DE68904264T2 - Fragmente und fraktionen von heparin mit wirkung gegen hiv. - Google Patents
Fragmente und fraktionen von heparin mit wirkung gegen hiv.Info
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Description
- Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Anwendung von Heparinfragmenten und Heparinfraktionen, welche durch Abbau mit Periodat, Heparinase oder Nitrit erhältlich sind, als Arzneimittel, welches die Vermehrung des menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV) inhibiert oder verhindert.
- Es ist bekannt, dass Heparin, aber auch andere Mucopolysaccharide, wie Dextransulfat, in vitro eine antivirale Wirksamkeit auf das menschliche Immunschwäche- Virus (HIV) ausüben. Diese Substanen ergeben eine merkliche Herabsetzung der Cytopathogenizität von HIV für, MT-4- und Molt-4-Zellen. [M. Ito et al., Antiviral Research, 7 (1987), 361-7]. Substanzen dieser Art könnten wirksame chemotherapeutische Mittel gegen HIV sein und könnten dazu dienen, AIDS (acquired immune deficiency syndrome) und ARC (AIDS-verwandter Komplex) zu bekämpfen. Der Vorteil der genannten Mucopolysaccharide gegen Nucleotide, wie 3'-Azjdo-2',3'-dideoxythymidin (AZT, Retrovir ) besteht in ihrer niederen Cytotoxizität, so dass sie als selektive Inhibitoren für die HIV-Vermehrung dienen können. Ein grosser Nachteil, welcher mit der Verwendung von Heparin und Dextransulfat für die Verhütung der HIV- Vermehrung verbunden ist, ist die Eigenschaft (von sulfatierten Glycosaminoglycanen), Blutungen zu erzeugen und/ oder den Blutgerinnungsprozess zu stören, was eindeutig ihre praktische Nützlichkeit als Anti-AIDS-Arzneimittel dämpft.
- Abgesehen von Heparin wurden auch fragmentierte Heparine auf die HIV-1-Vermehrung untersucht [M. Baba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 6132-6136]. Diese Veröffentlichung offenbart jedoch Heparinfragmente von unbekannter Zusammensetzung und unbekannter Herkunft, welche weniger oder nicht aktiv sind im Vergleich mit nicht-fragmentiertem Heparin.
- Es wurde nun gefunden, dass kleinere Heparinfragmente, welche durch Abbau mit Periodat, Heparinase, oder Nitrit erhältlich sind, und Heparin von niederer Affinität, von welchen bekannt ist, dass die Gefahr von Blutungen und/oder die Antigerinnungswirkung nieder sind, eine merkliche Wirksamkeit als Inhibitor für HIV- Vermehrung behalten. In niederer Dosis weisen sie eine starke Aktivität gegen HIV-1 wie auch gegen HIV-2 auf, und in bezug auf HIV-2 sind sie viel aktiver als Standard-Heparin.
- Es wurde gefunden, dass alle Arten von Heparinfragmenten diese Anti-HIV-Aktivität aufweisen, unabhängig von ihrem Molekulargewizht und dem Abbauverfahren (Periodat-, Heparinase- oder Nitritabbau) . Das Kriterium, nach welchem diese Substanzen ausgewählt werden, richtet sich auf die Blutungs- und Gerinnungskennzeichen. Wenn Heparinfragmente oder Heparinfraktionen ausgewählt werden, welche eine Anti-Thrombin-Aktivität von weniger als 50 Einheiten/mg, und vorzugsweise weniger als 20 Einheiten/mg aufweisen, sind die Risiken von Blutungen und die Antigerinnungswirkung niedrig. Substanzen mit einer minimalen Anti-Thrombin-Aktivität von weniger 1 Einheit/mg sind besonders interessant, weil die Anti-HIV-Aktivität nicht herabgesetzt ist, aber die Nebenwirkungen vernachlässigbar gering sind.
- Es wurde gefunden, dass das neue Produkt keine Mutagene und keine toxischen Eigenschaften besitzt, selbst in hohen Dosierungen (bis zu 400 mg/kg/Tag).
- Die Heparinfraktionen und -fragmente können auf verschiedenen Wegen erhalten werden. Säugetiergewebe, wie Lungen, Bauchspeicheldrüse, Leber, Eingeweide und isnbesondere Eingeweideschleim, können als Rohmaterial dienen. Das Produkt wird zuerst aus dem Säugetiergewebe durch Autolyse oder mit Hilfe von proteolytischen Enzymen (z.B. Enzyme aus der Bauchspeicheldrüse von Schweinen, oder bakterielle Enzyme, wie Proteasen aus Bacillus subtilis) freigesetzt.
