DE60314132T2

DE60314132T2 - Methode zur produktion monoklonaler antikörper

Info

Publication number: DE60314132T2
Application number: DE60314132T
Authority: DE
Inventors: Alan Michael Euro Sawyer; Federico European Molecular Biology DE MASI
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2023-04-18
Also published as: WO2003089471A1; AU2003227873B2; CA2480717C; ES2288214T3; IL164625A0; GB0208817D0; JP2006500912A; GB2387847B; DK1506235T3; JP4429736B2; JP5006923B2; CA2480717A1; AU2003227873A1; IL164625A; CN1659185A; ATE363490T1; GB2387847A; US20110287960A1; DE60314132D1; EP1506235B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper. Insbesondere betrifft die Erfindung Hochdurchsatzverfahren zur schnelleren Herstellung von monoklonalen Antikörpern als durch herkömmliche Verfahren.
Die Entwicklung von Zelllinien, die monoklonale Antikörper herstellen, durch somatische Fusionen von B-Lymphozyten mit Myelomzellen wurde zuerst von Kohler und Milstein vor über 25 Jahren beschrieben (Kohler & Milstein, 1975). Seit damals haben monoklonale Antikörper eine zentrale Rolle in dem exponenziellen Wachstum unseres Verständnisses von humaner Physiologie, Biochemie und Genetik gespielt. Monoklonale Antikörper sind vielseitige und empfindliche Werkzeuge für das Nachweisen und das Lokalisieren spezifischer biologischer Moleküle. Monoklonale Antikörper können gegen irgendein Zellmolekül hergestellt werden, was es ermöglicht, dass dieses Molekül identifiziert, lokalisiert und gereinigt wird. In einigen Fällen können monoklonale Antikörper auch helfen, die Funktion des Moleküls, an das sie binden, zu identifizieren.
Das diagnostische und therapeutische Potenzial von monoklonalen Antikörpern wurde auch schnell bemerkt, nachdem die Hybridomtechnik ihre Entwicklung Mitte der 70er Jahre des 20. Jahrhunderts erlaubte. Monoklnale Antikörper wurden zu Schlüsselbestandteilen in einer Vielzahl von Anordnungen von klinischen labordiagnostischen Tests. Zusätzlich enthalten eine große Vielzahl von lizenzierten Arzneimitteln monoklonale Antikörper, und große Anzahlen von Arzneimitteln in der Entwicklung sind monoklonale Antikörper. Die klinische Verwendung von monoklonalen Antikörpern wurde durch die Entwicklung von Chimären und vollstän dig humanisierten monoklonalen Antikörpern, die Nebenwirkungen in Patienten minimieren, verbessert.
Jedoch trotz der zentralen Rolle von monoklonalen Antikörpern in diesen Entwicklungen in der Medizin und der Molekularbiologie, hat sich der Vorgang für die Herstellung und das Screenen monoklonaler Antikörper nur wenig verändert, seit sie erstmals von Kohler & Milstein in der Mitte der 70er Jahre des 20. Jahrhunderts entwickelt wurden. Der Ansatz, der am häufigsten verwendet wird, um einen monoklonalen Antikörper gegen ein spezifisches Antigen herzustellen, benötigt eine Reihe von Immunisierungen von Mäusen oder Ratten mit einem Antigen über einen Zeitraum von einigen Wochen, um die Aktivierung und Proliferation von reifen B-Zellen, die Antigen-spezifische Antikörper herstellen, zu verstärken. Mehrere Mäuse werden für gewöhnlich immunisiert und werden periodisch hinsichtlich der Gegenwart von relevanten Serumimmunglobulin-Titern vor der somatischen Fusion getestet. Nach der Fusion werden die Überstände der Hybridoma unter Verwendung von Immunassays gescreent, um monoklonale Antikörper mit einer hohen Spezifität für das Antigen zu identifizieren. Der Zeitrahmen, der für die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung dieses Ansatzes benötigt wird, beträgt für gewöhnlich 3 bis 9 Monate.
Die WO 96/33735 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines humanen Antikörpers durch Immunisieren eines nicht humanen transgenen Tieres mit einem Antigen, gegen das es gewünscht ist, den Antikörper herzustellen. Das nicht humane transgene Tier ist modifiziert worden, um B-Zellen zu bilden, die humane Antikörper anstelle von endogenen Antikörpern sekregieren. Nach der Immunisierung werden B-Zellen aus der Milz des Tieres erhalten und unter Verwendung der Kohler & Milstein'schen Technik immortalisiert, um Hybridoma herzustellen. Ein Sandwich ELISA, in dem der monoklonale Antikörper des Hybridomüberstandes an Antigen und an eine anti-humane konstante Region gebunden ist, können verwendet werden, um zu bestätigen, dass der Antikörper human ist.
Templin et al., (Trend in Biotechnology, 2002, 20:160) betrifft die theoretischen Vorteile und Beschränkungen von Mikroarray Technologiesystemen und, insbesondere, die veränderte Verwendung von Protein Mikroarrays in diagnostischen Verfahren und der Genom- und Proteomforschung.
Die Entwicklung von RIMMS (engl.: repetitive, multiple site immunisation strategy; wiederholte, mehrere Stellen betreffende Immunisierungsstrategie) hat es ermöglicht, dass somatische Fusionen nur 8-14 Tage nach dem Beginn der Immunisierung stattfinden (Kilpatrick et al., 1997). Die Überstände der hergestellten Hybridoma können anschließend unter Verwendung von Standardimmunassays gescreent werden, was es erlaubt, dass ein monoklonaler Antikörper gegen ein spezifisches Antigen sehr viel schneller isoliert werden kann.
