DE68911002T2 - Immunoassayverfahren von Dioxinen und Dibenzofuranen. - Google Patents

Description

• Die U. S.-Regierung hat gemäß Vertrag Nr. W-7405-ENG-48 zwischen dem U. S. Ministerium für Energie und der Universität von Kalifornien über den Betrieb des Lawrence Livermore Nationallaboratoriums Rechte an der vorliegenden Erfindung.
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Dioxinen und Dibenzofuranen unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern und ein Verfahren zur Vorbereitung von Proben, um den Nachweis von Dioxinen durch immunologische Bestimmung in stark verunreinigten Proben zu optimieren.
• Polychlorierte Dibenzodioxine (PCDD) und Dibenzofurane (PCDF) sind beständige giftige Schadstoffe, welche sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Biosphäre im allgemeinen eine Bedrohung darstellen. Diese Verbindungen welche auch als polyhalogenierte. eben gebaute polycyclische Aromaten bezeichnet werden können, sind Verunreinigungen von Herbiziden, wie Agent Orange, und werden in einer Anzahl von industriellen chemischen Verfahren wie auch bei der Verbrennung von anderen polychlorierten organischen Verbindungen , wie Kunstoffen und polychlorierten Biphenylen (PCB) als Nebenprodukte gebildet. Im Hinblick auf die ausgedehnte Verwendung oder das Vorkommen solcher Verfahren, sind Dioxine und Dibenzofurane in der Umwelt weit verbreitet. Nachdem nun die gefährliche Natur dieser Stoffe in vollem Umfang erkannt wurde, ist es ein Anliegen von hoher Prioritat geworden, sich dem Problem des Nachweises dieser Verbindungen zuzuwenden. Ein bedeutender, nicht belangloser erster Schritt besteht darin, die Orte der Verunreinignng zu identifizieren. Dies erfordert einen einfachem wirtschaftlichen und schnellen Test zum Nachweis des Vorhandenseins dieser Verbindungen in Proben welche aus industriellen Verfahren Böden, menschlichen oder tierischen Geweben und aus Nahrungsmitteln entnommen wurden.
• Polychlorierte Dibenzodioxine und Dibenzofurane und andere bei Verbrennungsprozessen und in technischen Verfahren gebildete chemische Stoffe sind äußerst gitlig und außerdem unter Umweltbedingungen stabil. Anstrengungen zur Überwachung ihrer Bildung und Ausbreitung wurden in erster Linie mit Hilfe von Gaschromatographie und Massenspektroskopie durchgeführt. Dies ist ein relativ teures Verfahren, welches eine sorgfältige Vorbereitung der Proben und die Verwendung von teuren und komplizierten Apparaturen einschließt. Es besteht ein Bedürfnis nach einem einfacheren und wirtschaftlicheren analaytischen Verfahren für die erwähnten Substanzen insbesondere fiir diejengen, welche sich in industriellen Proben finden, die andere Substanzen enthalteit welche die Bestimmung stören können.
• Ein wichtiger Gesichtspunkt eines wünschenswerten Testverfahrens betrifft die Spezifität. Es gibt sowohl von PCDD's als auch von PCDF's, sowie von PCB's eine große Zahl von lsomeren welche in bezug auf ihre Toxizität von sehr hohen bis zu geringeren Toxizitaten variieren die aber auch anderen relativ harmlosen chemischen Verbindungen chemisch sehr ähnlich sind. Ein anderer Gesichtspunkt des Problems besteht darin, daß das für die Umwelt giftigste Isomere dieser Verbindungen, d. h. 2,3.7,8-Tetrachtordibenzo-p- dioxin, bereits in sehr geringen Mengen schädlich ist und die Eigenschaft besitzt beim Durchlaufen der Nahrungsmirtelketten angereichert zu werden. Daher muß ein wünschenswertes Prüfverfahren befähigt sein, das Vorhandensein dieser schädlichen Substanzen in Proben aus industriellen Verfahren, Proben aus der Umwelt, menschlichen oder tierischen Geweben und Nahrungsmitteln in sehr geringen Mengen nachzuweisen. Die chemische Analyse von Bodenproben auf verunreinigende Substanzen wird auch durch einige andere Faktoren behlndert: (1) Dioxine sind fest an den Boden gebunden und zeigen eine zu vernachlässigende Löslichkeit in Wasser und (2) die Vielzahl von Isomeren und verwandten vernnrernigenden chemischen Substanzen macht die quantitative Bestimmung durch übliche gaschromatograqphische und massenspektrometrische Verfahren kostspielig und zeitraubend. Die Kosten und die für die Durchführung der Bestimmungen benötigte Zeit verhindern eine ins einzelne gehende Entnahme von Proben aus einem Gebiet, um das Ausmaß der Verschmutzung zu bestimmen, und erfordern die Verwendung von mit höchster technischer Perfektion ausgestatteten zentralisierten Laboratorien, die für die Überwachung von gefährlichen polychlorierten Dibenzodioxinen und Dibenzofuranen auf dem Feld ungeeignet sind.
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Vorbereiten von Dioxine und verwandte Verbindungen enthaltendeni Proben in der Weise, daß sie zur Bestimmung durch immundiagnostische Verfahren geeignet sind, sowie einen Analysenkoffer (Test Kit) der für dieses Verfahren verwendet werden kann. Wichtige Vertreter der Klasse der erwähnten polyhalogenierten polycyklischen Aromaten mit ebener Struktur sind Dibenzodioxine Dibenzoturane und einige polyhalogenierte Biphenyle. Zum Zwecke der Vereinfachung wird die Klasse der erwähnten Substanzen in der nachfolgenden Beschreibung als Dioxine oder bei Verwendung als Adjektiv als Dioxine enthaltend. wie in Dioxine enthaltende Ftaktion, bezeichnet.
• Die möglichen Vorteile auf immunologischer Bestimmung basierenden Verfahren gegenüber üblichen Analysenmethoden sind bereits früher erkannt worden. Insbesondere wurde erkannt daß eine auf immunologische Bestimmung basierende Arbeitsweise ein Verfahren bietet welches ebenso empfindlich wie Gaschromatographie und/oder Massenspektrometrie ist obwohl es schneller und billiger ist.
• Ein früherer Versuch zum Nachweis von Dioxinen in der Umwelt war die Verwendung radioimmunologischen Bestimmung, welche auf polyklonalen, durch Immunisierung von Kaninchen mit 1-Amino3,7,8- trichlordiberzo-p-dioxin hergestellten Antisera beruhte. Dieses Verfahren wird in einer Publikation von P. W. Albro et al. in Methods in Enzmology, 84 619 - 639 (1982) und in US-A-4,238,472 diskutiert. Diese Bestimmungsmethode fand keine hreite Anwendung, weil sie die häufige Synthese von ¹²&sup5;I-TCDD als Grundsubstanz und eine Durchführungszeit von drei Tagen erforderlich macht, und weil die Bestimmung unspezifische Antisera von Kaninchen verwendet. welche für den giftigsten artverwandten Dioxinvertreter, 2.3,7,8-TCDD, weicher nachstehend als TCDD bezeichnet wird. nicht genügend spezifisch sind.
• Ein anderes Analysenverfahren für Dioxine, das von Stephen J. Keunel in einem Artikel in Toxicology and Applied Pharmacology. 82 256 - 263 (1986) beschrieben wurde, beruht auf monoklonalen Antikörpern, welche durch Immunisierung von Mausen mit Thyroglobulin-2-adipamid hergestellt wurden, 3,7,8- Trichlordibenzo-p-dioxin hat sich nicht als spezifisch für giltige Dioxinverbindungen erwiesen. Hybridomas, die durch Mitzzellen von gegenüber dieser Verbindung immunisierten Tieren hergestellt und mit Knochenmarkszellen fusioniert wurden, scheiden Antikörper aus. die in Lösung eine ungenügende Selektivität für das an nichtproteinisches Material gebundene giftigste Dioxinisomere 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin und andere Dioxinisomere besitzen, obwohl sie mit Verbindungen reagieren, welche keine toxischen Dioxine darstellen. Das Analysenverfahren verwendet auch ein radioimmunologisches Verfahren mit den darnit verbundenen Nachteilen.
