DE68923115T2

DE68923115T2 - Reinigung von Hepatitis-Proteinen.

Info

Publication number: DE68923115T2
Application number: DE68923115T
Authority: DE
Inventors: William Scot Craig; Robert Steven Siegel
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-04-14
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2009-04-15
Also published as: DE68923115D1; EP0337492B1; NO176439B; CA1339792C; US5004688A; JPH01311028A; AU608706B2; AU3277989A; IE891206L; MX166707B; IL89924A0; EP0337492A1; NO176439C; KR890016166A; KR960004707B1; ES2075006T3; DK181589D0; DK181589A; NO891532L; JP2721699B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis B-Oberflächenantigenen aus Pichia pastoris-Hefezellen.
Das Hepatitis B-Virus induziert eine Infektion, die als Hepatitis B bekannt ist. Die chronische Infektion mit dem Virus kann zu Lebercirrhose und Leberkarzinomen führen.
Gegenwärtig gibt es keine Heilungsmöglichkeit für Individuen, die mit dem Hepatitis B-Virus infiziert sind. Daher konzentriert sich die derzeitige medizinische Therapie auf die Prophylaxe durch Impfung.
Der aktive Bestandteil des Vakzins ist ein Polypeptid, das als Hepatitis B-Oberflächenantigen bekannt ist. Dieses Polypeptid tritt natürlicherweise an der Oberfläche des Hepatitis B-Virus auf.
Ein Verfahren zur Herstellung dieses Peptids besteht in der Isolierung aus dem Blut von Individuen, die mit dem Hepatitis B-Virus infiziert sind. Aufgrund der gegenwärtigen Angst vor der Übertragung von Erkrankungen, wie AIDS, über Blutprodukte ist dieses Verfahren jedoch in Mißkredit geraten.
Ein alternatives Verfahren besteht darin, das Hepatitis B-Oberflächenantigen gentechnisch herzustellen. Das Gen für das Hepatitis B-Oberflächenantigen-Polypeptid kann z.B. in eine Hefe, ein Bakterium oder eine Säugerzelle cloniert werden.
Die genetisch veränderte Zelle kann dann so gezüchtet werden, daß das Hepatitis B-Oberflächenantigen-Polypeptid exprimiert und zu Partikeln zusammengesetzt wird.
Obwohl das Hepatitis B-Oberflächenantigen-Polypeptid erfolgreich in rekombinanten Zellen hergestellt werden kann, bestehen noch Probleme bei gegenwärtigen Verfahren, die zur Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle und seiner Reinigung angewandt werden.
Zum Beispiel ist das am häufigsten angewandte Reinigungsverfahren für das Hepatitis B-Oberflächenantigen die Dichtegradientenzentrifugation. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Verwendung großer Mengen an Cäsiumchlorid und Saccharose sowie die Verwendung einer Ultrazentrifuge sowie verschiedener Rotoren entsprechend dem Grad der Reinigung und dem Maßstab, und daher ist dieses Verfahren im Hinblick auf die hohen Kosten nicht geeignet.
Im US-Patent 4 683 293, das am 28. Juli 1987 erteilt wurde, wurde festgestellt, daß lipophile Proteine, wie das Hepatitis B-Oberflächenantigen, das von genetisch modifizierten Stämmen von Pichia pastoris hergestellt wird, selektiv durch die Verwendung eines Lysepuffers mit einem Gehalt an chaotropen Salzen gewonnen werden kann. Ein derartiges Verfahren wird zwar als wesentlicher Fortschritt bei der Reinigung lipophiler Proteine betrachtet; es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an einem Gesamtverfahren, das die Gewinnung von Proteinen, wie dem Hepatitis B- Oberflächenantigen, in einer Form erlaubt, die für die Verwendung bei der Herstellung eines Vakzins geeignet ist.
Es wäre also ein wertvoller Beitrag zu diesem Fachgebiet, ein Gesamtverfahren zu entwickeln, das sich zur Durchführung im großtechnischen Maßstab für die Gewinnung von Hepatitis B-Oberflächenantigen-Partikeln aus Hefezellen in einem Zustand ausreichender Reinheit, so daß die Partikel direkt einem Vakzin einverleibt werden können, eignet.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung von Hepatitis B-Oberflächenantigen-Partikeln in einem Zustand ausreichender Reinheit, so daß die Partikel direkt einem Vakzin einverleibt werden können, und in einer Weise, die für die Durchführung in einem großtechnischen Maßstab geeignet ist, bereitzustellen.
Weitere Aspekte und Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden nachstehend klar.
Erfindungsgemäß ist festgestellt worden, daß die Hepatitis B-Oberflächenantigen-Partikel aus Hefezellen gemäß einem Verfahren gewonnen und gereinigt werden können, das folgende Stufen umfaßt:
a. Lyse der Hefezellen in Gegenwart eines chaotropen Salzes und Abtrennung des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands von dem lysierten Zellpellet;
b. Unterwerfen des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands, der in Stufe (a) erhalten wurde, unter Bedingungen, die geeignet sind, Lipide und verunreinigende Proteine aus dem Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstand auszufällen, und Entfernung des ausgefällten Rückstands von dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand;
c. Unterwerfen des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands, der in Stufe (b) erhalten wurde, einer Einengung und Diafiltration;
d. Kontaktieren des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Retentats, das in Stufe (c) erhalten wurde, mit Siliciumdioxid;
e. Waschen der Nicht-Hepatitis B-Oberflächenantigen-Proteine von dem Siliciumdioxid mit einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8;
f. Elution des Hepatitis B-Oberflächenantigens von dem Siliciumdioxid mit einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 9,5 bis 11,0 und einem Gehalt an Harnstoff, der in einer Konzentration von 0,5 bis 8 molar vorliegt;
g. Unterwerfen der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion, die in Stufe (f) erhalten wurde, einer Gelfiltration mit einem Material mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze, die geeignet ist, die Hepatitis B-Oberflächenantigen-Partikel von Verunreinigungen abzutrennen;
h. Kontaktieren der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion, die in Stufe (g) erhalten wurde, mit einem Anionenaustauschharz; und
i. Elution der Hepatitis B-Oberflächenantigen-Partikel von dem Anionenaustauschharz mit einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für eine beliebige transformierte Hefe, die zur Expression eines Hepatitis B-Oberflächenantigens imstande ist. Repräsentative Beispiele für geeignete transformierte Hefen können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus denjenigen Hefen besteht, die zu den Gattungen Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopis, Pichia und Kluyveromyces gehören. Eine besonders bevorzugte Hefe ist Pichia pastoris.