Jedoch benötigt die Herstellung und das Screenen von monoklonalen Antikörpern gegen große Anzahlen von verschiedenen Antigenen, selbst unter Verwendung von RIMMS, beachtliche Zeit und Mittel. Weil immer mehr neue Proteine entdeckt werden, gibt es einen Bedarf für schnellere und effizientere Verfahren zur Herstellung und dem Screenen monoklonaler Antikörper gegen diese Proteine, um ihre weitere Charakterisierung zu erlauben.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich stellt die Erfindung ein Hochdurchsatzverfahren zur Herstellung einer Vielzahl monoklonaler Antikörper bereit, von denen jeder einen verschiedenen Antigenkandidaten bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) das Einführen einer Vielzahl gereinigter Antigenkandidaten in ein Tier oder Tiere;
b) das Rückgewinnen Antikörper-produzierender Zellen aus dem Tier oder den Tieren und das Vereinigen dieser Zellen in eine Einzelzellsuspension;
c) das Erzeugen immortalisierter Zelllinien aus der Einzelzellsuspension;
d) das Screenen des Überstandes der immortalisierten Zelllinien gegen einen Protein-Chip, auf welchem die Antigenkandidaten dargestellt sind; und
e) das Auswählen monoklonaler Antikörper, welche an die Antigenkandidaten binden.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist beachtliche Vorteile gegenüber den Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper auf, die gegenwärtig zur Verfügung stehen. Wie bereits diskutiert wurde, schließen die gegenwärtigen Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen mehr als ein Antigen arbeitsintensive Immunisierungs- und Isolierungsprotokolle für jedes individuelle Antigen ein. Im Gegensatz dazu können in dem erfindungsgemäßen Verfahren dem Tier mehrere Antigene injiziert werden, was zu der gleichzeitigen Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen mehrere Antigene und zur Steigerung der Geschwindigkeit und Wirksamkeit der monoklonalen Antikörperherstellung führt. Die Verwendung eines Protein-Chips in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschleunigt den Vorgang des Screenens, um monoklonale Antikörper nachzuweisen, die an das Antigen oder die Antigene bindet/binden, mit dem/denen das Tier injiziert wurde. Zusätzlich ist der Protein-Chip empfindlicher als herkömmliche Screeningassays, wie Enzym basierte immunabsorbierende Assays (ELISAs; engl.: enzyme linked immunosorbent assays), was zu einer verbesserten Nachweisrate für langsam sekregierende Hybridomazellen führt, die unter Verwendung herkömmlicher Screeningverfahren verloren gehen würden. Darüber hinaus erlaubt die Verwendung eines Protein-Chips in dem erfindungsgemäßen Verfahren, dass jeder Überstand mehrere Male gegen ein Antigen gescreent werden kann und nur einen Bruchteil der Menge des Antigens verwendet, die für ein einzelnes Screenen in einem herkömmlichen Screeningassay, wie einem ELISA, benötigt wird. Zum Beispiel kann jeder Überstand zweifach, dreifach oder vierfach gegen ein Antigen gescreent werden.
Das Tier in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann irgendein nicht-humanes Säugetier sein. Vorzugsweise ist das Tier eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Hamster oder ein Meerschweinchen. Vorzugsweise ist das Tier eine Maus.
Der Antigenkandidat in Schritt a) ist vorzugsweise ein gereinigter Antigenkandidat. Entweder ein gereinigter Antigenkandidat oder eine Mischung aus gereinigten Antigenkandidaten kann in das Tier eingeführt werden. Unter "gereinigtem Antigenkandidaten" wird verstanden, dass das Antigen eine homogene Präparation aus Antigen ist, die im Wesentlichen frei ist von anderen Bestandteilen. Unter "einem Gemisch aus gereinigten Antigenkandidaten" wird verstanden, dass mehr als ein gereinigtes Antigen in der Zusammensetzung, die für die Immunisierung verwendet wird, anwesend ist, aber dass die Präparation frei ist von kontaminierenden Bestandteilen, für die es keine Absicht gibt, die Produktion von Antikörpern hervorzurufen. Obwohl beispielsweise herkömmliche Verfahren verwendet werden, kann ein Tier mit mehreren Antigenen gleichzeitig durch Immunisierung mit homogenisiertem Gewebe, immunisiert werden, sodass die Immunisierung keine Immunisierung mit gereinigtem Antigenkandidaten darstellt, so wie dies hier definiert ist, weil die Antigene mit zellulärem Debris kontaminiert sein würden.
Irgendeine Anzahl von gereinigten Antigenkandidaten kann in das Tier eingeführt werden. Vorzugsweise wird mehr als ein gereinigter Antigenkandidat in das Tier eingeführt. Beispielsweise können 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 oder mehr als 50 gereinigte Antigenkandidaten in das Tier eingeführt werden. Die Antigene können gleichzeitig eingeführt werden, in dem Sinn, dass sie alle zusammengemischt werden. Alternativ dazu können die Antigene getrennt eines nach dem anderen eingeführt werden. Die Einführung von verschiedenen Antigenen kann durch einen Zeitraum von Tagen voneinander getrennt sein. Vorzugsweise beträgt der Zeitraum, der die Einführung von verschiedenen Antigenen voneinander trennt, weniger als 48 Stunden, vorzugsweise weniger als 24 Stunden. Vorzugsweise schließt das Verfahren zur Einführung die Injektion von Antigen(en) in das Tier ein.
