DE68906248T2 - Antagonisten fuer den platelet-aktivierungsfaktor, phomactine genannt, ihre herstellung und verwendung. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuen Verbindungen, denen die Klassenbezeichnung "Phomactin" gegeben wurde. Diese Verbindungen können durch Züchten eines geeigneten Mikroorganismus (Fungus) des Genus Phoma produziert werden. Die Erfindung sieht auch ein Fermentationsverfahren zum Produzieren dieser Verbindungen unter Verwendung eines neuen Stammes des Mikroorganismus des Genus Phoma vor, ebenso wie den neuen Stamm an sich, und schafft Verfahren und Zusammensetzungen unter Verwendung der neuen Verbindungen nach der Erfindung als Antagonisten für den Blutplättchen aktivierenden Faktor.
• "Blutplättchen aktivierender Faktor" wird hier der Einfachheit halber als "PAF" abgekürzt.
• Natürlicher PAF, zumindest der, wie er aus den Geweben von Säugetieren isoliert wird, ist ein Gemisch aus 2 bis 5 Phospholipiden, wobei die Anzahl von der Art des Ursprungsgewebes abhängt. Die Hauptbestandteile von PAF können durch die Formel (A) dargestellt werden:
• in der R eine langkettige aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe ist, die gesättigt oder ungesättigt sein kann. Natürlicher PAF ist linksdrehend, wobei die verschiedenen Bestandteile von natürlichem PAF beispielsweise identifiziert werden können als: 1-C16:0 = Formel (A), in der R eine Hexadecylgruppe ist; 1- C18:0 = Formel (A), in der R eine Octadecylgruppe ist; oder 1- C18:1 = Formel (A), in der R eine 9(Z)-Octadecenylgruppe ist. Die vorstehend für die Identifizierung der PAF-Bestandteile benutzte Konvention gibt zunächst die Drehung (1 in den obigen Beispielen), dann die Anzahl der Kohlenstoffatome und schließlich die Anzahl der Doppelbindungen an.
• PAF hat eine starke Blutplättchen aktivierende und aggregierende Wirkung, von der sein Name herrührt. Er ist jedoch in den letzten Jahren als potentieller entscheidender Mittler bei einer großen Vielzahl von pathologischen Prozessen erkannt worden. So hat er eine blutdrucksenkende Wirkung und steigert die Vasopermeabilität; es wird angenommen, daß er ein Wirkstoff bei der Induktion von Schockzuständen (beispielsweise bei Endotoxin-induziertem Schock) ist und als Mittler bei entzündlichen Erkrankungen wirkt. Es wurde auch gefunden, daß er bei der Herz und Körpersystem-Anaphylaxe, bei Magen- und Darmgeschwüren, bei Psoriasis und bei Immun- und Nierenstörungen eine Rolle spielt.
• Deshalb ist es nicht überraschend, daß als Ergebnis PAF-Antagonisten im Hinblick auf die Entwicklung von neuen Behandlungsmethoden für die vor stehend genannten Pathologien und insbesondere neue Antischockmittel und entzündungshemmende Mittel untersucht wurden. Folglich wurden bei einem Versuch, solche PAF-Antagonisten zu finden, verschiedene Verbindungen untersucht, und zur Zeit sind mehrere Verbindungen als PAF-Antagonisten bekannt. Obwohl die chemische Struktur von PAF-Antagonisten in großem Umfang variiert und kein offensichtlicher gemeinsamer Faktor vorzuliegen scheint, der ihre chemischen Strukturen verknüpft, können im allgemeinen bekannte Stoffe mit Aktivität als PAF-Antagonist entsprechend ihrer chemischen Struktur entweder als Verbindung vom PAF-Typ oder als Verbindung vom Nicht-PAF-Typ klassifiziert werden. Von den bekannten Verbindungen werden Antagonisten vom PAF-Typ meistens durch chemische Synthese hergestellt, während Antagonisten vom Nicht- PAF-Typ meistens aus den sekundären Stoffwechselprodukten von Pflanzen und Mikroorganismen gewonnen werden. Beispiele für Verbindungen vom Nicht-PAF-Typ umfassen beispielsweise Ginkgolide (isoliert aus Ginkgo biloba), Kadzurenone (isoliert aus Piper futokadzura), Veraguensin (isoliert aus Magnolia acuminata), Galbengin und Galbrabin (isoliert aus Himantandra velgravena), Nectandrin A und B (isoliert aus Nectandra rigida) Burseran (isoliert aus Bursera microphylla) [Einzelheiten über die obigen Verbindungen sind von P. Braquet und J.J. Godfroid: Trends in Pharm. Sci., Bd. 7, Seite 397 ff. (1986) angegeben], ein Gliotoxinderivat [isoliert aus Penicillium terlikowskii: M. Okamoto, Chem. Pharm. Bull., 34, 340 (1986)] und ein Diketopiperazinderivat [isoliert aus Streptomyces sp.: S. Takase, J. org. Chem., 52, 3485 (1987)].
• Eine Vielzahl von Verbindungen vom PAF-Typ sind bekannt, aber diese sind für die vorliegende Erfindung nicht relevant.
• Ein Überblick über die Natur und die Verwendungen von PAF-Antagonisten wird von P. Braquet et al. in Trends in Pharm. Sci., Bd. 10, Seiten 23 ff. (1989) gegeben.
• Es wurde nun eine Reihe von neuen PAF-Antagonist-Verbindungen vom Nicht-PAF-Typ gefunden, die entsprechend der derzeitigen Konvention "Phomactine" genannt wurden und die durch Züchten eines Mikroorganismus produziert werden können, der als SANK 11486 identifiziert wurde und zu der Spezies Phoma gehört und aus den Schalen von bestimmten Krabben isoliert worden ist.
• Somit betrifft die vorliegende Erfindung in ihrem breitesten Aspekt neue Verbindungen, die Phomactine genannt wurden.
• Die Phomactine sind hier als Verbindungen mit Aktivität als PAF-Antagonist und Befähigung zur Produktion von Phoma sp. SANK 11486 durch Fermentation definiert. Im allgemeinen wird von der chemischen Struktur des Phomactins angenommen, daß es durch einen Cyclohexenring charakterisiert ist, der zwischen einem Kohlenstoffatom der Doppelbindung und einem um zwei Positionen von diesem entfernten Kohlenstoffatom durch eine 9-gliedrige Kohlenstoff-Brückenstruktur überbrückt ist, die selbst überbrückt sein kann.
