DE68908146T2

DE68908146T2 - Schutzstoff gegen strahleneffekte.

Info

Publication number: DE68908146T2
Application number: DE89904210T
Authority: DE
Inventors: Hayao Abe; Akira Dainiapato Awaya; Yusaku Ishizuka; Hisashi Kobayashi; Mikio Shikita
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1994-01-27
Anticipated expiration: 2009-04-05
Also published as: EP0377044B1; EP0377044A1; EP0377044A4; WO1989009613A1; KR920002700B1; DE68908146D1; KR900700127A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei Menschen oder Tieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Arzneimittels, das eine Schutzwirkung gegen verschiedene Strahlenschäden ausübt, oder eines Arzneimittels, das befähigt ist, die Heilung von Strahlenschäden, z.B. Störungen der Hämatopoese, zu fördern.
Kürzlich wurden Schäden beschrieben, die durch elektromagnetische Wellen zur medizinischen Anwendung, wie z.B. Röntgen- oder Gammastrahlen, oder durch Strahlung, wie z.B. kosmische Strahlung oder auch die im Sonnenlicht enthaltene UV- Strahlung, verursacht werden, insbesondere diejenigen Strahlenschäden, die bei der Radiotherapie von bösartigen Tumoren, Carcinomen und Leukämie auftreten. Radiotherapie stellt zusammen mit einer Operation eine radikale Krebsbehandlung dar. Aufgrund der frühen Schäden, die bei Patienten nach Bestrahlung auftreten, wurden Akzeptanz und Erfolgsaussichten dieser Therapie jedoch geschälert. Solche frühen Schäden umfassen Störungen der Hämatopoese, lokale Schäden, wie z.B. Fibrose in Organen, Haut oder Schleimhaut, sowie gastrointestinale Schäden. Insbesondere die Linderung und Heilung von Störungen der Hämatopoese sind sehr wichtig, um die Prognose der Patienten zu verbessern und ihre Lebenserwartung zu vergrößern.
Die Entwicklung eines Schutzstoffes zur Verhinderung und Heilung solcher durch Strahlung verursachter Schäden eröffnet die Möglichkeit, die Strahlendosen, mit denen die betroffenen Körperteile bei der Strahlentherapie bestrahlt werden, drastisch zu erhöhen, und trägt damit zu einer weiteren Steigerung der radiotherapeutischen Wirkung der Krebsbehandlung bei.
Ein wichtiges, zu lösendes Problem besteht darin, wie man Patienten vor den frühen Strahleneffekten, wie z.B. Erythem oder Pigmentierung der Haut, und vor den späten Strahleneffekten, wie z.B. Verbrennungen der Haut, Störungen der Hämatopoese, schnellerer Alterung oder Verkürzung des Lebens, und insbesondere vor der Gefahr einer sekundären Carcinogenese aufgrund der Strahlentherapie schützen kann.
Außerdem nimmt die Zahl der Krebspatienten zu, dies ist auf genetische Effekte, carcinogene Aktivität und dergleichen, auf die Strahlenexposition von Personen, die mit Strahlung umgehen, oder von Reaktorpersonal, wie auch auf den Kontakt mit intensiverer UV-Strahlung zurüchzuführen, die aus der Zerstörung der Ozonschicht in der oberen Stratosphäre aufgrund von Fluorkohlenwasserstoffgasen oder dergleichen resultiert.
Die menschliche Haut ist gegenüber UV-Strahlung im Wellenlängenbereich von 280 bis 320 nm empfindlich, die Strahlung im Bereich von 305 bis 310 nm wird als Verursacher von Hautkrebs angesehen. Es wurde diskutiert, daß die Zerstörung der Ozonschicht, die die UV-Strahlung in diesem Wellenlängenbereich normalerweise absorbiert, eine Verstärkung der bis zur Erde durchdringenden UV-Strahlung bewirkt und auf diese Weise zur vorstehend erwähnten Zunahme von Hautkrebs führt. Somit ist die Entwicklung eines Arzneimittels zur Verhinderung und Heilung solcher durch Strahlenexposition verursachter Schäden ein wichtiges Anliegen.
Als Mittel zum Schutz des lebenden Organismus vor Strahlenexposition wurden schwefelhaltige Aminverbindungen getestet, jedoch noch nicht klinisch angewendet. Seit kurzem ist Amifostine (Walter Reed Army Inst.) in den Vereinigten Staaten von Amerika als Strahlenschutzmittel in der klinischen Prüfung, wobei jedoch aufgrund ungünstiger Nebenwirkungen Probleme auftreten.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfinder haben das Ziel verfolgt, ein Arzneimittel zu entwickeln, das, anders als Chemotherapeutika wie Amifostine, die Schutzfähigkeit des lebenden Organismus stärkt, hierfür haben die Erfinder eine Vielzahl von Peptiden natürlichen Ursprungs mit hoher Sicherheit durchgetestet, wobei sie Substanzen gesucht haben, die als Schutzstoff zur Verhinderung von Strahlenschäden und zu deren Heilung nützlich sind.
