptids wird erzielt, indem man das Peptid bei niedriger Konzentration für eine Stunde in einer wässrigen Lösung (pH 8) stehen lässt, um eine Disulfidbrücke zwischen den zwei terminalen Cysteinresten zu erzeugen. Die N-terminale Aminogruppe des Peptids gestattet seine Anheftung an ein Trägerprotein für die Immunisierung von Mäusen.
  • A Herstellung des Immunogens
  • 1. Peptidsynthese
  • Das Peptidhapten wird mittels Festphasentechnik unter Anwendung des Polyamid/Kieselguhr-Verbundharzes (14) synthetisiert. Die Seitenkettenschutzgruppen sind die folgenden: O-tert-Butyl (Tyrosin, Glutaminsäure, Serin, Threonin); N-4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulphonyl (Arginin); und S-Trityl (Cystein). Der temporäre Schutz der N-Funktion erfolgt über Fluorenylmethoxycarbonyl, das in 10 Minuten mit Piperidin/DMF : 20/80 entfernt wird. Die Kupplungsreaktionen werden unter Anwendung der FMOC-Aminosäureanhydride (14) durchgeführt. Das geschützte Peptidyl-Harz wird vollständig durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Thioanisol/m-Cresol/Thiophenol/Ethandithiol als Lösung 90/2/2/2/4 für drei Stunden entschützt. Nach Filtration wird das Filtrat unter Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Ether wird zugesetzt, um ein Präzipitat des Peptids zu erhalten. Der Etherüberstand wird entfernt und das peptidische Präzipitat zweimal mit Ether gewaschen, um das Peptidhapten zu erhalten:
    Figure 00290001
    worin die in Klammern angegebene Einheit ein Difluoroketon-Übergangsanalogon als Tripeptidisosteres ist.
  • 2. Zyklisierung des Peptidhaptens
  • Das Peptidhapten wird zyklisiert, um die „β-Haarnadel"-Konformation zu erhalten, indem eine Disulfidbindung zwischen den zwei terminalen Cysteinresten gebildet wird. Die Disulfidbindung wird in einer Stunde durch Luftoxidation einer wässrigen Lösung (pH 8) bei einer Konzentration von 0,3 mg Peptid pro ml vervollständigt. Das oxidierte Produkt wird anschließend mittels Lyophilisation entfernt und mittels HPLC gereinigt.
  • 3. Konjugation des Haptens an Trägermolekül
  • Das zyklische Peptidhapten
    Figure 00290002
    wird an Nacktschneckenhämocyanin (keyhole limpet hemocyanin: KLH) unter Anwendung von Glutaraldehyd konjugiert. Die Kupplungseffizienz beträgt 50–80%, abgeschätzt über die Bindung einer Spurenmenge an I125-Peptid, das dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird.
  • B. Herstellung und Sichten/Screenen monoklonaler Antikörper
  • KLH-konjugiertes Peptid (50 μg) in vollständigem Freunds Adjuvans wird in BALB/c-Mäuse injiziert. Hybridomfusionen erfolgen mittels Standardmethoden unter Anwendung von SP2/0-Myelomen als Fusionspartner. Polyklonale Antiserumantworten und Hybridome als sekretierende Zellen, resultierend aus der Fusion, werden auf die Bindungsaktivität mittels ELISA gesichtet.
  • Vertiefungen von Kunststoffmikrotiterplatten (Falcon 3915 Probind, Becton Dickinson Labware, CA, USA) werden mit 50 μl Peptid (5 μg/ml) in Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 9,6) beschichtet.
  • Die Platten werden zunächst für 30 Minuten bei 37°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Tween-enthaltendem Phosphat-gepuffertem Kochsalz (PBS-Tween 0,1%, pH 7,4), werden 50 μl serieller Verdünnungen der Antiseren in PBS-BSA 1%, pH 7,4, in die peptidbeschichteten Vertiefungen zweifach zugesetzt und für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten werden dreimal wiederum mit PBS-Tween 0,1% gewaschen und die Vertiefungen anschließend mit 50 μl eines mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Maus-IgG der Ziege behandelt, verdünnt 1 : 500 (Sigma, MO, USA). Die Inkubation erfolgt für eine Stunde bei 37°C.
  • Zusätzlichem extensiven Waschen mit PBS-Tween 0,1% folgt die Inkubation mit 150 ml des Substrats der alkalischen Phosphatase (2 Tabletten/10 ml Sigma 104–105), gelöst in 0,1 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,4), enthaltend MgCl2 und ZnCl2, 1 mM. Die enzymatische Reaktion lässt man für zwei Stunden bei 37°C ablaufen und stoppt durch Zusatz von 50 μl Na2CO3 (1,5 M).
  • Die Absorption wird bei 405 nm in einem Titerteck Multiskan ELISA-Ablesegerät (Flow laboratories) abgelesen. Die Titerexpression wird durch Multiplizieren der optischen Dichte mit der maximalen Verdünnung bestimmt, die eine dreimal so hohe Absorption wie die negative Kontrolle ergibt (bestehend aus vereinigten normalen Mausseren, verdünnt 1 : 100).
  • Eine positive Reaktion in diesem Sichtungstest ergebende Hybridome werden für die weitere Untersuchung gewählt. Das IgG wird aus dem Ascitesfluid mittels HPLC mit einer Bakerbond Abx-HPLC-Säule gereinigt.
  • C. Katalyse der Peptidspaltung durch katalytische Antikörper spezifisch für den „Flap"-Bereich des humanen Renins
  • Das Decapeptidsubstrat
    Figure 00310001
    (2,7 μM)wird mit den katalitischen Antikörpern inkubiert, die über das oben beschriebene Verfahren eryeugt wurden, und die Reaktion durch Umkehrphasen-HPLC-Analzse der Mischung überwacht. Die Reaktion erfolgt bei pH-Werten, die für eine hohe Kcat des katalztischen Antikörpers optimal sind (der potimale pH wird bestimmt unter Ausnutyung des chromogenen p-Nitroanilid-Substrats
    Figure 00310002
    oder des fluoreszenten Cumarin-Substrats
    Figure 00310003
    und unter Berücksichtigung der Bindungsenergie des katalytischen Antikörpers für die Reste auf der C-terminalen Seite der Spaltstelle bei pH-Änderungen).
  • Die Antikörper, die die besten Kcat-Werte für die Spaltung des Dekapeptidsubstrats zeigen, werden auf ihre Fähigkeit hin getestet, humanes Renin zu inhibieren.