• Der in jüngeren Publikati onen diskutierte Nachweis von Dioxinen beschreibt immunologische Analysenverfahren die monoklonale Antikörper verwenden. welche sich spezifisch mit toxischen Dioxinen verbinden. Diese Publikationen sind: Stanker, L., Watkins. B., Rogers N. und Vanderlan, M., "Monoclonal Antibodies to Dioxin,. Antibody Characterisation und Assay Development", J. Toxicol. 45, 229 - 243 (1985); und Stanker. L., Watkins, B.. Vandelan M. und Budde, W., "Development of an Imununoassay for Chlorinated Dioxins Based on a Monoclonal Antibody and an Enzyme Linked Immunosorbency Assay (ELISA)". Chemosphere 16, 1635 - 1639 (1987). Chemisch reine Dioxine oder Proben. aus denen das Dioxin leicht isoliert werden kann, können mit diesem Verfahren ohne weiteres analysiert werden. Proben aus industriellen Verfahren, die andere Substanzen enthalten, welche die Bestimmung beeinflussen können, wurden jodoch nicht untersucht. Bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung war ein Verfahren zur Analyse von Proben aus der Industrie und der Umwelt wegen der bei der Vorbereitung der Proben auftretenden Schwierigkeiten, die eine teilweise Reinigung der Dioxinfraktion und das anschließende Löslichmachen der Dioxinfraktion in einer wässerigen Lösung für den spezifischen Nachweis mit Antikörpern erforderlich machen, nicht verfügbar. Das in vorliegender Beschreibung dargelegte Verfahren ermöglicht die Verwendung einer immunodiagnostischen Bestimmung von Dioxinen in Proben, welche störende Verunreingungen von Proben aus chemischen Verfahren oder aus der Umwelt enthalten können.
• Frühere Forscher haben für Proben, die bezüglich Vemnreinigung durch Dioxin ausgewertet werden sollten, verschiedene Extraktions- und chromatographische Techniken verwendet. Diese Techniken sind zur Vorbereitung von Proben geeignet, die durch Gaschromatographie und Massenspektrospopie analysiert werden sollen. So hergestellte Proben können immer noch Kompenenten enthalten, die bei immunologischen Bestimmungen stören. Präparative Verfahren umfassen die mehrfache Behandlung der Proben zur GC/LRMS- Analyse durch Chromatographle. Alununiumoxid-Kolonnen zur Abtrennung von Dioxinen aus Materialien, die sich auf einem Lagerplatz für gefährliche Abfälle finden, und Extraktion von Dioxinen mit Phenol oder Toluol in einer Soxhlet-Apparatur, obwohl diese Verfahren eine starke Streuung der Ergebnisse ergaben und das Verfahren für Flugasche ungeeignet ist. Mehrfache Extraktionsverfahren sind dazu verwendet worden, um durch GC/MS-Analyse und nachfolgende Lösungsmittelextraktion für HGRC/MS-Analysen sehr geringe Verunreinigungen durch Dioxin nachzuweisen. Diese beschriebenen Verfahren wurden alle zur Vorbereitung von Proben zur GC/MS-Analyse verwendet. Es wurde nicht bestimmt, ob diese Proben frei von Substanzen waren, welche bei Antikörperreaktionen, die in einem wässerigen Medium stattfinden, stören können. Die früher beschriebenen Verfahren welche nichtionische Detergentien verwendeten, zeigten, daß nur Triton X-305 und Cutscum für radioimmunologische Bestimmungen geeignet waren, weil andere Detergentien das TCDD nicht löslich machten, es vom Antikörper "abschirmten" oder sie mit den Proteinen der Antisera in Wechselwirkung traten. Es wurde nicht angegeben, ob diese Detergentien in Reaktionen stören wurden, welche für Dioxine spezifische Antikörper verwenden.
• Bei einem Vergieich der Zuverlässigkeit und der Empfindlichkeit der von verschiedenen Laboratorien durchgeführten Analysen wurde festgestellt, daß die prkktischen Grenzen des Nachweises in Prben durch GC/MS bei Proben, die aus Produkten von technischer Qualität hergestellt wurden, bei etwa 10 ppb lag, wobei die Reproduzierbarkeit ±100% betrug. Die Anwendung des in vorliegender Beschreibung beschriebenen Verfahrens zur Vorbereitung von Proben und Analyse durch monoklonale Antikörper ergibt einen ähnlichen oder besseren Grad des Nachweises und der Reproduzierbarkeit.
• Die vorstehenden Ausführungen zeigen klar, daß ein fortgesetztes Bedurfnis nach einem wirksamen praktisehen Prüfverfahren zum Nachweis von giftigen Dioxinen besteht.
• Dementsprechend ist es ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, Prohen aus industriellen oder chemischen Verfhiren für einen immunologischen Nachweis von Dioxinen in der Weise herzustellen, daß der Nachweis die notwendige Selektivität und Empfindlichkeit aufweist, um das Vorhandensein von Dioxinen in Konzentrationen von wenigen Teilen pro Billion (ng pro Probe) schlüssig anzugeben.
• Ein anderes Ziel besteht darin, eine vereinfachte Extraktion und ein Prüfverfahren zum Nachweis von Dioxinen vorzusehen, welches schnell in der Umgebung des Feldes durchgeführt werden kann.
• Noch ein anderes Ziel besteht darin, ein immunologisches Analysenverfahren bereitzustellen, das befähigt ist, die Dioxine mit der höchsten Toxizität zuverlässig zu erkennen.
• Ein weiteres Ziel ist es, ein Verfahren anzugeben, dnrch welches die Empfindlichkeit des Nachweises von Dioxin erhöht werden kann, um einen Nachweis bei einer Konzentration von wenigen Teilen pro Trillion zu erreichen.
• Ein weiteres Ziel besteht darin, ein qualitatives und quantitatives Bestimmungsverfahren für polyhalogenierte polycyclische Aromaten mit ebener Struktur, welche als Dioxine bezeichnet werden, in rohen industriellen und Umweltproben. einschließlich Proben von Böden, bereitzustellen.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verhiuen zur Vorbereitung von Proben zur Bestimmung des Vorhandenseins von polychlorienen Dioxinen und insbesondere von 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) dar, welches monoklonale Antikörper verwendet. die aus Zellstämmen von Hybridoma erhalten wurden. Die Herstellung der Zellstämme und die Charakterisierung der von ihnen abgeleiteten Antikörper ist im einzelnen in EP-A-0 251 635 von Vanderlaan et al. beschrieben worden. Diese Antikörper sind durch eine hohe Affinität und Selektivität gegenüber TCDD gekennzeichnet. Ihre Verwendung mit einer verbesserten ELISA (Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay) Analysenvorschrift gestattet den Nachweis des Vorhandenseins von Dioxinen in Analysenproben in Konzentrationen von wenigen Teilen pro Billion und weniger. Die Untersuchungen können eher in Stunden als in Tagen vollständig durchgeführt werden. Die Verwendung von radioaktiven Verbindungen wird vermieden. Prüfungen auf TCDD mit Antikörpern können in wässerigen Medien durchgeführt werden, wobei das Löslichmachen der organischen Testverbindungen durch Detergentien und/oder eine Ultraschallbehundlung erhöht wird. Nach einer bevorzugten Arbeitsweise kann die Empfindlichkeit des immunologischen Analyserverfahrens durch Löslichmachen des Probenmaterials durch Zugabe von Detergentien in einer Konzentration in der Größenordnung von etwa 0,01 - 2,0 Gew.-% erhöht werden. Die Verwendung einer beschränkten Konzentration von umhüllendem Antigen und Verstärkung des Peroxidase-Enzymendpunktes mit einem Avidin/Biotin-Verstärkungssystem ermöglicht es, TCDD-Konzentrationen im Bereich von wenigen Teilen pro Trillion nachzuweisen. Andere Antikörperzubereitungen. die unter Verwendung gewünschter Dioxine als Immunogene erhalten wurden, können ebenfalls verwendet werden.