Als Ergebnis wurde nun gefunden, daß ein Nonapeptid, bekannt als "Facteur Thymique Serique", nachstehend als FTS bezeichnet, und seine Derivate oder Salze das Verenden von mit Röntgenstrahlung bestrahlten Mäusen verhindern und somit das Überleben dieser Tiere oder die Verlängerung ihres Lebens sicherstellen. Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund der vorstehenden Erkenntnis erhalten und stellt einen Schutzstoff zur Verhinderung oder Heilung von verschiedenen Schäden bereit, die durch Röntgen-, Gamma-, UV-Strahlung oder dergleichen verursacht werden.
Die Erfinder haben kürzlich herausgefunden, daß FTS als Arzneimittel für Multiple Sklerose, Guillan-Barre-Syndrom, entzündliche Neuritis, Polyneuritis und verschiedene andere, mit Immunmangel einhergehende Erkrankungen, wie z.B. immunologische demyelinisierende Erkrankungen, nützlich ist, und sie haben solche Arzneimittel bereitgestellt (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho. 58-52225). Die Tatsache, daß ein Nonapeptid, das als FTS bekannt ist, eine schützende und therapeutische Wirkung zum Schutz vor Strahlenschäden besitzt, war nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten und wurde erstmals von den Erfindern entdeckt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Strahlenschutzmittel bereitgestellt, dadurch gekennzeichent, daß es als Wirkstoff ein Nonapeptid der folgenden Aminosäuresequenz:
pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
oder einen Ester oder ein Amid an der Carboxylgruppe des C- Terminus des Asparagins oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon enthält.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Nonapeptid kann ohne Schwierigkeit nach einem Verfahren der Flüssigphasen- oder Festphasen-Peptidsynthese hergestellt werden, das üblicherweise zur Synthese von gebräuchlichen Peptiden verwendet wird (bezüglich dieses Verfahrens vgl. die japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. Sho. 54-16425 und US-Patent 4 301 065). Alternativ kann das Nonapeptid auch durch ein gentechnisches oder ein zelltechnisches Verfahren hergestellt werden.
Die Ester an der Carboxylgruppe des C-Terminus des Asparagins im erfindungsgemäßen Nonapeptid sind die pharmazeutisch verträglichen Ester der Carbonsäure, Beispiele solcher Ester umfassen Methylester, Ethylester, Propylester, Isopropylester, n-Butylester, Isobutylester, tert.-Butylester, n-Pentylester, Isopentylester, Neopentylester, tert.-Pentylester, n-Hexylester, sek.-Hexylester, Heptylester, Octylester, sek.-Octylester, tert.-Octylester, Nonylester, Decylester, Undecylester, Dodecylester, Tridecylester, Tetradecylester, Hexadecylester, Octadecylester, Nonadecylester, Eicosylester, Cyclopentylester, Cyclohexylester, Cycloheptylester, Cyclooctylester, Allylester, Isopropenylester, Benzylester, o-, m- oder p- Chlorbenzylester, o-, m- oder p-Fluorbenzylester, o-, m- oder p-Brombenzylester, o-, m- oder p-Iodbenzylester, o-, m- oder p-Methylbenzylester, o-, m- oder p-Ethylbenzylester, o-, m- oder p-Isopropylbenzylester, Zimtsäureester, Aminoethylester, o-, m- oder p-Aminobenzylester, o-, m- oder p-Nitrobenzylester, o-, m- oder p-Methoxybenzylester, o-, m- oder p-Ethoxybenzylester, o-, m- oder p-Aminophenethylester, α-Furfurylester, α-Thienylmethylester, α-Pyridylmethylester, α-Pyridylethylester, Piperidinomethylester, α-Piperidylmethylester, Morpholinomethylester, α-Morpholinylinethylester. Die Amide an der Carboxylgruppe des C-Terminus des Asparagins im erfindungsgemäßen Nonapeptid sind die pharmazeutisch verträglichen Amide der Carbonsäure, Beispiele solcher Amide umfassen das Amid selbst, Methylamid, Ethylamid, Propylamid, Isopropylamid, n-Butylamid, Isobutylamid, tert.-Butylamid, n-Pentylamid, Isopentylamid, Neopentylamid, tert.-Pentylamid, n-Hexylamid, sek.-Hexylamid, Heptylamid, Octylamid, sek.-Octylamid, tert.Octylamid, Nonylamid, Decylamid, Undecylamid, Dodecylamid, Tridecylamid, Tetradecylamid, Hexadecylamid, Octadecylamid, Nonadecylamid, Eicosylamid, Cyclopentylamid, Cyclohexylamid, Cycloheptylamid, Cyclooctylamid, Allylamid, Isopropenylamid, Benzylamid, o-, m- oder p-Chlorbenzylamid, o-, m- oder p- Fluorbenzylamid, o-, m- oder p-Brombenzylamid, o-, m- oder p- Iodbenzylamid, o-, m- oder p-Methylbenzylamid, o-, m- oder p- Ethylbenzylamid, o-, m- oder p-Isopropylbenzylamid, Zimtamid, Aminoethylamid, o-, m- oder p-Aminobenzylamid, o-, m- oder p- Nitrobenzylamid, o-, m- oder p-Methoxybenzylamid, o-, m- oder p-Ethoxybenzylamid, o-, m- oder p-Aminophenethylamid, α-Furfurylamid, α-Thienylmethylamid, α-Pyridylinethylamid, α-Pyridylethylamid, Piperidinomethylamid, α-Piperidylinethylamid, Morpholinoethylamid, α-Morpholinylmethylamid, Methoxycarbonyl-(α- mercaptomethyl)methylamid und Ethoxycarbonyl-(α-mercaptomethyl) methylamid.