Typischerweise werden Hefen kultiviert, indem sie auf einer geeigneten Kohlenstoffquelle unter aeroben wäßrigen Fermentationsbedingungen bei Einsatz einer assimilierbaren Stickstoffquelle, von Mineralsalzen und molekularem Sauerstoff bei einem geeigneten pH-Wert und der Steuerung weiterer Parameter, wie sie dem Fachmann bekannt sind, gezüchtet werden. Die genaue Weise, in der die Hefe gezüchtet wird, ist für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht kritisch.
Dem Fachmann ist bekannt, daß Hepatitis B-Virusgenome drei Varianten des Hepatitis B-Oberflächenantigen-Polypeptids bilden. Diese Varianten werden üblicherweise als die S-Form, die pre-S&sub1;-Form und die pre-S&sub2;- Form bezeichnet. Das vorliegende Verfahren eignet sich zur Gewinnung und Reinigung von Partikeln, die aus beliebigen dieser Formen des Polypeptids bestehen, z.B. können die Partikel aus einem Gemisch von Hepatitis B- Oberflächenantigen-Polypeptiden bestehen.
In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Ausdruck Hepatitis B-Oberflächenantigen auf Partikel der S-Form, der pre-S&sub1;-Form und der pre-S&sub2;-Form sowie Gemische davon.
Die erste Stufe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Hefezellen in Gegenwart eines chaotropen Salzes zu lysieren (US-Patent 4 683 293). Typischerweise werden die Zellen durch Homogenisieren in einer Kugelmühle lysiert.
In der vorliegenden Offenbarung bezieht sich der Ausdruck "chaotropes Salz" auf Salze, deren Anionen die Übertragung einer apolaren Gruppe in Wasser begünstigen. Derartige Salze umfassen Verbindungen, die das Thiocyanatanion, Halogenidanionen, wie Iodid und Bromid, und Hypohalitanionen, wie Perchlorat, sowie Kationen, wie Lithium, Calcium und Barium, enthalten.
Repräsentative Beispiele für geeignete chaotrope Salze können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumhypochlorit, Lithiumchlorid, Lithiumbromid, Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumthiocyanat, Harnstoff und dgl. besteht. Kaliumthiocyanat wird gegenwärtig bevorzugt.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß das chaotrope Salz in einer molaren Konzentration von etwa 1 bis etwa 8 vorhanden ist.
Es wird auch bevorzugt, daß das chaotrope Salz gepuffert ist, um einen pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis etwa 8 aufrechtzuerhalten. Wie dem Fachmann bekannt ist, gibt es zahlreiche Puffersysteme, die imstande sind, den pH-Wert in einem Bereich von 6 bis 8 zu halten. Beliebige dieser Puffersysteme, die mit dem gewählten Salz verträglich sind, eignen sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Der gegenwärtig bevorzugte Puffer ist Natriumphosphat.
Gegebenenfalls können Proteaseinhibitoren in dem Medium mit dem chaotropen Salz vorhanden sein. Repräsentative Beispiele für geeignete Proteaseinhibitoren können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Phenylmethylsulfonylfluorid und Diisopropylfluorophosphat besteht.
Typischerweise wird die Lyse der Zellen mit dem chaotropen Salz in einem Temperaturbereich von 0 bis 10ºC durchgeführt, um den proteolytischen Abbau weiter zu minimieren.
Nachdem die Hefezellen lysiert worden sind, wird es gegenwärtig bevorzugt, den Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand von dem lysierten Zellpellet vor einer weiteren Reinigung abzutrennen. Diese Abtrennung kann durch Zentrifugation oder ein beliebiges anderes herkömmliches Verfahren durchgeführt werden.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß das lysierte Zellpellet, das bei der Extraktion mit dem chaotropen Salz erhalten wurde, einer weiteren Waschstufe mit einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 unterworfen wird, um restliche Hepatitis-Oberflächenantigene, die im Zellpellet zurückbleiben, zu minimieren.
Gegebenenfalls kann das gepufferte chaotrope Salz verwendet werden, um das Zellpellet zu waschen.
Nachdem das lysierte Zellpellet gewaschen worden ist, wird es bevorzugt, daß der erhaltene Überstand von den zellulären Bruchstücken, die mit dem lysierten Zellpellet verbunden sind, abgetrennt und mit dem Überstand, der früher erhalten wurde, für eine Reinigung vereinigt wird.
Die nächste Stufe der Reinigung besteht darin, den Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstand Bedingungen zu unterwerfen, die geeignet sind, Lipide und verunreinigende Proteine aus dem Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstand abzutrennen. Ein geeignetes Verfahren, um diese Ausfällung hervorzurufen, besteht darin, den Überstand auf eine Temperatur im Bereich von 45 bis 55ºC und vorzugsweise von 47 bis 50ºC für eine Zeitspanne im Bereich von 10 bis 30 Minuten zu erwärmen.
Ein weiteres geeignetes Verfahren zum Ausfällen der Lipide und verunreinigenden Proteine aus dem Überstand besteht darin, den Überstand in Gegenwart einer Säure zu erwärmen.
Es sollte ausreichend Säure zugegeben werden, so daß der pH-Wert des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands auf einen pH- Wert im Bereich von etwa 5,0 bis etwa 6,0 verringert wird.
Bei der bei dem Verfahren verwendeten Säure kann es sich um eine anorganische oder eine organische Säure handeln. Geeignete Säuren können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure und Ameisensäure besteht.
Die Ansäuerung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von nicht mehr als 30ºC und insbesondere von nicht mehr als 20ºC, d.h. in einem Bereich von 4ºC bis 30ºC und insbesondere von 4ºC bis 20ºC, durchgeführt.
Nach der Ausfällungsstufe wird es bevorzugt, daß die ausgefällten zellulären Komponenten von dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand abgetrennt werden. Dies kann nach einer beliebigen herkömmlichen Trenntechhik, wie Zentrifugation oder Dekantieren, erfolgen.
Wenn ein Ansäuern in der Ausfällungsstufe angewandt wird, dann wird es bevorzugt, daß der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand mit einer ausreichenden Menge an Base behandelt wird, um den pH-Wert zurück in einen Bereich von etwa 6 bis 8 und vorzugsweise auf etwa 6,5 vor der weiteren Reinigung zu bringen.
Die spezielle Base, die verwendet wird, um den pH-Wert zurück auf etwa 6 bis 8 zu bringen, ist bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht kritisch. Repräsentative Beispiele für geeignete Basen können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid und Ammoniumhydroxid besteht.
Die nächste Stufe der Reinigung besteht darin, den Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstand einer Einengung und Diafiltration zu unterwerfen. Die Einengung und Diafiltration sollte mit einer Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze durchgeführt werden, die ausreicht, um ein Durchtreten des Hepatitis B-Oberflächenantigens durch die Membran zu verhindern, die jedoch imstande ist, ein Durchtreten von verunreinigenden Peptiden und Elektrolyten zu erlauben.
