DE68928504T2 - Ein aus dem Hüll-Glycoprotein des HIV-2-EHO-Retrovirus bestehendes gereinigtes Antigen enthaltende immunologische Zusammensetzungen - Google Patents

Description

• Das humane Immunschwächevirus (HIV) wird als das auslösenden Agens für das erworbene Immunschwächesydrom (AIDS) angesehen (Montagnier et al, 1984). Bis zum heutigen Tage wurden zwei verwandte, aber unterschiedliche Typen HIV-1 und HIV-2 identifiziert (Barre Sinoussi et al, 1983, Popovic et al, 1984, Ratner et al, 1985, Wain Hobson et al, 1985, Clavel et al, 1985a, Brun-Vezinet et al, 1987).
• HIV-2 wurde in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0239425, angemeldet am 22. Januar 1987, beschrieben. Zu dieser Zeit wurde festgestellt, daß HIV-2 nahe verwandt mit dem Affenimmunschwäschevirus (SIV-mac) ist, welches eine AIDS-ähnliche Erkrankung bei Macaquen auslöst. Die Abfolgen der Nukleodidsequenzen von HIV-1, HIV-2 und SIV zeigen eine bemerkenswerte Homologie zwischen HIV-2 und SIV-mac. Diese zwei Viren haben eine Homologie in ca. 75 % ihrer Gesamtnukleotidsequenz, beide sind nur entfernt verwandt mit HIV-1, mit ca. 40 % Gesamthomologie gemäß (Guyader et al, 1987; Chakrabarti et al, 1977). Zusätzlich zu den Genen, die Strukturproteine (das Virioncapsid und Hüllproteine) und die für die provirale Synthese und Integration notwendigen Enzyme, die allen Retroviren gemeinsam sind, kodieren HIV-1, HIV-2 und SIV für Gene, die die Virusreplikation regulieren, wie auch für Gene, die Proteine mit einer bislang unbekannten Funktion kodieren. Der einzig bemerkenswerte Unterschied in der genetischen Organisation von HIV-1, HIV-2 und SIV liegt in dem offenen Leserahmen, bezeichnet als vpx, der bei HIV fehlt, und vpu, der in HIV-1, aber nicht in HIV-2 und SIV vorkommt (Cohen et al, 1988; Guyader et al, 1987). Diese Viren sind beide tropisch und cytopathisch für CD4-positive T-Lymphocyten (Klatzmann et al, 1984; Clavel et al, 1986a; Dalgleish et al, 1984; Daniel et al, 1985). Eine große Anzahl an Untersuchungen hat gezeigt, daß CD4 als zellulärer Rezeptor von HIV wirkt (Weiss, 1988).
• In anderen Untersuchungen wurde berichtet, daß HIV-2 und SIV mac von HIV-1 durch den Prozeßierungsweg ihrer Hüll-Glycoproteinvorläufer unterschieden werden können. HIV-2- und SIV-Hüllvorläufer bilden ein homologes Dimer (das ein Glycoprotein gp300 für HIV-2 ROD ist) während ihrer Prozeßierung in die reifen Produkte, die extrazellulären und die Transmembran-Glycoproteine gp125 und gp 36 (Rey et al, J.Virol. 63/647,658, 1989a). Ferner kommen die Transmembran-Glycoproteine von HIV-2 und SIV als Homodimere mit einem Molekulargewicht von ca. 80 kDa für HIV-2 ROD vor. Unter ähnlichen experimentellen Bedingungen werden keine Dimerisation des Hüllvorläufers und der dimeren Formen des Transmembran-Glycoproteins bei HIV-1 beobachtet. Daher können wir davon ausgehen, daß die Dimerisierung der Hüll-Glycoproteine eine spezifische Eigenschaft der HIV-2- und SIV- Hüllgenexpression ist. Demnach könnte diese Eigenschaft als bequemer Marker zur Unterscheidung zwischen verschiedenen HIV- und SIV-Isolaten dienen.
• Die Erfinder, die weiter mit humanen HIV-2-Retroviren arbeiteten, haben nun gezeigt, daß einige Unterschiede unter den verschiedenen Isolaten von HIV-2 vorkommen können. Demnach haben sie Subtypen des Retrovirus HIV definiert.
• Eine erste Subuntergruppe kann mit dem Isolat HIV-2 ROD in Verbindung gebracht werden, das beim CNCM unter der Nummer 1 532 am 21. Februar 1986 und beim ATCC unter der Nummer 87011002 am 9. Januar 1987 hinterlegt wurde.
• Eine zweite Untergruppe kann mit dem Isolat HIV-2 EHO, hinterlegt unter der CNCM-Nummer I 643 am 19. Dezember 1986, in Verbindung gebracht werden.
• Diese beiden Isolate wurden in der europäischen Patentanmeldung 0239425 beschrieben und wurden durch ihre allgemeinen Eigenschaften charakterisiert.
• Die Erfinder waren noch viel mehr interessiert in der Untersuchung der Eigenschaften eines spezifischen HIV-2 Isolats: HIV-2 EHO. Gemäß der bereits für den HIV-2-Retrovirustyp gegebenen Definition produziert HIV-2 EHO ein 14kDa-Protein, das mit dem Produkt des vpx-Typs von HIV-2 ROD verwandt ist.
• Die Erfinder haben nun eine überraschende Eigenschaft von HIV-2 EHO herausgestellt, die mit der Struktur ihres Hüllvorläufers und seinen reifen Produkten, den Transmembran- und extrazellulären Glycoproteinen und entsprechenden Proteinen in Verbindung steht.
• Die Erfindung betrifft daher neue Antigene, die aus Proteinen und Glycoproteinen, die für den HIV-2 EHO-Subtyp des HIV-2 Retrovirus charakteristisch sind, aufgebaut sind.
• Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, die die obigen Antigene und Antikörper, die diese Antigene erkennen, enthalten.
• Ferner stellt die Erfindung neue Mittel für die in vitro Diagnose einer Infektion durch einen HIV-2 EHO-Retrovirus oder einen verwandten Retrovirus zur Verfügung, bei dem diese Antigene beteiligt sind.
• Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Antigene und Antikörper.
• Überraschenderweise konnten die Erfinder nachweisen, daß der Hüllvorläufer und die reifen Produkte, das sind die extrazelluären und Transmembran-Glycoproteine von HIV-2 EHO, sich von den entsprechenden Antigenen von HIV-ROD durch einen Unterschied in ihrem Molekulargewicht und der fehlenden Kreuzreaktivität zwischen den HIV-2 EHO-Hüll-Glycoproteinen oder -vorläufern oder Glycoproteinen mit den gleichen immunologischen Eigenschaften unterscheiden, und ermittelten insbesondere Antikörper, die gegen HIV-2 ROD-Hüll-Glycoproteine oder Vorläufer dieser Glycoproteine gerichtet sind.
• Die Erfindung betrifft demnach ein gereinigtes Antigen des humanen HIV-2 EHO-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß er aus dem Hüll- Glycoprotein von HIV-2 EHO oder einem Glycoprotein einer Variante davon aufgebaut ist, oder einen Teil des Antigens oder ein Antigen mit den gleichen immunologischen Eigenschaften, wobei das Antigen erkennbar durch ein humandes HIV-2-positives Serum ist, das zur Erkennung von HIV-2 ROD- Antigenen in der Lage ist, in einem Immunpräzipitationstest oder in einem Western-Blott-Test, und nicht von Antikörpern, die gegen Glycoprotein gp300 von HIV-2 ROD unter den gleichen Bedingungen in einem Immunpräzipitationstest erkannt wird.
• Ein typisches humanes HIV-2-positives Serum, wie oben erwähnt, ist ein Serum, das zur Erkennung der Antigene von HIV-2 ROD in der Lage ist.
• Die Molekulargewichte der verschiedenen Proteine und Glycoproteine gemäß der Erfindung können in einem Bereich von ±10 % vom angegebenen Molekulargewicht variieren.
• Gemäß einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein gereinigtes Antigen mit den obigen Eigenschaften, definiert als ein gereinigtes Antigen des HIV-2 EHO-Retrovirus, oder ein Glycoprotein mit denselben immunologischen Eigenschaften, und erhalten aus einer Variante des HIV-2 EHO-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß es durch das env-Gen codiert wird, und daß ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 120 kDa, entsprechend dem Hüllvorläufer hat.