  • D. Bindung der gegen das Übergangszustandsanalogon gerichteten Antikörper an menschliches Renin und Inhibition von dessen enzymatischer Aktivität durch Spaltung der Reste 85–86 im „Flap"-Bereich
  • Die Inhibition des Plasma-Reninaktivität – die Fähigkeit der katalytischen Antikörper, die Reninaktivität zu inhibieren – wird an einem Pool von menschlichem Plasma mit hoher Reninaktivität (40 ng Angiotensin I/h/ml) getestet. Plasma (25 μl) wird mit 100 μl des katalytischen Antikörpers in PBS (pH 7,5), enthaltend 1% EDTA, (Endvolumen 0,2 ml) für verschiedene Zeitspannen vorinkubiert. Als nächstes wird ein Überschuss des Plasmarenin-Substrats (200 pM) zugesetzt, um ein Verhalten nullter Ordnung sicherzustellen, und wird die Mischung für 30 Minuten bei 37°C in PBS (pH 5,7) inkubiert. Die Endverdünnung des katalytischen Antikörpers beträgt 1 : 5 und 1 : 50. Das erzeugte Angiotensin I wird mittels Radioimmuntest (17) gemessen. Eine Kontrolle wird unter Anwendung derselben Verdünnungen der entsprechenden Abzyme eingeschlossen. Die Menge des erzeugten Angiotensins I ist kleiner als diejenige, die mit intaktem Renin beobachtet wird, was die Spaltung der Reste 85–86 im „Flap"-Bereich und die Inhibition anzeigt.
  • Beispiel 2
  • In vivo-Präparation von immogenen Übergangszustandsanaloga, enthaltend Peptid des HIV gp120-Hüllproteins
  • Die Oktapeptidsequenz Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr- des HIV-gp120-Hüllproteins ist für die Viruswechselwirkung mit dem OKT4-Antigen auf T4-Helfer/Inducer Zellen wichtig. Synthetische Peptide, die diesem Oktapeptid in der Sequenz identisch oder sehr ähnlich sind, inhibieren die Haftung des HIV an den Antigenrezeptor (18) stark. Computergestützte Suchen haben die Homologie zu einem Peptid belegt, das sich im Hüllbereich des Epstein-Barr-Virus findet. Zusätzlich bestehen starke Homologien zwischen dem HIV-Oktapeptid und Peptiden, die im menschlichen Lymphoadenopathievirus (LAV) und in isolaten menschlicher T-Zell-Leukämievieren (HTLV-IIIb) auftreten. Eine zusätzliche Homologie besteht zwischen dem HIV-Peptid und einer Sequenz, umfassend die Reste 19-26 der pankreatischen Ribonuklease A (RNase A) des Rinds. Diese Sequenz enthält die exponierte Subtilisin-Spaltstelle der RNase A zwischen den Resten 20 und 21 und 21 und 22.
  • Peptidhaptene gemäß der Erfindung sind:
    • (1) -Ala-[Ser-A-Thr]-Thr-Thr-Asn-Tyr-Cys
    • (2) -Ala-Ser-[Thr-A-Thr]-Thr-Asn-Tyr-Cys
    • (3) -Ala-Ser-Thr-[Thr-A-Thr]-Asn-Tyr-Cys
    • (4) -Ala-Ser-Thr-Thr-[Thr-A-Asn]-Tyr-Cys
  • Die Übergangszustands-Dipeptidisostere (angezeigt in Klammern), worin A ein Analogon der zu spaltenden Amidbindung darstellt, werden in die Peptide wie in Beispiel 1 beschrieben eingebaut. Jedes Peptidhapten wird mit Nacktschneckenhämocyanin (KLH) als Trägerprotein über den terminalen Cysteinrest gekoppelt, unter Anwendung des m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidesters als Quervernetzer (20).
  • B. Herstellung monoklonaler Antikörper
  • BALB/C-Mäuse werden mit den Konjugaten aus KLH-Peptidanalogon, emulgiert in vollständigem Freunds Adjuvans, immunisiert. Eine Blutprobe wird von jeder Maus erhalten, und das Serum mittels Zentrifugation abgetrennt und bei 4°C gelagert. Auf diesem Wege erhaltene Seren werden auf die Bindungsaktivität gegen das ursprüngliche Übergangszustandsanalogon als Immunogen mittels Standard-ELISA-Verfahren gesichtet. Antikörpererzeugende Mäuse, wie zuvor beschrieben immunisiert und auf Reaktivität mit dem Übergangszustandanalogon als Peptidimmunogen getestet, werden getötet und ihre Milzen entfernt und Hybridomzellen unter Anwendung von SP2/0-Myelomzellen hergestellt, wie in Beispiel 1B oben beschrieben.
  • C. Screenen von katalytische monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomzellen
  • Das Sichten auf die Bindung von Antikörpern an das jeweilige Übergangszustandsanalogon enthaltende Peptide wird im Wesentlichen wie in Beispiel 1 oben beschrieben durchgeführt. Hybridome, die monoklonale Antikörper sekretieren und eine positive Bindungsreaktion zeigen, werden für weitere Untersuchungen gewählt. Das IgG wird aus Ascitesfluid mittels HPLC mit Bakerbond ABxHPLC gereinigt.
  • Beispiel 3
  • In vitro Auslösen von katalytischen monoklonalen Antikörpern gegen ein virales Epitop das den humanen Immunschwächevirus (HIV) selektiv inhibiert
  • A. Herstellung des Immunogens
  • Das Dipeptid-Übergangszustands-Isostere
    Figure 00340001
    worin A ein Analogon der zu spaltenden Amidbindung darstellt, wird in ein Peptid wie in Beispiel 1 beschrieben inkorporiert, um das Hapten zu ergeben:
    Figure 00340002
  • Das resultierende Hapten ist designed, so daß es einen Teil des HIV gp120-Hüllproteins nachahmt. Das synthetische Peptid wird in einem in vitro-Immunisierungsverfahren unter Anwendung einer Modifikation eines Literaturverfahrens genutzt (21). Milzzellen werden bei 106 Zellen/ml in einem Medium kultiviert, enthaltend 50% frisches Eagles MEM mit 20% fötalem Rinderserum, 5 × 10–5 M β-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin und 50% konditioniertes Medium aus BALB/C-Maus-Thymocyten. Um das konditionierte Medium herzustellen, werden Thymocyten mit 3–5 × 106 Zellen/ml im selben Eagles MEM-Medium wie oben kultiviert. Nach 48–72 Stunden wird das Medium entfernt, mittels Filtration sterilisiert und sofort für die in vitro-Aktivierung genutzt. Das Antigen wird dem Milzzell- Kulturmedium bei Konzentrationen zugesetzt, äquivalent in etwa 1 μg Peptid/ml. Die Milzzellen werden in Anwesenheit des Antigens 4 Tage lang ohne eine Änderung des Mediums kultiviert und später hybridisiert.