• Die in vorliegender Beschreibung angegebenen Verfahren zur Vorbereitung der Proben ermöglichen die Analyse von industriellen Proben, welche Reaktionsgemische, Destillationsrückstände. Chemikalien, Flugasche, Filterstaub, Transformatorenflüssigkeit (PCE-Öl) oder Motoröl einschließen können, durch Nachweisverähren mit höherer Empfindlichkeit. Außerdem kann das Verfahren zur Prüng von Proben anderen Ursprunges, die Proben aus umgebender Luft, Wasser- und Bodenproben, menschlichen und tierischen Geweben und Nahrungssmttein einschließen, verwendet werden. Das Verfähren zur Vorbereitung der Probe umfaßt die einleitende Extraktion und Abtrennung der die interessierenden Dioxinverbindungen enthaltenden Fraktion und das anschließende Löslichmachen dieser Fraktion mit Detergenticn, um die Dioxinverbindungen den in wässerigen Medium vorliegenden Reaktanden zur immunologischen Bestimmung auszusetzen. Die Auswahl einer geeigneten Konzentration an umhüllenden Antigen für das Reaktionsgefäß und die Auswahl eines enzymatischen Verstärkungssystems für die ELISA-Methode erhöht die Empfindlichkeit der Bestimmung noch weiter. Das Verfahren ist zur analytischen Bestimmung von polychlorierten Dibenzodioxinen und Dibenzofuranen besonders geeignet und es wird ein spezifischer Nachweis bis in den Bereich von wenigen Teilen pro Trillion bewirkt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Figur 1 - Es werden nach der ELISA-Methode gewonnene Inhibierungsdaten von Probenextrakten dargestellt, welche durch gründliche Reinigung der Kohlekolonne allein (offene Quadrate) oder durch gründliche Reinigung der Kohlekolonne und anschließend der Oleum-Kieselsäurekolonne (gefülllte Quadrate) erhalten wurden. Die zusätzliche Extraktion von Proben in der Oleum-Kieselsäurekolonne änderten den Wert von I&sub5;&sub0; bei Proben aus PCB-Öl (Diagramm A) oder Trichlorphenol (Diagramm B) nicht der Wert für I&sub5;&sub0; für die aus dem Kolonnensumpf gewonnene Probe # 1 (Diagramm C), einem Destillationsrückstand aus einer Destillationsanlage für Chlornitrobenzol, war jedoch niedriger, was darauf hindeutet, daß hei der zweiten Extraktion von Dioxin verschiedenes, zur immunologischen Kreuzreaktion befähigtes Material entfernt wurde.
• Figur 2 - Die Empfindlichkeit des immnnologischen Nachweises von Dioxin wird durch Löslichmachen mit dem Detergens Cutscum von TCDD-Standard verbessert. Optimale Empfindlichkeit des Nachweises (I&sub5;&sub0;) wird mit 0,25% (offener Diamant) und 0,125% (Kreuz) Cutscum erreicht, wogegen höhere Konzentrationen an Detergens, 0,5% (gefülltes Ouadrat), 1,0% (gefüllter Diamant) und 2,0% (offenes Quadrat) die Konkurrenzreaktion zunehmend hemmten. Konzentrationen an Detergens von weniger als 0,1% machten das Dioxin nicht löslich.
Herkunft der Antikörper
• Das vorliegende Verfähren zur Vorbereitung von Proben ergibt Proben, die mit monoklonalen Antikörpern, welche für polychlorierte Dibenzodioxine (PCDD) und Dibenzofürane (PCDF) spezifisch sind, in wirksamer Weise auf Dioxine analysiert werden können, Antikörper die gezüchtet wurden, um die funktionellen Gruppen von Dioxinmolekülen zu unterscheiden, haben in der in vorliegender Beschreibung angegebenen Analysenmethode eine geeignete Spezifität.
• Es wurden Hybridomas verwendet, die für polyhalogenierte, eben gebaute Aromaten spezifische Antikörper produzieren, welche als ihr Dioxin spezifische Antikörper bezeichnet werden. Beispiele für die genannten Hybridomas sind DD-1, DD-3, DD4, DD-5 und DD6, welche von Vanderlaan et al. in US-Patentanmeldung 877,909, die als US-A4,798,807 publiziert wurde und die zur EP-A-0 251 635 equivalent ist, beschrieben werden. Diese Hybridomas sind bei der Hinterlegungsstelle der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, öffentlich erhältlich und sind durch die folgenden Registriernummern identifiziert: DD-1, (HB 9741): DD-3, (HB 9742): DD4, (9743); DD-5, (HB 9744); und DD6, (HB 9745). Diese Stämme wurden durch Fusionieren von Rückenmarkzellen mit Milzzellen hergestellt, die von einer mit dem TCDD-Analogen 1-Amino-3,7,8-trichlordibenzo-p-dioxin (A-triCDD) immunisierten Maus erhalten wurden. Diese Verbindung wurde synthetisiert und dann an Thyroglobulin als Trägerprotein gebunden. Nach der Immunisierung mit dem Hapten-Proteinkomplex wurden die immunoreaktiven Milzzellen gesammelt und mit Rückenmarkzellen fusioniert, und aus den erhaltenen Hybridomas wurden diejenigen ausgesondert, welche die Fähigkeit zeigten, an Protein gebundenes TCDD und in freier Form suspendiertes TCDD zu erkennen. Aus diesen Prüfungen wurden fünf Hybridomas (mit der Bezeichnung DD-1, DD-3, DD4, DD-5 und DD6) zur weiteren Untersuchung ihrer Spezifität ausgewählt. Die Spezifität dieser Antikörper für eine Vielzahl von Dioxinen, Dibenzofuranen, PCB's und anderen chlorierten Kohlenwasserstoffen wird von Vanderlaan et al. in EP-A-0 251 635 beschrieben. Die Bindungsspezifitäten dieser Antikörper sind höchst wünschenswert, da sie sich selektiv an die giftigst en Dioxin- und Dibenzofuranisomere binden.
Vorbereitung der Proben
• Das für Proben aus der Industrie und der Umwelt geeignete analytische Verfahren wurde entwickelt, um Probleme in Zusammenhang mit der Analyse von realen Proben durch Einleiten einer teilweisen Reinigung und Extraktion der giftigen Dioxine. bevor sie in wässerigen Lösungen zur Analyse löslich gemacht werden, zu überwinden. Das Verfahren zur Vorbereitung von Proben ermöglicht die qualitative und quantitative Bestimmung von Dioxinverbindungen in industriellen Proben aus Reaktionsgemischen, Destillationsrückstanden und anderen stark verunreinigten Proben. Monoklonale Antikörper, die spezifische Reaktionsfähigkeit gegenüber Dioxinen besitzen, wurden oben beschrieben (Stanker et al. (1987) J. Toxicol., 45, 229 -249). Da einzelne Antikörper mit bestimmten Verbindungen oder Gruppen von Verbindungen reagieren können, werden die Ergebnisse von mehreren präparativen Schemata am besten durch Bezugnahme auf eine Standardverbindung von bekannter Konzentration in einer Standardprobe verglichen.
• Es ist zweckmäßig, industrielle Proben vor der Durchführung der Reaktion zur immunologischen Analyse zur Bestimmung von Dioxinen zu extrahieren und/oder vorzubereiten. Dies wird nach dem Verfahren der Erfindung durch die nachstehenden aufeinanderfolgenden Schritte erreicht.
• a. Herstellung eines Rohextraktes durch Zersetzung der Probe durch eine Behandlung mit Säure,
• b. Abtrennung der Fraktion der polyhalogenierten polycyclischen Aromaten von ebener Struktur, welche als Dioxinfraktion bezeichnet wird,
• c. Löslichmachen der Dioxinfraktion in einer wässerigen Pufferlösung.
• Nach der Durchführung dieser Arbeitsschritte wird dann die so erhaltene Dioxinfraktion durch Reaktion mit spezifischen Antikörpern analysiert.
• Es ist am besten, die Extrakion mit Säure vor der Analyse von hauptsächlich anorganischen Proben, wie Flugasche, Filterstaub und anorganische Chemikalien, durchzuführen. Für diesen Zweck sind verschiedene Säuren geeignet. wobei insbesondere konzentrierte HCl und H&sub2;SO&sub4; bevorzugt sind. Nach der Behandlung mit Säure wird die Mischung dann mit einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln extrahiert. Für diesen Zweck sind verschiedene organische Lösungsmittel geeignet. Die bevorzugten Lösungsmittel schließen CCl&sub4;, CHCl&sub3;, CH&sub2;Cl&sub2;, Benzol, Toluol, Chlorbenzol, Chlortoluol, Hexan, Cyclohexan, Chlorcyclohexane, Methanol und Ethanol ein. Besonders bevorzugt sind CH&sub2;Cl&sub2; und Cyclohexan, insbesondere Mischungen dieser beiden Lösungsmittel.