- Das Produkt wird sodann isoliert durch Ausfällung mit organischen Lösungsmitteln, üblicherweise mit wassermischbaren Lösungsmitteln, wie Alkoholen, z.B. Methanolen. Andere Methoden zur Isolierung basieren auf der Bindung an eine quaternäre aliphatische Ammoniumbase oder an einen basischen Ionenaustauscher. Weitere Reinigung des Produktes kann durch fraktionierte Ausfällung erfogen. Das Heparin kann sodann in eine Fraktion von hoher Affinität und eine Fraktion von niederer Affinität getrennt werden, z.B. durch Trennung über eine AT- III-Sepharose-Säule. Die Fraktion von niederer Affinität kann als solche verwendet oder weiter abgebaut werden.
- Die Fraktion mit hoher Affinität kann abgebaut werden, und die derart erhaltenen Fragmente können wiederum in Fraktionen mit hoher und solche mit niederer Affinität getrennt werden, von welchen die Fraktion mit niederer Affinität als ein Anti-HIV-Arzneimittel verwendet werden kann.
- Der Abbau kann auch mit Heparin durchgeführt werden, welches nicht über AT-III aufgetrennt wurde. Abgebaute Heparinfragmente können als solche verwendet werden oder können noch weiter über eine AT-III-Sepharose-Säule in eine Fraktion von hoher und einer Fraktion von niederer Affinität getrennt werden.
- Eine gemeinsame Eigenschaft der Heparinfragmente und -fraktionen besteht darin, dass sie Oligomere oder Polymere mit sich wiederholenden Einheiten sind, welche aus den Disacchariden α-D-(1T4)-Gluzosamin-β-D-(1T4)- glucuronsäure und/oder α-D-(1T4)-Glucosamin-α-L-(1T4)- iduronsäure bestehen. Die verschiedenen Hydroxy- und Aminogruppen können sulfatiert sein. Die Aminogruppen können auch acetyliert sein. Im Fall von Fragmenten, kann je nach der gewählten Abbaumethode, eine nichtreduzierende Endeinheit eine Doppelbindung enthalten und/oder ein reduzierendes Glucosaminende kann in eine Anhydromannose umgewandelt sein.
- Abbaumethoden, welche verwendet werden können, sind die folgenden Methoden, welche in der Heparinchemie bekannt sind:
- - Nitritabbau
- - Periodatabbau
- - Heparinaseabbau.
- Heparin, welches mit Periodat abgebaut ist, und Heparin von niederer Affinität, welches mit Nitrit abgebaut ist, sind besonders geeignet infolge ihres günstigen therapeutischen Index.
- Der Heparinabbau mit Periodat kann z.B. nach der von Fransson und Lewis [FEBS Lett., 97(1), (1979), 119] beschriebenen Methode durchgeführt werden. Bevorzugt werden die mit Periodat abgebauten Fragmente mit einem Molekulargewicht von zwischen 2500 und 6500 D.
- Die Wirkung dieser Heparinfraktionen und -fragmente ist nicht mit Sicherheit bekannt, doch wird angenommen, dass eine a-spezifische Zusammenwirkung zwischen Heparin und T-Lymphocyten erfolgt, als deren Resultat die Bindung zwischen Virus und Lymphocyt inhibiert wird. Dies würde erklären, warum das Molekulargewicht und die spezifische Zusammensetzung der Heparinfraktionen oder -fragmente von geringer Bedeutung ist.
- Die Fragmente und Fraktionen können auf die für Heparin übliche Weise zu einer pharmazeutischen Dosierungsform verarbeitet werden, z.B. durch Auflösen in Wasser, welches sich für Injektionszwecke eignet, zu welchen, falls erwünscht, pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe (Konservierungsmittel, gewisse Salze) auch zugesetzt werden können. Die klinische Anwendung erfolgt vorzugsweise durch subkutane oder intravenöse (gegebenenfalls intermittierend) Injektion oder mit Hilfe einer Infusion. Die Anwendung als Depot oder als Präparat mit Langzeitwirkung ist ebenfalls gut möglich. Andere Dosierungsmittel, wie intrapulmonäre Verabreichung via Sprühinhalation oder Verabreichung mit Hilfe eines Suppositoriums sind ebenfalls möglich.
- Die Substanzen der vorliegenden Erfindung können in einem breiten Dosierungsbereich angewandt werden. Die normalen Dosierungen liegen zwischen 0,1 und 400 mg/kg/ Tag; eine Dosierung von zwischen 0,5 und 150 mg/kg/Tag wird bevorzugt.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Untersuchungen illustriert, ohne dass diese einen restriktiven Charakter aufweisen.