  • Die Hybridisierungen erfolgen mit der Maus-Plasmacytom-Zelllinie 45 6TGL.7 (22), bezogen von dem Cell Distribution Center des Salk Insitutes. Milzzellen (entweder frisch isoliert oder aus in vitro-Aktivierungskulturen) und Plasmacytomzellen werden zweimal in serinfreiem Eagles MEM gewaschen, anschließend unter Anwendung von PEG 1000 fusioniert, wie zuvor in der Literatur beschrieben. Hybride werden durch Behandlung der Kulturen mit HAT selektiert. Hybridzellen, die Antikörper produzieren, die mit dem Peptid als Übergangszustandsanalogon reagieren (beurteilt über einen ELISA-Test), werden kloniert und durch Grenzverdünnung in konditioniertem Medium aus den Eltern-Plasmacytomzellen rekloniert.
  • Das Screenen auf die Bindung von Antikörpern an die das jeweilige Übergangszustandsanalogon enthaltenden Peptide erfolgt im Wesentlichen wie in Beispiel 6 oben beschrieben. Monoklonale Antikörper sekretierende Hybridome, die eine positive Bindungsreaktion ergaben, werden für weitere Untersuchungen gewählt. Das IgG wird aus dem Ascitesfluid mittels HPLC mit Bakerbond AbxHPLC gereinigt. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Antikörper gegen das Peptid, das das Übergangszustandsanalogon nicht enthält, getestet werden können.
  • Der Virusreplikationstest erfolgt im Wesentlichen wie in der Literatur beschrieben (25), ausgenommen, daß die Kulturen in 200 μl enthaltenden Mikroröhrchenvertiefungen propagiert werden. Gestufte Konzentrationen an gereinigten Antikörpern, erhalten aus der in vitro-Immunisierungsprozedur oder nur Puffer, jeweils 25 μl, werden für eine Stunde bei 37°C in 5% CO2 mit 50 TCID50 HTLV-IIIB in 25 μl vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden H9-Zellen (1 × 105 Zellen in 150 μl RPM1-040, supplementiert mit 20% wärmeinaktiviertem FCS) den Vertiefungen zugesetzt, was Antikörperendkonzentrationen im Bereich von 0,1 μg/ml bis 10 μg/ml ergab. Mikrotiterplatten werden bei 37°C in 5% CO2 für 14 Tage inkubiert. Die Zellen werden durch Austauschen von 100 μl zeltfreiem Überstandsfluid an den Tagen 3, 7 und 10 durch frisches Medium gefüttert, und kein weiterer Antikörper wird während dieser Zeitspanne zugesetzt. Zellfreies Überstandsfluid (100 μl) wird auf das p24-Antigen mittels RIA (Dupont, NEK-040) analysiert.
  • Der C8166-Fusionstest ist in der Literatur beschrieben. Drei monoklonale Antikörper (die Klone AHIV1.6; AHIV1.3 und AHIV2.0) werden in einem zweistündigen Test getestet. H9-Zellen (1 × 104), chronisch infiziert mit HTLV-IIIB, werden mit verschiedenen Konzentrationen an Antikörper in 150 μl Medium in einer Platte mit 96 Vertiefungen vorinkubiert. Alle Tests erfolgen dreifach. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C in 5% CO2 setzt man 3 × 104 C8166-Zellen (HTLV-1-transformierte Nabelschnur-Lymphozyten) in 50 μl zu den Vertiefungen zu. Die Vertiefungsendkonzentrationen an Antikörpern betragen 41 μg/ml und 5 μg/ml. Die Vorinkubation mit OKT4A (Ortho Diagnostics) mit 25 μg/ml diente als Kontrolle. Nach Inkubation der Platten für zwei Stunden bei 37°C in 5% CO2 werden Syncytien (aufgeblasene Cytoplasmen mit Durchmessern größer als 3 Lymphozytenzellen) gezählt. Um eine Beeinflussung während des Zählens zu verhindern, werden die Proben kodiert.
  • Die antivirale Aktivität der Klone AHIV1.3, AHIV1.6 und AHIV2.0 wird in HIV I-Replikations- und Zellfusionstests untersucht. 1 zeigt die dosisabhängige Inhibition der HIV I p24 gag-Produktion in infizierten H9-Zellen durch den Klon AHIV 1.3. 2 zeigt die dosisabhängige Inhibition der HIV-induzierten Zellfusion durch die Klone AHIV1.3, AHIV1.6 und AHIV2.0.
  • Die katalytischen monoklonalen Antikörper, die durch die in vitro-Immunisierung mit den Übergangszustands-Dipeptidisosteren als Analoga, inkorporiert in die exponierte Peptidsequenz des HIV gp120, ausgelöst wurden, können die Infektion durch HIV-Viren verhindern, in dem sie einen wichtigen Bereich des viralen Hüllproteins aufreißen, der in die Bindung an den CD4-Rezeptor auf Lymphozyten involviert ist. Der katalytische monoklonale Antikörper bricht die Peptidbindung in der gewählten Sequenz auf (d. h. zwischen den ersten zwei Threoninresten von links des in Beispiel 2 gezeigten Octapeptids), auf eine Weise, die der Wirkung proteolytischer Enzyme analog ist. Der Mechanismus dieser antikörperkatalysierten Hydrolyse des Octapeptids involviert kein Metallion und kann infolgedessen entweder ein Nukleophil in der aktiven Stelle des Antikörpers oder eine nukleophile Addition von Wasser, das durch die Aminosäurereste in der mit dem Antikörper kombinierenden Stelle aktiviert ist, involvieren.
  • Beispiel 4
  • Produktion von Abzym-Proteasen, zielgerichtet gegen den Tumornekrosefaktor
  • Bei dem Tumornekrosefaktor (TNF) handelt es sich um ein Cytokin, das von aktivierten Makrophagen sekretiert wird. Es wurde gezeigt, dass TNF eine Vielzahl biologischer Wirkungen vermittelt, eingeschlossen den Endotoxin induzierten Schock, die Suppression der Lipoproteinlipase-Aktivität (LPL-Aktivität) in Präadipocyten, die Stimulation der Kollagenaseaktivität und der Prostaglandin E2-Produktion durch Synovialzellen, die Stimulation der Interleukin 1-Produktion und die Induktion der Cachexie in Nacktmäusen. TNF-spezifische Zelloberflächenrezeptoren finden sich auf zahlreichen Zelltypen. Die Bindung von TNF an diese Rezeptoren wird für die Induktion der biologischen Effekte von TNF als erforderlich erachtet. Es ist gezeigt worden, dass Antikörper gegen die Aminosäuren 1–15 von hTNF dessen Bindung an Zelloberflächenrezeptoren blockieren (Socher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 8829–8833). Es ist ebenfalls bekannt, dass die acht N-terminalen Aminosäuren des hTNF nicht für die Rezeptorerkennung erforderlich sind. Somit kann der kritische Bereich für die Rezeptorbindung die Reste 9–15 involvieren. Die Formel unten zeigt die 25 N-terminalen Aminosäuren des TNF, die kritischen Reste 9–15 (*) und eine metastabile Stelle NP, Asn-Pro.