• Schwer lösliche Proben, welche hauptsächlich von organischer Natur sind, wie Reaktions- und Destillationsrückstande, werden vorzugsweise durch Suspendieren in einer Säure, vorzugsweise in konzentrierter H&sub2;SO&sub4;, welche mit SO&sub3; gesättigt ist, und anschließendes Vermischen mit einer Festsubstanz (z. B. Silicagel), vorzugsweise bis die Mischung fließfähig wird, vorbereitet. Diese Mischung kann dann hei Siedehitze in einer geeigneten Apparatur, vorzugsweise mit einem der oben genannten Lösungsmittel oder einer entsprechenden Mischung extrahiert werden.
• Leicht lösliche Proben, welche hauptsächlich von organischer Natur sind, wie Motoröl, PCB-Öl und organische Chemikalien werden bewußt ohne vorherige Behandlung mit Säure mit einem oder mehreren der oben genannten Lösungsmittel extrahiert. Hier ist eine Extraktion in der Siedehitze des zur Diskussion stehenden Lösungsmittels (z. B. unter Verwendung einer Soxhlet-Extraktionsapparatur) bevorzugt.
• Die Dioxinfraktion kann in verschiedener Weise aus dem erhaltenen Extrakt abgetrennt werden. Hier ist die Abtrennung durch ein chromatographisches Verfahren vorzuziehen, das demjenigen ähnlich ist, welches von der Environmental Protection Agency in "Polyhalogenated" Dibenzo-p-diioxins/Dibenzofürans: Testing and Reporting Requirements. Federal Register 52, 108. 5. Juni 1987, Seiten 21412 - 21452, 40CFR, Abschnitte 707 und 766" beschrieben ist. Besonders bevorzugt ist die Abtrennung durch Fest-Flüssigchromatographie, beispielweise mit einer aus homogen mit Aktivkohle vermischten Glasfasern bestehenden festen Phase. Die Glasfasern und die Aktivkohle werden falls notwendig, nach Zugabe eines Lösungsmittels, bewußt vermischt (z. B. mit einer Vorrichtung, die gegenläufig rotierende Mischblätter besitzt oder mit einer Mühle). Der Gehalt an Aktivkohle Beträgt etwa 8 - 12 Gew.-%. wobei ein Gehalt von etwa 10% besonders bevorzugt ist.
• Die Dioxinfraktion wird am besten nach der letzteren Methode in einem mit einer Kolonne arbeitenden Verfahren abgetrennt. Zu diesem Zweck wird der Dioxinextrakt auf die Kolonne aufgegeben, die mit einer festen Phase aus Glasfasern ausgestattet ist, die mit Aktivkohle beschichtet sind. Nach dem Aufgeben des Dioxinextraktes wird die Koloune. falls notwendig, vorzugsweise mit einer aus CH&sub2;Cl&sub2; und Hexan bestehenden Mischung gewaschen, wobei ein Mischungsverhaltnis von etwa 0.8 bis 1,2 : 0,8 - 1,2 besonders bevorzugt ist. Es kann eine weitere Waschung mit anderen Lösungsmitteln folgen, wobei einen aus Dich1ormethan, Methanol und Toluol bestehende Mischung bevorzugt isL insbesondere in einem Mischungsverhältnis von 65 bis 85 :15 bis 25 : 0 bis 10. Für die beschriebenen Waschungen sind viele andere Lösungsmittel und Mischungen davon ebenfalls geeignet. Bevorzugte Lösungsmittel sind diejenigen, welche bereits im Zusammenhang mit der Herstellung der Extrakte erwähnt wurden. Die optimale Zusammensetzung der Waschflüssigkeiten muß für spezielle Zusammensetzungen des Extraktes möglicherweise empirisch bestimmt werden.
• Die Dioxinfraktion wird vorzugsweise nach Drehen der Kolonne um 180º eluiert. Für dieses Verfahren können verschiedene Lösungsmittel oder Mischungen davon verwendet werden. Bevorzugt hierfür ist die Verwendung von Toluol, Benzol, Xylolen und ihren chlorierten Derivaten. Toluol ist besonders bevorzugt. Die Bestimmung von geeigneten Zusammensetzungen für die Wasch- und Eluierflüssigkeit kann durch Versuche vereinfacht werden, in welchen dem Dioxinextrakt ein markierender Farbstoff zugesetzt wird. Der markierende Farbstoff (Fat Blue B (p-Anthrachlnonderivat, das von Hoechst AG, Frankfurt/Main hergestellt wird;) wird in ähnlicher Weise adsorbiett und eluiert, wie die in Rede stehende Dioxinfraktion. Markierende Farbstoffe wie diese sind auch zur Überwachung von einzelnen Waschstufen des Eluierungsverfahrens geeignet.
• In Ausnahmefällen, in welchen die Dioxinfraktion noch störende Kompenenten enthält kann eine zusätzliche Reinigungsoperation verwendet werden. Dies kann beispielsweise eine weitere auf Fest-Flüssigchromatographie beruhende Extraktion sein. Es wurde gezeigt, daß ein chromatographisches Verfahren, welches eine Kolonne mit durch Säure imprägniertem Silicagel als feste Phase verwendet, besonders gut geeignet ist, Diese Kolonne kann durch Zugabe von etwa einem Teil von mit SO&sub3; gesättigter H&sub2;SO&sub4; zu ungehr 8 bis 12 Teilen von mit Oleum gesättigtem Silicagel und Erhitzen dieser Mischung wahrend etwa 10 bis 20 Minuten auf etwa 70 bis 90ºC hergestellt werden. Die noch unreine Dioxinfraktion wird einem teil des aktivierten Silicagels zugesetzt, und diese Mischung wird als oberste Schicht auf eine Kolonne aufgegeben. Weitere Schichten, die aus etwa 5 bis 15% AgNO&sub3; enthaltendem Silicagel (erhalten durch Mischen von wässeriger AgNO&sub3;-Lösung mit Silicagel und anschließendes Verdampfen des Wassers) und aus Oleum und Silicagel bestehen, können ebenfalls eingegeben werden. Die Schichten sollten durch Silicagel oder aktiviertes Silicagel voneinander getrennt sein. Das Dioxin kann aus einer in der beschriebenen Weise hergestellten Kolonne durch Eluieren mit einem unpolaren organischen Lösungsmittel, wie Hexan, Cyclohexan, Benzol und Toluol, vorzugsweise Hexan, erhalten werden. Die mit der ELISA-Methode erhaltenen Analysendaten von Figur 1 veranschaulichen, daß eine nach einer einzigen, mit einer Kohlekolonne durchgeführten Extraktion durchgeführte zweite Extraktion von in PCB-Transformatoröl (Diagramm A) oder in Trichlorphenol (Diagramm B) enthaltenen Dioxinen mit der Oleum-Silicagelkolonne, die durch immunologische Bestimmung erhaltenen Analysenergebnisse nicht änderte, daß diese aber nicht aus Dioxinen bestehendes, zur immunochemischen Kreuzreaktion befahigtes Material aus dem Destillationsrückstand der Probe # 1 aus dem Kolonnensumpf (Diagramm C) entfernte.
• Die nach dem beschriebenen Verfahren erhaltene Dioxinfraktion wird dann zum Nachweis von Dioxinen durch Reaction mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern analysiert. Das immunologische Bestimmungsverfahren kann in verschiedener Weise angewendet werden beispielsweise so, wie es in P. Tijssen, "Practice and Theorie of Enzyme Immunoassays" (Herausgeber R. H. Burden und P. H. Van Knippenberg) Elsevier, Amsterdam (1985) beschrieben ist. Das immunologische Bestimmungsverfahren wird vorzugsweise als konkurrierende Bestimmung durchgeführt. Zu diesem Zweck wird die konzentrierte Dioxinfraktion am besten in einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln gelöst, wobei unpolare organische Lösungsmittel, wie Hexan und Cyclohexan, für diese Zwecke besonders geeignet sind. Zu dieser Lösung wird bewußt eine alkoholische Lösung von Detergentien, vorzugsweise ein oder mehrere nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Cutscum (Isooktylphenoxy-polyethoxyethanol, Fischer Scientific Company, Raleigh, NC, USA), Polyoxyethylenether, wie Polyoxyethylenstearylether oder Polyoxyethylenlaurylether, N-Oktanoylglucopyranoside, N-Heptylglucopyranoside, Nonanoyl-N-methylglucamid, Heptanoyl-N-methylglucamid, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Oktylphenolethoxylat, 3-(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio-2-hydroxy-1-propansulfonat, 3-(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propansulfonat oder Oktanoyl-N-methylglucamid, wobei Polyoxyethylenether,, wie Polyoxyethylenstearylether und Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, welches als Tween bekannt ist, Oktylphenolethoxylat und Cutscum beforzugt sind. Besonders bevorzugt ist Cutscum .