• Die Erfindung sieht auch ein Verfahren zum produzieren eines Phomactins durch Züchten eines Phomacin produzierenden Mikroorganismus des Stammes Phoma und Abtrennen mindestens eines Phomactins aus der Kulturbrühe vor.
• Die Erfindung sieht auch eine pharmazeutische Zubereitung für die Behandlung von Entzündungen oder Schock vor, welche einen PAF-Antagonisten in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält, wobei der PAF-Antagonist mindestens ein phomactin, wie es vorstehend definiert ist, ist.
• Die Erfindung sieht weiterhin die Verwendung eines Phomactins in der Therapie vor.
• Die Erfindung sieht ferner die Verwendung mindestens eines Phomactins, besonders von Phomactin A oder B, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder die Prophylaxe bei einer PAF-vermittelten Pathologie bei Säugern vor, die gegenüber einer solchen Pathologie anfällig sind.
• Die Erfindung sieht ferner die Verwendung mindestens eines Phomactins, insbesondere von Phomactin A oder B, bei der Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von Asthma, Entzündungen oder Schock bei einem Lebewesen vor (das ein Säuger, z.B. ein Mensch, sein kann).
• Eine der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung, die "Phomactin A" genannt wurde, hat die folgende chemische Formel und Eigenschaften:
• 1) Chemische Formel, wie in Formel (I) angegeben:
• 2) Aussehen: farblose, ölige Substanz.
• 3) Spezifische Drehung: [α]25D = +146.7º (c 0,75, Chloroform).
• 4) Elementaranalyse:
• Gefunden: C 71,65 %; H 9,10 %.
• Berechnet: C 71,82 %; H 9,04 %.
• 5) Molekularformel: C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub0;O&sub4; (bestimmt durch Massenspekroskopie hoher Auflösung).
• 6) Molekulargewicht: 334 (bestimmt durch Massenspektroskopie).
• 7) Infrarot-Absorptionsspektrum, νmax cm&supmin;¹ (Flüssigkeitsfilm) : 3395, 1580, 1450, 1380, 1230, 1050, 960 und 756.
• Das als Flüssigkeitsfilm gemessene Infrarot-Absorptionsspektrum ist in Fig. 1 der beigefügten Zeichnung gezeigt.
• 8) ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum, δ ppm: Das kernmagnetische Resonanzspektrum (500 MHz), gemessen in perdeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard, ist in Fig. 2 der beigefügten Zeichnung gezeigt.
• 9) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum, δ ppm: Das kernmagnetische Resonanzspektrum (126 MHz), gemessen in perdeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard, ist in Fig. 3 der beigefügten Zeichnung gezeigt, und die chemischen Verschiebungen und Multiplizitäten sind wie folgt:
• 14,9 (q), 16,5 (q), 19,6 (q), 21,9 (q), 25,8 (t), 27,8 (d), 34,2 (t), 34,5 (t), 37,6 (t), 38,0 (s), 38,6 (t), 62,6 (d), 72,0 (t), 74,6 (d), 81,2 (s), 110,0 (s), 128,7 (s, 131,3 (s), 131,4 (d) 144,6 (s).
• (q ist ein Quartett, t ein Triplett, d ein Dublett und s ein Singulett).
• 10) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm: Das in Ethanol gemessene Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt nur Endgruppen-Absorption.
• 11) Löslichkeit: löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Dimethylsulfoxid, Benzol und Diethylether; unlöslich in Wasser.
• 12) Farbreaktionen: positiv in den Schwefelsäure- und Iod-Farbtests.
• 13) Dünnschichtchromatographie: Rf: 0,54 Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck) Entwicklungslösungsmittel: Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:2.
• Die systematische Bezeichnung von Phomactin A ist 3,3a-Dihydroxy-2,6-(3'-methyl-3'-hexeno)-2,6,7-trimethyl-3a,5,6,7,8,8a- hexahydrofuro[2,3,4-de]chroman.
• Eine weitere Verbindung nach der vorliegenden Erfindung, die als "Phomactin B" bezeichnet wurde, hat die folgende chemische Formel und Eigenschaften:
• 1) Chemische Formel, wie in Formel (II) gezeigt:
• 2) Aussehen: farblose Nadeln.
• 3) Spezifische Drehung: [α]25D = +175º (c 0,70, Chloroform).
• 4) Elementaranalyse:
• Gefunden: C 71,71 %; H 9,09 %
• Berechnet: C 71,82 %; H 9,04 %
• 5) Molekülformel: C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub0;O&sub4; (bestimmt durch Massenspektroskopie hoher Auflösung).
• 6) Molekulargewicht: 334 (bestimmt durch Massenspektroskopie).
• 7) Infrarot-Absorptionsspektrum, νmax cm&supmin;¹ (KBr) : 3420, 3380, 1669, 1630, 1460, 1392, 1250, 1200, 1080, 1000, 903 und 812.
• Das auf einer KBr-Scheibe gemessene Infrarot- Absorptionsspektrum ist in Fig. 4 der beigefügten Zeichnung gezeigt.
• 8) ¹H-Kernmagnetisches Resonanzspektrum, δ ppm: Das kernmagnetische Resonanzspektrum (500 MHz), gemessen in perdeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard, ist in Fig. 5 der beigefügten Zeichnung gezeigt.
• 9) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum, δ ppm: Das kernmagnetische Resonanzspektrum (126 MHz), gemessen in perdeuteriertem Methanol unter Verwendung von Tetramethylsilan als interner Standard, ist in Fig. 6 der beigefügten Zeichnung gezeigt, und die chemischen Verschiebungen und Multiplizitäten sind wie folgt:
• 14,5 (q), 16,4 (q), 19,7 (2 x q), 22,7 (t), 23,2 (q), 33,6 (t), 36,7 (t), 37,4 (t), 41,5 (s) 46,3 (d), 62,8 (s), 65,9 (d), 71,4 (d), 73,3 (s) 120,3 (d), 135,6 (d), 136,8 (s), 147,2 (s), 200,1 (s)
• (Abkürzungen wie vorstehend).
• 10) Ultraviolett-Absorptionsspektrum, λmax nm: Das in Ethanol gemessene Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt eine Absorption bei 240 nm (E = 2500).