• Gemäß einem zweiten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein gereinigtes Antigen des HIV-2 EHO-Retrovirus oder eine Glycoprotein mit denselben immunologischen Eigenschaften zur Verfügung gestellt und erhalten aus einer Variante des HIV-2 EHO-Retrovirus dadurch gekennzeichnet, daß es ein Glycoprotein gp270, entsprechend der dimeren Form des gp120 ist, und daß es ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 270 kDa hat.
• Dieses Antigen stellt die dimere Form der Vorläufer des HIV-2 EHO- Glycoproteins gp120 dar, das zuerst während des Prozesses der Virusbildung synthetisiert wird. Dieses Antigen scheint notwendig für die Bildung der viralen Partikel zu sein.
• Ein drittes Glycoprotein, das die Erfindung betrifft, ist ein gereinigtes Antigen des HIV-2 EHO-Retrovirus oder ein Glyoprotein den gleichen immunologischen Eigenschaften und erhalten aus einer Variante des HIV-2 EHO-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß es dem reifen Produkt des Hüll-Vorläufers gp120 entspricht, und daß es das extrazelluläre Hüll- Glycoprotein gp120 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 100 kDa ist.
• Die Charakterisierung durch die Erfinder der obigen Glycoproteine, die Bildung und Reifung des Hüll-Glycoproteins gp100 von HIV-2 EHO betreffen, hat ihnen ermöglicht, einen allgemeinen Unterschied von ca. 20 bis 30 kDalton (kDa) zwischen den scheinbaren Molekulargewichten der Glycoproteine von HIV-2 EHO und den entsprechenden von HIV-2 ROD festzustellen.
• Sie haben ferner Forschungen unternommen, um den Ursprung dieses Unterschiedes herauszufinden. Da es mindestens 30 potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen auf dem Hüll-Vorläufer gp140 von HIV-2 ROD gibt, bleibt es möglich, daß die Variation des Molekulargewichts zwischen den Glycoproteinen, die die Hüll-Glycoproteine von HIV-2 EHO auf der einen Seite und HIV-2 ROD auf der anderen Seite betreffen, mit einer verminderten Anzahl an Oligosaccharidketten in den obigen Glycoproteinen von HIV-2 EHO einhergeht.
• Überraschenderweise haben die Erfinder gezeigt, daß die Variationen der Molekulargewichte der verschiedenen, bei der Bildung der Hülle von HIV- 2 EHO beteiligten Glycoproteine auf Unterschieden in den Polypeptidmustern der Glycoproteine beruht, die die Unterschiede der Aminosäure- Zusammensetzung zwischen beiden Hüllvorläufern ergeben.
• Daher betrifft die Erfindung auch ein gereinigtes Antigen des HIV-2 EHO-Retrovirus oder ein nicht-glycosyliertes Produkt des Glycoproteins mit den gleichen immunologischen Eigenschaften und erhalten aus einer Variante des HIV-2 EHO-Retrovirus, dadurch gekennzeichnet, daß es ein p60-Protein ist, und daß es die gleiche Aminosäurezusammensetzung des Glycoproteins gp120 hat, und darin, daß es keine Oligosaccharidketten hat.
• Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung sind irgendwelche Proteine, abgeleitet aus den obigen gp120-, gp270- und gp-100-Glycoproteinen betroffen, mit der Maßgabe, daß diese Proteine frei von Oligosaccharidketten, die in den Glycoproteinen vorliegen, sind.
• Ein solches Protein könnte bestimmte Epitope präsentieren, die im allgemeinen nicht in dem entsprechenden Glycoprotein zugänglich sind.
• Die oben beschriebenen Proteine und Glycoproteine können in einer Zusammensetzung für die in vitro-Diagnose einer Infektion, insbesondere aufgrund eines humanen Retrovirus des HIV-2 EHO-Subtyps, allein oder in irgendeiner möglichen Kombination, enthalten sein.
• In einer ersten bevorzugten Ausführungsform ist die oben definierte Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, daß sie den Vorläufer gp120 des Hüll-Glycoproteins mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 120 kDa enthält.
• In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform enthält die Zusammensetzung das extrazelluläre Hüll-Glycoprotein gp100 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 100 kDa, oder sie enthält dieses gp100 assoziiert mit dem obigen gp120.
• In einer weiteren Ausführungsform gemäß der Erfindung enthält die Zusammensetzung das dimere Glycoprotein gp270 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 270 kDa. Diese Zusammensetzung kann ferner eine der oben beschriebenen Glycoproteine oder eine Kombination davon enthalten.
• Andere Zusammensetzungen, die den erfindungsgemäßen Definitionen entsprechen, sind solche, die Proteine enthalten, die aus den obigen Glycoproteinen abgeleitet sind, und die charakterisiert sind durch das Fehlen der Oligosaccharidketten.
• Eines der gängigen Proteine für die Verwirklichung der Zusammensetzungen ist das Protein p60, wie oben definiert.
• Die Erfindung betrifft auch ein gereinigtes Antigen von HIV-2 EHO gemäß der obigen allgemeinen Definition oder ein Glycoprotein mit den gleichen immunologischen Eigenschaften und erhalten aus einer Variante von HIV-2 EHO, dadurch gekennzeichnet, daß es das Transmembran-Glycoprotein gp36 ist, mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 36 kDa.
• Ein weiteres Antigen gemäß der Erfindung, und das mit dem vorhergehenden verwandt ist, oder ein Glycoprotein mit den gleichen immunologischen Eigenschaften und erhalten aus einer Variante von HIV-2 EHO, ist dadurch gekennzeichnet, daß es das Glycoprotein gp80 ist, und es der dimeren Form des gp36 entspricht.
• Die Erfindung betrifft auch eine immunogene Zusammensetzung, enthaltend Antigene von HIV-2 EHO, wie auf den vorhergehenden Seiten beschrieben, oder Antigene mit den immunologischen Eigenschaften der HIV-2 EHO-Antigene.
• Eine solche Zusammensetzung könnte als ein Impfstoff verwendet werden. In diesem Fall werden sie hergestellt, um eine Verabreichung einer Dosis von 50 bis 100µg pro Kilogramm zu ermöglichen.
• Zusammensetzungen entsprechend der obigen Definition umfassen z.B. das Glycoprotein gp100, das mit anderen der Glycoproteine gp270, gp120, gp80 oder gp36 assoziiert sein könnte.
• Eine bevorzugte immunogene Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthält ferner die entsprechenden Antigene von HIV-2 ROD, insbesondere ausgewählt aus gp300, gp140, gp129, gp80 oder gp36.
• Die Erfindung betrifft auch polyklonale Antikörper, erhalten aus Tieren, und monoklonale Antikörper, gerichtet gegen die oben definierten Antigene.
• Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind gemäß einer ersten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß sie ein gemeinsames Epitop der gereinigten Antigene gp120, gp270 und gp100 erkennen.
• In einer zweiten Auführungsform sind diese monoklonalen Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch das Glycoprotein gp100 erkennen.
• In einer dritten bevorzugten Ausführungsform sind diese monoklonalen Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch das Glycoprotein gp120 erkennen.
• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind diese monoklonalen Antikörper dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch das Glycoprotein gp270 erkennen.
• Insbesondere sind die oben beschriebenen Antikörper derart, daß sie gegen Epitope gerichtet sind, die auf einem oder mehreren Antigenen der Erfindung vorliegen, wobei diese Epitope nicht von Antikörpern gegen gp300 oder gegen einen der mit der Hülle verwandten Glycoproteine gp140 oder gp125 von HIV-2 ROD erkannt werden.
• Mehrere Verfahren zur Herstellung von Antikörper können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Zum Beispiel kann von Ascite-Kulturen in Tieren Gebrauch gemacht werden, insbesondere in Nagern, wie Mäusen oder mausähnlichen. Gebrauch gemacht werden kann auch von Zellkulturen, entweder immobilisiert oder verkapselt oder in Suspension. Die Hybridom-Technik, erhalten wie von Köhler und Milstein beschrieben (Nature 256, 495-497) kann eingesetzt werden. Hiernach umfaßt ein Verfahren zur Herstellung von Hybridoma für die Gewinnung der monoklonalen Antikörper der Erfindung:
• - Ausgehen von Milzzellen eines Tieres, z.B. einer Maus oder Ratte, die zuvor in vivo immunisiert wurde, oder aus Milzzellen eines solchen Tieres, das zuvor in vitro mit einem erfindungsgemäßen Antigen immunisiert wurde.
