DE68919395T2

DE68919395T2 - Bestimmungsverfahren.

Info

Publication number: DE68919395T2
Application number: DE68919395T
Authority: DE
Inventors: Robert Ashworth; Michael Flanagan
Original assignee: ARS HOLDING 89 NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1988-03-29
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1995-04-20
Anticipated expiration: 2009-03-29
Also published as: AU3361889A; DE68919395D1; NO894744D0; EP0359807B1; AU632477B2; NO176293B; WO1989009408A1; NO176293C; JP2571971B2; ATE114192T1; EP0359807A1; GB8807488D0; CA1332206C; NO894744L; JPH03501294A

Description

Die Erfindung betrifft Assaytechniken und Mittel zur Durchführung solcher Techniken. Insbesondere betrifft sie eine verbesserte Assaytechnik, die ein verbessertes Signal:Rausch-Verhältnis und eine verbesserte Empfindlichkeit gewährleistet.
Fluoreszenzassays, beispielsweise Fluoreszenz-Immunoassays, bei denen eine Assaykomponente auf der Grenzfläche eines Hohlleiters immobilisiert ist, führten zu dem Problem der Unterscheidung zwischen der Fluoreszenzemission aus einem markierten weiteren Assayreagenz, das an die Oberfläche gebunden ist (das benötigte Signal) und der Fluoreszenzemission aus dem weiteren Reagenz, das noch in Lösung ist und ein unerwünschtes Hintergrundsignal ergibt.
Eine größere Differenzierung zwischen diesen zwei Populationen von gebundenem und nichtgebundenem Reagenz würde das Signal: Rausch-Verhältnis und die Empfindlichkeit des Assays verbessern.
Die nachstehend beschriebene Erfindung verwendet die Eigenschaften des abklingenden Feldes von optischen Hohlleitern in Kombination mit einer Stufe der Übertragung der Resonanzenergie [Forster Energy Transfer] zwischen einem Fluorophor, das an ein Reagenz X, auf oder neben einem immobilisierten Nachweisreagenz Y, beispielsweise einem Antikörper, gebunden ist, und in einigen Fällen Farbstoffen, die auf einem Hohlleiter immobilisiert sind, oder in einem immobilisierten Filmträger vorhanden sind.
Die Unterscheidung zwischen gebundenen und freien Reagenzien in homogenen Assays dieses Typs wird erzielt, weil der Energietransfer nur effizient über Moleküldimensionen eintritt und daher nur bei Komplexbildung beobachtet wird. Bekannte abklingende Hohlleiterassays beruhen auf der Annahme, daß die Durchdringung der abklingenden Welle jenseits der Moleküldimensionen vernachlässigbar ist und daher nur den Marker auf dem Komplex anregt. Jedoch ist in der Realität diese Annahme eine zu starke Vereinfachung, und die Empfindlichkeit solcher Assays ist geringer als man annehmen würde.
Die EP-A-211 587 beschreibt einen dielektrischen Hohlleiter-Sensor zur Verwendung bei spektrophotometrischen Assays von Hohlleitern in Flüssigkeiten. Dieser Hohlleiter besitzt einen Kern mit einem Brechungsindex, der größer als der Brechungsindex der Flüssigkeit ist. Ein Dotierungsmittel ist in dem Kern vorhanden, das durch eine primäre Signalstrahlung, die von dem Analyten emittiert wird, angeregt werden kann, so daß eine zweite Signalstrahlung emittiert wird, die durch Messen des Hohlleiterkerns nachgewiesen wird. Der Hohlleiter ist so ausgerichtet, daß der gebundene Analyt durch eine abklingende Welle, die aus den Schwingungen der elektromagnetischen Strahlung, die entlang des Hohlleiterkerns fortgepflanzt wird, auftritt, angeregt wird.
Die EP-A-242 527 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Analyten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Komplex, umfassend den Analyten und eine Bindungseinheit, bildet. Die Bindungseinheit umfaßt ein Erkennungssegment und einen ersten Partner eines Energietransfersystems. Der Komplex wird nachher mit einer Aufzeichnungseinheit unter Bildung einer Einheit in Kontakt gebracht, wobei die Aufzeichnungseinheit einen zweiten Partner des Energietransfersystems umfaßt. Die Einheit wird direkt mit Energie, die nur von einem der Partner absorbiert werden kann, bestrahlt. Dieser Partner emittiert die Fluoreszenzenergie, von der ein Teil von dem anderen der Partner absorbiert wird. Dieser fluoresziert ebenfalls, aber bei einer größeren Wellenlänge als der erste Partner und möglicherweise auch für eine längere Zeitdauer, was den Nachweis des Vorhandenseins des Analyten ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß einem Gesichtspunkt ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe umfassend
A) gleichzeitiges Inkubieren oder Inkubieren in irgendeiner gewünschten Reihenfolge
(a) der Probe,
(b) eines mit einem ersten Energieakzeptor markierten Reagenzes X,
(c) eines direkt oder indirekt auf der Oberfläche eines optischen Hohlleiters immobilisierten Reagenzes Y,
(d) eines direkt oder indirekt (gegebenenfalls über das Reagenz Y) auf der Oberfläche des optischen Hohlleiters immobilisierten zweiten Energieakzeptors,