  • Figure 00370001
  • Die Synthese des Peptidanalogons, enthaltend das Dipeptidisostere des Übergangszustands, erfolgt im Wesentlichen wie zuvor in Beispiel 1 beschrieben. Die Immnunogenherstellung, Immunisierung und das Screening auf katalytische Antikörper erfolgt im Wesentlichen wie beschrieben, ausgenommen, dass ein Bioassay genutzt wird, um die TNF-Abzym-Proteolyse und Inaktivierung zu bestimmen.
  • Tumornekrosefaktor-Zelllyse-Test
  • L-929-Fibroblastenzellen der Maus (30.000 pro Vertiefung) werden in Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen in Anwesenheit von 1 μg/ml Actinomycin D kultiviert. Serielle Verdünnungen von TNF vor und nach der Behandlung mit dem katalytischen Antikörper werden zu den Vertiefungen zugesetzt und für 18 Stunden inkubiert. Das Kulturmedium wird anschließend entfernt und die Zellen mit einer 0,5%igen Kristallviolett-Lösung in 25% Methanol gefärbt. Die Absorption bei 540 nm wird auf einem Biotek ELISA-Mikrotiterplatten-Ablesegerät gemessen. Von den Zellen nur mit Medium wird angenommen, dass sie 0% Lyse aufweisen, und die mit 3 M Guanidin-HCL behandelten Zellen werden als vollständig lysiert betrachtet. Eine Einheit an TNF wird als diejenige Menge definiert, die erforderlich ist, um eine 50%ige Zelllyse zu ergeben.
  • Beispiel 5
  • Erzeugung von Abzymprozessen die auf HIV-Polypeptide zielgerichtet sind
  • Das Hauptereignis bei der Infektion von Zellen mit HIV ist die Wechselwirkung zwischen dem Glykoprotein gp120 der viralen Hülle und seinem zellulären Rezeptor CD4. Monoklonale Antikörper sind erzeugt worden, die die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 blockieren. Es wurde gezeigt, dass das gp120-Epitop in den Aminosäuren 397–439 enthalten ist. Die Deletion von 12 Aminosäuren aus diesem Bereich durch in vitro-Mutagenese führt zum vollständigen Verlust der Bindung, und eine einzelne Aminosäuresubstitution in diesem Bereich führt zu einer signifikant verringerten Bindung. Das Eptiop 329–439 hat die Sequenz:
    Figure 00380001
  • Die Sequenz zeigt außerdem ein tryptisches Peptid aus den Resten 406 bis 414 (*), das das Mab-Bindungsepitop weiter abgrenzt. Die Deletionsmutante der Reste 410–421 ist ebenfalls gezeigt (|–|), zusammen mit den zwei Cysteinresten, die den Deletionsbereich flankieren (C), von denen vorgeschlagen wurde, dass sie eine Disulfidbindung bilden, und Alanin 417, das dann, wenn es zu Asparaginsäure mittels Punktmutation geändert wird, zu einer verringerten CD4-Bindungsfähigkeit führt. Die von Lask et al. (Cell, 1987, 50, 975-985) präsentierten Daten implizieren, dass dieser Polypeptidbereich eine kritische Kontaktstelle für die Rezeptorbindung ist, und sie wurde konsequenterweise als mögliches Kandidatenpeptid für die Herstellung eines Immunogens gewählt, um katalytische Antikörper auszulösen, die die Proteolyse dieses Bereichs in der intakten HIV gp120-Hülle auslösen. Die Einführung eines Dipeptidisosteren in die gewählte Sequenz, die Konjugation an Trägerprotein, Immunisierung und das Screening auf katalytische Antikörper erfolgt im Wesentlichen wie in den Beispielen 1–4 oben beschrieben. Der Test auf katalytische Antikörper als Proteasen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit der Infektion von Zielzellen in vitro zu interferieren, erfolgt über das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren.
  • Beispiel 6
  • Entgiftung von LPS während des endotoxischen Schocks Gram-negative Bakterieninfektionen
  • Hintergrund
  • Trotz des Aufkommens von Antibiotika entwickeln ungefähr 200.000 Patienten nosokomiale Bakteriämien, die zu etwa 80.000 Todesfällen führen (Maki, 1981). Die Gramnegative Septikämie weist eine Sterblichkeit von 30% auf, und dann, wenn der Schock involviert ist, von 70% (Kreger et al., 1980). Viele der Symptome und Wirkungen wie auch die Resistenz gegen die Antibiotikatherapie sind mit der Voraussetzung konsistent, daß ein Endotoxin oder Lipopolysaccharid (LPS) das ursächliche Mittel des Bakterien induzierten Schocks darstellt. Einige der biologischen Wirkungen des LPS schließen den Bluthochdruck, Fieber, die intravaskuläre Blutgerinnung und den Tod ein. LPS stimuliert in verschiedenen Zelltypen die Freisetzung von Mediatoren, Hormonen oder anderen Faktoren (insbesondere des Tumornekrosefaktors), die wiederum andere Organe oder Ziele anregen und beeinflussen. Die therapeutische Intervention umfasst üblicherweise Antibiotika, diese Behandlungen sind jedoch häufig nicht erfolgreich im Stoppen der LPS-Kaskadenwirkungen. Neue Therapien werden entwickelt, um die Bakterien und das LPS zu neutralisieren, bevor sie andere Ziele beeinflussen.
  • Bakterielle Produkte
  • Gram-negative Bakterien weisen eine charakteristische Membran auf, die aus Lipoprotein, Lipopolysaccharid, Mucokomplex und cytoplasmatischen Membranschichten besteht. Einige der äußeren Oberflächenstrukturen und Proteine stellen Hilfsmittel dar, über die die Organismen in Serogruppen oder Serotypen klassifiziert werden. Beispielsweise wird die Kapsel genutzt, um die Meningococcen in die Gruppen A, B, C usw. zu serogruppieren. Eine andere Strukturkomponente, die antigenisch ist und für die Serotypisierung (O-Antigen) genutzt wird, ist das LPS. Polysaccharideinheiten umfassen den äußeren Kern und sind für die beobachtete antigenische Variation verantwortlich. Das LPS weist auch einen inneren Kern von 1-Glycero-D-mannoheptose- und KDO (2-Keto-3-desoxymannooctulosonsäure)-Einheiten auf, die allen Gram-negativen Bakterien gemeinsam sind (ausgenommen wenige mutierte Stämme). Innerhalb der bakteriellen Membran befindet sich der Lipid A-Kern (I), der konserviert ist und aus Glucosamindisaccharid, Fettsäureketten und Phosphateinheiten besteht. Es ist dieser Lipid A-Kern, der strukturell wie auch bei der Erzeugung der zuvor beschriebenen bestimmten Symptome wesentlich ist.
  • Das Lipid X, ein Monosaccharidvorläufer des Lipids A (II), ist in Dosen über 3 mg für Mäuse und 1 mg/kg bei Schafen nicht toxisch und schützt Mäuse vor einer lethalen Dosis an Endotoxin (Munford und Hall, 1986). Dieses Beispiel skizziert ein Verfahren, in dem die Acyloxyacylhydrolyse von einem katalytischen Antikörper katalysiert werden wird.