• - Fusionieren der immunisierten Zelle mit Myelomzellen unter Hybridom-bildenden Bedingungen, und
• - Auswählen solcher Hybridoma, die die monoklonalen Antikörper ausscheiden, welche spezifisch die oben definierten Antigene erkennen.
• Die Hybridom-Selektion kann durch konventionelle Techniken erfolgen, bei denen Tests auf die Fähigkeit der Hybridoma zur Produktion von Antikörpern gegen die bestimmten Antigene involviert sind.
• Ein Verfahren zur Herstellung der gegen eines oder mehrere Antigene, wie oben definiert, gerichteten monoklonalen Antikörper umfaßt:
• - Kultur der selektierten Hybridoma, wie oben angegeben in geeignetem Kulturmedium, und
• - Gewinnen der von den selektierten Hybridoma ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper, oder wahlweise
• - Implantieren der selektierten Hybridoma in das Peritoneum einer Maus, und nachdem Ascites-Flüssigkeit in dem Tier produziert wurde,
• - Gewinnen der dann gebildeten monoklonalen Antikörper aus dem Ascites.
• Die Antikörper können für verschiedene Techniken, wie Radioimmun-Test, mit den erkennenden Antigenen wiedergewonnen werden.
• In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Anigens mit den obigen Eigenschaften, umfassend die folgenden Schritte:
• - Lysieren von mit einem humanen Retrovirus HIV-2 EHO oder HIV-2 EHO-Viralpellets infizierten Zellen, und Abtrennung des Überstands vom Zellextrakt,
• - Inkubieren des verdünnten Extraktes mit einem Serum eines mit HIV-2 EHO oder HIV-2 EHO-Viralpellets infizierten Retrovirus, oder mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, wie oben definiert, auf einer Immun-Affinitätssäule unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Bildung eines Komplexes zwischen den Antikörpern und den Antigenen des zellulären Extraktes zu erlauben.
• - Waschen der Immun-Affinitätssäule und Entfernung der Moleküle, die nicht vom Träger zurückgehalten werden,
• - Auftrennen der eluierten Antigene.
• Die infizierten Zellen können in vitro nach Infektion der Zellen, z.B. von CEM-Zellen, und nach Kultur dieser Zellen erhalten werden.
• Die Auflösung der Antigene kann z.B. durch Elektrophorese z.B. auf einem Polyacrylamid-SDS-Gel erfolgen.
• Die Auflösung der Proteine kann z.B. erhalten werden durch:
• - Elution der an der Immun-Affinitätssäule anhaftenden Proteine,
• - Reinigung der so eluierten Produkte auf einer chromatographiesäule, die an einen Träger gebundene monoklonale Antikörper enthält, die das zu reinigende Antigen erkennen.
• Die Herstellung dieser Antigene kann auch erfolgen mit Viruspellets.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung der Proteine wird die Lyse der infizierten Zellen oder Viruspellets in einer Detergenslösung durchgeführt, die Antikörper, die in dem Immunoadsorbens enthalten sind, sind an Agarose gebunden, und ein Bindungspuffer wird verwendet.
• Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur in vitro-Diagnose einer Infektion, insbesondere durch einen HIV-2 EHO-Retrovirus in einer biologischen Probe, zum Nachweis des möglichen Vorliegens von HIV-2 EHO, umfassend die folgenden Schritte:
• - In-Kontakbringen der zu testenden biologischen Probe mit einem oder mehreren der vorhergehenden Antigen(e), oder eine diese enthaltende Zusammensetzung, unter Bedingungen, die die Bildung eines Konjugats zwischen den Antigenen und den möglicherweise in der biologischen Probe vorhandenen Antikörpern erlauben,
• - Nachweisen des möglicherweise gebildeten immunologischen Konjugats.
• Ein weiteres Verfahren nach der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung für die in vitro-Diagnose einer Infektion, in Beziehung auf HIV-2 ROD- oder HIV-2 EHO-Subtyp, in einer biologischen Probe zum Nachweis des möglichen Vorliegens von Antikörpern gegen die Antigene von HIV-2 ROD oder von HIV-2 EHO, umfassend die folgenden Schritte:
• - In-Kontaktbringen der zu testenden biologischen Probe mit einem Antigen von HIV-2 EHO oder einer Zusammensetzung von Antigenen in Kombination mit den entsprechenden Antigenen von HIV-2 ROD, die einige immunologische Unterschiede mit solchen von HIV-2 EHO, wie oben erklärt haben, unter Bedingungen, die die Bildung eines Konjugats zwischen den Antigenen und den Antikörpern, die möglichweise in der biologischen Probe vorliegen, erlauben,
• - Nachweis des möglicherweise gebildeten immunologischen Konjugats.
• Ein Kit, das zur Verwendung gemäß dem Verfahren zur in vitro-Diagnose eines Retrovirus von HIV-2 EHO-Subtyp in einer biologischen Probe zum Nachweis auf das Vorliegen von Antikörpern gegen HIV-2 EHO verwendet werden soll, ist dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:
• - Ein Antigen mit den oben definierten Eigenschaften oder eine Zusammensetzung dieser möglicherweise markierten Antigene,
• - Mittel, die die Reaktion zur Bildung des immunologischen Komplexes zwischen den obigen Antigenen und den möglicherweise in der zu testenden biologischen Probe vorhandenen Antikörpern erlauben, falls erforderlich ein oder mehrere Inkubationspuffer,
• - eine negative Kontrolle,
• - Mittel zum Nachweis des möglicherweise gebildeten immunologischen Komplexes zwischen den Antigenen und den möglicherweise in der Probe vorliegenden Antikörpern.
• Ein weiteres Diagnosekit ist ein Kit für die in vitro-Diagnose einer Infektion durch einen Retrovirus HIV-2 ROD oder HIV-2 EHO in einer biologischen Probe zum Nachweis auf das Vorliegen von Antikörpern gegen HIV-2 ROD oder HIV-2 EHO, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:
• - Antigen von HIV-2 EHO, wie in den vorhergehenden Seiten definiert, in Kombination mit den entsprechenden Antigenen von HIV-2 ROD die unterschiedliche immunologische Eigenschaften zeigen,
• - Mittel zur Ermöglichung der Reaktion zur Bildung des immunologischen Komplexes zwischen den obigen Antigenen und die möglicherweise zu testenden biologischen Probe vorliegenden Antikörpern, falls erforderlich ein oder mehrere Inkubationspuffer,
• - eine Negativkontrolle,
• - Mittel zum Nachweis des möglicherweise gebildeten immunologischen Komplexes zwischen den Antigenen und den möglicherweise in der Probe vorliegenden Antikörpern.
• Der Schritt des Nachweises des möglicherweise gebildeten immunologischen Komplexes kann nach üblichen Verfahren, wie einem Western- Blott oder ELISA erfolgen.
• Bevorzugte Zusammensetzungen von Antigenen, die die Diagnose von HIV-2 gemäß der Erfindung erlauben, sind z.B. solche, die eine Mischung von einem oder mehreren Antigenen, ausgewählt aus gp300, gp140, gp125, gp80 oder gp36 von HIV-2 EHO mit einem oder mehreren Antigenen, ausgewählt aus gp270, gp100, gp80 oder gp36 von HIV-2 EHO enthalten.
• Die vorliegende Teilanmeldung betrifft spezifische immunogene Zusammensetzungen wie oben definiert.
• Weitere Vorteile der Erfindung werden aus den Beispielen und den Figuren im folgenden offensichtlich.
FIGUR 1: Identifikation von HIV-2 EHO-Proteinen durch Immunpräzipitation.
• HIV-2 ROD oder EHO infizierte CEM-Zellen wurden mit [³&sup5;S]-Methionin markiert, und der Kulturüberstand wurde in einem Immunpräzipitations-Test unter Verwendung von Serum aus dem Patienten EHO (Bahn 1), einem typischen HIV-2 positiven Serum (Bahnen 2) und einem typischen HIV-1 positiven Serum (Bahn 3) verwendet. Die Proben wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12,5 %) analysiert. Ein Fluorgraph ist gezeigt. gp125 und p26 betreffen das extrazelluläre Hüllprotein und das Hauptkernprotein von HIV-2 ROD. gp100 und p27 betreffen das extrazelluläre Hüll-Glycoprotein und das Hauptkernprotein von HIV-2 EHO.