(e) gegebenenfalls mindestens eines weiteren Energieakzeptors, der dem ersten oder zweiten Energieakzeptor gleich oder verschieden davon sein kann, der direkt oder indirekt auf oder innerhalb der Oberfläche des optischen Hohlleiters immobilisiert ist, wobei eines der Reagenzien X und Y einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden umfaßt, und das andere der Reagenzien X und Y entweder ein Ligandenanalogon oder einen spezifischen Bindungspartner des Liganden umfaßt, und worin einer des ersten oder zweiten Energieakzeptors einen Fluorophor (ein "Donorfluorophor") umfaßt, dessen Elektronenemissionsspektrum mit dem Elektronenabsorptionsspektrum des anderen des ersten und zweiten Energieakzeptors überlappt,
(B) elektromagnetisches Bestrahlen des optischen Hohlleiters mit einer zur Anregung des Donorfluorophors geeigneten Wellenlänge, und
(C) Nachweisen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit der Resonanzenergietransfer entweder direkt oder indirekt zwischen dem ersten und zweiten Energieakzeptor bzw. zwischen dem zweiten und ersten Energieakzeptor eintritt, wobei entweder das Bestrahlen von Stufe (B) mittels des abklingenden Felds, das durch elektromagnetische Strahlung, die sich entlang des Hohlleiters fortpflanzt, durchgeführt wird, und/oder bei der Nachweisstufe (C) die Kopplung des abklingenden Feldes in den Hohlleiter der Fluoreszenz des ersten Energieakzeptors oder - sofern vorhanden - der Fluoreszenz des zweiten Energieakzeptors verwendet wird. Der hier verwendete Ausdruck "Liganden-Analogon" bezieht sich auf ein Teilchen mit der Fähigkeit zur Komplexbildung mit der gleichen Bindungsstelle des gleichen spezifischen Bindungspartners wie der nachzuweisende Ligand und umfaßt unter anderem eine bekannte Menge des nachzuweisenden Liganden.
Der hier verwendete Ausdruck "Energieakzeptor" bezeichnet eine Verbindung, die elektromagnetische Energie absorbieren kann, beispielsweise einen Farbstoff oder einen Fluorophor. Typische Energieakzeptoren umfassen beispielsweise diejenigen der Cumarin-, Fluorescein-, Lucifer-Gelb- und Rhodamin-Familien, Phycobiliproteine und Erythrosin: Spezifische Beispiele für Energieakzeptoren umfassen Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin-B, Rhodamin- 6G Rhodamin-123, R-Phycoerythrin, c-Phycocyanin, Allophycocyanin, Fluorescamin, Lucifer-Gelb-VS und Lucifer-Gelb-CH. Wie vorstehend erwähnt, ist einer des ersten und zweiten Energieakzeptors ein Donorfluorophor. Der andere des ersten und zweiten Energieakzeptors kann ein Akzeptorfluorophor oder ein Akzeptorfarbstoff sein. Die Energieakzeptoren sind so gewählt, daß die Anregung des Donorfluorophors durch elektromagnetische Bestrahlung mit einer geeigneten Wellenlänge und die Bildung eines direkten oder indirekten Komplexes zwischen den Reagenzien X und Y den Resonanzenergietransfer entweder direkt oder indirekt zwischen den Energieakzeptoren erleichtert. Wenn so der erste und der zweite Energieakzeptor einen Donorfluorophor und einen Akzeptorfarbstoff bzw. einen Akzeptorfarbstoff und einen Donorfluorophor umfassen, wird die Fluoreszenz des Donorfluorophors gelöscht, und wenn der erste und zweite Energieakzeptor einen Donorfluorophor und einen Akzeptorfluorophor bzw. einen Akzeptorfluorophor und einen Donorfluorophor umfassen, wird die Fluoreszenz des Donorfluorophors gelöscht, und der Akzeptorfluorophor fluoresziert (obwohl die Fluoreszenz des Akzeptorfluorophors eine sehr niedrige Quantenausbeute haben kann).
Nur als Beispiel sind in der nachstehenden Tabelle I repräsentative Paare von Verbindungen, die zur Verwendung als erfindungsgemäße Donor- und Akzeptorfluorophore geeignet sind, aufgeführt. Tabelle I Donorflurophor Entsprechender Akzeptor Fluorophor Fluorescein-Isothiocyanat R-Phycoerythrin Fluorescein-Isothiocyanat Rhodamin-B Fluorescamin C-Phycocyanin Rhodamin-B Allophycocyanin R-Phycoerythrin Allophycocyanin Lucifer-Gelb-VS R-Phycoerythrin
Wenn mindestens ein weiterer Energieakzeptor als Komponente (e) vorhanden ist, können zwei oder mehrere Resonanzenergietransferstufen auftreten. Wenn so beispielsweise der erste Energieakzeptor ein Akzeptorfarbstoff, der zweite Energieakzeptor ein Donorfluorophor ist, und ein Akzeptorfluorophor als Komponente (e) vorhanden ist, erleichtert die Komplexbildung zwischen den Reagenzien X und Y, den Resonanzenergietransfer zwischen dem Donorfluorophor und dem Akzeptorfarbstoff so, daß der Akzeptorfarbstoff die sowohl von dem Donorfluorophor als auch dem als Komponente (e) vorhandenen Akezptorfluorophor emittierte Fluoreszenz löscht.
Indem man nachweist, ob der Resonanzenergietransfer zwischen dem ersten und dem zweiten Energieakzeptor oder umgekehrt eintritt, kann es möglich sein, die Löschung der Fluoreszenz des Donorfluorophors und/oder, sofern vorhanden, der Fluoreszenz eines Akzeptorfluorophors nachzuweisen. Wenn einer oder mehrere weitere Energieakzeptoren als Komponente (e) vorhanden sind, kann das Löschen und /oder die Fluoreszenz einer oder mehrerer Komponenten nachgewiesen werden. Wenn so beispielsweise der erste Energieakzeptor ein Akzeptorfarbstoff ist, der zweite Energieakzeptor ein Donorfluorophor ist, und ein Akezptorfluorophor als Komponente (e) vorhanden ist, kann das Löschen der Fluoreszenz des Donorfluorophors und/oder des Akzeptorfluorophors nachgewiesen werden.