Die vorstehend erwähnten pharmazeutisch verträglichen Salze umfassen Säureadditionssalze an der Aminogruppe des Nonapeptids und Salze mit Basen an der Carbonsäure des Nonapeptids. Die Säureadditionssalze umfassen diejenigen mit organischen Säuren und diejenigen mit anorganischen Säuren. Beispiele dieser Salze sind Salze mit Carbonsäuren, wie z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Trifluoressigsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Maleinsäure, Oxalsäure und Naphthoesäure, und Salze mit Sulfonsäuren, wie z.B. Methansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und Naphthalinsulfonsäure, außerdem Salze mit anorganischen Säuren, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure.
Die vorstehend erwähnten Salze mit Basen umfassen Salze mit anorganischen Basen, wie z.B. Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze und Ammoniumsalze, außerdem Salze mit organischen Basen, d.h. Salze mit Aminen. Beispiele dieser Salze sind Lithiumsalz, Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz, Ammoniumsalz, Triethylaminsalz, Ethanolaminsalz, Trissalz und Dicyclohexylaminsalz.
Das erfindungsgemäße Strahlenschutzmittel kann entsprechend der Art der Dosierungsform in einer üblichen Art und Weise der herkömmlichen pharmazeutischen Praxis hergestellt werden. Ein Wirkstoff, ausgewählt aus dem Nonapeptid, einem Ester, einem Amid und einem Salz davon, wird gründlich mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Excipienten oder Verdünnungsmittel zum Erhalt einer geeigneten Dosierungsform verarbeitet. Eine beliebige Dosierungsform kann verwendet werden, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet ist, wie z.B. für die äußerliche Anwendung, die orale Verabreichung, die nicht-orale Verabreichung usw..
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Strahlenschutzmittels wird durch die nachstehend beschriebenen Experimente bestätigt. Hierbei wurden Mäuse, Ratten, Meerschweinchen oder ähnliche Säuger einer Ganzkörperbestrahlung unter Verwendung einer Röntgenapparatur (Shimazu Seisaku-sho, Shin-Ai 250 II) unterzogen, wobei die prozentuale Überlebensrate in einer Zeitspanne von 30 Tagen bestimmt wurde. Bei Durchführung dieser Experimente wurden bestimmte Mengen des Nonapeptids über verschiedene Verabreichungswege, z.B. den intraperitonealen, intravenösen, intramuskulären, subcutanen oder oralen Verabreichungsweg, entweder jeden Tag oder jeden zweiten Tag in einem bestimmten Zeitraum verabreicht, beginnend entweder vor oder unmittelbar nach der Bestrahlung, wobei das Körpergewicht der Tiere bestimmt und außerdem festgestellt wurde, ob sie noch lebten oder ob sie verendet waren. Gemäß den Ergebnissen dieser Experimente verendeten beispielsweise alle Mäuse einer Kontrollgruppe, wohingegen die prozentuale Überlebensrate einer Gruppe von Tieren, die das erfindungsgemäße Arzneimittel erhalten hatten, abhängig von der Bestrahlungsdosis, 40 bis 100% betrug. Außerdem wurde beobachtet, daß auch beim Verenden diejenige Gruppe, die das Arzneimittel erhalten hatte, eine signifikante oder deutliche lebensverlängernde Wirkung gegenüber der Kontrollgruppe zeigte. Außerdem zeigte die Gruppe, die das Arzneimittel erhalten hatte, hinsichtlich des Körpergewichts im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Hemmung des Körpergewichtsverlusts.
Andererseits wurden die Tiere einer Ganzkörperbestrahlung mit letalen oder subletalen Dosen unterworfen und die mit der Zeit auftretenden Veränderungen in der Zahl der Blutzellen für bestimmte Zeiträume gemessen, wobei die fördernde Wirkung des Arzneimittels auf die Heilung von Störungen der Hämatopoese getestet wurde. Die als Anzeiger verwendeten Blutzellen umfaßten rote Blutzellen, Reticulocyten, weiße Blutzellen, wie z.B. Lymphocyten und Neutrophile, Blutplättchen, Hämoglobine, Hämatokrit und dgl.. Bei Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels wurde beobachtet, daß die strahlungsbedingte Reduktion dieser Blutzellen deutlich gehemmt war und die Erholung auf normale Werte schneller vor sich ging. Außerdem wurden bei der Gruppe, die das Arzneimittel erhalten hatte, jeden Tag, bis die Tiere verendeten, die Immunantworten der Immunzellen getestet, d.h. die Kompetenz von Milzzellen zur Antwort auf Concavalin A (Con A) und die Reaktionsfähigkeit von Thymuszellen auf Interleukin-1 (IL-1), wobei gefunden wurde, daß sie deutlich höher waren als diejenigen der Kontrollgruppe. Auch hinsichtlich der Befähigung der Immunzellen zur Produktion