FIGUR 2: Charakterisierung von HIV-2 EHO-Hüll-Glycoproteinen.
• a/ HIV-2 ROD- und EHO-infizierte Zellen wurden mit [355] -Methionin markiert und die Extrakte wurden dann in einem Immunpräzipitations-Test unter Verwendung eines typischen HIV-2-positiven Serums verwendet. Die Proben wurden auf einem 5 %igen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,1 % Bisacrylamid, analysiert.
• b/ Extrakte aus HIV-2 infizierten Zellen, markiert mit [³H] Glucosamin wurden durch Immunprazipitation unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, spezifisch für das Transmembran-Glycoprotein von HIV-2 ROD, getestet. Die Proben wurden auf einer Polyacrylamidgel- Elektrophorese (10 %) analysiert.
FIGUR 3: Elektrophoretische Mobilitäten von deglycosylierten Hüllvorläufern von HIV-2 ROD und EHO.
• [³&sup5;S]-Methionin markiertes gp300 (ROD) und gp270 (EHO) wurden durch Immunpräzipitation gereinigt, worauf präparative Gel-Elektrophorese folgte ("Material und Methoden"). Die lyophilisierten Proben wurden in Endo-H- Puffer suspendiert, was zur Dissoziation von Dimeren führt), enthaltend 150mM Natriumcitrat pH 5,5, 0,1 % SDS (Gew./V), und 0,5mM PMSF. Diese Proben wurden in Abwesenheit (Bahnen-) oder Anwesenheit (Bahnen+) von 10 Einheiten endo H inkubiert (30ºC, 2h). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 2-fach konzentrierten Elektrophorese-Probenpuffer abgebrochen. Die Proben wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (7,5 %) analysiert. Fluorgraphen sind angegeben. Auf der rechten Seite zeigen die Pfeile die Position der verdauten Produkte, 80 und 60 kDa für ROD und EHO, an.
FIGUR 4: Teilverdau von HIV-2 ROD- und EHO-Hüllvorläufern mit der V8-Protease.
• [³&sup5;S]-Methionin-markierte Hüllvorläufer von HIV-2 ROD und EHO wurden wie in Fig. 3 beschrieben, gereinigt. Die lyophilisierten Proben wurden in 100µl Puffer, enthaltend 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8 und 0,1 % SDS (Gew./V) lyophilisiert. Die Proben wurden dann inkubiert (37ºC, 30 min) ohne (Bahn-) oder mit (Bahn+) 1µg Staphyloccocus Aureus V8-Protease. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 2-fach konzentrierten Elektrophore-Probenpuffer abgebrochen. Die verschiedenen Proben wurden durch Elektrophorese auf einem 7,5 %igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wird eine Fluorgraphie gezeigt. Auf der rechten Seite zeigen die Pfeile auf die Position der Verdauungsprodukte: 130, 110 und 80 kDa für gp140 ROD, wogegen 90, 75 und 60 kDa für gp120 EHO.
FIGUR 5: Immunpräzipitationstest unter Verwendung von polyklonaler Antikörper erzeugt gegen gp300 von HIV-2 ROD.
• [³H]-Glucosamin-markierte Extrakte aus HIV-1 BRU, HIV-2 ROD, HIV-2 EHO und SIV mac infizierten Zellen wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines typischen menschlichen HIV-1 positiven Serums (Bahn S1), einem typischen Human-HIV-2 positiven Serum (Bahnen S2) und murinen polyklonalen Antikörpern, erzeugt gegen gp300 von HIV-2 ROD (Bahnen AB) getestet. Die Proben wurden Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12,5 %) analysiert. Es werden Fluorgraphien gezeigt.
FIGUR 6: Hüll-Glycoproteine von HIV-2 EHO werden nicht durch Anti- gp300-Antikörper erkannt.
• Extrakte aus CEM-Zellen, infiziert mit HIV-1 oder HIV-2 ROD oder HIV-2 EHO, wurden durch Immun-Blotten unter Verwendung des Serums des Patienten EHO (Sektionsserum HIV-2), Murin-Anti-gp300-Antikörper (Sektion Anti-gp300) und einem typischen HIV-1 positiven Serum (Sektion Serum HIV-1) analysiert. CONT betrifft Extrakte aus nicht-infizierten Zellen; Polyacrylamidgel Elektrophorese erfolgte auf 10 %igem Acrylamid (in Abschnitten Serum HIV-2 und Serum HIV-1) oder 7,5 % Polyacrylamid (Abschnitte Anti-gp300)-Gele. Es werden Autradiographien gezeigt.
MATERIALIEN UND METHODEN MATERIALIEN
• L-[³&sup5;S]-Methionin (spezifische Aktivität) 1000µCi/mmol), D-[6-³H]- Glucosamin (spezifische Aktivität: 20-40µCi/mmol) wurden erworben von Amersham (Amersham, UK). Endo-β-N-acetylglucosaminidase H und Spaphylococcus V8-Protease stammten von Calbiochem, San Diego, USA. Poly(A).poly(U) wurde vom Institut Curie, Paris, bezogen und hergestellt nach dem Verfahren, beschrieben von Hovanessian et al, 1982 (Journal Interferon Research Band 2, Seiten 209 bis 216).
• Die monoklonalen Antikörper, spezifisch für das Transmembran- Glycoprotein, wurden von Oncogen Seattle, USA, erstanden. Die Präparation dieses monoklonalen Antikörpers (bezeichnet als mAb1H8) wird beschrieben.
VIRUS UND ZELLEN
• HIV-¹BRU-Isolat aus humanem Immunschwächevirus-Typ 1 (Montagnier et al, 1984), HIV-2ROD-Isolat des humanen Immunschwächevirus-Typ 2 (Clavel et al, 1986) und Affen-Immunschwächevirus, SIVmac&sub1;&sub4;&sub2; (Daniel et al, 1985) wurden in dieser Untersuchung eingesetzt.
• Die verschiedenen Zellinien und humanen Lymphocyten wurden in einem Suspensionsmedium RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Cergy-Pontoise Frankreich), enthaltend 10 % (V/V) kultiviert; 2µg/ml Polybrene (Sigma) wurde für HIV- infizierte Zellkulturen zugegeben. CEM-Klon 13-Zellen wurden aus der humanen Lymphoid-Zellinie CEM (ATCC-CCL 119) abgeleitet und exprimieren das T4-Antigen in einem hohen Spiegel. Fünf Tage nach Infektion mit HIV-1BRU oder HIV-2ROD-Isolaten produzieren ca. 80 bis 90 % der Zellen virale Partikel und können durch einen cytopathischen Effekt entsprechend der Vakuolisierung der Zellen und Auftreten kleiner Syncitia nachgewiesen werden.
• Die HUT-78-Zellinie ist eine weitere humane T4-positive Lymphoidzellinie, die hoch geeignet für die Replikation von SIVmac&sub1;&sub4;&sub2; ist (Daniel et al, 1985). Periphere Blutlymphocyten aus gesunden Blutspendern wurden 3 Tage mit 0,2 % (Gew./V) Phytohämagglutinin (PHA)-Fraktion P (Difco, Detroit, USA) in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 %-igem fötalen Kalbsserum, stimuliert. Die Zellen wurden dann in RPMI-1640-Medium, enthaltend 10 % (V/V)-T-Zell-Wachstumsfaktor (TCFG, Biotest.) kultiviert.
• Nach Infektion mit HIV-2 wurden die Lymphocyten in Gegenwart von 10 % (V/V) TCGF und 2µg/ml Polybrene kultiviert.