Wenn eines der Reagenzien X und Y ein Ligandenanalogon umfaßt, und das andere der Reagenzien X und Y einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden umfaßt, kann die Komplexbildung zwischen den Reagenzien X und Y direkt eintreten. Wenn alternativ beide Reagenzien X und Y spezifische Bindungspartner für den Liganden umfassen, kann die Komplexbildung zwischen den Reagenzien X und Y indirekt über den Liganden, sofern in der Probe vorhanden, eintreten.
Es ist zu verstehen, daß das Reagenz Y auf der Oberfläche des optischen Hohlleiters entweder direkt oder indirekt immobilisiert sein kann. Wenn beispielsweise das Reagenz Y ein Antikörper ist, kann die indirekte Immobilisierung mittels eines Antispezies-spezifischen Antikörpers gegen das Reagenz Y, das seinerseits an die Oberfläche des optischen Hohlleiters gebunden ist, durchgeführt werden.
Die Immobilisierung auf der Oberfläche des optischen Hohlleiters kann so mittels einer immunologischen Bindung, wie bei einer Antikörper-Antigen-Bindung oder Antikörper- Hapten-Bindung oder einer nichtimmunologischen Bindung, wie der zwischen einem Protein und einem Liganden, beispielsweise zwischen Avidin und Biotin, eintreten.
Geeignete Materialien für den optischen Hohlleiter umfassen beispielsweise Glas (z.B. Permablock-Glas oder Kronglas), Plastik (z.B. Acryl oder Polystyrol, Kieselgel und Quarz); aber im Prinzip kann jedes beliebige Material mit einem geeigneten Brechungsindex, das für die Strahlung bei mindestens den an dem Assay beteiligten Wellenlängen transparent ist, verwendet werden.
Bevorzugt wird sowohl bei der Bestrahlungsstufe (B) als auch der Nachweisstufe (C) die Kopplung des abklingenden Feldes verwendet.
Mehrere Vorteile treten durch Kombination der zwei Techniken des Resonanzenergietransfers und der abklingenden Feldkopplung auf.
1. Die Konvolution der Abhängigkeit in der umgekehrten sechsten Potenz von der Entfernung des Resonanzenergietransfers mit dem exponentiellen Abbau der abklingenden Welle beschränkt die Lokalisierung der Anregungsregion näher zu dem Hohlleiter.
2. Die Stoke'sche Frequenzverschiebung zwischen der anregenden elektromagnetischen Strahlung und dem emittierten Licht wird durch eine geeignete Wahl des Donorfluorophors und, sofern vorhanden, des Effektorfluorophors erhöht, wodurch eine effektivere Signalfilterung ermöglicht wird.
3. Das Signal:Rausch-Verhältnis wird verbessert. Wenn ein Akzeptorfluorophor bei der Messung des Akzeptorfluoreszenzsignals in Gegenwart des Donors vorhanden ist, wird der Hintergrund durch Immobilisierung des Akzeptors auf der Oberfläche des Hohlleiters verringert. Die Anzahl der Transferwege kann durch Immobilisieren weiterer Donoren oder Akzeptoren auf oder in der Oberfläche des Hohlleiters erhöht werden.
4. Die Stoke'sche Verschiebung kann weiter durch die begleitende Immobilisierung weiterer Fluorophorteilchen, die bei längeren Wellenlängen emittieren, erhöht werden, was das Eintreten einer Kette von Transferstufen ermöglicht. Eine solche Kette von Transferstufen und eine erhöhte Anzahl von Transferwegen kann mit einem herkömmlichen homogenen Assay nicht effektiv herbeigeführt werden.
5. Der Transfer entlang einer Kette von Fluorophoren ist effizienter, wenn die immobilisierten Fluorophore in geeigneter Weise ausgerichtet sind. Solche Ausrichtungen können mit Flüssigkristallen und der Auftragung eines Langmuir-Blodgett-Films in Kombination mit der Immobilisierung des Fluorophors erreicht werden.
Der vorstehend erwähnte optische Hohlleiter kann gegebenenfalls in eine Gitteranordnung wie in unserer gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit dem gleichen Datum, veröffentlicht als EP-A-0 363 467 mit dem Titel "Hohlleitersensor" beschrieben ist, eingearbeitet sein.
Eine solche Gitteranordnung, die in Zusammenhang mit den vorstehenden Transfertechniken verwendet wird, ermöglicht die Abtrennung und Filterung der emittierten und anregenden Strahlung innerhalb der Hohlleitersensorvorrichtung selbst, wodurch externe Monochromatoren oder Filter nicht mehr notwendig sind.
Es ist besonders zu bemerken, daß die Vorrichtungen des in die EP-A-171 148 beschriebenen und beanspruchten Typs vorteilhafterweise angepaßt sein können, um die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchenden Testproben zu tragen.
Die emittierte Strahlung kann gegebenenfalls gefiltert und/oder kollimiert werden, bevor sie durch herkömmliche Mittel, beispielsweise durch eine oder mehrere Fotomultiplierröhren nachgewiesen wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assayverfahrens bereitgestellt, das i) ein wie vorstehend definiertes Reagenz X und ii) einen optischen Hohlleiter, auf dessen Oberfläche (direkt oder indirekt) ein wie vorstehend definiertes Reagenz Y immobilisiert ist, und auf dem (direkt oder indirekt, gegebenenfalls über das Reagenz Y) mindestens ein weiterer Energieakzeptor, wie vorstehend definiert, immobilisiert ist, umfaßt.
Die Erfindung wird nachstehend speziell unter Bezug auf ein Antigen als Ligand und auf den Fall, in dem die Reagenzien X und Y jeweils einen Antikörper umfassen, beschrieben, d.h. ein Immunoassay vom Sandwich-Typ. Jedoch kann die Erfindung auch auf Immunoassays vom kompetitiven Typ angewandt werden, beispielsweise, wenn eines der Reagenzien X und Y einen Antikörper umfaßt, und das andere ein Ligandenanalogon umfaßt.