  • Synthese des Antigens
  • Das Schema 1 skizziert mögliche synthetische Reaktionen, die zum Synthetisieren des Antigens (III) erforderlich sind, die teilweise den von Kusumoto et al. (1984) verwendeten Verfahren folgen.
  • Hybridom-Produktion und Screening
  • Das Lipid X-Analogon (III) wird in Liposomen verschiedener Größe und Lipidzusammensetzung eingebaut oder auf Schaferythrozyten aufgeschichtet für die optimale Antigenprä sentation, bevor es in BALB/C-Mäuse gemäß dem von Brade et al. (1987) beschriebenen Verfahren injiziert wird.
  • Hybridome, die Antikörper gegen das Übergangszustandsanalogon der Acyloxyacylhydrolase (III) erzeugen, werden über Standardmethoden hergestellt. Die Hybridomüberstandsfluide werden auf Antikörper getestet, die an das Lipid X-Analogon binden und zwar mittels ELISA und/oder der passiven Hämolyseinhibition. Die katalytische Aktivität wird über die später zu beschreibenden Methoden getestet.
  • Test auf Esteraseaktivität
  • Biosynthetisch markiertes LPS wird durch Kultivieren von S. typhimurium PR122 (gal Em nag-) mit [3H]-Acetat und N-Acetyl-1-[14C]-glucosamin (New England Nuclear Corp., Boston, Mass.) hergestellt. Um das LPS niedrigen Molekulargewichts (rauhes LPS [R-LPS]) zu erzeugen, wird S. typhimurium in Abwesenheit von D-Galaktose kultiviert. Diese Zellen werden in Aliquots geteilt, von denen eines als eine Suspension in 50% Glycerin bei –70°C gelagert wird, und werden unter Anwendung von Phenol/Chloroform/PET-Ether (2 : 5 : 8 Vol/Vol) extrahiert. Für die Erzeugung von LPS mit hohem Molekulargewicht (glattem LPS (S-LPS)) werden die S. typhimurium wie oben beschrieben unter Zusatz von D-Galaktose kultiviert. Diese Zellen werden in zwei Aliquots geteilt. Eines wird als ganze Zellen in 50% Glycerin bei –70°C gelagert. Das S-LPS wird aus dem zweiten unter Anwendung von 45% (Gewicht/Volumen) Phenol extrahiert, gefolgt von Dialyse gegen Wasser. Die zwei Präparationen des LPS werden weiter mittels Extraktion mit Diethylether gereinigt und anschließend in Wasser und Triethylamin (1 μg/ml) suspendiert, aufgeteilt und bei –70°C gelagert.
  • Biologische Aktivitäten des Abzym-behandelten LPS: in vivo-Tests; Pyrogentest
  • Behandeltes und Kontroll-LPS werden auf die Pyrogenizität in Kaninchen getestet. Mindestens drei Kaninchen (1,7 bis 2,3 kg) wird die LPS-Zubereitung injiziert und ihre Tempe raturveränderungen aufgezeichnet. Anfänglich testet man 5 μg des Kontroll-LPS und 50, 100 und 200 μg des behandelten LPS.
  • Lethalitätstest
  • C57BL/6-Mäusen werden 16 mg D-Galactosamin (I.P.) injiziert, um die Empfindlichkeit gegenüber LPS zu induzieren. Das behandelte und unbehandelte LPS wird injiziert (I.V.) und der LD50-Wert ermittelt. Konzentrationen zwischen 2 ng und 20 μg werden getestet.
  • In vitro-Tests: Macrophagenverteilung
  • Macrophagen werden in Anwesenheit und in Abwesenheit von behandeltem und Kontroll-LPS kultiviert. Der Prozentsatz der Macrophagenverbreitung (entsprechend (Anzahl Verteilung/Anzahl gesamt angehefteter Zellen) × 100) wird berechnet. Macrophagen werden als sich verteilend definiert, wenn ihre Membran die doppelte Fläche derjenigen sich nicht verteilenden Zellen bedeckt.
  • Splenocytenstimulation
  • Die Stimulation muriner Splenocyten wird mittels Thymidinaufnahme beobachtet. Splenocyten von BALB/c nu/nu-, C3H/HeN- und C3H/HeJ-Mäusen werden mit [3H]-Thymidin und behandeltem wie auch Kontroll-LPS in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Eine Kontrollkultur ohne LPS wird ebenfalls hergestellt. Der stimulierende Effekt wird als Verhältnis der cpm (Zählrate) der Testkultur zur Kontrollkultur ausgedrückt.
  • Figure 00430001
  • Schema 1
    Figure 00440001
  • Schema 1 (fortgesetzt)
    Figure 00450001
  • Schema 1 (fortgesetzt)
    Figure 00460001
  • Reagenzien:
    • (a) Benzylchlorformiat/NaOH; (b) Allylalkohol/HCl; (c) Aceton/TsOH/CaSO4;
    • (d) NaH/SnBr; (e) [Ir(COD)(PMePh2)2]PF6; (f) I2/H2O/THF; (g) n-BuLi/–70°;
    • (h) (PhO)2P(O)Cl; (i) H2/Pd/C; (j)DCCI/DMAP/Verbindung A; (k) PhSH/Et3N;
    • (l) H2/Pd/C/PtO2/AcOH; (m) HCl/THF; (n) P(OMe)3; (o) NaOH; (p) SOCl2; (q) (R)-3-Hydroxytetradecansäure; (r) H2/Pd/C
  • Beispiel 7
  • Methodik der Herstellung, des Sichtens und der Isolierung von monoklonalen Antikörpern die humanes IgG spalten und allergische Reaktionen verhindern
  • Hintergrund
  • Die Rolle des IgE bei der Initiation allergischer Antworten ist Gegenstand intensiver Untersuchungen für mehr als 60 Jahre gewesen. Diese Untersuchungen hat zu einem detaillierten Verständnis des Weges der allergischen Reaktion geführt. Das Primärereignis bei der Initiation der allergischen Reaktion ist die Bindung des Allergens (Antigens) an IgE. Dieses führt zur Vernetzung des IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und basophilen Zellen, wobei das IgE über seinen Fc-Bereich an Fc-Rezeptoren gebunden ist, die auf den Zielzellen vorhanden sind. Die Folge dieser Quervernetzung ist die Auslösung der Freisetzung von Histamin, SRS-A und anderen vasoaktiven Aminen, die letztlich zu den schädlichen Effekten einer allergischen Antwort über ihre Wirkungen auf andere Gewebe im Körper führen.