Beliebige handelsübliche Membranen zum Einengen mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze im Bereich von 5000 bis 500 000 und vorzugsweise von 75 000 bis 100 000 eignen sich für die Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren.
Es wird auch bevorzugt, daß die Membran zum Einengen verwendet wird, um das chaotrope Salz zu entfernen. Dies kann durch Zugabe von 1 bis 2 Volumina an gepufferter Lösung, die vom chaotropen Salz frei ist und einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 aufweist, zu dem Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstand nach dem anfänglichen Einengen und Wiederholen des Einengens durchgeführt werden.
Jedes zusätzliche gleiche Volumen an Puffer verdünnt die Konzentration des chaotropen Salzes in der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Lösung um einen Faktor von etwa 50 %. Durch diese zusätzlichen Volumina wird also allmählich das chaotrope Salz aus der Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Lösung entfernt.
Die nächste Stufe im Reinigungsschema besteht darin, den Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand einer Adsorptionschromatographie mit Siliciumdioxid zu unterwerfen.
Die Adsorptionschromatographie kann durch ein Säulenverfahren oder durch ein diskontinuierliches Verfahren durchgeführt werden. Das diskontinuierliche Verfahren wird gegenwärtig bevorzugt. Siliciumdioxid, das sich für die Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet, umfaßt teilchenförmiges Siliciumdioxid-hydrat und Siliciumdioxid-anhydrat mit einer verfügbaren Oberfläche im Bereich von etwa 100 m²/g bis 500 m²/g. Ein geeignetes teilchenförmiges Siliciumdioxid ist unter der Warenbezeichnung Aerosil 380 von Degussa Corp., New Jersey, erhältlich,
Bei dem diskontinuierlichen Verfahren wird das teilchenförmige Siliciumdioxid in einer ausreichenden Menge Wasser dispergiert, um eine Siliciumdioxid-Aufschlämmung mit einem Gehalt an 40 bis 60 Gew.-% Siliciumdioxid zu erhalten.
Die Siliciumdioxidaufschlämmung wird anschließend mit dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand in Kontakt gebracht.
Die verwendete Menge an Siliciumdioxid-Aufschlämmung sollte so gewählt sein, daß, wenn die anfängliche Partikelkonzentration > 1 % der gesamten extrahierbaren Proteine aus dem lysierten Zellextrakt beträgt, pro 1 mg an Hepatitis B-Oberflächenantigen-Aktivität, die im Überstand vorhanden ist, 50 bis 100 mg Siliciumdioxid zu dem Überstand gegeben werden. Vorzugsweise werden etwa 60 mg Siliciumdioxid pro 1 mg an vorhandener AUSRIA-Aktivität gegeben, wenn die anfängliche Partikelkonzentration > 1 % beträgt. Wenn die Partikelkonzentration im lysierten Zellextrakt < 1 % beträgt, dann sollte die Siliciumdioxid-Menge proportional zur verringerten Partikelkonzentration erhöht werden.
Der AUSRIA II-Analyse-Reagenzsatz ist im Handel von Abbott Laboratories, Chicago, IL, erhältlich.
Nachdem der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand mit der Siliciumdioxid-Lösung in Kontakt gebracht worden ist, wird es bevorzugt daß das erhaltene Gemisch zusammen für eine Zeitspanne im Bereich von 15 Minuten bis 4 Stunden gerührt wird.
Nachdem die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Lösung in Kontakt mit dem Siliciumdioxid für eine geeignete Zeitspanne belassen worden ist, wird es bevorzugt, daß der Überstand von dem Siliciumdioxidgebundenen Hepatitis B-Oberflächenantigen entfernt wird. Dies kann durch Zentrifugation und Dekantieren oder eine beliebige andere Technik, die herkömmlicherweise angewandt wird, erreicht werden.
Die nächste Stufe der Reinigung besteht in der Entfernung von verunreinigenden Proteinen von dem Siliciumdioxid. Dies kann durch Waschen des Siliciumdioxids mit einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 und vorzugsweise von etwa 7,2 erreicht werden. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind zahlreiche Puffersysteme verfügbar, um den pH-Wert in einem Bereich von 6 bis 8 zu halten. Beliebige dieser Puffersysteme eignen sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Das gegenwärtig bevorzugte Puffersystem ist ein Natriumphosphat- Natriumchlorid-Puffersystem.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß das Siliciumdioxid mehrere Male mit jeweils 5 bis 15 Volumina Puffer gewaschen wird, um die Entfernung der verunreinigenden Proteine sicherzustellen. Eine Art, um die Entfernung von verunreinigenden Proteinen zu überwachen, besteht in der Messung der Extinktion jeder Waschlösung bei 280 nm. Wenn die Extinktion den gleichen unveränderlichen minimalen Wert erreicht, dann ist das Waschverfahren abgeschlossen.
Nachdem die verunreinigenden Proteine von dem Siliciumdioxid entfernt worden sind, kann das Hepatitis B-Oberflächenantigen von dem Siliciumdioxid durch Kontaktieren des Siliciumdioxids mit einem geeigneten Puffer mit einem Gehalt an Harnstoff, der in einer Konzentration von 0,5 bis 3 molar vorliegt, eluiert werden.
Geeignete Puffer weisen einen pH-Wert im Bereich von 9,5 bis 11 auf. Wie dem Fachmann bekannt ist, gibt es zahlreiche Puffersysteme, die imstande sind, den pH-Wert in einem Bereich von 9,5 bis 11 zu halten. Beliebige dieser Puffersysteme eignen sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Gegenwärtig wird ein Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer bevorzugt.
Wenn ein diskontinuierliches Verfahren angewandt worden ist, dann wird es bevorzugt daß 8 bis 12 Volumina des Harnstoff enthaltenden Puffers in Kontakt mit dem Siliciumdioxid für eine Zeitspanne im Bereich von 1 bis 4 Stunden und vorzugsweise von etwa 2 Stunden gebracht werden. Nach dieser Zeitspanne wird der Überstand, der das Hepatitis B-Oberflächenantigen enthält, von dem Siliciumdioxid abgetrennt und für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß das Siliciumdioxid einer weiteren Elution mit 8 bis 12 Volumina an gepuffertem Harnstoff unterworfen wird. Die zusätzlich hergestellten, Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktionen werden mit der früheren Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion vereinigt und der weiteren Reinigung unterworfen.
Wenn das Säulenverfahren angewandt wird, wird eine chromatographische Säule mit teilchenförmigem Siliciumdioxid gepackt, und der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand wird mit der Säule in Kontakt gebracht. Die verunreinigenden Proteine werden von dem Siliciumdioxid mit einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, wie es vorstehend für das diskontinuierliche Verfahren beschrieben wurde, gewaschen. Das Hepatitis B-Oberflächenantigen kann mit einem Harnstoffpuffer mit einem pH-Wert im Bereich von 9,5 bis 11, wie es vorstehend für das diskontinuierliche Verfahren beschrieben wurde, eluiert werden.