Ferner soll die Erfindung nicht auf Assays von Antikörpern oder Antigenen beschränkt werden. Beispiele für Liganden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammen mit einer Angabe eines geeigneten spezifischen Bindungspartners in jedem Falle aufgeführt. Tabelle 2 Ligand Antigen Antikörper Hormon Hormonrezeptor Polynucleotidstrang Avidin Biotin Protein A Immunglobulin Enzym Enzym Cofaktor (Substrat) oder -inhibitor Lectine spezifisches Kohlenhydrat der Lectine Spezifische Bindungspartner spezifischer Antikörper Antigen Hormonrezeptor Hormon komplementärer Polynucleotidstrang Biotin Avidin Immunglobulin Protein A Enzym-Cofaktor (Substrat) oder -inhibitor Enzym spezifisches Kohlenhydrat Lectine
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine sehr breite Anwendbarkeit, aber kann insbesondere für Assays verwendet werden: Hormone, einschließlich Peptidhormone (z.B. schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Choriongonadotropin (hCG), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin), oder nichtpeptidartige Hormone (z.B. Steroidhormone, wie Cortisol, Östradiol, Progesteron und Testosteron, oder Schilddrüsenhormone, wie Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z.B. carcinoembryonales Antigen (CEA) und α-Fetoprotein (AFP)), Arzneimittel (z.B. Digoxin), Zucker, Toxine, Vitamine, Viren, wie Influenza-, Parainfluenza-, Adeno-, Heptatitis-, respiratorische und AIDS-Viren, oder Mikroorganismen.
Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Antikörper", der hier verwendet wird, die folgenden Bedeutungen umfaßt:
(a) Eine der verschiedenen Immunglobulinklassen oder -unterklassen, z.B. IgG, IgM, abgeleitet von einem der üblicherweise verwendeten Tiere, z.B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse;
(b) monoclonale Antikörper;
(c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, wobei die Fragmente solche sind, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, d.h. Fragmente ohne den Fc-Teil (z.B. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sogenannten "Halb-Molekül"-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schwerkettigen Komponenten des intakten Antikörpers verknüpfen, erhalten wurden.
Das Verfahren zur Herstellung der Antikörperfragmente ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Antigen" werden sowohl permanent antigene Teilchen (z.B. Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, verstanden.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, worin die Figuren 1 bis 10 schematisch verschiedene erfindungsgemäße Assayformate darstellen, und Figur 11 schematisch eine Anordnung einer Apparatur, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist, zeigt.
Bei den in den Figuren dargestellten Ausführungsformen tritt der Forster-Energietransfer von einem angeregten "Donor"-fluorophor (D) zu einem "Akzeptor"-fluorophor (A) ein. Der Donorflurophor wird entweder durch ein abklingendes Feld des in dem Hohlleiter, an den der Assaykomplex immobilisiert ist, geführten Lichts oder direkt durch Licht über oder unter dem Hohlleiter angeregt.
Die Fluoreszenzemission wird von beiden oder einem der beiden der Donor- und Akzeptorfluorophore gesammelt.
Die Fluoreszenzemission wird entweder in die Hohlleiterschwingungen gekoppelt oder kann (wenn der Donorfluorophor durch ein abklingedes Lichtfeld angeregt wird) durch den Hohlleiter vor dem Nachweis transmittiert werden.
Die Figur 1 zeigt die Oberfläche 2 eines optischen Hohlleiters mit einem darauf immobilisierten Antikörper 4 (Reagenz Y), wobei der Antikörper mit einem Akzeptorfluorophor (A) markiert ist. Ein zweiter Antikörper 6, der mit einem Donorfluorophor (D) markiert ist, ist als Reagenz X vorhanden.
Während des Assays wird ein Antigen 8 (d.h. der Ligand) in der Probe an die Bindungsstellen sowohl auf dem A-markierten Antikörper 4 als auch dem D-markierten Antikörper 6 gebunden, wodurch ein "Sandwich-Komplex" gebildet wird. Der Donorfluorophor D wird elektronisch durch Absorption der einfallenden Strahlung angeregt. Der Forster-Energietransfer 10 tritt dann zwischen dem Donorfluorophor D und dem Akzeptorfluorophor A ein, was zur elektronischen Anregung des letzteren führt, während der Donorfluorophor desaktiviert wird und so seine Fluoreszenzfähigkeit verliert. Während des Assays kann die Fluoreszenz aus einem der beiden oder aus beiden Fluorophoren aufgezeichnet werden.
In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, die in der Figur 2 gezeigt ist, ist das immobilisierte Reagenz Y das Fab-Fragment 12 eines Antikörpers. Die Verwendung solcher Fragmente verringert den Abstand zwischen den Donor- und den Akzeptorfluorophoren und macht daher den Energietransfer effizienter.
Bei dieser Ausführungsform sind die Akzeptorfluorophore 14 auf der Oberfläche des optischen Hohlleiters immobilisiert.
Die Figur 3 zeigt die Umkehrung der in Figur 1 gezeigten Situation. Der immobilisierte Antikörper 22 (Reagenz Y) ist mit einem Donorfluorophor (D) markiert, und das Reagenz X umfaßt einen zweiten Antikörper 24, der mit einem Akzeptorfluorophor A markiert ist.