• Die erwähnten Detergentien werden vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-% verwendet, wobei eine Konzentration von weniger als 1 Gew.-%, insbesondere etwa 0,1 bis 0,4 Gew.-%, besonders bevorzugt ist. Die Auswirkung der Detergenskonzentration auf die Empfindlichkeit des immunologischen Nachweises wird in Figur 2 dargestellt. Die maximale Wirksamkeit trat ein, wenn die Konzentration an Detergens etwa 0,1 bis 0,4 Gew.-% betrug. Wenn die Konzentration an Detergens zu hoch ist, löst sich das Dioxin zwar gut es wird jedoch vom Antikörper nicht mehr "erkannt", was zu einer verminderten Empfindlichkeit des immunologischen Nachweises führt. Die wässerige Lösung des Detergens kann auch einen Anteil an organischem Lösungsmittel, wie Aceton oder Methanol, enthalten, um das Pipettieren zu erleichtern.
• Die vereinigten Lösungen werden getrocknet, beispielsweise durch einen Strom von Stickstoff oder warmer Luft. Anschließend wird der monoklonale Antikörper zugegeben, welcher in einer wässerigen Pufferlösung gelöst sein kann.
• Die wässerige Pufferlösung zum Suspendieren der Dioxinfraktion ist aus verschiedenen Substanzen zusammengesetzt. Sie enthält vorzugsweise die folgenden Bestandteile: etwa 0.05 bis 0,15 Mol/l einer Verbindung oder einer Mischung von Verbindungen, die in einem pH-Bereich von 7 - 8 als Puffer wirken, wobei Puffersubstanzen, welche auf Tris(hydroxymethyl)-aminomethan oder Phosphatpuffern basieren, besonders bevorzugt sind, etwa 0,1 bis 5 Gew.-% eines Proteins, insbesondere etwa 0,2 bis 1 Gew.-% eines Proteins, vorzugsweise Eialbumin, Kaninchenserumalbumin oder Rinderserumalbumin, wobei Rinderserumalbumin besonders bevorzugt ist: etwa 0,1 bis 0,3 Mol/l eines Alkalihalogenides vorzugsweise NaCl: etwa 0,005 bis 0,5 Vol.-% Detergentien, besonders bevorzugt 0,008 bis 0,012 Vol.-% Detergentien, vorzugsweise eines der oben erwähnten Detergentien, insbesondere Polyoxyethylensorbitanmonolaurat.
Immunologische Bestimmung
• Das beforzugte Gefäß zum Durchführung der konkurrierenden immunologischen Bestimmung ist ein vorzugsweise aus Polystyrol bestehendes, mit einem Überzug aus Antigen versehenes Prüfrohr, vorzugsweise in Form einer Mikrotiterplatte. Das den Überzug bildende Antigen kann in verschiedener Weise aufgebracht werden, beispielsweise so, wie es in der vorgenannten Monographie von R. Tijssen beschrieben ist. Vorzugsweise wird eine Lösung eines Dioxin-Proteinkonjugates verwendet, das aus polyhalogenierten polycyclischen Aromaten von ebener Struktur, vorzugsweise aus Dibenzodioxin oder Dibenzofuran besteht, die mit einem Säugetierserumalbumin, bevorzugt Kaninchen- oder Rinderserumalbumin umgesetzt wurden, mit der das Reaktionsgefäß behandelt wird.
• Nachdem das mit dem Überzug versehene Gefäß mit einer Antikörper-Dioxin-Mlschung inkubiert wurde, kann das nicht gebundene Material ausgewaschen werden, und das gebundene Antikörpermaterial kann in bekannter Weise, beispielsweise durch Messung der Markierung des Antikörpers, nachgewiesen werden. Für die Markierung kann ein radioaktives Isotop oder Verbindungen welche sich in einer durch Enzyme katalysierten Reaktion an einer Emission von Chemilumineszenz oder Fluoreszenz beteiligen können, verwendet werden. Je stärker das während der konkurrierenden Bestimmung wahrgenommene Signal ist, um so niedriger ist die Konzentration an Dioxin in der untersuchten Probe. Die fruhere Durchführung der Bestimmung zeigte eine praktische Grenze des Nachweises von Hapten, wenn die Menge des verwendeten Protein-Haptenkonjugates auf 50 ng/Vertiefung (der Mikrotiterplatte) beschränkt wurde.
• Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der konkurrierenden immunologischen Bestimmung schließt jedoch die Beschichtung der zur Immunreaktion befähigten Vertiefungen mit einer beschränkten Menge an Antigen ein, da weniger Analysensubstanz benötigt wird, um den Antikörper vom gebundenen Hapten abzuziehen. Die optimale Empfindlichkeit des Nachweissystems wird erhalten, wenn die bevorzugte Konzentration des den Überzug bildenden Antigens von 100 ng auf etwa 0,5 ng den Überzug bildendes Antigen pro Vertiefung (der Mikrotiterplatte) vermindert wird, wobei eine Konzentration zwischen etwa 0,2 ng bis 1,0 ng besonders bevorzugt ist. Um eine derart begrenzte Menge von den Überzug bildendem Antigen nachzuweisen, muß jedoch das Signal zusätzlich verstärkt werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Verstärkung des durch Enzyme katalysierten optisch wahrnehmbaren Signals besteht in der Verwendung eines Avidin-Peroxidase/Biotin-Antimaus Immunoglobulinsystems, welches die Empfindlichkeit der immunologischen Bestimmung verbessert, wenn sie mit niedrigen Hintergrundmengen an aufgebrachtem Antigen durchgeführt wird. Das Avidin-Peroxidase/Biotin-Antimaus Immunoglobulinsystem kann dazu verwendet werden, die Wirksamkeit einer an Enzyme gebundenen immunologischen Bestimmung zu verbessern, weil das Biotin ohne Verlust an Aktivität leicht mit den Antikörpern oder Enzymen gekoppelt werden kann. Die außerordentlich hohe Bindungsaffinität von Avidin 10¹&sup5;/M) zu Biotin führt zur Bildung von überbrückenden Komplexen zwischen den mit Biotin umgesetzten Molekülen. Sowohl der spezifisch bindende Antikörper als auch das aus Peroxidase und Enzym bestehende Indikatorsystem sind au Biotin gebunden. Die Bindung der Biotinmoleküle an Avidin führt zur Komplexierung der Indikatormoleküle und erhöht die Empfindlichkeit des spektral nachweisbaren Signals.
• Dioxinspezifische Antikörper können nach den in Kapitel 3 der oben erwähnten Monographie von P.Tijssen beschriebenen Verfahren mit Biotin konjugiert werden. Biotinyl-N-hydroxysuccinimid(BNHS)ester kann mit dem dioxinspezifischen Antikörper umgesetzt werden, um biotinylierte Immunoreaktanten herzustellen. Nach einem bevorzugten Verfahren kann der dioxinspezifische Antikörper durch Bindung eines biotinylierten Antimaus IgG Immunoglobulins an den Antikörper identifiziert werden. Die biotinylierte Peroxidase Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kann nach der Brückenbildung zum Avidin-Biotin-Verstärkungskomplex als Signal für den Nachweis verwendet werden.
• Bei Verwendung des in vorliegender Erfindung beschriebenen Verfahrens kann mit einer einzigen Analyse eine Aussage über die Verunreinigung einer Probe durch Dioxin gemacht werden. Um einen höheren Grad von Sicherheit von quantitativen Aussagen sicherzustellen, ist es jedoch am besten, eine Verdünungsreihe der zu untersuchend en Probe zu messen, vorzugsweise gleichzeitig mit Standardproben mit bekanntem Dioxingehalt. Es wurde radioaktiv markiertes Dioxin verwendet, um die Wirksamkeit der verschiedenen Verfähren zu bestimmen, die verwendet wurden, um Dioxin in den wässerigen Analysenlösungen zu suspendieren. Die Wirkungsgrade bei der Rückgewinnung der Proben betrug normalerweise etwa 90%, bei nicht weniger als 70% Rückgewinnung.