Vorzugsweise wird die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion anschließend zusätzlichen Diafiltrationsstufen unterworfen, um den Harnstoff zu entfernen. Es sollte ein Diafiltrationssystem mit einer Membran mit einer solchen Molekulargewichtsgrenze verwendet werden, daß das Hepatitis B-Oberflächenantigen nicht durchtreten kann.
Geeignete Membranen sind Membranen mit einer Molekulargewichtsgrenze im Bereich von 5000 bis 500 000.
Der Harnstoff wird von der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion entfernt, indem die Fraktion wiederholten Diafiltrationen unterworfen wird, wobei währenddessen ein zusätzliches Volumen an keinen Harnstoff enthaltendem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 zu der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion gegeben wird. Durch diese wiederholten Diafiltrationen mit zusätzlichem Puffer wird der Harnstoff in der Lösung allmählich verdünnt.
Die nächste Stufe der Reinigung besteht darin, die Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltende Fraktion einer Gelfiltration zu unterwerfen.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß die Gelfiltration über eine chromatographische Säule durchgeführt wird, die mit einem Agarosegel gepackt worden ist. Weitere geeignete polare Matrices, die verwendet werden können, um die Säule zu packen, können, ohne Beschränkung hieraus, aus der aus Dextrangelen und Polyacrylamidgelen bestehenden Gruppe ausgewählt werden.
Die polare Matrix, die als Packmaterial für die Gelfiltration verwendet wird, sollte eine Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von mindestens einer Million aufweisen.
Vor dem Kontaktieren der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion mit der chromatographischen Säule sollte die Säule vorzugsweise mit einem geeigneten Puffer äquilibriert werden, um zu verhindern, daß das Hepatitis B-Oberflächenantigen an dem Packmaterial adsorbiert wird. Geeignete Puffer weisen einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 auf. Wie dem Fachmann bekannt ist, gibt es zahlreiche Puffer, die imstande sind, einen pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 aufrechtzuerhalten. Beliebige dieser Puffer eignen sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Gegenwärtig wird ein Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-chlorid-Puffer (Tris-Puffer) bevorzugt.
Nachdem die Säule äquilibriert worden ist, sollte die Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltende Fraktion mit dem Packmaterial in der Säule in Kontakt gebracht werden.
Der bei der Äquilibrierung der Säule verwendete Puffer wird auch beim Eluieren sowohl der verunreinigenden Proteine als auch der Hepatitis B-Oberflächenantigene von der Säule verwendet.
Wie dem Fachmann bekannt ist, treten die Moleküle mit dem größten Molekulargewicht zuerst durch die Säule, wobei die kleineren Moleküle folgen. Die Säule sollte kontinuierlich mit einem geeigneten Puffer gewaschen werden, bis die Hepatitis B-Oberflächenantigene eluiert worden sind.
Das Vorhandensein von Hepatitis B-Oberflächenantigen im Eluat kann durch Gelelektrophorese oder durch einen beliebigen handelsüblichen Analyse-Reagenzsatz, der für Hepatitis B-Oberflächenantigen empfindlich ist, nachgewiesen werden. Ein geeigneter Reagenzsatz ist AUSRIA II, der von Abbott Laboratories erhältlich ist.
Diejenigen Fraktionen, die ein positives Testergebnis im Hinblick auf Hepatitis B-Oberflächenantigene zeigen, werden vereinigt und wahlweise einem Einengen unterworfen. Eine geeignete Maßnahme zum Einengen ist die Ultrafiltration.
Die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktionen werden anschließend einer weiteren Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie unterworfen. Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß die Reinigung mit einem Anionenaustauschliganden durchgeführt wird. Der gegenwärtig bevorzugte Anionenaustauschligand ist ein Diethylaminoethylkation.
Wie dem Fachmann bekannt ist, wird der Anionenaustauschligand in ein Polyacrylamidgel-Harz oder ein Kohlenhydrat-Polymer-Harz, wie Cellulose oder Dextran, eingeführt, und die chromatographische Säule wird mit diesem Material gepackt. Die Säulenanordnung kann, ohne Beschränkung hierauf, einen herkömmlichen, senkrechten Strom oder einen radialen Strom aufweisen. Cellulose ist das gegenwärtig bevorzugte Harz.
Vor dem Kontaktieren der Hepatitis B-Oberflächenantigene mit dem Anionenaustauschharz sollten die Harze mit einem geeigneten Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 äguilibriert werden.
Zahlreiche Puffer sind imstande, den pH-Wert in diesem Bereich zu halten. Beliebige dieser Puffer eignen sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Gegenwärtig bevorzugt wird ein Tris-chlorid-Puffer.
Nach dem Äquilibrieren sollten die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktionen mit dem Anionenaustauschharz in Kontakt gebracht werden.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß die Hepatitis B-Oberflächenantigene von dem Anionenaustauschharz durch lineare Gradientenelution eluiert werden. Dies kann durch eine lineare Änderung der Ionenstärke oder eine lineare Änderung des pH-Wertes erreicht werden. Zunächst wird die Säule mit einem Puffersystem gewaschen, das mit dem in der Äquilibrierungsstufe verwendeten Puffersystems identisch ist. Allmählich wird die Lösungsmittelzusammensetzung durch Einführen eines Elektrolyten in das Puffersystem und allmähliche Erhöhung der Konzentration des Elektrolyten bis auf eine Molarität von etwa 0,3 molar verändert.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß es sich bei dem Elektrolyten um Natriumchlorid handelt, wobei andere Elektrolyten jedoch in gleicher Weise wirksam sind.
Es wird gegenwärtig bevorzugt, daß die verschiedenen Fraktionen, die als Ergebnis der Gradientenelution erhalten werden, auf den Gehalt an Hepatitis B-Oberflächenantigen untersucht werden. Dies kann in der gleichen Weise geschehen, in der das ausströmende Medium aus der Gelfiltration untersucht wurde.
Diejenigen Fraktionen, die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthalten, werden vereinigt. Gegebenenfalls können die erhaltenen vereinigten Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktionen durch Ultrafiltration eingeengt werden.
Das nach der vorstehend erläuterten Reinigung erhaltene Hepatitis B-Oberflächenantigen weist nun mindestens einen solchen Reinheitsgrad auf, daß es direkt einem Vakzin einverleibt werden kann.
Das nachstehende Beispiel wird vorgelegt, um die Vorteile der Erfindung weiter zu erläutern. Es sollte jedoch nicht dahingehend mißverstanden werden, daß es die Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt.