• Das HIV-2 EHO-Isolat wurde aus Blutlymphocyten des Ivory Coast- Patienten (EHO) mit AIDS erhalten. Blutlymphocyten wurden mit PHA stimuliert und mit PHA-stimulierten, normalen humanen Lymphocyten cokultiviert. Diese Kulturen wurden in Gegenwart von TCGF gehalten. Die Virusproduktion wurde durch die cytophatischen Effekte und durch reverse Transkriptase-Aktivität im Überstand (Rey et al, 1987) überwacht. Das Virus (HIV-2 EHO) wurde dann auf CEM-Klon 13-Zellen kultiviert. Vier bis fünf Tage nach Infektion mit HIV-2 EHO lieferten ca. mehr als 80 % der Zellen virale Partikel.
METABOLISCHE MARKIERUNG DER ZELLEN
• Zur metabolischen Markierung von Proteinen wurden die infizierten Zellen 16 Stunden bei 37ºC in MEM-Kultur inkubiert (Milie Minimum Essentiel, Abreviation de Minium Essential Medium) ohne L-Methionin und Serum, jedoch ergänzt mit 200µCi/ml[³&sup5;]-Methionin. Für die metabolische Markierung von Glycoproteinen wurden infizierte Zellen 16 Stunden bei 37ºC in MEM-Kulturmedium inkubiert, dem Serum und Glycose fehlte, das jedoch mit 200µCi/ml [³H]-Glucosamin ergänzt war.
ZELLEN UND VIRALE EXTRAKTE
• Zellpellets, entsprechend 10&sup7;-Zellen wurden in 100µl Puffer resuspendiert: 10mM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 0,2mM PMSF, 100 Einheiten/ml Aprotinin (Iniprol , Choay) vor Zugabe von 100µl des gleichen Puffers, enthaltend 2 % (V/V) Triton X-100 . Die Zellextakte wurden bei 12.000g 10 min zentrifugiert, der Überstand wurde bei -80ºC bis zur Verwendung aufbewahrt. Für virale Zellextrakt-Präparationen wurden 100µl loxlysepuffer (100mM Tris-HCl pH 7,6, 1,5M NaCl, 10mM EDTA, 10 % 5 V/V) Triton x-100 , 100 Einheiten pro ml Aprotinin) pro ml des geklärten Überstands aus infizierten CEM-Zellen zugegeben und wie oben weiter verarbeitet. Zur Herstellung von Extrakten aus Viruspellets wurde das Kulturmedium aus infizierten Zellen zunächst bei 12.000 g 10 Minuten vor einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation bei 100.000 g für 15 Minuten in einer Beckman-TL100-Zentrifuge zentrifugiert. Viruspellets (Material aus 10&sup7;-Zellen) wurden dann in 200µl Lysepuffer solubilisiert.
PRAPÄRATIVE ELEKTROPHORESE
• HIV-2-Glycoproteine, gereinigt durch Immunpräzipitation wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese, wie zuvor beschrieben, aufgetrennt (Rey et al, 1989, J.Virol 63, 647-658), und die Regionen des Gels, enthaltend die viralen Glycoproteine wurden unter Bezug auf die Position eines vorgefärbten Molekulargewicht-Proteinmarkers (BRL) ausgeschnitten.
• Glycoproteine wurden durch Inkubation für 16 Stunden bei 4ºC in einem Elutionspuffer (0,1M NaHCO&sub3;, 0,5mM EDTA, 0,05 % (Gew./V) SDS, 0,2mM PMSF) eluiert. Die so erhaltenen Glycoprotein-Fraktionen wurden lyophilisiert und bis zur Verwendung im Kühlschrank gehalten.
HERSTELLUNG VON MURINEN POLYKLONALEN ANTIKÖRPERN, ANTI-gp300
• HIV-2 ROD-Hüll-Glycoprotein gp300 wurde aus Extrakten von infizierten CEM-Zellen (3 x 108 Zellen) durch Immunaffinitäts-Chromatographie auf HIV- 2-Serum-Sepharose gereinigt, worauf präparative Gelelektrophorese folgte (Rey et al, 1989a Precite). Die gereinigte gp300-Präparation wurde in 10 ml 150mM NaCl, enthaltend 0,5M Harnstoff und 1 mg/ml Maus-Serum-Proteine gelöst und 24 Stunden gegen eine Lösung, enthaltend 150 mM NaCl und 0,5M Harnstoff, dialysiert. Das dialysierte Material wurde dann zentrifugiert und 2 ml Aliquots wurden bei -80ºC aufbewahrt. Fünf Mäuse (6 Wochen alt) wurden intraperitoneal fünfmal in einem 12-tägigen Intervall 350 µl der gp300 Präparation (ca. 0,1µg gp300) injiziert. Poly(A) Poly(U) (200µg; 1 mg/ml in 150 mM NaCl) wurde als Adjuvans verwendet, das intravenös während jeder Immunisierung verabreicht wurde. Zwei Tage nach der letzten Injektion wurden den Mäusen intraperitoneal eine Suspension von 10&sup6; Sarcoma 180/TG- Zellen zur Herstellung einer hyperimmunen Ascite-Flüssigkeit verabreicht (Hovanessian et al, 1988, Immunology Today 9, 161-162). Acht Tage später wurden die Mäuse getötet und die Ascite-Flüssigkeit gesammelt. Ascite- Zellen wurden durch Zentrifugation (200 g, 5 min) entfernt und die peritoneale Flüssigkeit wurde gewonnen.
PRODUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON MONOKLONALEN, mAb 1H8
• HIV-2 ROD-Virionen wurden in CEM-Zellen kultiviert und aus konzentrierten Kulturüberständen durch Bandenbildung in Saccharose- Gradienten konzentriert. Gereinigter Virus wurde in 0,5 % Triton X-100 , 150 mM NaCl. 50mM Tris, pH 8,0, 1 % Aprotinin (Sigma) aufgebrochen und mit Ultrazentrifugation geklärt. Das viral Extrakt wurde dann über eine Lentil- Lecitin-Sepharose 4B -Affinitätssäule (Pharmacia) geleitet, die Säule gewaschen und die gebundenen Glycoproteine mit 0,5 M Methyl-α-D- mannopyranosid (Sigma) eluiert, und über Nacht gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert. BALB-C-Mäuse wurden intraperitoneal mit 0,3 ml gereinigter Glycoproteine (2-5µg), die wieder an Lentil-Lecitin-Sepharose 48 (50-100µl) angeheftet war, immunisiert. Die Mäuse wurden alle 4 bis 6 Wochen für 24 Wochen mit dem gleichen Immunogen geboostet und auf HIV-2 Virionextrakte und quantitativ mit den "Genetic Systems HIV-2 disrupted Virion EIA" überwacht. Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Milzzellen mit NS1-Myelomzellen nach dem Verfahren von Köhler und Milstein fusioniert. 96-Well-Fusionsplatten wurden auf Hybridomas gescreent, die Anti-HIV-2-Antikörper ausschieden unter Verwendung des Genetic Systems HIV- 2 disrupted virion EIA. Verfahren zur Vermehrung und Stabilisierung der Klon-Hybridomas und für die Ascites-Produktion wurden zuvor beschrieben von Gosting et al (J. of Clinical Microbiology, 25, 845-848). Hybridom- Kulturüberstände wurden durch RIPA und Wester-Blott-Analyse gescreent. Monoklonaler Antikörper (mAb) 1H8, der mit dem Transmembran-Glycoprotein reagierte, wurde weiter auf die Aminosäuresequenz 579-604 innerhalb des HIV-2 Transmembran-Glycoproteins unter Verwendung eines EIA's, basierend auf einem synthetischen Peptid, kartiert. Die HIV-2-Aminosäuresequenz 579- 604 ist hoch konserviert unter allen HIV-2- und SIV-Isolaten, die so bislang sequenziert wurden, monoklonaler Antikörper 1H8 kreuzreagiert mit allen HIV-2- und SIV-Isolaten, die bislang getestet wurden. Das synthetische Peptid p39' wurden entsprechend der Aminosäuresequenz 579-604, abgeleitet aus der Nukleotidsequenz der HIV-2 ROD -Hülle, synthetisiert. Die Aminosäuresequenz des Peptids p39' ist die folgende VTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCH.