  • Das IgE-Molekül lässt sich funktional in zwei Teile teilen, die über ihre Bindungsaktivitäten definiert sind. Dieses lässt sich belegen, wenn das Molekül der Papain-Proteolyse unterworfen wird, die zwei Fragmente erzeugt. Die Folgen dieser Proteolyse bestehen in der Inaktivierung des IgE bezüglich seiner Fähigkeit, allergische Reaktionen auszulösen. Tatsächlich wird es zu einem Inhibitor über die Blockade der Fc-Rezeptoren mit Fc-Fragmenten.
  • Um einen antiallergenen monoklonalen Antikörper zu erzeugen, werden katalytische Antikörper hergestellt, die spezifisch IgE spalten und dieses inaktivieren können, ohne andere schädliche Wirkungen. Um dies zu erzielen, werden monoklonale Antikörper mit einem zyklischen Dipeptidanalogon (1) ausgelöst, das in der interessierenden Sequenz ent halten ist. Die so ausgelösten katalytischen monoklonalen Antikörper werden die Spaltung der nativen IgE-Peptidsequenz an der gezeigten Position verursachen:
    Figure 00480001
  • Diese Sequenz befindet sich zwischen den CH2- und CH3-Domänen des IgE, deren Spaltung die Aktivität des IgE-Moleküls ausbrechen und die Erzeugung einer allergischen Antwort inhibieren wird.
  • Um katalytische Antikörper gegen diesen Bereich zu erzeugen, wird das Peptidhapten ADS(X)RGV, worin (X) das unten gezeigte zyklische Dipeptidanalogon repräsentiert, über Standardfestphasen- oder Lösungsphasenmethoden synthetisiert. Das vollständige Peptid wird völlig entschützt, und, falls die feste Phase verwendet wird, vom festen Träger abgespalten, und zwar unter Anwendung von Trifluoressigsäure. Die N-terminale Aminogruppe des Peptid gestattet dessen Anheftung an ein Trägerprotein für die Immunisierung von Mäusen.
  • A. Herstellung des Immunogens
  • 1. Peptidsynthese
  • Das Peptidhapten wird über die Festphasentechnik unter Anwendung des Polyamid-Kieselguhr-Verbundharzes synthetisiert. Die Seitenkettenschutzgruppen sind die folgenden: O-tert-Butyl (Tyrosin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin, Threonin); N-4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulphonyl (Arginin). Der temporäre Schutz der N-Funktion erfolgt über Fluorenylmethoxycarbonyl, das in 10 Minuten mit Piperidin/DMF: 20/80 entfernt wird. Die Kupplungsreaktionen erfolgen unter Anwendung der FMOC-Aminosäureanhydride. Das geschützte Peptidylharz wird vollständig durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Thioanisol/m-Cresol/Thiophenol/Ethandithiol als Lösung: 90/2/2/2/4 für 3 Stunden entschützt. Nach Filtration wird das Filtrat unter Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Ether wird zugesetzt, um ein Präzipitat des Peptids zu er halten. Der etherische Überstand wird entfernt, und das peptidische Präzipitat zweimal mit Ether gewaschen, um das Peptidhapten
    Figure 00490001
    zu erhalten, worin die in Klammern angegebene Einheit das unten gezeigte zyklische Dipeptidanalogon darstellt.
  • 2. Konjugation des Haptens an das Trägermolekül
  • Das obige Peptidhapten wird an Nacktschneckenhämocyanin (KLH) unter Anwendung von Glutaraldehyd konjugiert. Die Kupplungseffizienz beträgt 50-80%, wie abgeschätzt über die Bindung einer Spurenmenge an mit Jod-125 markiertem Peptid, das dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird.
  • B. Herstellung und Screening monoklonaler Antikörper
  • Das an KLH konjugierte Peptid (50 μg) in vollständigem Freunds Adjuvans wird in BALB/c-Mäuse injiziert. Hybridomfusionen erfolgen über Standardmethoden unter Anwendung von SP2/0-Myelomen als Fusionspartner. Polyklonale Antiserumantworten und Hybridom-Sichtungszellen, die aus der Fusion resultieren, werden auf die Bindungsaktivität mittels ELISA gesichtet.
  • Vertiefungen von Kunststoffmikrotiterplatten (Falcon 3915 Probind, Becton Dickinson Labware CAS, USA) werden mit 50 μl Peptid (5 mg/ml) in Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 9,6) beschichtet.
  • Die Platten werden zunächst für 30 Minuten bei 37°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Tween-enthaltendem phosphatgepufferten Kochsalz (PBS-Tween 0,1%, pH 7,4), setzt man 50 μl serieller Verdünnungen von Antiseren in PBS-BSA 1%, pH 7,4, in doppelte Peptid-beschichtete Vertiefungen zu und inkubiert für 2 Stunden bei 37°C. Die Platten werden dreimal wiederum mit PBS-Tween 0,1% gewaschen, und die Vertiefungen werden anschließend mit 50 μl eines mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Maus-IgG aus Ziege, verdünnt 1 : 500 (Sigma, MO, USA), behandelt. Die Inkubation erfolgt für 1 Stunde bei 37°C.
  • Dem zusätzlichen extensiven Waschen mit PBS-Tween 0,1% folgt die Inkubation mit 150 μl des Substrats der alkalischen Phosphatase (2 Tabletten/10 ml Sigma 104–105), gelöst in 0,1 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,4), enthaltend MgCl2 und ZnCl2, 1 mM. Die enzymatische Reaktion lässt man für 2 Stunden bei 37°C ablaufen und stoppt durch Zusatz von 50 μl Na2CO3 (1,5 M).
  • Die Absorption wird auf einem Titertech Multiskan ELISA-Ablesegerät (Flow Laboratories) bei 405 nm abgelesen. Die Titerexpression wird durch Multiplizieren der optischen Dichte mit der maximalen Verdünnung, die eine dreimal so hohe Absorption wie die negative Kontrolle ergibt (bestehend aus vereinigtem normalen Mausserum, verdünnt 1 : 100), bestimmt.
  • Hybridome, die eine positive Reaktion in diesem Sichtungstest ergeben, werden für die weitere Untersuchung gewählt. Das IgG wird aus dem Ascitesfluid mittels HPLC mit einer Bakerbond ABx-HPLC-Säule gereinigt.
  • C. Katalyse der Peptidspaltung durch katalytische Antikörper die für den CH2-CH3-Bereich des menschlichen IgE spezifisch sind
  • Das Peptidsubstrat ADSNPRGV (2,7 μM) wird mit den über das oben beschriebene Verfahren hergestellten, katalytischen Antikörpern inkubiert und die Reaktion mittels Umkehrphasen HPLC-Analyse der Mischung überwacht. Antikörper, die eine katalytische Peptidaseaktivität gegen das Peptidsubstrat zeigen, werden auf ihre Fähigkeit, IgE zu spalten, behandelt.