• Es kann ein Analysenkoffer (Test Kit) zur Ausführung der erfindungsgemäßen Reaktion zusammengestellt werden, welcher alle notwendigen Chemikalien, wie Mäterialien für die Chromatographie, Lösungsmittel und Eluierungsmittel, Prufröhren, Detergentien, Antikörper und Chemikalien für die Nachweisrektion enthält. Ein solcher Analysenkoffer sollte vorzugsweise auf eine Endpunktbestimmung durch Fluoreszenzreaktion oder eine durch Enzyme katalysierte Reaktion abgestellt sein, weil die Kosten für die Ausstattung des Analysenkoffers dann für die Verwendung in fast jedem Laboratorium wirtschaftlich und bequem verfügbar wären.
BEISPIEL 1 - Extraktionsverfahren
• Der Dioxingehalt eines Destillationsruckstandes kann nach der Extraktion und der Fraktionierung mit spezifischen Antikörpern bestimmt werden. Eine Probe von 5 d eines Destillationsrückstandes wird in 20 ml mit SO&sub3; gesättigter H&sub2;SO&sub4; suspendiert und mit Silicagel vermischt, bis eine fließfähige Mischung erhalten wird. Die Mischung wird in einer Soxhlet-Extraktionsapparatur mit ungefähr 200 ml siedendem Toluol extrahiert. Der Rotationsverdampferextrakt und 1 mg Fat Blue B werden in 50 ml Dichlormethan/Cyclohexan (50:50) gelöst und auf eine Kolonne aufgegeben, die mit 1g Aktivkohle (10%) auf Glasfasern (63 - 200 µm Dicke), welche durch Trocknen bei 130ºC wahrend mehrerer Stunden aktiviert worden waren, gefüllt war. Die Kolonne wird mit 50 ml Dichlormethan/Cyclohexan (50:50) und 5() ml Dichlormethan/Methanol/Toluol (75:20:5) gewaschen. Die Kolonne wird anschließend umgedreht und in der umgekehrten Richtung mit 50 ml Toluol eluiert. Das Toluoleluat enthält die "Dioxinfraktion" und ist blau gefärbt. Das Toluol wird durch Verdampfen im Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 1 ml Hexan gelöst. Die Hexanlösung wird auf 2 g Oleum/Silicagel (1:10) aufgegeben, welches ebenfalls durch vorheriges Erhitzen auf 130ºC aktiviert worden war, und bei 80ºC während 15 Minuten im Rotationsverdampfer gemischt. Die Probe, die auf dem Silicagel absorbiert war , wird auf eine mit 1 g Oleum/Silicagel (1:10), 1 g Silbernitrat/Silicagel (1: 10) und 0,5 g Silicagel zwischen den Schichten gefüllte Kolonne aufgegeben. Die Kolonne wird mit 50 ml n-Hexan eluiert. Das die "Dioxinfraktion" enthaltende Eluat wird im Rotationsverdampfer eingedampft, der Rückstand in 500 ul n-Hexan gelöst und in der konkurrierenden immunologischen Bestimmung auf Dioxingehalt untersucht. Gemäß der konkurrierenden immunologischen Bestimmung hatte die untersuchte Probe einen Gehalt an Dioxinequivalenten, der 25 ppb betrug.
BEISPIEL 2 - Immunologisches Bestimmungsverfahren
• Das konkurrierende Analysenverfahren für Dioxine wurde bereits im einzelnen durch Stanker et al. (1987) Chemosphere 16, 1635 - 1639, diskutiert. Ein großer Teil des Erfolges des vorliegenden Verfahrens, welches monoklonale Antikörper mit charakteristischer Bindungsspezifität verwendet, ist auf die Entwicklung einer zuverlässigen Arbeitsvorschrift für ein konkurrierendes ELISA-Verfahren zurückzuführen. Mikrotiterplatten werden mit einem Überzug von Tri-CDD-Albumin (Antigen)-Lösung versehen, einer blockierenden Albuminlösung ausgesetzt und dann einer Verdünnungsreihe einer löslich gemachten Probe oder einer Dioxin- Standardlösung unterworfen. Wenn die Lösung des Antikörpers zugegeben wird, verteilt sich der Antikörper zwischen dem an die Platte gebundenen Tri-CDD-Albumin (Antigen) und der Dioxinprobe in Lösung. Nach der Reaktion wird die Lösung der Probe entfernt und die Platte wird noch einmal gewaschen und mit einem durch ein Enzym markiertem Erkennungsmolekül inkubiert. Die Entwicklung des Enzym-Antikörper-Konjugates mit einem geeigneten Substrat ermöglicht das Sichtbarmachen des monoklonalen Antikörpers, der sich an das auf der Platte fixierte Tri-CDD-Albumin(Antigen) gebunden hat. Die Ergebnisse werden dann als Bruchteil der Reaktion in Vertiefungen ohne Konkurrrenten angegeben. Aus diesen Daten kann man die Konzentration berechnen, die erforderlich ist, um die Bindung des Antikörpers zu 50% zu hemmen (I&sub5;&sub0;).
• Für die immunologische Bestimmung die von Stanker et al. (1987) beschrieben wurde, wird die "Dioxinfräktion" in fünf gleiche Teile von 100 ul geteilt. Zwei Teile bleiben unverändert, während ein Teil sechs Mal im Verhältnis 1:2 verdünnt wird, und zwei Teile mit 1 oder 10 ng 2,3,7,8-TCDD-Standard versetzt werden. Als Detergenslösung werden jeder Probe 40 ul einer 0.5%igen Lösung von Cutscum in Aceton zugesetzt, und die Lösungsmittel werden unter einem Stickstoffstrom entfernt. Die Rückstände werden mit 100 ul der dioxinspezifischen Antikörper (100 ng/ml) in der Tris-hydroxymethyl(aminomethan)-Pufferlösung suspendiert und auf eine Mikrotiterplatte aufgebracht, die mit einem Trchlordibenzodioxin (Tri- CDD)-Kaninchenserumalbumin-Konjugat beschichtet ist. Die zurückgehaltenen Antikörper werden mit Schaf-Antimaus IgG Peroxidase und o-Phenylendiamin (OPD) als Substrat durch eine Farbreaktion quantitativ bestimmt wobei die Lichtabsorption bei 492 nm gemessen wird.
• Ein bevorzugtes Verfahren für die immunologische Bestimmung schließt die Verstärkung des Peroxidase- Enzym-Endpunktes durch Kuppeln an einen Avidin-Peroxidase/Antimaus-Immunoglobulinkomplex ein. Optimale Empfindlichkeit des Enzyms tritt ein, wenn eine minimale an überzugbildendem Antigen (Tri- CDD-BSA) verwendet wird. Die Gesamtkapazität der Platte zur Bindung von Protein ist groß. so daß das überschüssige nicht konjugierte Trägerprotein keine Bindungen abbaut. Im bevorzugten Verfahren werden die Mikrotiterplatten durch Zugabe von 0.2 bis 1,0 ng Tri-DD-BSA/Vertiefung, bevorzugter 0,5 ng/Vertiefung mit einer Tri-CDD-BSDA-Lösung beschichtet. Die beschichtete Platte kann getrocknet und gelagert werden, bis sie gebraucht wird.
• Die aus der Probe gewonnenen Extrakte werden aus Glasfläschchen (Schalen) mit Hexan in die mit einem Überzug von Antigen versehenen Vertiefungen der Mikrotiterplatte übertragen, wo sie mit 40 ul einer 0,5%igen Lösung von Cutscum als Detergens in Aceton löslich gemacht werden. Die Proben werden über Nacht bei Raumtemperatur oder mit einem Strom von darüber geblasener warmer Luft bei 45ºC getrocknet. Die immunologische Bestimmung wird durch Inkubation von Proben mit dioxinspezifischen Antikörpern bei einer Konzentration von 100 ng/ml in einer für die Bestimmung geeigneten Pufferlösung während einer Stunde bei 37ºC durchgeführt. Die Mikrotiterplatten werden mit einer 0,5%igen Detergenslösung (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) als Waschlösung gewaschen (2x).