RADIO-IMMUNPRAZIPITATIONS-TEST (RIPA)
• Zell- oder virale Extrakte (20µl) (Material entsprechend 1 x 10&sup6;- infizierten Zellen) wurde zunächst in zwei Volumeneinheiten RIPA-Puffer [(10mM Tris-HCl pH 7,6, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1 % Triton x-100 (V/V), 0,2 % Natriumdeoxycholat (Gew./V), 0,1 % SDS (Gew./V) 7 mM 2-β- Mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF, 100 ml Aprotinin (Iniprol , Choay)] verdünnt. Verdünnte Extrakte wurden inkubiert (45 min, 4ºC) mit Seren oder murinpolyklonalen oder monoklonalen Antikörpern (2-5µl). Protein A-Sepharose wurde dann zugegeben und die Proben wurden weiter 3 Stunden bei 4ºC inkubiert. Diese Proben wurden im RIPA-Puffer gewaschen. Proteine, die durch Immunpräzipitation wiedergewonnen worden waren, wurden durch Erhitzen (95ºC, 5 min) im Elektrophorese-Probenpuffer [125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1 % SDS (Gew./V), 20 % Glycerin (V/V), 1 % 2-β-Mercaptoethanol] eluiert. Eluierte Proteine wurden durch Elektrophorese in Polyacrylamid SDS-Gelen, enthaltend 0,1 % Bis-acrylamid anstelle von 0,2 % (Gew./V) und 2M Harnstoff aufgetrennt.
ELEKTROPHORESE-TRANSFER-IMMUNBLOTT-ANALYSE: WESTERN-BLOTT
• Die Proteine wurden einer Analyse durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese vor elektrophoretischer Überführung auf 0,45µm Nitrocellulose-Folien (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) in Elektrodenpuffer (20mM Tris-Base, 150mM Glycin, 20 % Methanol, V/V), wie beschrieben (Burnette 1981, Anal. Biochem. 112, 195-230) überführt. Die Elektrophorese-Blotts wurden mit 5 % (Gew./V) fettfreier Trockenmilch in PBS (Johnson et al, 1984, Gene Anal. Techn., 1, 3-8) gesättigt. Dann wurden sie in einem versiegelten Beutel (über Nacht 4ºC) entweder mit HIV-1 oder HIV-2 positiven Seren (in einer 1:100 Verdünnung) oder mit Mauspolyklonalen oder -monoklonalen Antikörpern (in einer Verdünnung 1:200) in PBS enthaltend 10 % FCS inkubiert. Die Folien wurden anschließend in PBS, PBS-haltigen 5 % Nonidet P-40 gewaschen und dann in PBS-enthaltenden fettfreien Milch (5 %) resaturiert. Die gewaschenen Folien wurden dann inkubiert (2 Stunden, Raumtemperatur) in einem versiegelten Beutel entweder mit einer Präparation von ¹²&sup5;I-markierten Protein A (Amersham, > 30mCi/mg) zur Sichtbarmachung der humanen polyklonalen Antikörper in den HIV-1- oder HIV-2-Seren oder mit einer Präparation von ¹²&sup5;I-markierten Ziege-Antimaus- Immunglobulinen (Amersham; 2-10µCi/µg). Die Folien wurden aus den Beuteln entfernt und wiederum gewaschen, getrocknet und autoradiographiert (Kodak RP Royal, X-Ray-Filme) bis zu 24 bis 48 h.
ERGEBNISSE ISOLATIONEN VON HIV-2 EHO:
• HIV-2 EHO wurde aus den peripheren Blutlymphocyten eines AIDS- Patienten (EHO) von der Elfenbeinküste isoliert. Der Virus wurde durch Co- Kultivierung von PHA-stimulierten Lymphocyten aus einem Patienten EHO und PHA-stimulierten normalen Humanlymphocyten in Gegenwart von TCGF isoliert. Reverse Transcriptase-Aktivität im Kulturüberstand war bis zum 15 Tag in Verbindung mit einem typischen cytophatischen Effekt nachweisbar. Der Virus wurde dann in CEM-Zellen unter Co-Kultivierung mit infizierten Lymphocyten vermehrt. Überstände solcher Kulturen wurden dann zur Infektion von CEM- Zellen und Herstellung der Stocklösung von Virus zur Verwendung in den hier vorgestellten Experimenten verwendet. Dieser Virus gehört zum HIV-2- Retrovirus-Typ, da seine genomische RNA in einem Dot-Blot-Test mit einer Sonde aus HIV-2 ROD, aber nicht aus HIV-1 BRU hybridisiert.
• Die Stocklösung-Präparation von HIV-2 EHO infiziert CEM-Zellen und verursacht einen cythopatischen Effekt. Drei bis vier Tage nach Infektion der CEM-Zellen mit HIV-2 EHO produzierten ca. 80 bis 90 % der Zellen virale Proteine, die durch Immunfluoreszenz-Untersuchungen unter Verwendung eines HIV-2 positiven Serums nachweisbar waren. Vier Tage nach Infektion zeigten die meisten der Zellen einen klaren cytophatischen Effekt, entsprechend der Vakuolisierung der Zellen und des Auftretens kleiner Syncitia.
• Zur Charakterisierung der Proteine von HIV-2 EHO-Virus wurden infizierte Zellen metabolisch mit [³&sup5;S]-Methionin markiert, und das virale Pellet im Kulturüberstand wurde durch Immunpräzipitation unter Verwendung verschiedener Seren getestet:
• 1/ Das Serum des durch HIV-2 EHO infizierten Patienten;
• 2/ ein typisches HIV-2 positives Serum;
• 3/ ein typisches HIV-1 positives Serum.
• Diese Tests wurden durchgeführt parallel mit Extrakten von [³&sup5;S]- Methionin-markiertem HIV-2 ROD-Virus. Das HIV-2 positive Serum und das Serum des Patienten EHO erkannten beide das extrazelluläre Glycoprotein gp125 von HIV-2 ROD. Aber nur das HIV-2 positive Serum erkannte das Hauptkernprotein p26 von HIV-2 ROD (Figur 1, Bahnen 1 und 2, ROD). Das HIV- 1 positive Serum erkannte nicht gp12s, es konnte jedoch p26 immunpräzipitieren (Figur 1, Bahn 3, ROD). Dies ist in Übereinstimmung mit den vorhergehenden Ergebnissen, die darauf hindeuten, daß gaq-Proteine von HIV-1 und HIV-2 antigen-kreuzreaktiv sind, wogegen die env-Proteine es nicht sind (Clavel et al, 1986a). Die Reaktivität dieser drei Seren mit den viralen Proteinen von HIV-2 EHO, ähnlich zu der von HIV-2 ROD. Das Serum des Patienten EHO und das HIV-2 positive Serum immunpräzipierten 100 kDa, das vermutlich das extrazelluläre Hüll-Glycoprotein von HIV-2 EHO war (Figur 1, Bahnen 1 und 2 EHO). Dieses 100 kDa-Protein war spezisch für HIV- 2, da es nicht vom HIV-1 positiven Serum erkannt wurde. Sowohl HIV-1 als auch HIV-2 positive Seren präzipitieren ein 27 kDa-Protein, das wahrscheinlich das Hauptkernprotein von HIV-2 EHO war. Jedoch dieses letztere Protein wurde nicht vom Serum aus einem Patienten EHO (Figur 1, EHO) erkannt. Diese Beobachtungen deuten auf das Fehlen von Anti-gaq- Antikörpern im Serum des Patienten EHO hin. Ein solches Phänomen wurde von HIV-1 infizierten Individuen berichtet, und es geht mit der Entwicklung von AIDS einher. Die späten Stadien der HIV-1 Infektion sind gekennzeichnet durch eine erhöhte Produktion von Antigenen und ein vermindertes Maß an Antikörpern, gerichtet gegen das Hauptkern-Protein. In der Tat wird diese Beobachtung routinemäßig als Marker zur Überwachung des Wechsels von der latenten zur aktiven HIV-Infektion verwendet (Lange et al, 1986 Br. Med. J. 293, 1459-1462; Pedersen et al, 1987 Br. Med. J. 295, 567-572).
IDENTIFIKATION VON EXTERNEN UND TRANSMEMBRANEN HÜLLPROTEINEN VON HIV-2 EHO
• In diesen Experimenten wurden HIV-2 ROD und EHO infizierte CEM-Zellen metabolisch mit [³&sup5;S]-Methionin markiert, und die markierten Extrakte wurden durch Immunpräzipitation unter Verwendung verschiedener Typen von Antikörpern getestet: Ein typisches HIV-2 positives Serum, mit dem Hüllproteine von HIV-2 ROD (Rey et al, 1989a), ein monoklonaler Antikörper, spezifisch für das Transmembran-Glycoprotein von HIV-2 ROD, ein monoklonaler Antikörper, spezifisch für das Hauptkernprotein p26 von HIV-2 ROD, und polyklonale Kaninchen-Antikörper, spezifisch für das vpx-Protein.