Wenn der Akzeptorfluorophor eine sehr niedrige Quantenausbeute an Fluoreszenz besitzt, kann es bevorzugt sein, die Löschung der Fluoreszenzemissionsintensität zu messen als eine Erhöhung von der 0-Intensität der Emission von dem fluoreszierenden Akzeptor zu bestimmen. Ein Akzeptorfarbstoff bietet einen Grenzfall eines Akzeptorfluorophors, dessen Fluoreszenz-Quantenausbeute vernachlässigbar klein ist.
Die Figur 4 zeigt eine Hohlleiteroberfläche, auf der ein Akzeptorfluorophor (A) und ein Antikörper 34, der mit dem gleichen Typ von Akeptorfluorophor (A) markiert ist, immobilisiert sind. Diese Anordnung erhöht die Effizienz des Energietransfers von dem Donorfluorophor (D), indem die Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor verringert wird und die Anzahl der Transferwege erhöht wird.
In Figur 5 ist zusätzlich zu einem immobilisierten Antikörper 40, der mit einem Akzeptorfluorophor markiert ist, und dem immobilisierten Akzeptorfluorophor gemäß Figur 4 eine Polymerschicht 42 ebenfalls auf der Oberfläche des Hohlleiters immobilisiert. Diese Polymerschicht kann auch mit einem Akzeptorfluorophor (A) 44 markiert sein, und dies dient dazu, die durchschnittliche Entfernung zwischen den Donor- und Akzeptorfluorophoren zu verringern. Eine geeignete Wahl des Polymeren verringert auch die Höhe der nichtspezifischen Bindung des Donorfluorophors (D) - markierter Antikörper 46 an die Oberfläche des Hohlleiters, was ein unerwünschtes Hintergrundsignal ergeben würde.
Alternativ kann der Akzeptorfluorophor wie in Figur 6 gezeigt, in der Oberfläche des Hohlleiters absorbiert sein, ebenso wie er zur Markierung des immobilisierten Antikörpers verwendet werden kann. Dies verhindert den Verlust der Fluoreszenzemission bei der Transmission durch die obere Hohlleitergrenzfläche.
Die Figur 7 zeigt eine Ausführungsform, die der von Figur 4 ähnlich ist, ausgenommen, daß die Positionen der Donor- und Akzeptorfluorophore vertauscht sind.
Die Figur 8 zeigt eine immobilisierte Molekülmatrix, in die Akzeptorfluorophore sowohl eingearbeitet als auch dadurch ausgerichtet sind. Dies dient dazu, das Winkelprofil der Fluoreszenzemission des Akzeptors zu verändern, um die Effizienz zu verbessern, mit der sie durch das Kollimations- und Nachweissystem gesammelt wird. Wenn die Donor- und Akzeptorpositionen vertauscht sind, dann kann eine effiziente Anregung des Donors, wie in Figur 9 gezeigt, eingerichtet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, die in Figur 10 gezeigt ist, verringert die Bindung eines Antikörpers 52, der mit einem Energieakzeptor markiert ist, der nicht fluoresziert, beispielsweise ein Farbstoff (A2), den Energietransfer von einem Donorfluorophor (D) zu einem Akzeptorfluorophor (A1). Dies vereinigt den Nachweis der Löschung von A1 mit einer verbesserten Stoke'schen Verschiebung, die durch die Energietransferstufe eingeführt wurde.
In jeder der in den Figuren 4 bis 10 dargestellten Ausführungsformen kann eine verstärkte Trennung der Stoke'schen Verschiebung zwischen den anregenden und den Emissionswellenlängen durch gleichzeitige Immobilisierung von mehr als einem Donor- oder Akzeptorteilchen auf der Oberfläche des Hohlleiters auf dem Polymeren oder innerhalb der ausrichtenden Matrix erzielt werden. Die ausrichtende Matrix kann selbst fluoreszierend sein. Die Verstärkung ist das Ergebnis von dem schrittweisen Transfer von einem fluoreszierenden Teilchen zu dem nächsten.
Die Figur 11 zeigt eine Versuchsanordnung, die zur Durchführung eines Assays gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Strahlung einer Wellenlänge, die für den Assay geeignet ist, tritt aus einer Lichtquelle 62 aus und tritt nach Kollimation durch ein herkömmliches Linsensystem durch einen Spalt 63 und einen Filter 64. Der so erhaltene Strahlungsstrahl 65 wird mittels eines Zerhackers 66 zerhackt und dann mittels eines Strahlungsaufspalters 67 aufgespalten. Der reflektierte Teil des Strahls (der Referenzstrahl) tritt durch eine Fotomulitplierröhre 68 über einen neutralen Dichtefilter 69 hindurch. Der transmittierte Teil des Strahls tritt durch ein hemizylindrisches Prisma 70 und in einen Hohlleiter 71, der mit dem Prisma mittels einer transparenten, im Index passenden Flüssigkeit oder Klebstoff verbunden ist, ein. Bei diesem Beispiel wird die Probenflüssigkeit in die Kapillarkavität zwischen dem Hohlleiter 71 und einer oberen Platte 72 gezogen, wie sie beispielsweise in einer Kapillarfüllvorrichtung (vgl. z.B. EP-A-171 148) vorhanden ist. Licht, das aus dem Prisma 70 austritt, wird durch eine oder mehr als eine Fotomultiplierröhre 73 nach Durchgang durch einen oder mehr als einen geeigneten Filter 74 nachgewiesen. Die Fotomultiplierröhren 68 und 73 und der Zerhacker 66 werden mittels eines synchronisierten Verstärkers 75 integriert. Die Signale aus den Fotomultiplierröhren können verarbeitet und geeigneterweise aufbereitet werden.
Das folgende nichtbeschränkende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel 1