• 11) Löslichkeit: löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Dimethylsulfoxid, Benzol und Diethylether; unlöslich in Wasser.
• 12) Farbreaktionen: positiv in dem Schwefelsäure- und Iod-Farbtest.
• 13) Dünnschichtchromatographie: Rf: 0,51 Adsorptionsmittel: Silicagelplatte (Kieselgel 60F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck) Entwicklungslösungsmittel: Gemisch aus Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:2.
• Die systematische Bezeichnung von Phomactin B ist 13,15-Dihydroxy-3,4-epoxy-2-oxo-4,8,11,12,15-pentamethyl- bicyclo[9.3.1]pentadeca-7,14-dien.
• Die Phomactine nach der vorliegenden Erfindungen können in Form von verschiedenen Stereoisomeren und geometrischen Isomeren vorliegen, obwohl die Verbindungen gemäß der Erfindung in der Form, wie sie auf natürlichem Wege durch einen Mikroorganismus des Genus Phoma produziert werden, normalerweise als ein einziges Isomer vorliegen. Bei den vorstehend angegebenen Formeln werden die einzelnen Isomeren und Isomerengemische durch eine einzige Formel dargestellt. Die vorliegende Erfindung deckt jedoch nicht nur die einzelnen Isomeren, sondern auch beliebige Gemische aus zwei oder mehr Isomeren ab, gleichgültig, ob sie auf natürlichem Wege oder durch chemische Manipulation produziert worden sind. Wenn das auf natürlichem Wege produzierte Isomer nicht das gewünschte ist, kann das gewünschte Isomer durch chemische Maßnahmen, wie sie in der einschlägigen Technik gut bekannt sind, produziert werden.
• Es wird gegenwärtig angenommen, daß die Konfigurationen der Phomactine A und B so sind, wie sie in den Formel (Ia) bzw. (IIa) gezeigt sind:
• Die Phomactine wurden durch Züchten eines Stammes des Mikroorganismus des Genus Phoma (ein Pilz) produziert, der als Stamm SANK 11486 bezeichnet wurde. Dieser erfindungsgemäß verwendete Phomactin produzierende Mikroorganismus des Stammes SANK 11486 wurde aus den Schalen von Krabben der Art Chinoecetes opilio (in der Umgangssprache als "Sugusani" bezeichnet, die eine Krabbenart sind, deren Schalen schwarz werden) isoliert, die in Küstennähe in der Fukui-Prafektur, Japan, gesaimnelt wurden.
• Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes sind wie folgt:
• Das Wachstum auf Hafermehl-Agar bei 25ºC erreichte in 7 Tagen einen Durchmesser von 20 mm und in 14 Tagen einen Durchmesser von 38 mm. An diesen beiden Tagen hatten die Kolonien ein feucht-samtiges Aussehen und eine grünlich-graue Farbe.
• Auf dem Hafermehl-Agar wurden nur Myzelien, aber keine Sporen oder Konidien beobachtet; jedoch bildeten sich auf mit künstlichem Meerwasser (Handelsname: Jamarin S) bereitetem Hafermehl- Agar Pyknidien, in denen Konidien produziert werden.
• Das Pyknidium wird mit halbkugelförmiger oder birnenförmiger Gestalt mit Abmessungen von 80 bis 120 x 80 bis 150 um beobachtet, wobei es in der Mitte ein Loch aufweist. Der Durchmesser des Loches beträgt 5 bis 15 um, und am Rand befinden sich braune Borsten mit Abinessungen von 20 bis 50 x 2 bis 4 um vorhanden.
• Die Konidiophoren sind nicht besonderes differenziert, und die innerste Schicht der Phorenwand wurde phiolenartig. Die Konidienfäden sind farblos, einzellig, elliptisch oder langgestreckt elliptisch mit Abmessungen von 2,5 bis 4,0 x 2,0 bis 2,5 um.
• Der Stamm wächst nicht bei 37ºC.
• Auf der Grundlage dieser Merkmale und unter Bezugnahme auf Standardtexte [B.C. Sutton, "The Coelomycetes", Commonwealth Mycological Institute, 1980; und J. Kohlmeyer und E. Kohlmeyer, "Marine Mycology, The Higher Fungi", Academic Press, 1979) wurde der vorliegende Stamm als neuer Stamm der bekannten Spezies Phoma sp. identifiziert und mit der Materialnummer SANK 11486 (FERM P-10364) versehen. Die hier verwendeten Farbnamen und -codes wurden nach den Angaben in Methuen Handbook of Colour, 3. Ausgabe (1978), von A. Kornerup und J.H. Wanscher, veröffentlicht von Eyre Methuen, London, zugeordnet.
• Der Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology1 Tokyo, Japan, unter dem Aktenzeichen FERM P-10364 hinterlegt, und die Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag wurde am 20. September 1989 unter dem Aktenzeichen FERM BP-2598 bestätigt.
• Es ist gesichert, daß der Stamm SANK 11486 Phomactine produziert. Wie jedoch gut bekannt ist, können die Eigenschaften von Pilzen im allgemeinen beträchtlich variieren, wobei solche Pilze die Tendenz haben, sowohl durch natürliche Ursachen als auch als Folge der Induktion von künstlichen Maßnahmen Mutationen durchzumachen. Deshalb umfaßt das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung die Verwendung von allen Mikroorganismen, die als zu dem Genus Phoma, insbesondere zu den Stämmen der Spezies des Genus Phoma, zu denen der neue Stamm SANK 11486 gehört, zugehörig klassifiziert werden können und die mit dem Stamm SANK 11486 die charakteristische Fähigkeit zur Produktion von Phomactinen teilen. Anhand eines einfachen Versuches auf der Grundlage der hier gegebenen Informationen bezüglich der Eigenschaften der Phomactine, insbesondere der biologischen Eigenschaften, kann ermittelt werden, ob irgendein gegebener Stamm irgendwelche Phomactine produziert oder es oder sie in ausreichender Menge produziert, um sicherzustellen, daß der Stamm potientiell wirtschaftlich interessant ist.