von humoralem Faktor, d.h. der Befähigung von peritonealen Makrophagen (Mφ) zur Produktion von IL-1 und der Befähigung von Milzzellen und peritonealen Mφ zur Produktion von koloniestimulierendem Faktor (CSF), wurde gefunden, daß die Gruppe, die das Arzneimittel erhalten hatte, die Kontrollgruppe übertraf. Somit wird vermutet, wie auch diese Beobachtungen zeigen, daß das erfindungsgemäße Arzneimittel auf hämatopoetischen Organe, z.B. das Knochenmark und die Milz, einwirkt und eine lebensverlängernde oder lebenserhaltende Wirkung ausübt, indem es Störungen der Hämatopoese hemmt oder deren Heilung fördert, aus diesem Grund ist es als ein vorbeugendes und therapeutisches Mittel gegen Strahlenschäden wertvoll.
Ferner wurde bei strahlentherapeutischen Experimenten mit krebstragenden Mäusen beobachtet, daß durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels vor oder nach der Bestrahlung die Wirkung gegen Krebs potenziert und außerdem die durch die Bestrahlung ausgelösten Nebenwirkungen abgeschwächt wurden, woraus folgt, daß die Dosen, die üblicherweise für die Krebstherapie eingesetzt werden, wirkungsvoll erhöht werden können. Darüberhinaus hemmt die Verabreichung des erfindungsgemäßen Arzneimittels über einen bestimmten Zeitraum bei Mäusen die Entwicklung von strahleninduzierten Carcinomen, ungeachtet der Tatsache, daß die Bestrahlung von Mäusen bekanntermaßen Krebs auslöst.
Zur Prüfung der Toxizität des Wirkstoffs des erfindungsgemäßen Arzneimittels erhielten Mäusen täglich an 14 aufeinanderfolgenden Tagen subcutane Verabreichungen von 100 mg/kg Wirkstoff, wonach bei äußerlicher Untersuchung kein krankhaftes Symptom gefunden wurde. Außerdem erhielten Ratten täglich an 21 aufeinanderfolgenden Tagen subcutane Verabreichungen von 30 mg/kg Wirkstoff, wonach bei externer Beobachtung des Verhaltens, bei biochemischer Diagnose der Seren und beim Ergebnis der pathologischen Anatomie kein krankhaftes Symptom gefunden wurde. Somit ist das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung ein sicheres Arzneimittel mit extrem niedriger Toxizität, das langfristig verabreicht werden kann.
Tiere, denen das erfindungsgemäße Arzneimittel verabreicht werden kann, sind beispielsweise der Mensch, Haustiere, wie z.B. Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Kaninchen, Hund und Katze, Säuger, die im Zoo oder dgl. gehalten werden, wie z.B. Löwe, Elefant, Giraffe, Bär, Gorilla, Affe und Schimpanse, verschiedene Versuchstiere, wie z.B. Maus, Ratte, Meerschweinchen und dgl., zahme Vögel, z.B. das Geflügel, und Haustiere, wie z.B. Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische. Die Dosis des Arzneimittels beträgt üblicherweise 0,1 ug bis 500 mg/Tag pro kg Körpergewicht dieser Tiere. Das Arzneimittel kann in diesen Dosen beispielsweise in ein bis sechs Portionen täglich verabreicht werden. Die Dosis kann gemäß dem Alter, den Sypmptomen usw. der zu behandelnden Lebewesen entsprechend erhöht oder erniedrigt werden. Beim Verabreichungsweg des Arzneimittels besteht keine Einschränkung, es kann durch intravenöse, intramuskuläre, intracutane oder subcutane Injektion verabreicht werden. Das Arzneimittel kann zu einer Salbe verarbeitet werden, die in Augen, Mundhöhle, Nasenhöhle, auf die Haut oder dgl. aufgetragen werden kann. Das Arzneimittel kann in Form eines Suppositoriums, eines Gels, von Augentropfen, Nasentropfen, von Präparaten, die in Nasen- und Mundhöhle absorbierbar sind, eines Aerosols, eines Sprays, von oralen Präparaten oder dergleichen verabreicht werden. Um eine rasche Zersetzung oder Inaktivierung des Wirkstoffs im lebenden Körper zu verhindern, kann der Wirkstoff mit geeigneten pharmazeutischen Zusatzstoffen, z.B. alkoholischen, öligen oder fetten, physiologisch unschädlichen Feststoffen oder Flüssigkeiten, wie z.B. Lecithin oder einer Liposomensuspension davon, zu medizinischen Präparaten zubereitet werden, in denen die Aktivität langfristig erhalten bleibt.
Das Arzneimittel der vorliegenden Erfindung kann zusammen mit anderen Arzneimitteln, z.B. Modifikatoren der biologischen Antwort, wie z.B. positiven Immunmodulatoren und Glutathion, Adenin oder Cepharantin-Präparaten, die bekanntermaßen Leukopenie-heilende Aktivität besitzen, verabreicht oder alternativ mit diesen zu einem Kombinationspräparat verarbeitet werden, um die klinische Wirkung zu steigern.
Die vorliegende Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen und Versuchsbeispielen ausführlicher erläutert, jedoch sollen diese Beispiele in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken.