Assay auf menschliches Choriongonadotropin (hCG)

Bei diesem Assay wird ein fluoreszierend markierter Antikörper als Ergebnis der Bildung eines Sandwich-Komplexes mit dem Analyten-Liganden (hCG) und einem zweiten Antikörper, der auch mit dem Fluorophor, der an den Hohlleiter gebunden ist, markiert ist, gebunden.

Herstellung der Ausgangsmaterialien

(i) Die Herstellung von mit Avidin beschichteten Hohlleitern

Glashohlleiter mit den Maßen 10 x 20 x 1,1 mm wurdne aus Permablock-Glas (Warenzeichen, Pilkington Glass Ltd., St. Helens, UK) unter Verwendung von Standardglas-Ätztechniken herausgeschnitten. Nach gründlichem Waschen mit einem Detergenz und Ultraschallbehandlung wurde das Glas mit Silan (8% 3-Glycidopropyltrimethoxysilan (Fluka, Glossop, UK)) bei einem pH-Wert von 3,5 zwei Stunden lang aktiviert. Das Glas wurde dann gewaschen und ein geeignetes Vernetzungsmittel (z.B. SMCC, Succinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Pierce, Luton, England) oder Glutaraldehyd) wurde verwendet, um Avidin an die Glasoberfläche nach Standardtechniken zu koppeln (vgl. z.B. Ishikura et al, Journal of Immunoassay 4, 209- 237(1983)). Die Glasobjektträger wurden dann unter Rotation mit einer 10%-igen Saccharoselösung, die 0,1% Casein enthielt, beschichtet und bei 4ºC bis zum Gebrauch trocken gelagert.