• Die neuen Verbindungen, nämlich die Phomactine, nach der vorliegenden Erfindung können durch Züchten von beliebigen dieser Pilzstämme in Kulturmedien von dem Typ hergestellt werden, wie sie für die Produktion von anderen Fermentationsprodukten aus ähnlichen Mikroorganismen gebräuchlich sind. Solche Medien enthalten notwendigerweise mikrobiologisch assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff ebenso wie anorganische Salze, wie auf dem Sachgebiet gut bekannt ist. In allen Belangen sind jedoch die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Kulturmedien dieselben wie die, die für das Züchten von bekannten Pilzstämmen verwendet werden.
• Bevorzugte Beispiele für Kohlenstoffquellen umfassen: Glukose, Fruktose, Maltose, Saccharose, Mannitol, Glycerin, Dextrin, Hafer, Roggen, Maisstärke, Kartoffeln, Kartoffelstärke, Maismehl, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatkuchen, Baumwollsaatöl, Melasse, Citronensäure, Weinsäure u. dgl., vorzugsweise Glukose, Saccharose oder Kartoffeln oder beliebige Kombinationen daraus. Solche Verbindungen können allein oder in beliebiger geeigneter Kombination verwendet werden. Im allgemeinen kann die verwendete Menge in dem Bereich von 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, variieren.
• Bevorzugte Stickstoffquellen sind normalerweise proteinhaltige Substanzen, aber sie können auch andere Stoffe sein, einschließlich anorganischen Stoffen, wie sie gewöhnlich bei einem Fermentationsverfahren verwendet werden. Beispiele für solche Stickstoffquellen umfassen: Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Erdnußmehl, Baumwollsaatkuchen, Bamwollsaatöl, Baumwollsaatmehl, Caseinhydrolysate, Pharmamin, Fischmehl, Korneinweichflüssigkeit, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Malzextrakt, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat u. dgl., vorzugsweise Pepton und/oder Fleischextrakt. Diese Stickstoffquellen können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Im allgemeinen werden sie vorzugsweise bei einer Konzentration zwischen 0,2 und 6 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, angewendet.
• Die anorganischen Nährstoffsalze, die dem Kulturmedium vorzugsweise zugesetzt werden sollten, können gebräuchliche Salze sein, die zur Bereitstellung von verschiedenen Ionen befähigt sind, die für das Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, wie Natrium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chloridund Carbonat-Ionen, wie auf dem einschlägigen Gebiet gut bekannt ist. Außerdem sollte das Medium vorzugsweise kleinere Mengen an anderen essentiellen Metallen, wie Kalium, Calcium, Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium, enthalten, wie ebenfalls auf diesem Gebiet gut bekannt ist.
• Die wäßrige Komponente des Kulturmediums kann, wie in bestimmten nachfolgenden Beispielen erläutert wird, durch eine Form von Meerwasser bereitgestellt werden, die natürlicher Herkunft (was zu bevorzugen ist) oder künstlicher Herkunft ist; jedoch werden ebenso gute Ergebnisse bei Verwendung von gewöhnlichem Wasser erzielt, und die Verwendung von Meerwasser ist deshalb bei der vorliegenden Erfindung unnötig.
• Wenn das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in einem Flüssigkulturverfahren durchgeführt wird, wird in dem Kulturmedium vorzugsweise ein Antischaummittel, wie Siliconöl, ein Pflanzenöl oder ein oberflächenaktives Mittel, zugesetzt.
• Der pH-Wert des Kulturmediums zum Produzieren der Phomactine durch Züchten von Phoma sp. SANK 11486 vaiiert vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 5,0 bis 9,0, noch vorteilhafter von 6,5 bis 8,5. Wenn ein anderer Mikroorganismenstamm eingesetzt wird, kann der optimale pH-Wert von diesen vorgeschlagenen Bereichen abweichen, jedoch kann dieses Optimum durch einfache Routineversuche, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind, leicht ermittelt werden.
• Das Züchten kann bei jeder Temperatur innerhalb des Bereiches von 15 bis 30ºC durchgeführt werden, wenn auch eine Temperatur von 20 bis 28ºC für ein gutes Wachstum zu bevorzugen ist, während eine Temperatur von 22 bis 26º zu bevorzugen ist, um die Produktion an Phomactinen zu optimieren. Wenn ein anderer Mikroorganismenstamm eingesetzt wird, kann die optimale Temperatur von diesen vorgeschlagenen Bereichen abweichen, aber das Optimum kann durch einfache Routineversuche, wie sie auf diesem Gebiet üblich sind, ebenfalls leicht ermittelt werden.
• Die Phomactine werden unter aeroben Kulturbedingungen produziert, wobei gebräuchliche aerobe Kulturverfahren, wie die feste Kultur, die Schüttelkultur, die Kultur unter Belüften und Rühren (Submersverfahren), angewandt werden können. Im Falle der Züchtung in kleinem Maßstab wird typischerweise eine Schüttelkultur über einen Zeitraum von einigen Tagen bis zu zwei Wochen bei einer geeigneten Temperatur, wie 22 bis 26ºC, durchgeführt. Bei einem solchen Kulturverfahren in kleinem Maßstab kann die Züchtung mit 1 oder 2 Proliferationsschritten initiiert werden, wobei Keimkulturen beispielsweise in mit Prallplatten, die den Flüssigkeitsfluß regulieren, ausgestatteten Erlenmeyerkolben produziert werden. Das Medium für die Keimkulturschritte enthält vorzugsweise sowohl Kohlenstoff- als auch Stickstoffguellen, wie sie vorstehend für die Züchtungsschritte angegeben sind. Bei der bevorzugten Abfolge von Arbeitsgängen für eine solche Züchtung in kleinem Maßstab werden die Keimkulturkolben vorzugsweise in einem Wärmeschrank mit konstanter Temperatur, beispielsweise 22 bis 26ºC, für 7 Tage oder bis zum Erreichen eines ausreichenden Wachstums geschüttelt. Die gewachsene Keimkultur kann dann in ein zweites Keimmedium oder in das Produktionsmedium überführt werden. Wenn eine Zwischen-Wachstumsphase eingeschaltet wird, kann im wesentlichen dasselbe Verfahren für das Wachstum angewandt werden, wobei das Produktionsmedium mit einer Teilmenge des erhaltenen Zwischenproduktes beimpft werden kann. Der beimpfte Kolben kann einige Tage unter Schütteln bei einer geeigneten Temperatur, z.B. 22 bis 26ºC, inkubiert werden, und nach Beendigung der Inkubation können die Inhalte der Kolben zentrifugiert oder filtriert oder auf andere Weise getrennt werden.