Beispiel I

Dieses Beispiel zeigt die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung bei der Reinigung von Hepatitis B-Oberflächenantigenen, die in transformierten Pichia Pastoris-Kulturen hergestellt worden sind.
Eine Kultur von Pichia pastoris-Zellen (GS115; NRRL Y-15851) wurde mit einem Vektor pBSAGI5I (erhältlich in einem E. coli-Wirt vom Northern Regional Research Center of the U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, mit der Hinterlegungs-Nr. NRRLB-18021) transformiert.
Diese Kulturen von Pichia pastoris wurden nach herkömmlichen Techniken bis zu einer Zelldichte von 264 g/l Naßgewicht fermentiert.
1900 ml der Fermentationsbrühe wurden dem Fermentationsbehälter entnommen. Diese Fermentationsbrühe wurde bei 8500 U/min (RCF bei rMittel=7700) für ungefähr 10 Minuten zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde verworfen.
Ein chaotroper Puffer wurde für die Extraktionsstufe hergestellt, der Kaliumthiocyanat in einer Konzentration von 3 molar und Natriumphosphat in einer Konzentration von 10 millimolar enthielt. Ein Proteaseinhibitor, nämlich Phenylmethylsulfonylfluorid, wurde in einer Konzentration von 1 millimolar zugegeben. Der erhaltene Puffer wies einen pH-Wert von 7,5 auf.
Die Lysestufe wurde durch Bewegen von 500 g Zellen aus dem Pellet in 1500 ml des chaotropen Puffers in Gegenwart von 500 ml Glaskügelchen von 0,5 mm in einer Kugelmühle durchgeführt.
Das Zellen-Kügelchen-Gemisch wurde 15 Minuten bei 12 500 U/min (RCF bei rMittel = 16 000) zentrifugiert. Der Überstand wurde von dem Zellen-Kügelchen-Gemisch durch Dekantieren abgetrennt und für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Das Zellen-Kügelchen-Gemisch wurde anschließend einer weiteren Waschstufe mit 1000 ml chaotropem Puffer unterworfen. Der erhaltene Überstand wurde anschließend von dem Zellen-Kügelchen-Gemisch abgetrennt und für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Die Extraktion mit einem chaotropen Salz wurde bei einer Temperatur von 4ºC durchgeführt. Alle weiteren Reinigungsstufen wurden ebenfalls bei 4ºC durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Dieses erfolgte, um den proteolytischen Abbau zu minimieren.
Die Überstände wurden vereinigt und einer Ausfällung durch Erwärmen des Überstands auf Raumtemperatur in einem Wasserbad unterworfen. Sobald der Überstand Raumtemperatur angenommen hatte, wurde 1 n Phosphorsäure zu dem Überstand in einer Menge gegeben, um den pH-Wert des Überstands von 7,5 auf 5 zu verringern. Die Lösung wurde dann ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Während dieser Zeit fielen verunreinigende Proteine und Lipide aus dem Hepatitis-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand aus.
Der Überstand wurde auf 4ºC gekühlt und 15 Minuten bei 12 500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, um ihn von den ausgefällten Bruchstücken abzutrennen.
Der pH-Wert des Überstands wurde anschließend durch Zugabe von 1 n Natriumhydroxid auf 6,5 erhöht.
Zu diesem Zeitpunkt hatte man 3120 ml Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand. Ein AUSRIA II-Assay wurde durchgeführt. Dieser Assay zeigte, daß 236 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen im Überstand vorhanden waren. Dies stellt eine Gewinnung von 80,5 % dar.
Die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Lösung wurde anschließend einem Einengen und einer Diafiltration mit einem Amicon-Hohlfaser-Ultrafiltrationssystem mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 100 000 unterworfen.
Nach dem anfänglichen Einengen auf ungefähr 0,5 l wurde 1 l Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 zu dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde einer weiteren Einengung unterworfen. Dies wurde zweimal wiederholt, bis das Kaliumthiocyanat in der Lösung verdünnt war.
Nachdem das Kaliumthiocyanat aus dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand durch Diafiltration entfernt worden war, wurde ein weiterer AUSRIA II-Assay für die 405 ml Retentat durchgeführt. Dieser Assay zeigte, daß 231 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen vorhanden waren, was eine Gewinnung von 78,8 % darstellt.
Der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand wurde anschließend in einem diskontinuierlichen Verfahren an Siliciumdioxid mit einer verfügbaren Oberfläche von 380 m²/g gebunden.
Dies wurde auffolgende Weise durchgeführt. Zuerst wurde trockenes Siliciumdioxid mit destilliertem Wasser zu einer 50 %-igen Aufschlämmung (Trockengewicht/Volumen) verarbeitet. Dies ergab ein Gemisch mit 50 mg Siliciumdioxid pro ml Aufschlämmung.
275 ml der Siliciumdioxid-Aufschlämmung wurden zu dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden langsam bei Raumtemperatur gerührt.
Das Hepatitis-Siliciumdioxid-Gemisch wurde anschließend auf 4ºC gekühlt und 15 Minuten bei 5000 U/min (RCF bei rMittel = 2500) zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde verworfen.
Das Siliciumdioxid wurde anschließend mit 500 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 und einem Gehalt an 0,15 molar NaCl gewaschen. Die Waschlösung wurde verworfen. Diese Waschstufen mit Phosphatpuffer wurden fortgesetzt, bis die Extinktion bei 280 nm des Überstands einen minimalen unveränderlichen Wert erreichte.
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde dann von dem Siliciumdioxid mit einem Puffer mit einem Gehalt an 25 millimolar Natriumcarbonat, 25 millimolar Natriumbicarbonat und 1 molar Harnstoff eluiert. Der schließliche pH-Wert des Puffers betrug 10.