Beispiel 1 Präparat im Gläschen zur Injektion

1 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) wurde in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung sterilfiltriert, in ein Gläschen gefüllt und sodann gefriergetrocknet.

Beispiel 2 Ampullenpräparat zur Injektion

5 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und die Lösung sterilfiltriert und in eine Ampulle gefüllt.

Beispiel 3 Injektionspräparat zur subcutanen Injektion

2 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) pro Dosierungseinheit wurden in einer 2% Carboxymethylcellulose-PBS (physiologische Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) suspendiert. Die Suspension wurde mit Lipomal, umfassend Sojabohnen-Phosphatid (hergestellt von Huhtamaki OY/Leiras Pharmaceuticals Co.), oder Intralipid (hergestellt von Cutter Laboratories) als eine Öl-in-Wasser-Emulsion zur intravenösen Injektion gemischt. Sofern Lipomal verwendet wurde, wurde die PBS-Lösung, die zur Lösung von FTS verwendet wurde, mit der gleichen Menge von Lipomal gemischt. Sofern Intralipid verwendet wurde, wurden 2,5 ml der PBS-Lösung, die zur Lösung von FTS verwendet wurde, mit 0,1 ml Tween 80 (hergestellt von Sigma Chemicals Inc.) und 4,6 ml Intralipid gemischt.

Beispiel 4 Liposomenpräparat

Es gibt drei Typen von Liposomenpräparaten, die sich voneinander in der elektrischen Ladung unterscheiden. Die Liposomenpräparate werden nach ihren Strukturen in vier Typen eingeteilt.
Es gibt drei verschiedene elektrische Ladungen: neutral, positiv und negativ. Hinsichtlich der Struktur sind vier Typen bekannt: ein multilaminares Liposom (MLV, multilamellares Vesikel), ein kleines unilaminares Liposom (SUV, kleines unilamellares Vesikel), ein großes unilaminares Liposom (LUV, großes unilamellares Vesikel) und eines, das eine Struktur aufweist, das dem LUV ähnlich ist, jedoch mehrere Lamellen besitzt (REV, Umkehrphase-Verdampfungs-Vesikel).