• Im Falle der Produktion in großem Maßstab ist die Verwendung eines mit einem Rührer und einer Belüftungsvorrichtung versehenen geeigneten Fermenters zu bevorzugen. In diesem Fall kann das Nährmedium im Inneren des Fermenters bereitet werden. Das Medium wird vorzugsweise durch Erhöhen der Temperatur auf eine ausreichend hohe Temperatur, wie 125ºC, zunächst sterilisiert; nach Abkühlung kann das sterilisierte Medium mit der zuvor bereiteten Keimkultur beimpft werden. Die Züchtung kann dann unter Rühren und Belüften bei einer geeigneten Temperatur, z.B. 22 bis 26ºC, voranschreiten. Dieses Verfahren ist zum Erhalten der Verbindung nach der vorliegenden Erfindung in großer Menge geeignet.
• Der Ablauf der Züchtung und die Menge an mit dem Ablauf der Züchtung produzierten phomactinen kann durch verschiedene gut bekannte Methoden überwacht und bestimmt werden, die auf diesem Gebiet üblicherweise angewandt werden. Beispielsweise kann der Ablauf dadurch überwacht werden, daß man den Anstieg der Anti- PAF-Aktivität der Kulturbrühe verfolgt. Im allgemeinen wird angenommen, daß die Gesamtmenge an produzierten Phomactinen zwischen 10 und 14 Tagen nach der Initiierung der Fermentation ein Maximum erreicht, jedoch schwankt die genaue Zeit in Abhängigkeit von der Temperatur und anderen Fermentationsbedingungen; jedoch kann die genaue optimale Zeit für jeden vorgegebenen Satz von Bedingungen durch Überwachen des Ablaufes der Produktion der Phomactine, wie vorstehend vorgeschlagen, leicht ermittelt werden.
• Nach Beendigung der Züchtung können die in der flüssigen Fraktion der gezüchteten Masse vorhandenen Phomactine durch auf dem Sachgebiet gut bekannte geeignete Maßnahmen, beispielsweise durch Filtration, vorzugsweise unter Verwendung einer Filterhilfe, wie Diatomeenerde, oder durch Zentrifugieren oder durch beliebige andere Standardverfahren abgetrennt werden. Die in dem Filtrat oder in der überstehenden Lösung vorhandenen Phomactine können durch Extraktion aus diesem Filtrat gewonnen und/oder unter Ausnutzung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Phomactine gereinigt werden. Beispielsweise können die in dem Filtrat oder in der überstehenden Lösung vorhandenen Phomactine bei einem neutralen pH-Wert mit einem oder mehreren mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln (wie Diethylether, Ethylacetat, Hexan, Chloroform, Ethylenchlorid oder Methylenchlorid) extrahiert werden1 wobei die Lösungsmittel einzeln oder als Gemisch verwendet werden können.
• Ein alternatives Verfahren ist die Verwendung eines Adsorptionsmittels, beispielsweise Aktivkohle, oder eines Adsorptionsharzes, wie Amberlite (Warenzeichen) XAD-2 oder XAD-4 (Rohm & Haas Co., Ltd.) oder Diaion (Warenzeichen HP-10, HP-20, CHP-20P oder HP-50 (Mitsubishi Kasei Corporation). Das die Phomactine enthaltende Fluid kann durch eine Schicht aus einem dieser Adsorptionsmittel geschickt werden, um die adsorbierten Verunreinigungen zu entfernen, oder die adsorbierten Phomactine können mit einem geeigneten Eluiermittel, wie wäßrigem Methanol, wäßrigem Aceton oder wäßrigem Butanol, eluiert werden. Es wird angenommen, daß nahezu die gesamte erzeugte Phomactinmenge an das Kulturmedium abgegeben wird, während davon ausgegangen wird, daß nur sehr wenig in den Zellen zurückgehalten wird; wenn es jedoch erwünscht ist, auch die Phomactine zu gewinnen, die möglicherweise in der Zellen zurückgehalten werden, kann dies durch gebräuchliche Maßnahmen erreicht werden.
• Die auf vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Phomactine können, falls erwünscht, durch verschiedene gebräuchliche Methoden weiter gereinigt werden, insbesondere durch verschiedene chromatographische Verfahren, wie die Adsorptions-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Trägers, wie Silicagel oder Magnesiumoxid-Silicagel, wie Florisil (Warenzeichen), Verteilungschromatographie unter Verwendung von Sephadex (Warenzeichen) LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Säule für ein normales oder ein Phasenumkehrverfahren.
• Bei jeder geeigneten Stufe des obigen Verfahrens können, falls erwünscht, die verschiedenen Phomactine durch beliebige herkömmliche Verfahren voneinander getrennt werden, von denen die chromatographischen Verfahren, insbesondere die Säulenchromatographie, derzeit als die wirksamsten angesehen werden und somit zu bevorzugen sind. Es ist deshalb zweckmäßig, die Phomactine im Verlauf des vorstehend erläuterten Reinigungsverfahrens zu trennen.