• Der Antikörper, welcher sich zwischen dem gebundenen Dioxin-Antigen auf der Plattenoberfläche und dem ungebundenen Dioxin der extrahierten Probe verteilt hat, wird sichtbar gemacht, wenn er durch Bindung mit biotinyliertem Antimaus IgG Immunoglobulin (ungefähr 1,5ug/Vertiefung) an das auf der Plattenoberfläche befindliche Antigen gebunden wird. Nach einer Inkubation von 45 Minuten werden Avidin-Peroxidase- Komplex und biotinyliertes Antimäus-Immunoglobulin zugesetzt und weitere 30 Minuten reagieren gelassen. Nach einer 5-maligen Wäsche mit einer 0,5%igen Detergenslösung (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) werden Peroxid und o-Phenylendiamin (OPD)-Substrat zugesetzt, und nach dem Abstoppen mit konzentrierter Schwefelsäure wurde eine erste Ablesung des Fast ELISA-Abfalles bei 450 nm und abschließende Fast ELISA-Ablesungen bei 492 nm durchgeführt.
• Die Werte der Proben wurden mit einer Standardkurve verglichen, die für jede Mikrotiterplatte aufgenommen wurde. Die Standardkurve zeigt einen Hemmwert von 50% zwischen 0,1 und 0,3 ng TCDD. Die relativen Daten werden als Funktion von Grammequivalenten Ausgangsmaterial pro Vertiefung angegeben.
• Gleichzeitig wird für jede Mikrotiterplatte eine Verdünnungsreihe eines 2,3,7,8-TCDD-Standards im Verhältnis 1:2 im Bereich von 0. 1 bis 500 ppb durchgeführt.
BEISPIEL 3 - Auswertung
• Die Konzentration einer Probe kann, bezogen auf die mit einer Verdünnungsreihe des 2,3,7,8-TCDD-Standards hergestellten Eichkurve, in TCDD-Equivalenten angegeben werden. Der doppelte Wert der unverdünnten Probe sollte den Werten in der Verdünnungsreihe entsprechen. Eine Störung durch Grundsubstanzen, welche nicht entfernt worden sein können, zeigt sich durch Diskrepanzen in den Proben, denen Standardsubstanz zugesetzt wurde. Die Bestimmung einer Probe wird ungültig, wenn die in den Proben durch Zusatz von Standardsubstanz eingestellte Konzentration nicht der Probe plus den der Probe zugesetzten 1 oder 10 ng entspricht.
BEISPIEL 4 - Proben aus industriellen Verfahren
• Eine Reihe von industriellen chemischen Proben aus Labor- und technischen Verfahren wurden nach dem oben beschriebenen Verfahren auf Verunreinigung durch vorhandene Dioxine und Dibenzofurane untersucht (Tabelle 1, Seite 18 am Ende der Beschreibung). Die praktischen Beispiele für die Bestimmungen schließen fünf Proben von verschiedenen Destillationsrückständen (Kolonnensumpfprodukt), 2,4,6-Trichlorphenol (TCP), Nitrodiphenylether, eine Probe von Flugasche und eine Probe von polychloriertem Biphenyl (PCB) Öl aus einem Transformator, der in einen Brand verwickelt war. Diese Beispiele variierten nach Art und Menge der vorhandenen Verunreinigungen beträchtlich. Der Grad der Verunreinigung durch Dioxine, welcher in Proben bestimmt wurde, die zur immunologischen Bestimmung vorbereitet worden waren, wurde mit der Verunreinigung von Parallelproben durch Dioxin verglichen, die durch Gaschromatographie/Massenspektroskopie bestimmt wurde, welche von Dr. B. Bogdoll (H. Anders, A. Buhlmann und B. Bogdoll - nicht publizierte Ergebnisse) zur Verfügung gestellt wurden. Die GC/MS-Daten waren als der Gesamtgehalt aller tetra- und pentachlorierten artverwandten Verbindungen, und als Gesamtverunreinigung durch die vier giftigsten artverwandten Verbindungen (2,3,7,8-Tetra-CDD, 2,3,7,8- Tetra-CDF 1,2,3,7,8- Penta-CDD und 2,3,4,7,8- Penta-CDF) angegeben. Die meisten Proben enthielten eine Mischung von PCDF's und PCDD's, während einige nur eine dieser Gruppen von Verbindungen enthielten. Es wurden auch Proben einbezogen, die keine Vorgeschichte hatten, die eine Verunreinigung durch PCDD und PCDF vermuten ließ. Diese umfaßten 3,4-Dichlornitrobenzol (dCNBz) von technischer Qualität ein, von welchem angenommen wurde, daß es möglicherweise eine Kreuzreaktion eingehen würde; Paraffin, das nicht leicht durch GC/MS-Analyse untersucht werden kann; und HD-30 Maschinenöl, welches eine übliche Grundsubstanz ist, die auf PCDD analysiert wird.
• Die ELISA-Analysen aus Proben von chemischen Verfahren erforderten verschiedenen Mengen an Probenmaterial. Die zur Bestimmung des 50% Hemmpunktes des ELISA-Verfahrens benötigte Menge an Ausgangsmaterial betrug für Kolonnensumpf # 1 1 mg, für die Proben von PCB und TCP je 10 mg, und für die Flugaschenprobe 0,4 g. Diese Proben zeigten, ausgedrückt in Equivalenten von PCDD einen Grad von Verunreinigung von 5.000, 500, 500 beziehungsweise 25 ppb. Gleiche Bewertungen der Verunreinigung durch PCDD wurden gemacht, wenn diese Proben an einem darauffolgenden Tag nochmals durch immunologische Bestimmung analysiert wurden.
• Vier Proben welche keine Wirkstoffe enthielten die in nachweisbarer Weise die ELISA-Bestimmung hemmen, nämlich die beiden dCNBz-Proben, Paraffin und Maschinenöl wurden untersucht, um festzustellen, ob diese Grundsubstanzen die Bestimmung zum Nachweis von Dioxin störten. Proben, die mit 1, 3 oder 10 ng Tetra-CDD versetzt worden waren, zeigten eine ähnliche Hemmung bei der ELlSA-Bestimmung, wie diejenige, welche durch Zugabe von ähnlichen Mengen Dioxin in Hexan verursacht würde.
BEISPIEL 5- Bodenproben
• In einem Versuch, eine minimale Verfahrenszeit zu ermitteln, die eine hohe Rückgewinnung von Dioxinen ergibt, wurden Bodenproben in mehreren Extraktionsverfahren untersucht. Vergleiche, die mit Verfahren durchgeführt wurden, die sowohl die Arbeitsvorschrift für eine über Nacht mit einem großen Volumen von Hexan durchgeführte Extraktion oder eine kürzere Arbeitsweise mit zwei Waschungen mit Hexan verwendeten, zeigten, daß jedes der Verfahren eine Rückgewinnung von über 90% an zugesetztem radioaktiv markiertem TCDD ergab.
• Es wurde ein Schnellextraktionsverfahren untersucht, das zwei aufeinanderfolgende Waschungen der Boden-Natriumsulfat-Probe mit 10 ml Hexan ohne über Nacht durchgeführtes Mischen verwendete. Wenn zur Extraktion Acetonitril/Methylenchlorid (1:1) verwendet wurde, wurde eine niedrigere und starker streuende Rückgewinnung der radioaktiv markierten Indikätorsubstanz beobachtet.
• In einem beispielhaften Extraktionsverfahren für Bodenproben wurden 10 g feuchtes Bodenmaterial durch Schütteln mit 10 g Natriumsulfat während einer Stunde getrocknet. Die Probe wurde mit 10 ml Hexan und 5 ml Ethanol extrahiert, zentrifugiert und die Hexanschicht mit einer Pipette entfernt. Die Mischung wurde nochmals mit 10 ml Hexan extrahiert, welches zugemischt und 15 Minuten geschüttelt wurde. Heftiges Schütteln mit einer handelsüblichen Schüttelvorrichtung für Farben vor der Trennung der Phasen verbesserte die Wirksamkeit der Extraktion. Die Hexanschichten wurden vereinigt und ihr Volumen wurde in einem Rotationsverdampfer eingeengt. Das Lösungsmittel wurde unter einem Strom von trockenem Stickstoff entfernt und der Rückstand wurde in 1 ml Dichlorhexan/Cyclohexan (1:1) resuspendiert und mit Fat Blue B versetzt. Die Probe wurde auf eine mit Aktivkohle/Glasfasern (1:9) beschickte Kolonne aufgegeben. Die Kolonne wurde mit Dichlormethan/Methanol/Toluol (15:4:1) gewaschen und die Dioxine wurden durch umgekehrtes Eluieren mit Toluol gewonnen. Die PCDD's (polychlorierte Dibenzodioxine) und TCDF's (polychlorierte Dibenzofürane) wurden zusammen mit dem Fat Blue B Farbstoff-Indikator eluiert. Die Probe wurde dann auf eine Kolonne aufgegeben, welche mit rauchender Schwefelsäure imprägniertes Silicagel und mit Silbernitrat imprägniertes Silicagel enthielt, mit Hexan eluiert und eingedampft. Die Probe wurde, wie vorstehend beschrieben, löslich gemacht und durch immunologische Bestimmung analysiert.