ii) Herstellung eines Biotin/R-Phycoerythrin/anti-hCG- Antikörpers

Monoclonale Anti-hCG-Antikörper wurden aus der Ascitesflüssigkeit von Mäusen nach dem Verfahren von Milstein und Köhler gemäß Nature 256, 495-497 (9175) erhalten.
Antikörper aus einzelnen Hybridoma-Zellinien wurden abgesucht, um diejenigen zu identifizieren, die Antikörper gegen klar bestimmte Antigenedeterminanten produzieren. Diejenigen mit den höchsten Affinitäten gegen hCG wurden zur Verwendung in dem Assay ausgewählt. 1,48 mg R- Phycoerythrin wurden mit 0,34 mg N-Hydroxysuccinimidobiotinester (Sigma, Poole, UK) nach Standardverfahren (vgl. Guesdon et al, J. Histochem. Cytochem. 27, 1131 (1979) vermischt. Das so erhaltene Phycoerythrin/Biotinkonjugat wurde unter Verwendung einer Pharmacia PD10-Säule mit 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0, gereinigt und dann mit SMCC (vgl. Ishikura et al, Journal of Immunoassay 4, 209-327 (1983)) aktiviert. Der Antikörper A wurde mit 2-Iminothiolan aktiviert und dann mit dem Phycoerythrin/Biotinkonjugat in gleichen Mengen vermischt und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Das Konjugat wurde auf einer TSK 3000 SWG-Säule (Warenzeichen) unter Elution mit einem Triethanolaminpuffer (0,1 M, pH 7,3), enthaltend NaCl (0,1 M) MgCl&sub2; (10&supmin;³M), ZnCl&sub2; (10&supmin;³M) und 1% NaN&sub3; gereinigt, wobei die Fraktionen mit dem höchsten Molekulargewicht gesammelt wurden.

(iii) Herstellung eines Allophycocyanin/Anti-hCG Antikörpers

Antikörper B (ein zweiter monoclonaler Antikörper gegen hCG, spezifisch für eine andere antigene Determinante) wurde an Allophycocyanin nach den in Stryer et al, US 4,542,104 (1985) beschriebenen Verfahren konjugiert.

(iv) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Ein gefriergetrocknetes hCG-Präparat, das gegen das erste internationale Referenz-Pärparat (75/537) kalibriert war, wurde von Biodata SpA, Mailand, Italien bezogen. Diese Probe wurde in Pferdeserum (Serono Diagnostics, Woking, England) auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

Apparatur für die optischen Messungen

Eine optische Apparatur, die zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Assays geeignet ist, ist in Figur 11 der beigefügten Figuren gezeigt. Die Lichtquelle 62 ist eine 150 W Xenon Bogenlampe, der Anregungsfilter 64 besitzt eine Zentralwellenlänge von 485 nm (60 nm Bandweite), der Detektionsfilter besitzt eine Zentralwellenlänge von 580 nm (70 nm Bandweite). Diese Filter sind für einen Assay mit R-Phycoerythrin geeignet. Ein Kollektor mit einer langen Bandbreite für Allophycocyanin besaß einen Wellenlängenbeginn bei 465 nm. Eine Hakuto R928 Fotomultiplierröhre (Hakuto, Waltham Cross UK) wurde als Fotodetektoren 68 und 73 verwendet und ein EG und G 5207 (PAR, Precton, USA) Lock-in-Verstärker 75 wurde verwendet. Der Glashohlleiter 71 kann in einer Zelle, die ausreichend klein dimensioniert ist, so daß die Probe über die Oberfläche des Hohlleiters mittels Kapillarwirkung gezogen werden kann, angebracht sein.

Assayverfahren

Ein Sandwich-Assay, bei dem die vorstehenden Ausgangsmaterialien und die vorstehende Vorrichtung verwendet werden, kann wie folgt durchgeführt werden. Der mit Avidin beschichtete Hohlleiter wird mit einer Lösung des Biotin/R- Phycoerythrin/Anti-hCG-Antikörpers inkubiert. Der mit dem Donorfluorophor markierte Antikörper A wird so auf der Oberfläche des Hohlleiters als Ergebnis der hohen wechselseitigen Affinität von Avidin und Biotin immobilisiert. Der Hohlleiter wird dann mit einer Probe, die das zu bestimmende Antigen (hCG) und eine fixierte Menge des Allophycocyanins-(Akzeptorfluorphor)-markierten Antikörpers B) enthält inkubiert. Der Hohlleiter wird mit einer Strahlung bei einer Wellenlänge, die zur Anregung des Donorfluorophors geeignet ist, d.h. bei 485 nm für R-Phycoerythrin bestrahlt. Die Bestrahlung kann entweder nach Erreichen des Gleichgewichts oder im Verlauf der Gleichgewichtseinstellung durchgeführt werden. Die Intensität des aus dem Donorfluorophor emittierten Lichts wird bestimmt, d.h. bei 580 nm für R-Phycoerythrin. Als Ergebnis der Bildung des Sandwich-Komplexes nimmt die Fluoreszenzintensität bei 580 nm als Funktion der hCG-Konzentration ab. Die Kalibrierung kann durch Vergleich der Ergebnisse mit Probenlösungen, die 0-Mengen oder bekannte Mengen an hCG enthalten, durchgeführt werden.
Wie vorstehend erwähnt, kann auch ein Assay vom kompetitiven Typ nach dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden. Das Verfahren in diesen Fällen ist ähnlich.