Unter dem Begriff "Antigenkandidat" wird irgendeine Substanz verstanden, die fähig ist, eine Immunantwort in einem Tier zu induzieren, wenn dieser Antigenkandidat in das Tier eingeführt wird. Der Begriff schließt deshalb proteinöse Substanzen und nicht-proteinöse Substanzen ein. Proteinöse Substanzen, die Antigene sind, schließen Proteine und Derivate davon ein, wie Glykoproteine, Lipoproteine und Nukleoproteine und Peptide. Fragmente von solchen proteinösen Substanzen sind ebenfalls in dem Begriff "Antigen" eingeschlossen. Vorzugsweise bestehen solche Fragmente aus oder umfassen antigene Determinanten. Nicht-proteinöse Substanzen, die Antigene sind, schließen Polysaccharide, Lipopolysaccharide und Nukleinsäuren ein. Insbesondere schließt der Begriff "Antigen" Nukleinsäuremoleküle ein, die eine Immunantwort gegen die Proteine induzieren, welche sie kodieren. Fragmente von solchen nicht-proteinösen Substanzen sind ebenfalls in dem Begriff "Antigen" eingeschlossen. Der Begriff "Antigen" schließt weiterhin proteinöse oder nicht-proteinöse Substanzen ein, die an einen Träger gebunden sind, der fähig ist, eine Immunantwort zu induzieren, wie Lipide oder Haptene, durch welche Antigenität verliehen wird, wenn sie mit einem Träger verbunden sind. Die erfindungsgemäßen Antigene können natürlich vorkommende Substanzen sein, oder sie können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden.
Das Antigen ist vorzugsweise eine proteinöse Substanz oder ein Nukleinsäuremolekül. Wo das gereinigte Antigen eine proteinöse Substanz ist, kann es alleine oder in Form eines Fusionsproteins eingeführt werden. Insbesondere stellt die Erfindung bereit, dass das Antigen in der Form eines Fusionsproteins vorliegen kann, das auf der Oberfläche eines rekombinanten Virions exprimiert wird, wobei das Tier mit dem rekombinanten Virion injiziert wird. Die Herstellung von solchen rekombinanten Virionen unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die das proteinöse Antigen kodiert, ist in Lindley et al., 2000 beschrieben.
Irgendeine Kombination von gereinigten Antigenen kann verwendet werden. Das Tier kann mit nur proteinösen Antigenen, nur nicht-proteinösen Antigenen oder einer Mischung aus beiden injiziert werden. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die gereinigten Antigene alle proteinös. Die gereinigten Antigene können Fragmente sein, die von demselben Protein oder verschiedenen Proteinen abgeleitet sind. Die gereinigten Antigene können rekombinante Virionen sein, die von einer cDNA Bibliothek abgeleitet sind, wobei jedes rekombinante Virion ein Protein exprimiert, das durch eine cDNA aus der Bibliothek auf seiner Oberfläche kodiert wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung bereit, dass mehrere gereinigte Antigene in das Tier in der Form von Nukleinsäuremolekülen eingeführt werden, die Proteine kodieren, gegen die es gewünscht ist, monoklonale Antikörper herzustellen. Die Nukleinsäuremoleküle können DNA Moleküle, cDNA Moleküle oder RNA Moleküle sein. Vorzugsweise kann in diesem Aspekt der Erfindung eine cDNA Bibliothek in das Tier eingeführt werden. Es ist deshalb möglich, das Tier mit Nukleinsäuremolekülen zu injizieren, die ein Protein von unbekannter Identität kodieren, und, wie unten beschrieben wird, können Zell-Chips verwendet werden, um einen Antikörper gegen das Protein zu isolieren, der wiederum erlaubt, dass das Protein gereinigt wird.
Wo das gereinigte Antigen ein Nukleinsäuremolekül ist, besteht es vorzugsweise aus oder umfasst eine DNA, cDNA oder RNA Sequenz, die ein Protein kodiert, gegen das eine Immunantwort induziert werden soll. Das Nukleinsäuremolekül kann ein nacktes Nukleinsäuremolekül sein, oder es kann in der Form eines Vektors vorliegen.
Der Vektor kann in viraler Vektor, vorzugsweise ein retroviraler, adenoviraler, adeno-assoziierter viraler (AAV), Herpes viraler, Alphavirus Vektor oder irgendein anderer geeigneter Vektor sein, wie für den Fachmann offensichtlich sein wird. Alternativ dazu kann das Nukleinsäuremolekül in der Form eines nicht viralen Vektors, vorzugsweise eines Plasmidvektors vorliegen. Viele solche Vektoren sind bekannt und im Stand der Technik dokumentiert (siehe zum Beispiel Fernandez J.M. & Hoeffler J.P. in Gene expression systems. Using nature for the art of expression Hrsg. Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokio, Toronto, 1998). Solche Vektoren können zusätzlich regulatorische Sequenzen, wie Enhancer, Promotoren, Ribosomen Bindestellen und Terminationssignale in den 5' und 3' nicht-translatierten Regionen von Genen aufweisen, die benötigt werden, um sicherzustellen, dass die kodierende Sequenz richtig transkribiert und translatiert wird.
Alternativ dazu kann das Nukleinsäuremolekül in der Form von polykationisch kondensierter DNA vorliegen, die mit abgetötetem Adenovirus alleine, siehe zum Beispiel Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, oder Liganden verbundener DNA, siehe zum Beispiel Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-1698, gebunden oder ungebunden ist. Das Nukleinsäuremolekül kann auch in der Form von DNA beschichteten Latexkügelchen vorliegen. Alternativ dazu kann das Nukleinsäuremolekül in Liposomen verkapselt sein, wie zum Beispiel in der WO 95/13796 , in der WO 94/23697 , in der WO 91/14445 und der EP-524,968 . SA 91(24):11581-11585 beschrieben ist.
Das Antigen kann in das Tier auf irgendeine geeignete Weise eingeführt werden. Vorzugsweise schließt das Verfahren zur Einführung die Injektion ein. Die Tiere können mit dem gereinigten Antigen oder den gereinigten Antigenen in die Milz, intravenös, intraperitoneal, intradermal oder subkutan oder auf irgendeine andere geeignete Weise immunisiert werden. Die Tiere können mit dem gereinigten Antigen oder den gereinigten Antigenen über mehr als einen dieser Wege immunisiert werden. Zum Beispiel kann etwas des gereinigten Antigens oder der gereinigten Antigene intraperitoneal und der Rest subkutan injiziert werden. Die injektionsweise wird von dem Antigen oder den Antigenen, das/die injiziert werden soll/en, abhängen. Zum Beispiel kann im Fall der Injektion mit einem Nukleinsäuremolekül eine in der Hand gehaltene Gentransfer Teilchenpistole, wie in der US 5,149,655 beschrieben, verwendet werden, um das Nukleinsäuremolekül zu injizieren.