Das Hepatitis-Antigen-Siliciumdioxid-Gemisch wurde in 500 ml Harnstoffpuffer gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die gepufferte Harnstofflösung, die Siliciumdioxid/Hepatitis enthielt, wurde auf 4ºC gekühlt und 15 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Das Siliciumdioxid wurde anschließend mit einem zweiten Volumen von 500 ml Harnstofflösung, die in der gleichen Weise wie beim ersten Mal gepuffert war, verdünnt. Der erhaltene Überstand wurde mit dem ersten Überstand vereinigt und einer Eineng- und Diafiltrationsstufe unterworfen, um den Harnstoff zu entfernen.
Zu diesem Zeitpunkt wurde der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand einem Einengen mit einem Amicon-Hohlfilter-Diafiltrationssystem mit einer Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 100 000 unterworfen.
Nach diesem ersten Einengen auf ungefähr 100 ml wurden 200 ml 10 millimolar Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 zu dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand gegeben, der einem weiteren Einengen unterworfen wurde. Diese Stufe hatte die Wirkung des Verdünnens des Harnstoffs. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, was die Wirkung hatte, daß 89 % des Harnstoffs aus der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion entfernt wurden.
Nach der Diafiltration wurde die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion 15 Minuten bei 16 000 U/min zentrifugiert.
Zu diesem Zeitpunkt wurde ein AUSRIA II-Assay durchgeführt. Der Assay zeigte, daß 234 mg Hepatitis-Antigen vorhanden waren, was einer Gewinnung von 64,5 % entspricht.
Der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand wurde anschließend einer Gelfiltration unterworfen.
Es wurde eine handelsübliche Sepharose CL4B-Größenausschlußsäule verwendet. Diese Säule wies ein Volumen von 2 l auf und war mit einem Agarosegel mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von 20 x 10&sup6; gepackt.
Die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion wurde dann in Kontakt mit dieser Säule gebracht. Das Hepatitis-Antigen wurde von der Säule mit 25 millimolar Tris-chlorid mit einem pH-Wert von 8 eluiert.
Die Fraktionen wurden so gesammelt, wie sie von der Säule eluiert wurden, und auf ihren Gehalt an Hepatitis B-Oberflächenantigen untersucht. Die Fraktionen mit Hepatitis B-Oberflächenantigen-Aktivität (auf der Grundlage einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese-Analyse) wurden vereinigt und für die weitere Reinigung aufbewahrt. Bei dem verwendeten Assay handelte es sich um den AUSRIA II-Assay, der im Handel von Abbott Labs. erhältlich ist.
Die vereinigten Fraktionen wiesen eine Gesamtaktivität an 170 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen auf, was einer Gewinnung von 63,1 % entspricht.
Diese vereinigte Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion wurde dann unter Verwendung eines Amicon YM 30-Filters eingeengt.
Die eingeengte Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion wurde anschließend einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen.
Die Ionenaustauschchromatographie wurde über eine Säule durchgeführt, bei der ein Diethylaminoethylkation verwendet wurde, das an eine Celluloseträgermatrix gebunden war. Diese Säule wurde mit Tris-chlorid- Puffer mit einem pH-Wert von 8 äquilibriert.
Nach dem Äquilibrieren des Harzes wurde die vereinigte Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion in Kontakt mit dem chromatographischen Ionenaustauschharz gebracht.
Das Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde anschließend von dem Harz durch lineare Gradientenelution unter Verwendung eines Tris-chlorid- Puffers mit einem pH-Wert von 8 und einer Natriumchlorid-Konzentration, die von 0 bis 0,3 molar variierte, eluiert.
Die Fraktionen wurden so gesammelt, wie sie von der chromatographischen Säule eluiert wurden, und sie wurden auf Hepatitis B-Oberflächenantigene untersucht, wie es vorstehend beschrieben wurde. Proben der Fraktionen, die eine Hepatitis B-Oberflächenantigen-Aktivität zeigten, wurden anschließend einem Anfärben mit Silber unterworfen, und die erhaltenen Gele wurden analysiert, um das Vorhandensein und die Reinheit des Hepatitis B-Oberflächenantigens zu bestätigen.
Die Fraktionen, die Hepatitis B-Oberflächenantigen aufwiesen, wurden vereinigt. Ein weiterer AUSRIA II-Assay wurde durchgeführt und zeigte, daß 63 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen vorhanden waren, was eine Gewinnung 42 % darstellt. Das Produkt war zu ungefähr 95 % rein.
Die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Lösung wurde anschließend durch einen Filter mit 0,2 um filtriert und bei -70ºC gelagert.
Dieses Beispiel zeigt also, daß Hepatitis B-Oberflächenantigen- Proteine aus Hefezellen gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen werden können.
Dieses Beispiel wurde lediglich vorgelegt, um die Ausführung der Erfindung zu erläutern, und es sollte nicht dahingehend verstanden werden, daß es den Schutzumfang der Erfindung oder der beigefügten Ansprüche in irgendeiner Weise beschränkt.
Vernünftige Variationen und Modifizierungen, die nicht vom Wesen und Geist der Erfindung abweichen, werden als zum Umfang des gewünschten und gesuchten Patentschutzes gehörend betrachtet.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Hepatitis B-Oberflächenantigen aus Pichia pastoris-Zellen, das die folgenden Stufen umfaßt:

a) Lyse der Pichia pastoris-Zellen in Gegenwart eines gepufferten chaotropen Salzes, wobei das chaotrope Salz unter Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natriumhypochlorit, Lithiumchlorid, Lithiumbromid, Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumthiocyanat und Harnstoff ausgewählt ist, wobei das chaotrope Salz in einer Konzentration von 1 bis 8 molar vorhanden ist, und wobei das chaotrope Salz durch ein Puffersystem mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 gepuffert ist, und Abtrennen des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands von den lysierten Zellen;

b) Unterwerfen des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands, der in Stufe a) erhalten wurde, unter Bedingungen, die geeignet sind, die Lipide und verunreinigenden Proteine aus dem Überstand auszufällen;

c) Unterwerfen des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstands, der in Stufe b) erhalten wurde, einer Diafiltration, wobei die Diafiltration mit einer Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze im Bereich von 5000 bis 500 000 durchgeführt wird;

d) Kontaktieren des Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Retentats, das in Stufe c) erhalten wurde, mit Siliciumdioxid, wobei das Siliciumdioxid eine verfügbare Oberfläche im Bereich von 100 bis 500 m²/aufweist und wobei, wenn die anfängliche Partikelkonzentration ≥ 1 % der gesamten extrahierbaren Proteine aus dem lysierten Zellextrakt beträgt, pro 1 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen-Aktivität, die in dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand vorhanden ist, 50 bis 100 Siliciumdioxid verwendet werden, und wobei, wenn die anfängliche Partikelkonzentration < 1 % der gesamten extrahierbaren Proteine aus dem lysierten Zellextrakt beträgt, pro 1 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen-Aktivität, die in dem Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Überstand vorhanden ist, ein entsprechend proportionaler Anstieg des Siliciumdioxids von einer Basis von 50 bis 100 mg Siliciumdioxid pro 1 % verwendet wird;