Kompetitiver Assay auf hCG

Ein mit dem Donorfluorophor (R-Phycoerythrin) markierter Antikörper wird auf der Oberfläche des Hohlleiters mittels der Avidin/Biotin-Wechselwirkung nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren immobilisiert. Der Akzeptorfluorophor (Allophycocyanin) wird an die hCG-Moleküle konjugiert. Der Hohlleiter wird dann mit einer flüssigen Probe, die hCG und eine feste, bekannte Menge des Allophycocyanin/hCG-Konjugats enthält, inkubiert. Die Donorfluorophore werden durch Anwendugn von Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt und die Abschwächung der Fluoreszenz des Donorfluorophors wird bestimmt. Die Fluoreszenz als Folge des Donorfluorophors nimmt mit abnehmender Menge an hCG in der Probe ab.

Claims

1) Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend

(A) gleichzeitiges Inkubieren oder Inkubieren in irgendeiner gewünschten Reihenfolge

(a) der Probe,

(b) eines mit einem ersten Energieakzeptor markierten Reagenzes X,

(c) eines direkt oder indirekt auf der 0berfläche eines optischen Hohlleiters immobilisierten Reagenzes Y,

(d) eines direkt oder indirekt (gegebenenfalls über das Reagenz Y) auf der Oberfläche des optischen Hohlleiters immobilisierten zweiten Energieakzeptors,

(e) gegebenenfalls mindestens eines weiteren Energieakzeptors, der dem ersten oder zweiten Energieakzeptor gleich oder verschieden davon sein kann, der direkt oder indirekt auf oder innerhalb der Oberfläche des optischen Hohlleiters immobilisiert ist, wobei eines der Reagenzien X und Y einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden umfaßt, und das andere der Reagenzien X und Y entweder ein Ligandenanalogon oder einen spezifischen Bindungspartner des Liganden umfaßt, und worin einer des ersten oder zweiten Energieakzeptors einen Fluorophor (ein "Donorfluorophor") umfaßt, dessen Elektronenemissionsspektrum mit dem Elektronenabsorptionsspektrum des anderen des ersten und zweiten Energieakzeptors überlappt,

(B) elektromagnetisches Bestrahlen des optischen Hohlleiters mit einer zur Anregung des Donorfluorophors geeigneten Wellenlänge, und

(C) Nachweisen, ob, und gegebenenfalls in welchem Ausmaß und/oder mit welcher Geschwindigkeit der Resonanzenergietransfer entweder direkt oder indirekt zwischen dem ersten und zweiten Energieakzeptor bzw. zwischen dem zweiten und ersten Energieakzeptor eintritt, wobei entweder das Bestrahlen von Stufe (B) mittels des abklingenden Feldes, das durch elektromagnetische Strahlung, die sich entlang des Hohlleiters fortpflanzt, durchgeführt wird, und/oder bei der Nachweisstufe (C) die Kopplung des abklingenden Feldes in den Hohlleiter der Fluoreszenz des ersten Energieakzeptors oder - sofern vorhanden - der Fluoreszenz des zweiten Energieakzeptors verwendet wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Energieakzeptor einen Donorfluorophor umfaßt, und der zweite Energieakzeptor einen Akzeptorfarbstoff oder einen Akzeptorfluorophor umfaßt.

3) Verfahren nach Anspruch 1, worin der erste Energieakzeptor einen Akzeptorfarbstoff oder einen Akzeptorfluorophor umfaßt, und der zweite Energieakzeptor einen Donorfluorophor umfaßt.

4) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin ein Akzeptorfluorophor als Komponente (e) vorhanden ist.

5) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin man bei der Bestrahlung von Stufe (B) das abklingende Feld in Assoziation mit der elektromagnetische Strahlung, die sich entlang des Hohlleiters fortpflanzt, verwendet.

6) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin einer der Energieakzeptoren einen Akzeptorfluorophor umfaßt, und man bei der Nachweisstufe (C) die Kopplung des abklingenden Feldes der von dem Akzeptorfluorophor emittierten Strahlung in den Hohlleiter verwendet.

7) Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin man die Energieakzeptoren aus der Gruppe, umfassend Phycobiliproteine, Cumarine, Fluorescein, Rhodamine, Lucifer-Gelb, Erythrosin oder Derivate davon, auswählt.

8) Verfahren nach Anspruch 1, worin der optische Hohlleiter aus Glas oder Kieselsäure ist.

9) Kit zur Verwendung bei einem Verfahren nach Anspruch 1, umfassend

(i) ein mit einem ersten Energieakzeptor markiertes Reagenz X,

(ii) einen optischen Hohlleiter, auf dessen Oberfläche (direkt oder indirekt) ein Reagenz Y immobilisiert ist, und auf dem (direkt oder indirekt, gegebenenfalls über das Reagenz Y) mindestens ein weiterer Energieakzeptor immobilisiert ist, wobei die Reagenzien X und Y und die Energieakzeptoren wie in Anspruch 1 definiert sind.