Im Fall eines proteinösen Antigens sollte die Dosis jedes Antigens vorzugsweise im Bereich von zwischen 0,01 und 1000 Mikrogramm liegen.
Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren den zusätzlichen Schritt des Verabreichens einer Boosterdosis aus einigen oder den gesamten Antigenen an das Tier, die in das Tier vor der Rückgewinnung der Antikörperproduzierenden Zellen eingeführt wurde/n. Den Tieren kann ein Booster 1-365 nach der ersten Injektion verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Tiere 1- bis 20-mal geboostert.
Vorzugsweise sind die Immunisierungsprotokolle, die in der Methodik der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kurz, wenn mehr als ein Antigen verwendet wird, um zu verhindern, dass ein Antigen immundominant wird. Vorzugsweise, wenn das Tier mit mehr als einem Antigen immunisiert wird, wird es mit einem Booster jedes Antigens oder einem kombinierten Booster aus mehr als einem Antigen 3 Tage nach der ersten Injektion und einem weiteren Booster 5 Tage nach der anfänglichen Injektion injiziert, wobei das Milzgewebe oder die Lymphknoten zwischen Tag 6 und Tag 15 entfernt werden. Wo ein längeres Immunisierungsprotokoll gewünscht ist, kann das Tier zum Beispiel mit einem Booster jedes Antigens oder einem kombinierten Booster aus mehr als einem Antigen 21 Tage nach der ersten Injektion injiziert werden, wobei das Milzgewebe und die Lymphknoten am Tag 26 entfernt werden.
Die Immunisierung des Tieres kann mit oder ohne pharmazeutischen Trägern durchgeführt werden. Geeignete Träger sind typischerweise große, langsam metabolisierende Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, polylaktische Säuren, polyglykolische Säuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure Copolymere, Lipidaggregate (wie Öltröpfchen oder Liposomen) und inaktive Viruspartikel. Solche Träger sind dem Fachmann gut bekannt. Zusätzlich können diese Träger als immunstimulierende Mittel ("Adjuvantien") wirken. Die Immunisierung des Tieres kann mit oder ohne Adjuvantien zusätzlich zu den pharmazeutischen Trägern durchgeführt werden.
Bevorzugte Adjuvantien, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verstärken, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf: (1) Aluminiumsalze (Alaun), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc.; (2) Wasser-in-Öl Emulsionsformulierungen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulierende Mittel wie Muramylpeptide (siehe unten) oder bakterielle Zellwand Bestandteile), wie zum Beispiel (a) MF59^TM ( WO 90/14837 ; Kapitel 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, Hrsg. Powell & Newman, Plenum Press 1995), enthaltend 5 % Squalen, 0,5 % Tween 80 und 0,5 % Span 85 (wahlweise enthaltend MTP-PE), formuliert in Submikronpartikel unter Verwendung eines Mikroverflüssigers, (b) SAF, enthaltend 10 % Squalen, 0,4 % Tween 80,5 % Pluronic blockiertes Polymer 1121 und thr-MDP, entweder mikroverflüssigt in eine Submikronemulsion oder gevortext, um eine Emulsion mit großer Partikelgröße zu bilden, und (c) Ribi^TM Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), enthaltend 2 % Squalen, 0,2 % Tween 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwand Bestandteile aus der Gruppe bestehend aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM), und Zellwandskelett (CWS), vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin Adjuvantien, wie QS21 oder Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) können verwendet werden, oder Partikel, die daraus gebildet werden, wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe), wobei ISCOMs ohne zusätzliches Detergens vorliegen können, Z.B. WO 00/07621 ; (4) vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (z.B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (WO 99/44636 ), etc.), Interferone (z.B. Gamma Interferon), Makrophagenkolonie stimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosisfaktor (TNF), etc.; (6) Monophosphoryllipid A (MPL) oder 3-O-deacyliertes MPL (3dMPL) Z.B. G6-2220221, EP-A-0689454 , wahlweise in der im Wesentlichen Abwesenheit von Alum, wenn es mit pneumokokkalen Polysacchariden verwendet wird, z.B. WO 00/56358 ; (7) Kombinationen aus 3dMPL mit zum Beispiel QS21 und/oder Öl-in-Wasser Emulsionen, z.B. EP-A-0835318 , EP-A-0735898 , EP-A-0761231 ; (8) Oligonukleotide umfassend CpG Motive (Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-864; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveanu et al., Vaccine, 1998, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messing et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; und Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; internationale Patentanmeldungen WO 96/02555 , WO 98/16247 , WO 98/18810 , WO 98/40100 , WO 98/55495 , WO 98/37919 und WO 98/52581 ), d.h. enthaltend mindestens ein CG Dinukleotid, wobei 5-Methylcytosin wahlweise anstelle von Cytosin verwendet wird; (9) ein Polyoxyethylenether oder ein Polyoxyethylenester, z.B. WO 99/52549 ; (10) ein Polyoxyethylensorbitanester grenzflächenaktives Mittel in Kombination mit einem Octoxynol ( WO 01/21207 ) oder einem Polyoxyethylenalkylether oder -ester grenzflächenaktivem Mittel in Kombination mit mindestens einem zusätzlichen nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittel, wie einem Octoxynol ( WO 01/21152 ); (11) einem Saponin und einem immunstimulatorischen Oligonukleotid (z.B. einem CpG Oligonukleotid) ( WO 00/62800 ); (12) einem Immunostimulans und einem Partikel aus Metallsalz, z.B. WO 00/23105 ; (13) einem Saponin und einer Öl-in-Wasser Emulsion, z.B. WO 99/11241 ; (14) einem Saponin (z.B. QS21) + 3dMPL + IL-12 (wahlweise + einem Sterol), z.B. WO 98/57659 ; (15) anderen Substanzen, die als immunstimulierende Mittel wirken, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Zusätzliche Beispiele von Adjuvantien, die verwendet werden können, schließen Montanide ISA 50, Hunter'sches TiterMax und Gerbu Adjuvantien ein.