e) Waschen verunreinigender Proteine von dem erhaltenen, an Siliciumdioxid adsorbierten Hepatitis B-Oberflächenantigen mit einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8;

f) Elution des Hepatitis B-Oberflächenantigens von dem Siliciumdioxid mit einem gepufferten Elutionsmittels mit einem pH-Wert im Bereich von 9,5 bis 11,0, das 0,5 bis 8 molar Harnstoff enthält;

g) Unterwerfen der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion, die in Stufe f) erhalten wurde, einer Gelfiltrationsstufe, um das Hepatitis B-Oberflächenantigen von verunreinigenden Proteinen abzutrennen, wobei die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion einer Gelfiltration über eine polare Matrix unterworfen wird, die unter Agarosegelen, Dextrangelen und Polyacrylamidgelen ausgewählt ist, und wobei die polare Matrix einen Molekulargewichtsausschluß von mindestens 1 Million aufweist und das Hepatitis B-Oberflächenantigen durch die polare Matrix mit einem Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 eluiert wird; und

h) Unterwerfen der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Fraktion, die in Stufe g) erhalten wurde, einer Anionenaustauschchromatographiestufe, um das Hepatitis B-Oberflächenantigen von verunreinigenden Proteinen abzutrennen, wobei die Ionenaustauschchromatographie mit einem Anionenaustauschharz unter Verwendung eines Diethylaminoethylkat ions durchgeführt wird und wobei das Hepatitis B-Oberflächenantigen von dem Anionenaustauschharz unter Verwendung eines Puffers mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 und einer Elektrolytkonzentration im Bereich von 0 bis 0,3 molar eluiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pichia pastoris-Zellen durch Aufbrechen mit Glaskügelchen lysiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch l oder 2, wobei die Ausfällung von Lipiden und verunreinigenden Proteinen durch Erwärmen des Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstands auf eine Temperatur im Bereich von 45 bis 55ºC für eine Zeitspanne im Bereich von 10 bis 30 Minuten bewirkt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Ausfällung der Lipide und verunreinigenden Proteine bewirkt wird, indem die Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltende Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 4 bis 30ºC gehalten wird und eine ausreichende Menge an Säure, um den pH- Wert des Überstands auf einem Bereich von 4,5 bis 5,5 zu senken, zugegeben wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Säure unter Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure und Ameisensäure ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei nach der Ausfällung eine ausreichende Menge an Base zugegeben wird, um den pH-Wert des Hepatitis B- Oberflächenantigen enthaltenden Überstands auf einen Bereich von 6 bis 8 zu erhöhen.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Siliciumdioxid als eine Siliciumdioxid-Aufschlämmung mit einem Gehalt an 40 bis 60 Gew.-% Siliciumdioxid vorliegt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei

(a) die Pichia Pastoris-Zellen in Gegenwart eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von etwa 7,5 und einer Kaliumthiocyanat-Konzentration von etwa 3 molar lysiert werden;

(b) die Ausfällung bei einer Temperatur von etwa 20ºC in Gegenwart von Phosphorsäure mit einer Konzentration, die ausreicht, um den pH-Wert auf etwa 5,0 zu senken, durchgeführt wird.

(c) nach der Ausfällung eine ausreichende Menge an Natriumhydroxid zugegeben wird, um den pH-Wert der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltenden Lösung auf etwa 6,5 zu erhöhen;

(d) der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand mit einer Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von etwa 100 000 und in Gegenwart eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von etwa 7,5 diafiltriert wird;

(e) der Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Überstand mit einer ausreichenden Menge an etwa 50 Gew.-% Siliciumdioxid-Aufschlämmung in Kontakt gebracht wird, so daß pro 1 mg Hepatitis B-Oberflächenantigen- Aktivität, die in dem Überstand vorhanden ist, 60 mg Siliciumdioxid verwendet werden;

(f) die verunreinigenden Proteine von dem Siliciumdioxid mit einem phosphatgepufferten Kochsalzlösungs-Puffersystem mit einem pH-Wert von etwa 7 und einem Gehalt an etwa 0,15 molar NaCl gewaschen werden;

(g) das Hepatitis B-Oberflächenantigen von dem Siliciumdioxid mit einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 10,1 und einer Harnstoff-Konzentration von etwa 1 molar eluiert wird;

(h) die Hepatitis B-Oberflächenantigen enthaltende Fraktion, die in Stufe (g) erhalten wurde, einer Diafiltration über eine Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von etwa 100 000 in Gegenwart eines Tris-chlorid-Puffers mit einem pH-Wert von etwa 8 unterworfen wird;

(i) die Gelfiltration über ein Agarosegel mit einem Molekulargewichtsausschluß von etwa 20 x 10&sup6; durchgeführt und das Hepatitis B-Oberflächenantigen durch das Agarosegel mit einem Tris-chlorid-Puffer mit einem pH-Wert von etwa 8 eluiert wird;

(j) die Anionenaustauschchromatographie mit einem Diethylaminoethylkation durchgeführt und das Hepatitis B-Oberflächenantigen von dem Kation mit einem Tris-chlorid-Puffer mit einer Natriumchlorid-Konzentration im Bereich von 0 bis 0,3 molar eluiert wird.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei den Pichia pastoris-Zellen um Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851), transformiert mit pBSAGI5I (NRRLB-18021), handelt.