• Die Phomactine nach der vorliegenden Erfindung sind neue Verbindungen, die in der Literatur bisher nicht beschrieben sind. Sie haben in Tierversuchen eine Aktivität als PAF-Antagonist gezeigt und lassen deshalb den Schluß zu, daß sie eine ähnliche Aktivität auch bei anderen Lebewesen (z.B. Menschen, Hunden, Katzen und Kaninchen) zeigen. Es ist deshalb zu erwarten, daß sie nützliche Antithrombose-Arzneimittel und auch nützlich für die Prophylaxe und Therapie von Entzündungen, Schock, Asthma, Magengeschwüren, Nierenversagen, Bluthochdruck, Ischämie und ähnlichen Störungen sind, die durch die Verabreichung von PAF- Antagonisten gebessert werden können.
• Obwohl es noch nicht mit Sicherheit klargestellt ist und die Erfindung nicht durch irgendeine Theorie eingeschränkt werden soll, wird derzeit angenommen, daß die Phomactine durch Binden von PAF-Rezeptoren anstelle von PAF selbst als PAF-Antagonisten arbeiten. Dieser Mechanismus scheint bei mehreren Typen von PAF-Antagonisten trotz ihrer erheblich unterschiedlichen chemischen Strukturen üblich zu sein.
• Eines oder mehrere der Phomactine nach der vorliegenden Erfindung können allein als Therapeutikum oder als Prophylaxemittel verwendet werden, oder es oder sie können, falls erwünscht, mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Corrigentien und/oder Verdünnungsmitteln gemischt werden, die für seinen oder ihren beabsichtigen Verabreichungsweg, wie es auf dem einschlägigen Gebiet gut bekannt ist, geeignet sind. Beispielsweise kann das Arzneimittel bei peroraler Gabe vorzugsweise in Form von Pulvern, Granulat, Tabletten oder Kapseln vorliegen; für die parenterale Gabe kann das Arzneimittel in Form von Injektionen angewandt werden. Die Dosierung der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung variiert in Abhängigkeit von der Schwere und der Art der Erkrankung oder Störung, dem Alter, dem Körpergewicht und dem Zustand des Patienten und von dem Weg, der Häufigkeit und der Dauer der Verabreichung. Eine geeignete tägliche Dosis an Phomactin oder Phomactinen nach der vorliegenden Erfindung für einen Erwachsenen auf dem Wege über den Magen- und Darmkanal liegt jedoch in dem Bereich von 1 mg bis 1000 mg, wobei diese Menge als einzige Dosis oder aufgeteilt, z.B. auf mehrere Teildosen pro Tag, verabreicht werden kann.
• Die Herstellung der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
BEISPIEL 1 a) Züchtung
• Mit einer Platinöse voll Phoma sp. SANK 11486 aus einer Schrägkultur wurde ein mit Prallelementen (Keimkolben) ausgestatteter und 100 ml eines Keimkulturmediums der nachstehend erläuterten Zusammensetzung enthaltender 500 ml-Erlenmeyerkolben beimpft.
Zusammensetzung des Mediums
• Saccharose 20 g
• Kartoffeln 100 g
• Pepton 10 g
• Kaliumdihydrogenphosphat 5 g
• Künstliches Meerwasser (Handelsname: Jamarin S, Jamarin Laboratories Co., Ltd.) 1000 ml
• pH 8,5
• Die gesamte erhaltene Kulturbrühe wurde dann 7 Tage bei 26ºC auf einem Drehschüttler mit 200 Umdrehungen/min gezüchtet (7 cm Halbkreisdrehung).
• Jeweils 100 ml eines Kulturmediums (mit derselben Zusammensetzung wie das Keimkulturmedium) wurden in 120 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, wonach das Medium in jedem Kolben sterilisiert wurde. Jeder Kolben wurde dann mit 3 ml der Keimkultur beimpft. Das Material in jedem der 120 Kolben wurde dann unter denselben Bedingungen, wie sie für die Keimkultur angewandt wurden, 7 Tage der Schüttelkultur unterzogen.
b) Isolierung
• Die gesamte Kulturbrühe aus den 120 Kolben wurde vereinigt und durch Abnutschen filtriert, wodurch 13 l Filtrat erhalten wurden. Dieses wurde zweimal mit jeweils einer gleichen Menge Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatextrakte wurden vereinigt und mit 5 l Wasser gewaschen; sie wurden dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, wonach sie unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampers bis zur Trockne eingedampft wurden, wodurch 360 mg einer öligen Substanz erhalten wurden. Die Gesamtmenge dieser öligen Substanz wurde dann durch Adsorptions-Säulenchromatographie mit Silicagel (Artikel 9385, 230 bis 400 Siebmaschen des Tyler-Standardsiebes, Merck) in der 30-fachen Menge seines eigenen Volumens gereinigt und mit einem Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:1 eluiert. Die Fraktionen mit Aktivität als PAF-Antagonist wurden aufgefangen und das Lösungsmittel durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt, wodurch 130 mg eines öligen Materials enthalten wurden. Die Gesamtmenge dieses öligen Materials wurde durch Phasenumkehr-Säulenchromatographie (Lobar RP-8-Säule, Größe B, Merck) weiter gereinigt. Die mit 80 Vol.-%igem wäßrigem Methanol eluierten Fraktionen wurden aufgefangen und das Lösungsmittel abdestilliert. Das als Rückstand erhaltene ölige Material wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.) unter Verwendung von 40 Vol.-%igem wäßrigem Acetonitril als Eluiermittel gereinigt. Die aufgefangenen Fraktionen wurden durch Destillation unter vermindertem Druck vom Lösungsmittel befreit, wodurch 3 mg der gewünschten Verbindung Phomactin A {chemische Bezeichnung: (3'E)-3,3a-Dihydroxy-2,6-(3'-methyl-3'- hexeno)-2,6,7-trimethyl-3a,5,6,7,8,8a-hexahydrofuro[2,3,4-de]- chroman} als farbloses Öl erhalten wurden.
BEISPIEL 2