Bevorzugte Antikörperproduzierende Zellen zur Verwendung in der Erfindung schließen B-Zellen, T-Zellen und Stammzellen ein. Diese Antikörperproduzierenden Zellen zur Verwendung in der Erfindung können durch das Entfernen von irgendeinem geeigneten zellulären Bestandteil des Immunsystems aus dem Tier rückgewonnen werden. Vorzugsweise werden die Antikörperproduzierenden Zellen aus dem Tier durch Entfernen der Milz, der Lymphknoten oder des Knochenmarks oder Teilen davon rückgewonnen. Diese können in eine Einzelzellsuspension gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens über irgendein geeignetes Mittel überführt werden. Vorzugsweise werden Milzgewebe, Lymphknoten oder Knochenmark, das/die aus dem Tier entfernt wurde/n, in eine Einzelzellsuspension durch mechanisches Zerstören oder enzymatische Spaltung mit Proteasen überführt. Rote Blutkörperchen können aus der Zellsuspension durch hypotonische Lyse entfernt werden.
Vorzugsweise ist die immortalisierte Zelllinie, die in Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens spezifiziert ist, eine Hybridom-Zelllinie, die durch somatische Fusion der Zellen in der Einzelzellsuspension mit Myelomzellen hergestellt werden. Die Zellen in der Einzelzellsuspension werden mit einem Fusogen mit Myelomzellen fusioniert. Beispiele von Myelomzellen, die verwendet werden können, schließen SP2, NS1 und NS0 ein. Vorzugsweise ist das Fusogen PEG, ein Virus oder ein Verfahren der Elektrofusion (Zimmermann et al., 1990).
Die Hybridomzellen, die durch die Fusion der Einzelzellsuspension mit den Myelomzellen hergestellt wurden, sollten kultiviert werden. Vorzugsweise werden die Hybridomzellen anfänglich in einem Selektionsmedium, wie Azaserinhypoxanthin oder Hypoxanthinaminopterinthymidin, kultiviert und werden anschließend in ein nicht-selektives Medium überführt. Vorzugsweise werden die Hybridomzellen in dem Selektionsmedium für 7 Tage kultiviert und werden anschließend in ein nicht-selektives Medium für 3 Tage transferiert. Dies stellt sicher, dass die Wachstumsrate der Zellen vor dem Screeningschritt ansteigt. Vorzugsweise werden die Schritte, die in die Hybridomherstellung eingeschlossen sind, automatisch durch einen Roboter durchgeführt, um den Vorgang zu beschleunigen. Die Beispiele zeigen einen Weg des Durchführens der Schritte, die in die Hybridomherstellung durch einen Roboter eingeschlossen sind.
Alternativ dazu kann die immortalisierte Zelllinie eine Zelllinie sein, die durch Infektion von Zellen mit der Einzelzellsuspension mit einem immortalisierenden Virus gebildet wurde. Vorzugsweise ist das immortalisierende Virus das Epstein-Barr Virus (siehe zum Beispiel Epstein Barr Virus Protocols, Hrsg. Wilson and May, Humana Press; ISBN: 0896036901).
Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Screenen des Überstands der immortalisierten Zelllinie, vorzugsweise einer Hybridom-Zelllinie, gegen einen Protein-Chip umfassend einen Antigenkandidaten, mit dem das Tier immunisiert wurde. So wie hier verwendet, wird der Begriff "Protein-Chip" verwendet, um irgendeinen Mikroarray einzuschließen, der aus einem Trägermittel aufgebaut ist, an das ein Antigenkandidat angeheftet wurde.
Wo mehr als ein gereinigtes Antigen in das Tier eingeführt wurde, kann jedes gereinigte Antigen an einer verschiedenen Position auf dem Protein-Chip dargestellt werden, vorzugsweise an einer vorherbestimmten Position. Jede Position auf dem Protein-Chip kann somit ein unterschiedliches Antigen darstellen. Alternativ dazu kann dasselbe Antigen an jede Position in einer Reihe oder einer Säule eines Protein-Chips angeheftet werden, wobei ein unterschiedliches Antigen in jeder Reihe oder Säule dargestellt wird. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, selbst wenn das Tier mit mehr als einem gereinigten Antigen immunisiert wurde, einen anderen Chip für jedes Antigen zu verwenden. Ein Protein-Chip kann eine große Anzahl, wie zwischen 1 und 1000 gereinigten Antigenen, angeheftet an vorbestimmten Positionen auf einem Chip, aufweisen.
Irgendeine Art eines Protein-Chips, der im Stand der Technik bekannt ist, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann der Protein-Chip ein Glasobjektträger sein, an den das gereinigte Antigen oder die Antigene angeheftet sind. Wo nur ein Antigen getestet werden soll, kann ein solcher Objektträger einfach durch Beschichten eines Glasmikroskop Objektträgers mit Aminosilan (Ansorge, Faulstich), Hinzufügen einer Antigen-enthaltenden Lösung zu dem Objektträger und Trocknen hergestellt werden. Objektträger, die mit Aminosilan geschichtet sind, können von Telechem und Pierce zum Beschichten mit dem gereinigten Antigen erhalten werden. Vorzugsweise kann ein solcher Glasobjektträger mit (6-Aminohexil) Aminosilan beschichtet sein.