- 2 g Heparin wurden in 40 ml Wasser gelöst und 40 ml 0,2 M NaIO&sub4;-Lösung wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur unter Ausschluss von Licht während 6 Stunden bei pH 7 und 37ºC inkubiert, woraufhin 2 ml Aethylenglykol zugesetzt wurden und das Gemisch mit fliessendem deionisiertem Wasser dialysiert und anschliessend gefriergetrocknet wurde.
- 1 g des erhaltenen Pulvers wurde in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung wurde auf 50ºC erhitzt. 4 ml einer 0,5 M NaBH&sub4;-Lösung wurden sodann zugesetzt, und das Gemisch wurde während 2 Stunden bei 50ºC inkubiert. Das pH der Lösung wurde sodann mit 2N Essigsäure auf 3,4 eingestellt. Nach 5 Minuten wurde die Lösung mit 1N NaOH auf pH 7,1 neutralisiert. Das Gemisch wurde mit fliessendem deionisiertem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
- Molekulargewicht 6420 (HPLC in bezug auf Heparin-Standards).
- Uronsäuregehalt 90,4 % (in bezug auf Heparin).
- Heparin (2 % Gewicht/Volumen) wurde in 0,25 M Ammoniumacetat mit 0,023 M Calciumacetat bei einem pH von 5,8 gelöst und bei 30ºC mit Heparinase (5 IE/g Heparin) inkubiert. Bei einer OD&sub2;&sub3;&sub4; von 61 wurde ein stark basischer anionischer Austauscher zu dem Gemisch zugesetzt (5 g IW MP500A pro g Heparin) und nach Absorption während 2 Stunden wurde der Ionenaustauscher mit dem fünffachen Bettvolumen an 5 %iger Natriumchloridlösung eluiert. Die Hauptfraktion wurde sodann durch Eluierung mit fünffachem Bettvolumen an 15 %iger Natriumchloridlösung und Ausfällung mit 4 Volumina 100 %ige Methanol erhalten. Der Niederschlag wurde aufgearbeitet und unter Vakuum getrocknet.
- Molekulargewicht 2500 (HPLC in bezug auf Heparin-Standard)
- Uronsäuregehalt 98,6 % (in bezug auf Heparin).
- Heparin (0,05 % Gewicht/Volumen) wurde in 0,1 M Zitronensäurepuffer bei pH 3,0 gelöst. Eine 1 M Natriumnitritlösung wurde sodann zugesetzt (1 ml/10 mg Heparin).
- Nach 15 Minuten wurde das Gemisch sorgfältig mit 12,5 % (Gewicht/Volumen) Ammoniumsulfamat (2 ml/ 10 mg Heparin) neutralisiert. Das Gemisch wurde während einer weiteren halben Stunde gerührt und anschliessend während 1 Stunde stehen gelassen. Die Lösung wurde konzentriert, mit Alkali auf pH 7,0 ± 0,2 neutralisiert und auf einen basischen Anionenaustauscher (5 ml LKB DEAE- Zetaprep/ 10 mg Heparin) gegeben. Nach Voreluierung mit Wasser wurde die Hauptfraktion erhalten durch Eluierung mit 3 M Natriumchloridlösung. Die gesammelten Fraktionen wurden ausgefällt durch Zusatz von 3 Volumina 100 %igem Methanol. Der Niederschlag wurde aufgearbeitet und unter Vakuum getrocknet.
- Molekulargewicht 4800, 4400, 3900, 3500 (4 Spitzen in HPLC in bezug auf Heparin-Standard).
- Uronsäuregehalt 96,4 % (in bezug auf Heparin).
- Die niedermolekulare (LM) Heparinfraktion, welche in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde bei 4ºC in eine AT-III-Affinitätssäule (10 mg LM-Heparin/ 130 ml AT-III-MAAM-Siliciumoxid) eingeführt. Die Fraktion von niederer Affinität wurde erhalten durch Eluierung mit 1,5 Bettvolumina an 0,4 M Natriumchloridlösung in 0,05 M Ammoniumacetat bei pH 7,5.
- Das LM-Heparin von niederer Affinität wurde bei Zimmertemperatur gesammelt und auf einen basischen Ionenaustauscher verbracht. Nach dem Waschen mit Wasser wurde der Ionenaustauscher mit 3 M Natriumchloridlösung eluiert. Die gesammelten Fraktionen wurden mit 3 Volumina 100 %igem Methanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde aufgearbeitet und unter Vakuum getrocknet.