• Die Gesamtmenge der durch Züchten einer Keimkultur in 480 Kolben unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhaltenen Kulturbrühe wurde durch Abnutschen filtriert, wonach die erhaltenen 48 l Filtrat zweimal, jedesmal mit einem gleichen Volumen Ethylacetat, extrahiert wurden. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurden mit 20 l Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, wonach sie unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bis zur Trockne eingedampft wurden, wodurch eine ölige Substanz erhalten wurde. Diese ölige Substanz wurde der Silicagel-Säulenchromatographie mit der etwa 30-fachen Menge seines eigenen Volumens an Silicagel (Artikel 9385, 230 bis 400 Siebmaschen, Tyler, Merck) unterzogen und mit einem Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:1 und dann mit einem Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 2:3 eluiert. Die erste Fraktion wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und durch phasenumkehr-Chromatographie (Lobar RP-8-Säule, Größe B, Merck) und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.) gereinigt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wodurch 9,4 mg Phomactin A als farbloses Öl erhalten wurden. Die mit dem 2:3-Gemisch eluierten zweiten Fraktionen wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch 78,2 mg einer öligen Substanz erhalten wurden, die durch Silicagel-Säulenchromatographie (Lobar Si60-Säule, Größe A, Merck) weiter gereinigt und mit einem Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:1 eluiert wurde. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden dann der Phasenumkehr-Chromatographie (Lobar RP-8-Säule, Größe B, Merck) unterzogen und mit 60 Vol.-%igem wäßrigem Methanol eluiert, wodurch 15,9 mg Phomactin B {chemische Bezeichnung: (7E)-13,15-Di- hydroxy-3,4-epoxy-2-oxo-4,8,11,12,15-pentamethyl- bicyclo[9.3.1]pentadeca-7,14-dien} als farblose Nadeln erhalten wurden.
BEISPIEL 3
• Eine Keimkultur wurde 11 Tage bei 23ºC in 55 Kolben auf die in Beispiel 1 erläuterte Weise gezüchtet, mit der Ausnahme, daß anstelle des künstlichen Meerwassers Leitungswasser verwendet wurde. Die Gesamtmenge der erhaltenen Kulturbrühe wurde durch Abnutschen filtriert, wonach 5,4 l des erhaltenen Filtrats zweimal mit dem gleichen Volumen Ethylacetat extrahiert wurden. Die vereinigten Ethylacetatextrakte wurde mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, wonach sie unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft wurden, wodurch 636 mg einer öligen Substanz erhalten wurden. Die Gesamtmenge dieser öligen Substanz wurde der Silicagel-Säulenchromatographie (Artikel 9385, 230 bis 400 Tyler-Siebmaschen, Merck) unterzogen und mit einem Gemisch von Hexan und Ethylacetat im Volumenverhältnis von 1:4 eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden durch Verdampfen unter vermindertem Druck eingeengt, wodurch 274 mg einer öligen Substanz erhalten wurden. Diese wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.) gereinigt und mit 80 Vol.-%igem wäßrigem Methanol bei einer Fließrate von 6 ml/min eluiert, wobei bei einer Retentionszeit von 22,5 min 14,0 mg Phomactin A erhalten wurden. Die Vorlauffraktionen vor der Phomactin A enthaltenden Fraktion wurden durch Eindampfen unter vermindertem Druck eingeengt und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.) gereinigt und mit 70 Vol.-%igem wäßrigem Methanol bei einer Fließrate von 6 ml/min eluiert, wodurch bei einer Retentionszeit von 18 min 14,4 mg Phomactin B erhalten wurden.
VERSUCH 1
• Unter Verwendung von nach den vorstehenden Beispielen erhaltenem Phomactin A wurde der folgende Anti-Blutplättchen-Aggregationstest durchgeführt.
• Blut wurde aus einem Kaninchenherzen entnommen und sofort mit der neunfachen Menge seines eigenen Volumens an 3,8 % w/v wäßriger Natriumcitratlösung vermischt. Durch Zentrifugieren dieses Blutgemisches bei 150 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde dann ein blutplättchenreiches Plasma (PRP) als überstehende Lösung erhalten. Die das zentrifugierte Blutgemisch enthaltende verbleibende Niederschlagsfraktion wurde dann weitere 15 Minuten bei 10 000 x g zentrifugiert, wodurch als überstehende Lösung ein blutplättchenarmes Plasma (PPP) erhalten wurde. Geeignete Anteile an PRP und PPP wurden vermischt, um ein Plasma mit einer Plättchenzahl von 6 x 10&sup5;/ul zu erhalten.
• Die Plättchenaggregation wurde durch die Methode von Born et al. [Nature, 194, 927-929 (1962)] ermittelt, bei der die Zunahme des Lichtdurchtritts durch die Testprobe mittels eines Aggregometers gemessen wird.
• 3 ul einer die zu testende Verbindung in geeigneter Konzentration enthaltenden Dimethylsulfoxidlösung wurden zu 250 ul des auf vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Plasmas zugesetzt. Eine Minute danach wurden 25 ul einer Kochsalzlösung von synthetischem C16:0-PAF (bei einer Konzentration, die ausreichend ist, um eine Endkonzentration von 1 x 10&supmin;&sup8; bis 3 x 10&supmin;&sup8; M zu ergeben) zugesetzt und das Ausmaß der Aggregation 5 Minuten beobachtet. Die durch den Zusatz von PAF allein ohne vorherigen Zusatz der Testverbindung resultierende Aggregation wurde mit 100 % angenommen.
• Anstelle der Testlösung wurde physiologische Kochsalzlösung zugesetzt und die Aggregation eine Minuten nach dem Zusatz von C&sub1;&sub6;-PAF als Vergleich verwendet. Als Ergebnis wurde gefunden, daß Phomactin A bei einer Konzentration von 10 g/ml die Plättchenaggregation um etwa 91,7 % hemmt, was einem IC&sub5;&sub0;-Wert (d.h. der Konzentration, die notwendig ist, um die Aggregation um 50 % zu hemmen) von 17 uM entspricht.
VERSUCH 2
• Mit Phomactin B wurde derselbe Versuch wie in Versuch 1 durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß dessen IC&sub5;&sub0;-Wert ebenfalls 17 uM beträgt, was gleichfalls eine gute und nützliche Fähigkeit zum Hemmen der plättchenaggregation anzeigt.