(1) Liposom mit neutraler elektrischer Ladung, das FTS einschließt:

Ein Phospholipid, wie z.B. Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin, und eine Lösung von Cholesterin in Chloroform wurden in einem molaren Verhältnis von 2:1, 4:1 oder 1:1 gemischt und das Lösungmittel aus dem Gemisch durch Destillation unter vermindertem Druck einmal entfernt. Eine Lösung von 1/100 bis 1/1000 Äquivalent FTS in PBS (physiologische Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) wurde dem Gemisch zugesetzt und das Ganze mit Hilfe eines Vortex-Mischers gut gemischt, wodurch MLV erhalten wurde.
Dieses wurde sodann einer Ultraschallbehandlung bei einer Temperatur über der Phasenübergangstemperatur (Tc) des Phospholipids unterworfen, wodurch SUV erhalten wurde.
Das resultierende SUV wurde mit einer wäßrigen Lösung von Calciumchlorid versetzt und das Gemisch eine Stunde bei 37ºC zur Durchführung der Hybridisierung inkubiert. Anschließend wurde EDTA zugesetzt und das Gemisch zur Entfernung von Ca&spplus;&spplus; 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wodurch LUV erhalten wurde.
Das Verfahren zur Herstellung von REV sieht folgendermaßen aus: Nach Entfernung des Lösungsmittels aus einer Chloroformlösung des Lipids durch Destillation unter vermindertem Druck wird eine geeignete Menge Diethylether zugesetzt, um das Lipid ausreichend zu lösen. Eine PBS-Lösung von FTS wird zur Lösung zugefügt und das Gemisch mit Ultraschall behandelt, wodurch eine homogene einphasige Lösung erhalten wird. Nach Einengen der resultierenden Lösung unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur wird die PBS-Lösung zu dem Rückstand zugesetzt und das Gemisch gründlich mit Hilfe eines Vortex-Mischers gemischt, wodurch REV erhalten wird.

(2) Positiv geladenes Liposom, das FTS einschließt

Mit der Ausnahme, daß andere Lipidbestandteile verwendet werden, ist das Verfahren zur Herstellung des Liposom das gleiche wie das Verfahren im Fall des vorstehend erwähnten Liposoms mit neutraler elektrischer Ladung.
Ein Phospholipid, wie z.B. Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin, Cholesterin und ein positiv geladenes höheres aliphatisches Amin, wie z.B. Stearylamin, wurden in einem molaren Verhältnis von 7:2:1 oder 4:1:1 zusammengemischt, wodurch der Lipidbestandteil erzeugt wurde, sodann wurde FTS in ähnlicher Art und Weise eingearbeitet.

(3) Negativ geladenes Liposom, das FTS einschließt

Ein Phospholipid, wie z.B. Phosphatidylcholin oder Sphingomyelin, Cholesterin und ein negativ geladener höherer aliphatischer Ester, wie z.B. Dicetylphosphat oder Sulfatid, wurden in einem molaren Verhältnis von 7:2:1 oder 4:1:1 zusammengemischt, wodurch der Lipidbestandteil erzeugt wurde, sodann wurde FTS in ähnlicher Art und Weise eingearbeitet.

Beispiel 5 Salbe

2 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) wurden in gereinigtem Wasser gelöst. Sodann wurden 25 g weiße Vaseline, 20 g Stearylalkohol, 4 g HCO-60 und 1 g Glycerinmonostearat abgewogen und gemischt. Eine vorher hergestellte wäßrige Lösung (enthaltend FTS) von 12 g Propylenglykol, 0,1 g Methyl-p-hydroxybenzoat und 0,1 g Propyl-p-hydroxybenzoat wurde zum Gemisch zugesetzt und das Ganze gründlich vermischt, wodurch eine Emulsion entstand, die sodann solange gemischt wurde, bis sie abkühlte und fest wurde.

Beispiel 6 Suppositorium

10 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) wurden in einem vorher erwärmten, harten Fett dispergiert. Die Gesamtmenge wurde auf 2 g eingestellt.

Beispiel 7 Kapsel zur nasalen Anwendung

0,05 mg FTS wurden in 29,95 mg neutralem Öl Miglyol 812 (Dynamite Nobel Co.) unter sterilen Bedingungen gelöst. Diese Lösung wurde in einen herkömmlichen Einheitsdosenapplikator gefüllt, der unmittelbar vor der Anwendung auf eine Druckkapsel aufgesetzt wird.