Andere Arten von Protein-Chips, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, schließen ein 3D Gelpolster (Akrenov et al., 2000) und Mikrovertiefungs-Chips ein. Wie für den Fachmann offensichtlich sein wird, können Arten von Protein-Chips, die bislang noch nicht bekannt sind, aber die in der Zukunft bekannt werden, sich als geeignet für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung herausstellen.
Der Begriff "Protein-Chip" schließt auch Mikroarrays von Zellen ein, die definierte cDNAs (Ziauddin et al., 2001) exprimieren, die hier als "Zell-Chips" bezeichnet werden. In dieser Technik werden Säugetierzellen auf einem Glasobjektträger kultiviert, der an bestimmten Positionen mit verschiedenen cDNAs bedruckt ist. Zellen, die auf den bedruckten Stellen wachsen, nehmen die cDNAs auf und exprimieren sie. Zell-Chips sind insbesondere nützlich, wenn das Tier mit einer cDNA oder einer cDNA Bibliothek oder mit einem rekombinanten Virion oder Virionen, die aus einer cDNA Bibliothek hergestellt wurden, wie oben beschrieben, injiziert wurde. In solchen Fällen kann es sein, dass die Proteine, die durch die cDNA Sequenzen kodiert werden, nicht isoliert wurden. Durch Injizieren des Tieres mit cDNAs, die Proteine kodieren oder rekombinanten Virionen, die die cDNAs exprimieren, ist es möglich, monoklonale Antikörper gegen die Proteine herzustellen, die durch die cDNAs exprimiert werden. Wenn dieselben cDNAs unter Verwendung eines Zell-Chips exprimiert werden, werden diese Antikörper binden, und die Bindung kann wie unten beschrieben nachgewiesen werden. Vorausgesetzt, dass eine Nukleinsäuresequenz, die das Protein kodiert, zur Verfügung steht, erlaubt die Erfindung in dieser Weise den Nachweis und die Isolierung eines monoklonalen Antikörpers gegen dieses Protein, der verwendet werden kann, um das Protein selbst zu reinigen.
Für die Selektion von Antikörpern oder die Selektion von immortalisierten Zelllinien, die solche Antikörper herstellen, wird der Überstand von der immortalisierten Zelllinie oder den Zelllinien auf dem Protein-Chip oder den Protein-Chips an definierten Positionen auf dem Chip aufgespottet. Aufspotten der Überstände wird vorzugsweise mittels eines Roboters durchgeführt, zum Beispiel mit einem GE- nemachines Ominigrid Arrayer unter Verwendung von Telechem Nadeln. Vorzugsweise enthalten die Überstände, die auf dem Protein-Chip oder den Protein-Chips aufgespottet werden, Glycerol um das Trocknen und Fixieren der Antikörper auf dem Objektträger zu minimieren. Zum Beispiel kann 0 bis 99,9 % Glycerol verwendet werden. Der Chip wird anschließend gewaschen, um irgendwelchen ungebundenen Überstand zu entfernen. Auf dieser Stufe kann der monoklonale Antikörper, der durch die immortalisierte Zelllinie hergestellt wird und damit der Überstand an ein Antigen auf dem Chip gebunden werden.
Unter Verwendung verschiedener Elutionsbedingungen erlaubt das Verfahren die ungefähre Quantifizierung der Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers für seinen Bindungspartner. Elutionsmittel, die verwendet werden können, schließen kaotrope Mittel, wie Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff bei Konzentrationen zwischen 10 μmolar und 8 molar oder Ethylenglykol in einer wässrigen Lösung bei 0,01 % bis 100 % w/v ein. Die Elutionen können auch unter Verwendung von wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungen von Glycerin bei Konzentrationen zwischen 0,01 molar und einer gesättigten Lösung (vorzugsweise 200 mM), bei einem pH-Wert von zwischen pH 9 und pH 1, vorzugsweise pH 3,2, durchgeführt werden. Hohe pH-Wert Elutionen können unter Verwendung von wässrigen oder nichtwässrigen Lösungen aus Triethylamin zwischen 1 μmolar und einer gesättigten Lösung, vorzugsweise 100 mM, bei einem pH-Wert von zwischen pH 8 und pH 13, vorzugsweise pH 11,5 durchgeführt werden.
Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens schließt die Selektion eines monoklonalen Antikörpers ein, der an das Antigen bindet. Vorzugsweise schließt dieser Schritt einen Nachweisschritt, wie durch Hinzufügen eines Markers, der an gebundenen monoklonalen Antikörper binden wird und seine Gegenwart anzeigen wird, ein. Vorzugsweise ist der Marker mit einer Markierung markiert, wie einer enzymatischen oder fluoreszierenden Markierung, die es erlaubt, dass seine Gegenwart nachgewiesen wird. Zum Beispiel kann der Marker markiertes Protein A oder markiertes Protein G sein. Protein A oder Protein G können mit einer fluoreszierenden Markierung, wie Cy3 oder Cy5 markiert sein. Alternativ dazu können Protein A oder Protein G mit einer enzymatischen Markierung, wie Biotin, markiert sein, deren Gegenwart durch das Binden von markiertem Streptavidin oder Avidin nachgewiesen werden kann.
Vorzugsweise ist der Marker ein Antikörper, der an den ersten Antikörper binden wird. Vorzugsweise ist dieser Antikörper mit einer Markierung, wie einer enzymatischen oder einer fluoreszierenden Markierung markiert. Vorzugsweise ist dieser Antikörper mit fluoreszierenden Markierungen markiert, da es dies erlaubt, eine Ausstattung für das Scannen von DNA-Chips zu entwickeln, die für den Nachweis bzw. die Detektion verwendet werden kann.