• Im Fall der HIV-2 ROD-Hüll-Glycoproteine wurde bereits zuvor gezeigt, daß der Hüllvorläufer (gp140) ein Dimer (gp300) während seines Prozeßierens ausbildet, was für die Produktion von reifen Hüll-Proteinen erforderlich ist: Das extrazelluläre Glycoprotein gp125 und die dimere Form des Transmembran-Glycoproteins gp80. Das Monomer des Transmembran-Glycoproteins ist bereits unter experimentellen Bedingungen, wie sie in unseren Experimenten verwendet werden, nachweisbar. Zum Vergleich der Molekulargewichte der Hüll-Glycoproteine erfolgte eine Elektrophorese auf einem 5 Polyacrylamidgel, enthaltend 0,1 % Bis-acrylamid anstelle von 0,2 Figure 2a zeigt die Ergebnisse dieses Experiments, die darauf hindeuten, daß der Hüllvorläufer, die dimere Form des Hüllvorläufers und das extrazelluläre Hüll-Glycoprotein 20 bis 30 kDa kleiner im HIV-2 EHO als im Vergleich zu HIV-2 ROD sind. Nach Identifikation des Transmembran- Glycoproteins von HIV-2 EHO verwendeten wir einen monoklonalen Antikörper mAb1H8 gegen das Transmembran-Glycoprotein von HIV-2 ROD. Wie erwartet, identifiziert dieser monoklonale Antikörper auch einen Hüllvorläufer und seine dimere Form. Demnach präzipitierte der monoklonale Antikörper gp120, gp270 und gp80 aus HIV-2 EHO infizierten Zellen im Vergleich zu gp140, gp300 und gp80 aus HIV-2 ROD infizierten Zellen (Figur 2b). Die elektrophoretische Mobilität des Transmembran-Glycoproteindimers von HIV-2 EHO war leicht geringer als die von HIV-2 ROD. Da dieser Unterschied nicht signifikant ist, bezeichnen wir es aus Beqeumlichkeitsgründen als gp80. Pulse-chase-Experimente und Untersuchungen über die Genetik der Akkumulierung von Hüll-Proteinen von HIV-2 EHO zeigten, daß gp120 das erste vor der Bildung des Vorläufer-Dimers gp270 synthetisierte Glycoprotein und der Produktion von reifen Hüll-Proteinen war, dem dem extrazellulären Glycoprotein gp100 und dem Transmembran-Glycoprotein-Dimer gp80. Glycosilierung aller Hüll-Proteine wurde durch Tunicamycin blockiert, ein Antibiotikum, das die N-verknüpfte Glycosylierung von Proteinen inhibiert (Schwarz et al, 1976, J.Virol. 19, 782-791; Kornfeld und Kornfeld 1985, Ann.Rev.Biochem. 54, 631-664). Es wurde gefunden, daß von diesen Glycoproteinen der Hülle nur gp100 und gp80 in Verbindung mit Viruspartikeln gemäß den zuvor berichteten Ergebnissen auf HIV-2 ROD (Rey et al, 1989a) assoziiert waren.
CHAHAKTERISIERUNG VON HIV-2 ROD- UND HIV-2 EHO-HÖLLVORLÄUFERN
• Es gibt mindestens 30 potentielle N-verknüfte Glycosylierungsstellen auf dem Hüllvorläufer von HIV-2 ROD. Aufgrund dieser Tatsache bleibt es möglich, daß der 20 kDa Unterschied zwischen dem Hüllvorläufer von HIV-2 EHO und ROD aufgrund einer verminderten Anzahl von Oligosaccharid-Ketten im Hüllvorläufer von HIV-2 EHO beruhen könnte. Aus diesem Grund wurden die elektrophoretischen Mobilitäten dieser Vorläufer nach Entglycosylierung durch β-N-Acetylglucosaminase H (endo H), welche die Oligosaccharid-Ketten vom Mannose-Typ abspaltet (Tarentino et al, 1974 H.J. Biol. Chem. 249, 818- 824) analysiert. HIV-2 EHO und ROD infizierte Zellen wurden mit [³&sup5;S] Methionin markiert, und die Zellextrakte wurden zur Reinigung der dimeren Formen der Hüllvorläufer durch Immunpräzipitation und präparative Gel- Elektrophorese verwendet. Die gereinigten Dimer-Vorläufer wurden dann in Gegenwart von SDS und einem sauren pH (Rey et al, 1989a) vor Verdau mit endo H. dissoziiert. Die scheinbaren Molekulargewichte der Hüllvorläufer gp140 (ROD) und gp120 (EHO) wurden auf Proteine mit 80 und 60 kDa reduziert (Figur 3). Diese Ergebnisse zeigen daher, daß der 20 kDa -Unterschied zwischen den Hüllvorläufern der beiden HIV-2-Isolate nicht aufgrund eines Unterschieds der Anzahl von engverknüpften Oligosaccharid-Ketten bestand. Unter diesen experimentellen Bedingungen bei diesen Experimenten führte der Verdau mit endo H zu einer vollständigen Abspaltung aller Oligosaccharid- Ketten.
• Zum Vergleich des Polypeptid-Musters der Hüllvorläufer von HIV-2 ROD und EHO führten wir Teilproteolyse-Experimente mit Staphyloccocus aureus V8-Protease durch, welche eine Spezifität für Glutamyl-Bindungen zeigt. Die gereinigten Hüll-Dimer-Vorläufer wurden zuerst getrennt vor einer partiellen Proteolyse mit verschiedenen Konzentrationen der V8-Protease. Die mit 1µg Protease erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt. Das gp140, das bei der Dissoziation von gp300 von HIV-2 ROD hervorgeht, wurde in die drei Hauptpolypeptide 130, 110 und 80 kDa zerlegt, wogegen das gp120 aus der Dissoziation von gp270 von HIV-2 EHO in ein Haupt-60kDa-Polypeptid und zwei schwache 90 und 75 kDa-Polypeptide ungewandelt wurde. Daher führt der Verdau von gp140 und gp120 mit V8-Protease zur Produktion von unterschiedlichen Polypeptidmustern, die die Unterschiede in den Aminosäure-Zusammensetzungen zwischen den beiden Hüllvorläufern wiedergaben.
HIV-2 EHO HÜLL-GLYCOPROTEINE WERDEN NICHT VON MURINEN POLYKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN DIE HÜLL-GLYCOPROTEINE VON HIV-2 ROD ERKANNT.
• Polyklonale Antikörper wurden durch Immunisieren von Mäusen mit einer gereinigten Präparation von gp300 aus Zellen, die mit HIV-2 ROD infiziert waren ("Material und Methoden") hergestellt. Diese Antikörper wurden als Anti-gp300 polyklonale Antikörper bezeichnet. Die Reaktivität dieser Antikörper wurde in einem Immunpräzipitations-Test unter Verwendung von Extrakten aus HIV-1 BRU, HIV-2 ROD, HIV-2 EHO und SIV-mac infizierten Zellen, markiert mit [³H]-Glucosamin (Figur 5) getestet. Diese Tests wurden parallel mit typischen Humanseren, die spezifisch für HIV-1 und HIV-2 waren durchgeführt. Anti-gp300 polyklonale Antikörper immunpräzipitierten gp300, gp14o, gp12s und gp80 von HIV-2 ROD mit ähnlicher Affinität wie das HIV-2 positive humane Serum. Im Gegensatz hierzu erkannten Anti-gp300 Antikörper keine der Hüll-Glycoproteine von HIV-2 EHO (Figur 5, Abschnitte ROD und EHO). Jedoch diese letzteren (gp270, gp120, gp100 und gp80) wurden von einem typischen HIV-2 positiven Humanserum immunpräzipitiert. Diese Beobachtungen weisen auf das Vorliegen ähnlicher und einiger unterschiedlicher Epitope sowohl in den extrazellulären als auch den Transmembran-Regionen der Hüll-Glycoproteine von HIV-2 EHO hin (Figur 5, Abschnitte ROD und EHO).