  • Test auf IgE-Inaktivierung
  • Gereinigtes IgE gegen NP wird der Andauung mit dem gereinigten katalytischen Antikörper unterworfen, und zwar unter Anwendung von 1 μg IgE mit 1 μg des katalytischen An tikörpers. Die Inkubation erfolgt in PBS (pH &. 5) für verschiedene Zeitspannen (Stunden bis Tage) bei 37°C. Um auf die Unspezifizität in dieser Reaktion zu kontrollieren, werden nicht katalytische monoklonale Antikörper in parallelen Reaktionen eingeschlossen.
  • Um die Spaltung zu bewerten, wird der Verlust der Basophil-Bindung untersucht. Proben (1–5 ng) an IgE anti-NP aus der obigen Verdauungsreaktion werden mit einem Bereich an basophilen Zellen (6 × 105·107 Zellen/ml) in 200 μl RPMI 1640, 10% fötalem Kälberserum und 10 mM EDTA für 15 bei 37°C inkubiert. Diese Zellen werden anschließend dreimal im selben Puffer gewaschen, gefolgt von Zusatz von 35S-BSA-NIP (0,1 μCi) und weiterem Inkubieren für 15' bei 37°C. Die Zellen werden gewaschen und auf Radioaktivität gezählt. Die Verringerung oder der Verlust der 35S-Bindung an die Zellen, bezogen auf die IgE-Kontrollinkubationen, belegt, dass eine Spaltung des IgE aufgetreten ist.
  • Zyklisches Peptidanalogon
    Figure 00510001
  • BEISPIEL 8
  • Aktivierung eines Prodrug unter Verwendung eines katalytischen Antikörpers als Glycosidase Technischer Hintergrund
  • Antimetaboliten sind Verbindungen, die entweder mit der der Biosynthese, der Verwendung oder der metabolischen Funktion normaler zellulärer Metabolite interferieren. Um ausreichend selektiv bei der Chemotherapie von Tumoren zu sein, sollte ein Antimetabolit eine oder mehrere lebenswichtige metabolische Reaktionen des Tumors beeinträchtigen, ohne normales Gewebe ernsthaft in Gefahr zu bringen.
  • Einige der erfolgreichsten Antikrebsmitte sind Mittel auf Basis von Purin- oder Pyrimidinanaloga, deren Wirkung auf ihrer Fähigkeit, die DNA- oder RNA-Synthese zu inhibieren, beruht. Bei einem dieser Mittel handelt es sich um Arabinosylcytosin (I) (Cytartbine, Ara C oder CA), dessen Wirkung als Inhibitor der DNA-Synthese auf der Anwesenheit von Arabinose anstelle der Ribose beruht, wobei der Unterschied in der Stereochemie der 2'-Hydroxygruppe liegt. Ara C wird in seiner freien 5'-Hydroxylform verabreicht und wird erst nach seinen Eindringen in die Zelle durch Phosphorylierung zur 5'-Triphosphatform aktiviert. Somit stellt es bereit ein Prodrug dar; nach seiner systemischen Verabreichung kann die Aktivierung jedoch in jeder beliebigen Zelle, Tumor- oder normalen Zelle, in die das Prodrug eindringt, erfolgen. In Folge der weiten systemischen Verbreitung des Wirkstoffes treten zahlreiche Nebenwirkungen wie Übelkeit, Erbrechen, Alopezie (Haarlosigkeit), Myelosupression usw. auf.
  • Es hat sich nun herausgestellt, daß Ara C zu einer Prodrugform modifiziert werden kann, bei der die spontane intrazelluläre Aktivierung veringert ist. Zunächst wird ein monklonaler, gegen den Tumor gerichteter Antikörper zielgerichtet auf dem Tumor angebracht, der einen katalytischen Antikörper mit sich führt, wobei beide entweder chemisch oder genetisch miteinander verbunden sind. Im zweiten Schritt wird die Vorläuferform des Ara C verabreicht; ihre Aktivierung bleibt dann auf jene Gewebe begrenzt, die die Abzymaktivität tragen. Daraus resultiert eine bessere Unterscheidung von Tumor- und normalen Gewebe. Da Ara C nur eine sehr kurze Plasma-Halblebenszeituer hat, folgt der Abdiffusion des Wirkstoffes vom Tumor dessen schnelle Desaktivierung, noch bevor signifikante systemische Toxizität eintritt.
  • Synthese des 5'-Galactosyl-Ara C sowie von dessen Übergangszustandsanalogon
  • Die Synthese des Amidingalactosyl-Analogous von Ara C (15) ist in den Schemata 2 und 3 unten dargestellt. Das tribenzoylierte Derivat (3) aus Schema 1 wird durch Behandlung mit Methansulfonylchlorid in Pyridin gefolgt von Austausch mit Lithiumazid in N,N-Dimethylformamid bei 75 °C in (9) umgewandelt. Die Hydrierung von (9) in Ethanol unter einem Wasserstoffdruck von 50 psi in Anwesenheit von 10% Palladium auf Holzkohle ergibt das 4'-Aminoderivat.
  • Das β-Galactonolactam (13) wird hergestellt, indem man zunächst 2,3,4,6-Tetra-D-benzyl-2-d-galactopyranose (11) mit Dimethylsulfoxid und Essigsäureanhydrid zum Erhalt des 2,3,4, 6-Tetra-O-benzyl-D-galactono-1,5-lactons (12) behandelt, welches anschließend 6 Stunden lang in Dioxan mit einer wässrigen Ammoniaklösung (25% (Gew./Gew.)) in Anwesenheit von Spuren von Amberlite 1R 120 H+ zum Erhalt von (13) kondensiert wird. Durch die Umwandlung von (13) in sein Imidoesteranalogon durch Behandlung mit Trimethyloxoniumtetrafluorborat, gefolgt von dessen Umsetzung, ergibt das 5'-Amidinderivat (10) das voll geschützte Amidingalactosylanalogon (14). Die Entschützung durch Hydrierung unter einem Wasserstoffdruck von 50 psi in Anwesenheit von 10% Palladium auf Holzkohle und anschließende Behandlung mit konzentriertem wässrigen Ammoniak ergibt (15).
  • Die Synthese des 5'-β-D-Galactose-Analogons des Cytosin-β-D-Arabinofuranosids (5) ist in Schema 1 abgebildet.
  • Die Behandlung von Ara C (1) mit Bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethylchlorid in Pyridin, anschließende Tribenzoylierung unter Verwendung von Benzoylchlorid und danach Detritylierung von (2) mit Trichloressigsäure in Dichlormethan ergibt das teilgeschützte Derivat (3). Die Behandlung von β-D-Galactosepentaacetat (5) mit verdünnter wässriger Säure und anschließende Behandlung mit Natriumhydrid und Trichloracetonitrtl im Überschuß ergibt das Trichloracetimidat (8). Die Kupplung von (8) mit (3) in Anwesenheit der Lewissäure Bortrifluoridetherat in Dichlormethan ergibt (4). Nach vollständigem Entschützen von (4) unter Verwendung von konzentriertem wässrigem Ammoniak erhält man das 5'-β-D-Galactose-Analogon von Ara C (5).