• Bodenproben, denen 0,1 - 10 ppb Tetrachlodibenzedioxin (TCDD) zugesetzt worden war, zeigten in den extrahierenden Waschungen normalerweise eine 95%ige Rückgewinnnng des zugesetzten TCDD. Extrakte aus zusammengesetzten Böden, die aus 0,1 und 1,0 g Boden gewonnen wurden, störten bei einem mit einer TCDD-Standard-Kurve in Pufferlösung durchgeführten Versuch nicht. Wenn mit Standardsubstanz versetzte Proben nach dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert und mit einem Ergebnis analysiert wurden, das 0,2 g Equivalenten Boden/Vertiefung entsprach, stimmten die Ergebnisse der immunologischen Bestimmung gut mit den Werten überein, die für Böden erwartet wurden, die im Bereich von 0,1 - 10 ppb mit Dioxinen verunreinigt waren. Es bestand eine größere Übereinstimmung der Ergebnisse der immunologischen Bestimmung mit der zur Probe zugesetzten Menge Standardsubstanz, wenn 1,0 g Equivalent Bodenextrakt/Vertiefung bestimmt wurde. Dies ergab eine lineare Wechselbeziehung im Bereich von 0,1 bis 1,0 ppb, obwohl Bestimmungen von Probenextrakten bei 10 ppb außerhalb des linearen Bereichs der Kurve lagen.
• Mehrere Analysen einer Bodenprobe stimmten überein, wenn die Analyse über eine Zeitspanne von mehreren Monaten wiederholt wurde. Eine ausgewählte Bodenprobe mit einem Gehalt an organischem Material von weniger als 1% und einem Sandgehalt von 80% wurde über Nacht in Hexan und daran anschließend über Nacht mit Schwefelsäure extrahiert. Die Behandlung mit Schwefelsäure störte den immunologischen Nachweis nicht. Die mit Bodenextrakt und von mit Standardsubstanz versetzten Proben von Bodenextrakten erhaltene Kurve zeigte, daß nachweisbare Gehalte von Dioxin in den Bodenextrakten vorhanden waren.
• Restliche Grundmaterialien von verschiedenen Böden können die Bestimmung stören. Auch nach der Extraktion belegte ein Teil von einigen Böden mit Beschlag und machte es für die dioxinspezifischen Antikörper unerreichbar. Einige Böden enthalten große Mengen von in Hexan löslichem organischem Material, an welches sich das Dioxin bindet, statt sich in dem für die immunologischen Bestimmung verwendeten Lösungsmittel zu verteilen. Bei einigen Proben verbesserte eine vorherige Säulenchromatographie mit Alumniumoxid oder Kieselsäure die Empfindlichkeit der Bestimmung nicht. Der Gesamtgehalt des Bodens an organischem Material oder die physikalischen Eigenschaften des Bodens waren allein keine guten Indikatoren dafür, ob der Boden in geeigneter Weise durch immunochemische Mittel auf Dioxin analysiert werden konnte. Bei einigen Böden mit niedrigem Gehalt an organischem Material entfernt eine einfache Extraktion mit Hexan zusammen mit einer Behandlung mit Schwefelsaure störende Bestandteile in wirksamer Weise, so daß durch eine immunologische Bestimmung eine Verunreinigung durch Dioxin im Bereich von 1 ppb nachgewiesen werden kann. Es wird erwartet, daß die oben beschriebenen präparativen Bedingungen in gleiche Weise für Gewebe- oder Nahrungsmittelproben geeignet sind. TABELLE 1 Auf Dioxine analysierte chemische Proben Probe Grad der Verunreinigung (ppb) Immunologische Bestimmung Art Mengea (g/Analyse) alle artverwandten Tetra- u. Pentachlorverbindungen giftigste artverwandte Verbindungen Tetra-CDD-Equivalente Kolonnensumpf Nitrodiphenylether Flugasche Paraffin Maschinenöld a größte Menge von im ELISA-Verfahren pro Vertiefung untersuchten Probenextrakt. Ausgedrückt als Massenequivalente des Ausgangsmaterials. b von Dr. Bogdoll zur Verfügung gestellte GC/MS-Daten [12]. Die Zahlen für die "giffigsten aftverwandten Verbindungen" geben die Summe von 2,3,7,8-Tetra-CDD, 1 2,3,7,8-Penta-CDD, 2,3,7,8-Tetra-CDF und 1,2,3,7,8-Penta-CDF an. c aus einem Transformator, der gebrannt hatte. e die Probe enthielt nur Dioxine. f die Probe enthielt auch 18.000 ppb Tri-CDD. g die Probe enthielt nur Furane.

Claims (17)

1. Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von polyhalogenierten, eben gebauten, als Dioxine und Dibenzofurane bezeichneten, polycyclischen Aromaten in einer Probe, umfassend

a) Herstellung eines Rohextraktes durch Zersetzung der Probe durch Behandlung mit Säure;

b) Abtrennung der Fraktion der polyhalogenierten polycyclischen Aromaten mit ebener Struktur, welche als Dioxinfraktion bekannt ist;

c) Löslichmachen dieser Dioxinfraktion in einer wässerigen Lösung: und

d) Analyse der so erhaltenen Dioxinfraktion durch Reaktion mit spezifischen Antikörpern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Dioxine und Dibenzofurane in industriellen Proben bestimmt werden.

Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Dioxine und Dibenzofurane in Umweltproben bestimmt werden.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem die spezifischen Antikörper monoklonale Antikörper sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4 in welchem die spezifischen Antikörper aus Hybridomas der Gruppe, welche DD-1, DD-3, DD-4, DD-5 oder DD-6 mit den ATTC-Zugriffsnummern (HB 9741), (HB 9742), (HB 9743), (HB 9744) und (HB 9745) umfaßt, ausgewählt sind.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem der Behandlung mit Säure für Proben welche anorganischer Natur sind, eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, und für leicht lösliche Proben, welche in erster Linie organischer Natur sind, eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln folgt.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem die Dioxinfraktion durch Chromatographie abgetrennt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem die Dioxinfraktion durch Fest-Flüssig-Chromatographie abgetrennt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, in welchem in dieser Chromatographiestufe eine Grundsubstanz oder Grundsubstanzen aus der im wesentlichen aus Kohle-Glas, aktivierter Kieselsäure, Oleum-Kieselsäure, Silbernitrat-Kieselsäure und saurem Aluminiumoxid bestehenden Gruppe verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9, in welchem ein oder mehrere Farbstoffe verwendet werden, die ein ähnliches Absorptions- und Elutionsverhalten haben wie die zu bestimmende Substanz, um den Verfahrensschritt der Abtrennung durch Chromatographie zu überwachen.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem die Dioxinfraktion durch Zugabe eines oder mehrerer Detergentien in einer wässerigen Pufferlösung löslich gemacht wird.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem das Löslichmachen der Dioxinfraktion in wässeriger Lösung durch Vermischen unter Einwirkung von Ultraschall durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorausgehenden Ansprüche, in welchem die Bestimmungsreaktion in einer konkurrierenden Arbeitsweise durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, in welchem die Bestimmungsreaktion durch ein Signal angezeigt wird das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Emission eines radioaktiven Isotops, Emission von Chemilumineszenz, Emission von Fluoreszenz und ein mit einem Enzym gekoppeltes Signal umfaßt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, in welchem die konkurrierende Arbeitsweise mit einer Konzentration eines umhüllenden Antigens von etwa 1 - 10 ng pro Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, in welchem die Bestimmungsreaktion durch ein mit einem Enzym gekoppeltes Signal angezeigt wird, das durch eine Avidin-Biotin-Kopplung verstarkt wird.

17. Analysenkoffer (Test-Kit) zur Bestimmung von Dioxinen und Benzofuranen in einer belastigende Substanzen enthaltenden Probe, umfassend:

a) eine Einheit zum Zersetzen der Probe durch Behandlung mit Säure;

b) eine Einheit zur Abtrennung der Dioxinfraktion von den Proben; und

c) eine Einheit zur Bestimmung der Dioxinverbindungen durch dioxinspezifische Antikörper.