Vorzugsweise umfasst der Schritt des Detektierens eines monoklonalen Antikörpers, der an das Antigen gebunden ist, weiterhin das Isotypisieren der monoklonalen Antikörper. Vorzugsweise umfasst dieser Schritt des Detektierens und Isotypisierens der monoklonalen Antikörper das Hinzufügen von Isotyp-spezifischen Anti-Immunglobulin-Antikörpern zu dem Protein-Chip, wobei jeder Anti-Immunglobulin-Antikörper mit einer verschiedenen Isotyp-Spezifität eine verschiedene Markierung aufweist, und das Detektieren der Gegenwart der Markierungen umfasst. Dieses Verfahren erlaubt das gleichzeitige Detektieren des monoklonalen Antikörpers und die Bestimmung seines Isotyps.
Es wird erkannt werden, dass das Verfahren so viele verschiedene Isotypspezifische Anti-Immunglobulin-Antikörper, jeden mit einer verschiedenen Markierung, einsetzen kann, wie es Antikörperisotypen in dem Tier gibt, das immunisiert wurde. Wenn zum Beispiel ein Säugetier, wie eine Maus, mit einem Antigen injiziert wurde, kann der Schritt des Detektierens und des Isotypisierens monoklonaler Antikörper, die an das Antigen gebunden sind, das Hinzufügen eines Anti-IgA Antikörpers umfassen, der mit einer ersten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgD Antikörpers, der mit einer zweiten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgE Antiörpers, der mit einer dritten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgG1 Antikörpers, der mit einer vierten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgG2a Antikörpers, der mit einer fünften Markierung markiert ist, und/oder ei nes Anti-IgG2b Antikörpers, der mit einer sechsten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgG3 Antikörpers, der mit einer siebten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgG4 Antikörpers, der mit einer achten Markierung markiert ist, und/oder eines Anti-IgM Antikörpers, der mit einer neunten Markierung markiert ist. Alternativ dazu kann der Schritt des Detektierens und des Isotypisierens monoklonaler Antikörper, die an das Antigen gebunden sind, das Hinzufügen Isotyp-spezifischer Anti-Immunglobulin-Antikörper umfassen, die an einen Untersatz der möglichen Isotypen binden. Vorzugsweise umfassen die Isotyp-spezifischen Antiimmunglobulin-Antikörper einen Anti-IgM Antikörper, der mit einer ersten Markierung markiert ist und einen Anti-IgG Antikörper, der mit einer zweiten Markierung markiert ist. Vorzugsweise sind die Markierungen fluoreszierende Markierungen.
Das Detektieren der Markierungen zeigt die Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers, der an ein Antigen gebunden ist, und dies wird vorzugsweise mittels eines Roboters durchgeführt. Wo die Markierung eine fluoreszierende Markierung ist, kann die Detektion der Markierung und damit die Gegenwart des monoklonalen Antikörpers unter Verwendung einer Ausstattung durchgeführt werden, die für das Scannen von Protein-Chips zur Verfügung steht. Zum Beispiel kann das Scannen der Chips mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon Instruments, Inc.) oder mit einem Tecan LS200 oder LS400 Scanner durchgeführt werden. Die Scannen kann mit zwischen 1 und 4 Lasern und Kombinationen von Filtern, um die Sichtbarmachung der mehrfachen fluoreszierenden Markierungen zu erlauben, durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Sichtbarmachung der mehreren fluoreszierenden Markierungen gleichzeitig durchgeführt, obwohl sie auch nacheinander durchgeführt werden kann.
Es können Bilder unter Verwendung geeigneter Software, wie GenePix Pro Software (Axon Instruments, Inc.), Chipskipper Software (Schwager, Ansorge) or Tecan LS200 oder 15400 Software erhalten und analysiert werden.
Um sicherzustellen, dass die Detektion eines monoklonalen Antikörpers verlässlich ist, setzt das Screeningverfahren vorzugsweise verschiedene Kontrollen ein. Zum Beispiel werden im Fall eines Protein-Chips, der mit einem Antigen beschichtet ist, nicht nur die Überstände aus den immortalisierten Zelllinien, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, auf den Protein-Chip aufgespottet, sondern auch Positiv- und Negativkontrollen.
Positivkontrollen können in der Form von zuvor getesteten monoklonalen Antikörpern oder kommerziell erhältlichen polyklonalen Antikörpern vorliegen. Alternativ dazu können die Positivkontrollen aus verdünntem oder unverdünntem Serum bestehen, das zuvor von der immunisierten Maus gesammelt wurde, entweder in einem geeigneten Zeitraum nach dem Booster oder zu dem Moment, an dem das Tier für das Sammeln der Quelle der B-Zellen getötet wird.
Die Negativkontrollen können in der Form von Mock Überständen an bestimmten Positionen vorliegen. Ein anderes Niveau der Kontrolle wird durch die Tatsache bestimmt, dass jeder Überstand gegen mehrere Antigene gescreent wird. Signale, die nur gegen ein Antigen erhalten werden, werden als Überstände erachtet, die potenziell einen positiven monoklonalen Antikörper enthalten.
Positive Signale auf dem Protein-Chip können zu einer bestimmten immortalisierten Zelllinie zurückverfolgt werden, was es erlaubt, dass der monoklonale Antikörper gemäß Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens isoliert wird. Die weitere Charakterisierung der identifizierten Antikörper kann anschließend durchgeführt werden.