Beispiel 8 Nasentropfen

Natriumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid und EDTA-Dinatriumsalz wurden in den nachstehend dargestellten Mengen bei Raumtemperatur in destilliertem Wasser gelöst. FTS wurde in dieser Lösung gelöst, die sodann durch ein Membranfilter filtriert wurde.
FTS 0,10 mg
Natriummonohydrogenphosphat 2H&sub2;O 0,30 mg
Natriumdihydrogenphosphat 12H&sub2;O 10,10 mg
Benzalkoniumchlorid 0,10 mg
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA) 0,50 mg
Natriumchlorid 4,50 mg
Destilliertes Wasser 987,60 mg
pH-Wert 5,0 ± 0,3

Beispiel 9 Nasenspray-Präparat

2 mg FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O (hergestellt von Mitsui Seiyaku Kogyo KK) wurden in Hydroxypropylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulose suspendiert. Die Suspension wurde mit Hilfe einer Apparatur zur Sprayzubereitung zu einem Spraypräparat verarbeitet.
Nachstehend werden Beispiele von pharmakologischen Experimenten und Toxizitätsexperimenten angegeben, die das erfindungsgemäße Arzneimittel betreffen.

Versuchsbeispiel 1 Wirkung auf Mäuse, die mit 800 Röntgen (R) bestrahlt wurden

Männliche, 10 Wochen alte C3H/He-Mäuse wurden eingesetzt und Gruppen von jeweils 10 bis 15 Tieren zusammengefaßt.
Die Mäuse wurden einer achtminütigen Ganzkörperbestrahlung unter Verwendung einer Röntgenapparatur (hergestellt von Shimazu Seisaku-sho, Shin-Ai 250 II) unterworfen. Diese Tiere erhielten einmal pro Tag an 14 aufeinanderfolgenden Tagen eine subcutane Gabe von 100 ug FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O, das in Beispiel 1 eingesetzt wurde. Die Gruppe mit vorausgehender Verabreichung erhielt die erste Gabe zwei Tage vor der Bestrahlung. Die Gruppe mit nachfolgender Verabreichung erhielt die erste Gabe unmittelbar nach der Bestrahlung. Als Kontrollgruppen wurden zwei Gruppen eingesetzt, von denen die eine Gruppe nur eine einmalige subcutane Gabe von 1 KE Picibanil unmittelbar nach der Bestrahlung und die andere Gruppe täglich physiologische Kochsalzlösung erhielt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, verhindert oder hemmt das erfindungsgemäße Arzneimittel das strahlungsbedingte Verenden der Mäuse deutlich, aus diesem Grund ist es als Mittel zur Vorbeugung und Heilung von Strahlenschäden wertvoll. Insbesondere die Gruppe mit der nachfolgenden Verabreichung zeigte eine deutlichere Wirkung. Tabelle 1 Wirkung auf Mäuse, die mit Röntgenstrahlen von 800 R bestrahlt wurden Verabreichung Anzahl der verwendeten Tiere Tage und Anzahl der überlebenden Tiere nach Röntgenbestrahlung Physiologische Kochsalzlösung Vorausgehende Verabreichung des Arzneimittels (100 ug) Nachfolgende Verabreichung des Arzneimittels (100 ug) Nachfolgende Verabreichung von Picibanil (1 KE)

Versuchsbeispiel 2 Wirkung auf Mäuse, die mit 900 R bestrahlt wurden

In gleicher Art und Weise wie in Versuchsbeispiel 1 erhielten Mäuse nach neunminütiger Röntgenbestrahlung subcutane Gaben von 100 ug/Tag FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O einmal täglich, insgesamt zwölfmal, d.h. an den Tagen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11 und 12. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Gruppe mit FTS-Verabreichung zeigte bei Bestrahlung mit der hohen Dosis von 900 R eine Verlängerung des Lebens. Tabelle 2 Wirkung auf Mäuse, die mit Röntgenstrahlen von 900 R bestrahlt wurden Verabreichung Anzahl der verwendeten Tiere Tage und Anzahl der überlebende Tiere nach Röntgenstrahlung Physiologische Kochsalzlösung Nachfolgende Verabreichung des Arzneimittels

Versuchsbeispiel 3 Wirkung auf Mäuse, die mit 600 R bestrahlt wurden

In gleicher Art und Weise wie in den Versuchsbeispielen 1 und 2 wurden Mäuse 6 Minuten mit Röntgenstrahlung bestrahlt. Die Tiere erhielten in einem Zeitraum von 14 aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend zwei Tage vor der Bestrahlung, einmal täglich subcutane Gaben von 100 ug des Arzneimittels FTS CH&sub3;COOH 2H&sub2;O.
Obwohl die Röntgenbestrahlung mit subletaler Dosis durchgeführt wurde, überlebten vier von zehn Tieren der Kontrollgruppe, d.h. mehr als die Hälfte verendete innerhalb von 19 Tagen, wohingegen alle zehn Tiere der Gruppe mit Arzneimittelverabreichung überlebten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Wirkung auf Mäuse, die mit Röntgenstrahlung von 600 R bestrahlt wurden Verabreichung Anzahl der verwendeten Tiere Tage und Anzahl der überlebenden Tiere nach Röntgenbestrahlung Verabreichung von physiologischer Kochsalzlösung Vorausgehende Verabeichung des Arzneimittels (100 ug)