Claims (33)

1. Verbindung der Formel (I) :

2. Verbindung der Formel (II) :

3. Verbindung der Formel (Ia) :

4. Verbindung der Formel (IIa) :

5. Verbindung mit Aktivität als PAF-Antagonist, die aus einer Kultur eines Mikroorganismus des Stammes Phoma SANK 11486 (Nr. FERM BP-2598) hergestellt werden kann, wobei die Verbindung durch einen Cyclohexenring gekennzeichnet ist, der zwischen einem Kohlenstoffatom der Doppelbindung und einem um zwei Positionen von diesem entfernten Kohlenstoffatom durch eine 9-gliedrige Kohlenstoff-Brückenstruktur überbrückt ist, die selbst überbrückt oder nicht überbruckt sein kann.

6. Verfahren zur Herstellung eines Phomactins mit Aktivität als PAF-Antagonist, welches das Züchten eines Phomactin produzierenden Mikroorganismus des Genus Phoma und Abtrennen mindestens eines Phomactins aus der Kulturbrühe umfaßt, wobei die Verbindung durch einen Cyclohexenring gekennzeichnet ist, der zwischen einem Kohlenstoffatom der Doppelbindung und einem um zwei Positionen von diesem entfernten Kohlenstoffatom durch eine 9-gliedrige Kohlenstoff-Brückenstruktur überbrückt ist, die selbst überbrückt oder nicht überbrückt sein kann.

7. Verfahren zur Herstellung von Phomactin A der in Anspruch 1 definierten Formel (I), welches das Züchten eines Phomactin A produzierenden Mikroorganismus des Genus Phoma und Abtrennen von Phomactin A aus der Kulturbrühe umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung von Phomactin B der in Anspruch 2 definierten Formel (II), welches das Züchten eines Phomactin B produzierenden Mikroorganimus des Genus Phoma und Abtrennen von Phomactin B aus der Kulturbrühe umfaßt.

9. Verfahren zur Herstellung von Phomactin A der in Anspruch 3 definierten Formel (Ia), welches das Züchten eines Phomactin A produzierenden Mikroorganimus des Genus Phoma und Abtrennen von Phomactin A aus der Kulturbrühe umfaßt.

10. Verfahren zur Herstellung von Phomactin B der in Anspruch 4 definierten Formel (IIa), welches das Züchten eines Phomactin B produzierenden Mikroorganoismus des Genus Phoma und Abtrennen von Phomactin B aus der Kulturbrühe umfaßt.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, bei dem dieser Mikroorganismus ein Stamm eines Pilzes der Spezies ist, welcher auch der Stainin SANK 11486 (Nr. FERM BP-2598) als Stamm angehört.

12. Verfahren gemaß Anspruch 11, bei dem dieser Mikroorganismus Stamm SANK 11486 (Nr. FERM BP-2598) ist.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, bei dem die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 30ºC durchgeführt wird.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 28ºC durchgeführt wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem die Züchtung bei einer Temperatur im Bereich von 22 bis 26ºC durchgeführt wird.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 15, bei dem die Züchtung in einem Kulturmedium bei einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0 durchgeführt wird.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem die Züchtung in einem Kulturmedium bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 durchgeführt wird.

18. Pharmazeutische Zubereitung zur Behandlung einer durch PAF verursachten Erkrankung, speziell von Entzündung oder Schock, welche einen PAF-Antagonisten in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält, wobei der PAF-Antagonist mindestens ein Phomactin ist.

19. Zubereitung gemäß Anspruch 18, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist.

20. Zubereitung gemäß Anspruch 18, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 2 ist.

21. Zubereitung gemäß Anspruch 18, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 3 ist.

22. Zubereitung gemäß Anspruch 18, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 4 ist.

23. Verwendung mindestens eines Phomactins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer durch PAF verursachten Erkrankung.

24. Verwendung gemäß Anspruch 23, bei der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist.

25. Verwendung gemäß Anspruch 23, bei der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 2 ist.

26. Verwendung gemäß Anspruch 23, bei der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 3 ist.

27. Verwendung gemäß Anspruch 23, bei der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 4 ist.

28. Verwendung mindestens eines Phomactins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe einer durch PAF verursachten Erkrankung, insbesondere Asthma, Entzündung oder Schock.

29. Verwendung gemäß Anspruch 28, bei der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 1 ist.

30. Verwendung gemäß Anspruch 28, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 2 ist.

31. Verwendung gemäß Anspruch 28, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 3 ist.

32. Verwendung gemäß Anspruch 28, in der das Phomactin eine Verbindung gemäß Anspruch 4 ist.

33. Phoma SANK 11486 (Nr. FERM BP-2598).