  • Herstellung von Antikörpern und deren Durchtesten auf die Bindung an Analoga des Übergangszustands
  • Nach der Konjugation an einen geeigneten Träger werden monoklonale Antikörper gegen (15) aus Schema 4 im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Antikörper produzierende Klone werden zunächst mit Hilfe von den in Beispiel 1 beschriebenen vergleichbaren Verfahren auf ihre Fähigkeit hin getestet, das Ara C-Analogon (15) zu binden.
  • In-vitro-Test auf katalytische Aktivität
  • Diejenigen Antikörperklone, die eine Bindungsaktivität gegenüber (15) aufweisen, werden auf ihre Fähigkeit hin durchgetestet, die Galactosyleinheit von Ara C als Substrat abzuspalten, und zwar mittels eines Verfahrens, das im wesentlichen dem von Koerner und Nieman beschriebenen (J. Chromatography 449 (1988), S. 216–228) entspricht, wobei jedoch die Glucoseoxidase durch Galactoseoxidase ersetzt wurde. Das Testprinzip besteht im Nachweise von Galactose unter Verwendung eines Galactoseoxidase/Luminol-Chemolumineszenzverfahrens, wenn diese durch den katalytischen Antikörper aus dem Prodrug freigesetzt wird.
  • In-vivo-Tests
  • Die Umwandlung von Galactosyl-Ara C zu Ara C durch den katalytischen Antikörper in Anwesenheit der Zielzellen führt zur Inhibition der DNA-Synthese und zum Abtöten der Zellen. Ein einfacher Test für die DNA-Synthese wird im wesentlichen wie von Gish et al. beschrieben (J. Med. Chem. 14 (1971), S. 1159–1162) durchgeführt, wobei unter Verwendung der Testmethode des Einbaus von tritiiertem Thymnidin die Fähigkeit von Ara C gemessen wird, die DNA-Synthese in durch Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten Humanlymphozyten zu inhibieren.
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
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Claims (16)

  1. Die Verwendung einer wirksamen Menge eines die Geschwindigkeit erhöhenden Antikörpers für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krankheiten, die behandelbar sind durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, wobei dieser Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Auswahl der zu spaltenden oder zu bildenden spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält und das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dadurch Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  2. Die Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krankheiten, die behandelbar sind durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, von einer wirksamen Menge eines Antigens, das fähig ist Antikörper in einem Tier hervorzurufen, die die Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung dieser Bindung erhöhen, wobei der Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Auswahl der zu spaltenden oder zu bildenden spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält und das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dadurch Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  3. Eine Verwendung wie in Anspruch 2, in welcher dieses Antigen ein Analogon dieses Biomoleküls enthält, das ein Analogon dieser zu spaltenden oder zu bildenden Bindung enthält.
  4. Die Verwendung einer wirksamen Menge eines die Geschwindigkeit erhöhenden Antikörpers für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krankheiten, die behandelbar sind durch Aktivieren oder Deaktivieren einer biologischen Funktion in einem Tier durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, wobei dieser Antikörper hergestellt wurde durch das Verfahren der a) Identifizierung eines Biomoleküls, dessen Bildung oder Spaltung zu der Aktivierung oder Deaktivierung der gewünschten biologischen Funktion führt, wobei dieses Biomolekül eine zugängliche zu spaltende oder zu bildende Bindung aufweist; b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält, das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält; c) Aussetzen von Zellen, die fähig sind, Antikörper zu produzieren, an dieses Antigen und dabei Erzeugen von antikörperproduzierenden Zellen; d) Hybridisieren dieser antikörperproduzierenden Zellen mit Myelomzellen und dadurch Erzeugen einer Vielzahl an Hybridomzellen, von denen jede monoklonale Antikörper erzeugt; und e) Screenen dieser Vielzahl an monoklonalen Antikörpern, um einen monoklonalen Antikörper zu identifizieren, der die Spaltung oder Bildung dieser Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung verstärkt.
  5. Eine Verwendung wie in Anspruch 4, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird unter Bezugnahme auf die dreidimensionale Struktur dieses Biomoleküls.
  6. Eine Verwendung wie in Anspruch 4, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch rechnergestütztes Modellieren oder über vorhergesagte Strukturen.
  7. Eine Verwendung wie in Anspruch 4, in welcher die zu spaltende oder zu bildende als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch Analogie zu homologen Verbindungen.
  8. Eine Verwendung wie in Anspruch 4, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch Lokalisieren eines großen Anteils an hydrophilen oder geladenen Aminosäuren.
  9. Die Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Krankheiten, die behandelbar sind durch Aktivieren oder Deaktivieren einer biologischen Funktion durch Erhöhen der Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung einer spezifischen Amid-, Peptid-, Ester- oder Glykosidbindung in einem Biomolekül in vivo, von einer wirksamen Menge eines Antigens, das fähig ist, Antikörper in diesem Tier hervorzurufen, die die Geschwindigkeit der Spaltung oder Bildung dieser Bindung erhöhen, wobei dieses Antigen hergestellt wurde durch das Verfahren der: a) Identifizierung eines Biomoleküls, dessen Bildung oder Spaltung zu der Aktivierung oder Deaktivierung der gewünschten biologischen Funktion führt, wobei dieses Biomolekül eine zugängliche oder oberflächenlokalisierte, zu spaltende oder zu bildende Bindung aufweist; und b) Auswahl eines Antigens, das ein Analogon dieses Biomoleküls enthält, das ein Analogon dieser zu bildenden oder zu spaltenden Bindung enthält.
  10. Eine Verwendung wie in Anspruch 9, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird unter Bezugnahme auf die dreidimensionale Struktur dieses Biomoleküls.
  11. Eine Verwendung wie in Anspruch 9, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch rechnergestütztes Modellieren oder über vorhergesagte Strukturen.
  12. Eine Verwendung wie in Anspruch 9, in welcher die zu spaltende oder zu bildende als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch Analogie zu homologen Proteinen.
  13. Eine Verwendung wie in Anspruch 9, in welcher die zu spaltende oder zu bildende Bindung als zugänglich oder oberflächenlokalisiert ermittelt wird durch Lokalisieren eines großen Anteils an hydrophilen oder geladenen Aminosäuren.
  14. Eine Verwendung wie in Anspruch 9, in welcher ein zu spaltendes oder zu bildendes Peptid oder Protein eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ASN-GLY, ASN-PRO, ASP-GLY, ASP-PRO, GLN-X und GLU-X, wobei X irgendeine Aminosäure ist.
  15. Die Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welcher dieser Antikörper angepasst ist, eine Bindung in einem Molekül zu schneiden, das ausgewählt ist aus Renin, einem viralen Hüllprotein, LPS, TNF und IgE.
  16. Die Verwendung nach Anspruch 15, in welcher das virale Hüllprotein gp120 ist.
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