Versuchsbeispiel 4 Bluttest

Unabhängig von der in Versuchsbeispiel 3 durchgeführten Bestrahlung von Mäusen zur Feststellung von überleben/Verenden wurden Mäuse einer Röntgenbestrahlung von 600 R unterworfen, um einen täglichen Bluttest durchzuführen. Eine weitere Gruppe von Mäusen wurde zusammengestellt und einer Röntgenbestrahlung von 400 R unterworfen. Jede der mit 600 R und 400 R bestrahlten Gruppen wurde in zwei Hälften geteilt, wovon die eine Hälfte 100 ug des vorstehend erwähnten Arzneimittels vorausgehend vor der Bestrahlung erhielt und die andere Hälfte als Kontrolle diente. Täglich wurden Blutproben von jeder Maus genommen und die Anzahl der weißen Blutzellen (WBC), roten Blutzellen (RBC), Reticulocyten (RET), Blutplättchen (PLT), der Hämoglobin- (HGB) und der Hämatokrit-Wert (HCT) bestimmt.
Ein typisches Beispiel wird in Tabelle 4 gezeigt. Es wurde gezeigt, daß alle diese Blutparameter durch die Verabreichung des Arzneimittels im Vergleich zu denjenigen der Kontrollgruppe deutlich verbessert waren. Tabelle 4 Bluttest Behandlung Anzahl d. Tiere Blutparameter Normale Gruppe 600 R-Röntgrenstrahlung, phys. Kochsalzlösung, am 7. Tag 600 R-Röntgrenstrahlung, Arzneimittel, am 7. Tag 400 R-Röntgrenstrahlung, phys. Kochsalzlösung, am 14. Tag 400 R-Röntgrenstrahlung, Arzneimittel, am 14. Tag T-Test: *p< 0,05, **p< 0,01, ***p< 0,0001

Versuchsbeispiel 5 Bestimmung des Körpergewichts

Das Körpergewicht von jeder Mäuseversuchsgruppe von Versuchsbeispiel 3 wurde an aufeinanderfolgenden Tagen gemessen, um Gewichtsveränderungen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Es wurde gezeigt, daß die Gruppe mit Arzneimittel-Verabreichung deutlich mehr wog als die Kontrollgruppe. Tabelle 5 Körpergewicht Körpergewicht (g) [Mittelw. ± Standardabweichung) (Anzahl der Tiere) Tage nach der Bestrahlung 600 R-Röntgrenstrahlung, phys. Kochsalzlösung 600 R-Röntgrenstrahlung, Arzneimittel T-Test: ***p< 0,001, **p< 0,01

Versuchsbeispiel 6 Toxizitätsprüfung

Keine Toxizität wurde beobachtet, wenn 50 mg/kg und 100 mg/kg Wirkstoff an 14 aufeinanderfolgenden Tagen einer Gruppe von fünf männlichen ddy-Mäusen im Alter von 5 Wochen subcutan verabreicht wurden.

Versuchsbeispiel 7 Toxizitätsprüfung

Keine Toxizität wurde beobachtet, wenn 30 mg/kg Wirkstoff an 21 aufeinanderfolgenden Tagen einer Gruppe von 10 Wister- Ratten im Alter von 5 Wochen subcutan verabreicht wurden.
Wie vorstehend erwähnt, waren bisher auf dem medizinischen Fachgebiet des Strahlenschutzes nur wenige Medikamente verfügbar, die von Leukopenie-heilenden Mitteln verschieden sind, welche nur in geringem Umfang eingesetzt werden. Somit ist das erfindungsgemäße Medikament bahnbrechend, da es bei Strahlenschäden eine vorzügliche schützende bzw. therapeutische Wirkung bereitstellt, indem es das immunologische oder biologische Abwehrsystem aktiviert. Zusätzlich weist das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Nonapeptid (FTS), das ein Peptid tierischen Ursprungs und eine natürlich vorkommende Substanz darstellt, anders als FTS-Analoga mit ähnlicher Aminosäuresequenz im lebenden Organismus keine Toxizität auf und zeigt keine Probleme wie Antigenität oder anaphylaktischen Schock. Aus diesem Grund kann das erfindungsgemäße Arzneimittel als sicheres und nützliches Medikament bei Mensch und Tier angewendet werden.

Claims

Verwendung eines Nonapeptids der folgenden Aminosäuresequenz

pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

oder eines Esters oder eines Amids an der Carboxylgruppe des C-Terminus des Asparagins oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Strahlenschutzmittels.