- Molekulargewicht 4400, 3900 (2 Spitzen in HPLC in bezug auf Heparin-Standard).
- Uronsäuregehalt 110,6 % (in bezug auf Heparin).
- Kapillarer Blutungstest bei Ratten.
- Ein Placebo oder das zu untersuchende Produkt wurde über die Dorsal-Vene des Penis von anästhesierten Ratten dosiert. Nach 1 Minute wurde ein Hautlappen von Hand von dem rasierten Unterleib entlang zwei zuvor ausgeführten Einschnitten abgezogen. Die Wunde wurde mit einem Gazeverband bedeckt und der Hautlappen wurde über die Gaze gelegt. Nach 10 Minuten wurde die Gaze entfernt, und das darin enthaltene Blut wurde mit 20 ml Wasser extrahiert. Die Hämoglobinkonzentration in Wasser wurde spektrophotometrisch gemessen und als Parameter für den Blutverlust verwendet (s. Thrombos. Haemostas. 42, 466, 1979). Substanz Dosierung mg/kg Blutung % Placebo Heparin Produkt aus Beisp.
- Die Bestimmung der antiviralen Aktivität der Substanzen gegen HIV-Vermehrung wurde mit Hilfe der Inhibition von durch Viren induzierte Cytopathogenizität durchgeführt, wie sie mit der 3'-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Methode gemessen wird, welche von Pauwels et al. beschrieben ist [J. Virol. Methods, 20, (1988), 309-321] . Mit dieser Methode werden MT-4-Zellen mit HIV bei 1000 CCID&sub5;&sub0;/ml infisziert.
- Nach der Virusadsorption wurden die infiszierten Zellen gewaschen und in einem Kulturmedium suspendiert. Die Anzahl an MT-4-Zellen wurde auf 3 x 10&sup5; Zellen/ml gebracht. Sie wurden sodann auf eine Kunststoff-Mikrotitrierplatte verbracht, welche verschiedene Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen enthielt. Nach Inkubierung während 5 Tagen bei 37ºC wurde die Anzahl lebensfähiger Zellen nach der MTT-Methode bestimmt. Die Anti-HIV-1-Aktivität der Verbindungen wurde auch durch Ueberwachung der viralen Antigenexpression in HUT-78- Zellen 12 Tage nach der Infektion bestimmt unter Verwendung von indirekter Immunofluoreszenz und Laser-Fliesscytofluorographie, wie von Baba et al. beschrieben [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1983), 6132].
- Die 50 %ige antiviral wirksame Dosierung (ED&sub5;&sub0;) auf HIV-1 und HIV-2, die 50 %ige cytotoxische Dosierung (CD&sub5;&sub0;) und die Anti-Thrombin-Aktivität sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Anti-Thrombin-Aktivität (E/mg) HIV-1 (ED&sub5;&sub0;) (ug/ml) HIV-2 (ED&sub5;&sub0;) (ug/ml) CD&sub5;&sub0; (ug/ml) Heparin Produkt aus Beispiel N.T. nicht untersucht
Claims (7)
1. Verwendung von Heparinfraktionen oder
Heparinfragmenten, welche durch Abbau mit Periodat, Heparinase
oder Nitrit erhältlich sind und eine
Antithrombinaktivität von weniger als 50 Einheiten/mg aufweisen, für die
Herstellung eines Arzneimittels, welches die Vermehrung
des menschlichen Immunschwäche-Virus (HIV) inhibiert
oder verhindert.
2. Verwendung von Heparinfraktionen oder
Heparinfragmenten, welche durch Abbau mit Periodat, Heparinase
oder Nitrit erhältlich sind und eine
Antithrombinaktivität von weniger als 50 Einheiten/mg aufweisen, für die
Herstellung eines Arzneimittels, welches die Vermehrung
von HIV-1 und/oder HIV-2 inhibiert oder verhindert.
3. Verwendung von Heparinfraktionen oder
Heparinfragmenten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass ihre Antithrombinaktivität weniger als
20 Einheiten/mg beträgt.
4. Verwendung von Heparinfraktionen oder
Heparinfragmenten nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet,
dass ihre Antithrombinaktivität weniger als 1
Einheit/mg beträgt.
5. Verwendung von Heparinfragmenten nach einem
der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die
Heparinfragmenten mit Hilfe von Antithrombin III (AT III)
gebunden an einen Träger abgetrennt werden.
6. Verwendung von Heparinfragmenten nach
Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die
Heparinfragmentendurch Abbau mit Periodat erhältlich sind.
7. Verwendung von Heparinfragmenten nach
Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Heparinfragmenten
durch Abbau mit Nitrit erhältlich sind.
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