• Anti-gp300-Antikörper erkannten keine HIV-1-Hüll-Glycoproteine. Der Vorläufer pg160 und das extrazelluläre Glycoprotein gp120 wurden, wie erwartet, vom HIV-1 spezifischen Humanserum immunpräzipitiert (Figur 5, Abschnitt HIV-1). Interessanterweise immunpräzipitierten Anti-gp300- Antikörper SIV-mac-Hüll-Glycoproteine: Den Hüllvorläufer gp140, das Vorläufer-Dimer gp300 und das extrazelluläre Glycoprotein gp13o. Diese SIV- mac-Glycoproteine werden auch vom HIV-2 spezifischen Humanserum immunpräzipitiert (Figur 5, Abschnitt SIV-mac). Die Reaktivität der Antigp300-Antikörper mit Hüll-Glycoproteinen sowohl von HIV-2 ROD und SIV-mac aber nicht mit solchen von HIV-2 EHO, bestätigt die wichtige Homologie zwischen HIV-2 ROD und SIV-mac und legt auch nahe, daß HIV-2 EHO zu einem Subtyp von HIV-2 gehört, der durch seine geringere Homologenität gegen sowohl HIV-2 ROD als auch SIV-mac unterschieden werden könnte.
• Anti-gp300-Antikörper zusammen mit HIV-2 und und HIV-1 spezifischen humanen Seren wurden in einem Immun-Blot-Test mit Extrakten von HIV-1 BRU, HIV-2 ROD und HIV-2 EHO infizierten Zellen (Figur 6) verwendet. Das HIV-2 positive Serum identifizierte in hohem Maße gp300, gp140 und gp80 von HIV-2 ROD, und gp270, gp120 und gp80 von HIV-2 EHO, zeigte jedoch keine Reaktivität mit Hüll-Glycoproteinen von HIV-1 (Figur 5, Abschnitt Serum HIV-2; 10 % Polyacrylamid-Gel). Die schwache Affinität dieses Serums mit dem extrazellulären Glycoprotein von HIV-2 beruht wahrscheinlich auf der niedrigen Reaktivität mit dem denaturierten Protein, da dieses selbe Serum gp125 (ROD) und gp100 (EHO) unter nativen Bedingungen des Immunpräzipitations-Tests erkennen konnte (Figur 5). Anti-gp300-Antikörper identifizierten in hohem Maße das gesamte Hüll-Glycoprotein von HIV-2 ROD (gp300, gp140, gp125 und gp80), zeigte jedoch keine Reaktivität mit den entsprechenden Hüll-Glycoproteinen von HIV-2 EHO noch mit den Proteinen von HIV-1 (Figur 6, Abschnitt Anti-gp300; 7,5 % Polyacrylamid-Gel). Es wurde gefunden, daß die Reaktivität von Anti-gp300-Antikörpern mit dem 60 kDa- Protein nicht spezifisch war, da sie in Zellextrakten unabhängig von der Virusinfektion beobachtet wurde. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, daß Anti-gp300-Antikörper nicht mit Hüll-Glycoproteinen von HIV-2 EHO weder in nativer noch denaturierter Form reagieren.
• Vergleiche der durch Immun-Blot-Analyse und der Immunpräzipitations- Tests erhaltenen Ergebnisse (Figuren 5 und 6) zeigen, daß ein Patientenserum und Anti-gp300-polyklonale Antikörper die denaturierte Form von gp80 besser als seine native Form erkennen. Die native Form dieses Transmembran-Glycoprotein-Dimers hat möglicherweise eine Konformation, die die von diesen verschiedenen Antikörpern identifizierten Epitope maskiert.
DIE KREUZ-REAKTIVITÄT EINES HIV-1 POSIVITEN SERUMS MIT DENATURIERTEN HÜLL-GLYCOPROTEINEN VON HIV-2 ROD ABER NICHT MIT HIV-2 EHO.
• In diesen Experimenten wurde ein HIV-1 positives humanes Serum verwendet, dem ein Immunpräzipitations-Test eine Spezifität gegenüber HIV-1 zellulärem Hüll-Glycoprotein gp120 zeigte. In einem Immun-Blot-Test identifizierte dieses Serum gp120 und gaq-Vorläufer PSS und p40. Zusätzlich reagiertes dieses HIV-1 positive Serum stark mit gp300 und gp80 von HIV-2 ROD, wogegen keine Reaktivität mit HIV-2 EHO in Hüll-Glycoproteinen beobachtet wurde (Figur 6, Abschnitt Serum HIV-1; 10 % Polyacrylamid-Gel) Diese Beobachtung weist daraufhin, daß einige Kreuzreaktivität zwischen wenigen HIV-1 positiven Seren und HIV-2-Hüll-Glycoproteinen bestehen könnte. Diese Kreuzreaktivität scheint gegen die dimeren Formen der Hülle gerichtet zu sein, d.h. die dimere Form gp300 und des Transmembran- Glycoprotein-Dimers gp80. Die monomere Form des Vorläufers gp140 wurde sehr schwach erkannt von diesem HIV-1 positiven Serum, wogegen das extrazelluläre Glycoprotein gp150 überhaupt nicht erkannt wurde. Daher erschien die Vermutung naheliegend, daß HIV-1 positives Serum ein Epitop in der Transmembran-Region des HIV-2 ROD -Hüll-Glycoproteins erkannte, und für diese Interaktion sowohl Denaturierung als auch Dimerisierung erforlderlich war. Diese Ergebnisse betonen die antigenen Unterschiede zwischen den Hüll- Glycoproteinen von HIV-2 ROD und EHO.
• Die folgende Tabelle 1 gibt die Ergebnisse des Vergleichs zwischen den verschiedenen Retroviren HIV-1 und HIV-2 eines Isolats des letzteren wieder. Tabelle 1: Vergleich des Molekulargewichts (kDa) viraler Proteine von HIV-1 BRU, HIV-2 ROD, HIV-2 EHO und SIV-mac
• Pr: Vorläufer
• EC gp: Extrazelluläres Glycoprotein
• TM gp: Transmembran-Glycoprotein
• MP: Hauptprotein des Kerns

Claims (8)

1. Immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein gereinigtes Antigen, das aus dem Hüll-Glycoprotein von HIV-2 EHO oder einem Glycoprotein von einer Variante, oder einem Teil des Antigens gebildet ist, oder ein Antigen mit den gleichen immunologischen Eigenschaften, wobei das Antigen von einem humanen HIV-2-positiven Serum erkannt werden kann, welches zur Erkennung der Antigene von HIV-2 ROD in einem Immunpräzipitationstest oder einem Western-Blot-Test in der Lage ist, und wobei das Antigen von Antikörpern, die gegen das Glycoprotein gp300 von HIV-2 ROD gerichtet sind, in einem Immunpräzipitationstest oder einem Western-Blot-Test unter den gleichen Bedingungen nicht erkannt wird.

2. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das gereinigte Antigen von env-Gen kodiert wird und ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 120 kDa, entsprechend dem Hüll-Vorläufer, hat.

3. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin das gereinigte Antigen ein Glycoprotein gp270 entsprechend einer dimären Form von gp120 ist, und daß es ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 270 kDa hat.

4. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das gereinigte Antigen dem reifen Produkt des Vorläufers gp120 entspricht, und das extrazelluläre Hüllprotein gp100 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 100 kDa ist.

5. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das gereinigte Antigen ein Glycoprotein gp36 mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 36 kDa, oder ein Glycoprotein gp80, entsprechend der dimeren Form des gp36 ist.

6. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend eine nicht-glycosylierte Form des Hüll-Glycoproteins von HIV-2 EHO oder eine nicht-glycolysierte Form eines Glycoproteins von einer Variante, oder ein Teil des nicht-glycosylierten Antigens, oder ein Antigen, das durch das Serum eines mit HIV-2 EHO infizierten Patienten erkannt werden kann.

7. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4, die ferner eines oder mehrere der Glycoproteine gp270, gp120, gp180 oder gp36 von HIV- 2 EHO enthält.

8. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die ferner mindestens ein Antigen von HIV-2 ROD, insbesondere Antigene, ausgewählt aus gp300, gp140, gp125, gp80 oder gp36 enthält.