Verfahren zur Durchführen weiterer Charakterisierungen des Antikörpers können zum Beispiel den weiteren Schritt des Bestimmens der Spezifität der identifizierten monoklonalen Antikörper einschließen. Zum Beispiel kann ein monoklonaler Antikörper, der durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert wurde, verwendet werden, um einen zweiten Protein-Chip mit einer größeren Anzahl von verschiedenen Proteinen zu scannen, die an seiner Oberfläche angeheftet sind, um zu überprüfen, ob der monoklonale Antikörper spezifisch an ein Antigen bindet. Die Scanverfahren, die oben in der anfänglichen Identifizierung des Proteins beschrieben sind, können verwendet werden, um hinsichtlich seiner Spezifität zu scannen. Die Bindungsspezifität und Affinität der monoklonalen Antikörper, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt wurden, können weiter durch Verändern der Konzentrationen des Antigens auf den Protein-Chips oder des Veränderns der Stringenz der eluierenden Bedingungen, wie oben beschrieben, charakterisiert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Bank von immortalisierten Zelllinien, welche eine Vielzahl monoklonaler Antikörper von Interesse bilden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) das Einführen einer Vielzahl verschiedener Antigenkandidaten in ein Tier oder Tiere;
b) das Rückgewinnen Antikörperproduzierender Zellen aus dem Tier oder den Tieren und das Vereinen dieser Zellen in eine Einzelzellsuspension;
c) das Erzeugen immortalisierter Zelllinien aus der Einzelzellsuspension;
d) das Screenen des Überstands der immortalisierten Zelllinien gegen einen Protein-Chip, auf welchem die Antigenkandidaten dargestellt sind; und
e) das Auswählen immortalisierter Zelllinien, die Überstände bilden, welche an Antigenkandidaten bindende Antikörper enthalten.

Immortalisierte Zelllinien, die durch ein solches Verfahren hergestellt werden, sind von immenser Nützlichkeit in der Erzeugung von Antikörpern mit maßgeschneiderten Spezifitäten.
Die Antigenkandidaten sind vorzugsweise gereinigte Antigenkandidaten, wie oben beschrieben. Geeignete Verfahren zum Einführen der Antigenkandidaten in das Tier, das Rückgewinnen Antigen-produzierender Zellen, das Erzeugen immortalisierter Zelllinien und das Screenen der Überstände der immortalisierten Zelllinien sind oben beschrieben.
Verfahren des Standes der Technik schließen arbeitsintensive und zeitaufwändige Verfahren ein, um einen monoklonalen Antikörper gegen ein einziges Antigen zu erzeugen und zu screenen. Im Gegensatz dazu erlaubt dieses Verfahren die Erzeugung und das Hochdurchsatzscreenen von monoklonalen. Antikörpern gleichzeitig gegen eine Vielzahl von Antigen. Die Verwendung eines Protein-Chips, um Hochdurchsatzscreening der Antikörper durchzuführen, ist wirksamer und akkurater als die Verwendung von herkömmlichen Assays, und es benötigt weniger Antigenkandidat.
Vorzugsweise umfasst Schritt e) dieser Ausführungsform weiterhin das Isotypisieren der monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben. Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil gegenüber den Verfahren des Standes der Technik bereit, die keine gleichzeitige Detektion und Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern beschreiben.
Die Erfindung stellt monoklonale Antikörper bereit. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um eine Bank von Antikörpern, zum Beispiel mit Spezifitäten zu erzeugen, die ein vollständiges Proteom eines Organismus enthalten. Eine solche Bank von Antikörpern stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Die Erfindung stellt auch immortalisierte Zelllinien, vorzugsweise Hybridom-Zelllinien, bereit, die monoklonale Antikörper bilden. Die Erfindung stellt auch eine Bank von immortalisierten Zelllinien, vorzugsweise eine Bank von Hybridom-Zelllinien, bereit. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um eine Bank von Hybridom-Zelllinien, zum Beispiel eine, die Antikörper bildet, die das gesamte Proteom eines Organismus umfassen, zu erzeugen.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bildung einer Vielzahl von monoklonalen Antikörpern bereitgestellt, von denen jeder an einen verschiedenen gereinigten Antigenkandidaten bindet, umfassend das Einführen einer Vielzahl von gereinigten Antigenkandidaten in ein Tier.
Vorzugsweise ist jeder Antigenkandidat von einer verschiedenen Quelle abgeleitet. Dies bedeutet, dass jedes Antigen von einem verschiedenen Protein, einer verschiedenen Nukleinsäure und so weiter abgeleitet ist. Es ist beabsichtigt, dass die Verfahren zur Antikörperbildung, die das Injizieren eines Tieres mit verschiedenen Fragmenten desselben Proteins einschließen, von dem Schutzumfang dieses Aspekts der Erfindung ausgeschlossen sind. Zum Beispiel können die gereinigten Antigenkandidaten alle proteinöse Substanzen sein, vorausgesetzt, dass sie nicht alle Fragmente desselben Proteins sind.
Dieses Verfahren weist einen Vorteil gegenüber Verfahren auf, die im Stand der Technik offenbart sind, dahingehend, dass es die gleichzeitige Bildung von mehr als einem monoklonalen Antikörper erlaubt, von denen jeder an einen verschiedenen gereinigten Antigenkandidaten bindet.
Das Tier kann mit den gereinigten Antigenkandidaten unter Verwendung irgendeiner der hier beschriebenen Techniken injiziert werden. Zum Beispiel kann das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung weiterhin die Schritte des Rückgewinnens Antikörperproduzierender Zellen, wie B-Zellen, T-Zellen und Stammzellen aus einem immunisierten Tier, wie durch das Entfernen von Milzgewebe, Lymphknoten oder Knochenmark, und ihr Überführen in eine Einzelzellsuspension, umfassen. Das Verfahren kann weiterhin das Erzeugen immortalisierter Zelllinien, vorzugsweise Hybridom-Zelllinien, aus den Zellen der Einzelzellsuspension umfassen. Vorzugsweise umfasst das Verfahren dieses Aspekts der Erfindung diese Schritte und umfasst zusätzlich die Schritte des Screenens der Überstände der immortalisierten Zeillinien, vorzugsweise Hybridom-Zelllinien, gegen einen Protein-Chip oder Protein-Chips, auf dem/denen die Antigenkandidaten dargestellt werden; und das Selektieren monoklonaler Antikörper, die an die Antigene binden und vorzugsweise das Isolieren dieser und/oder der immortalisierten Zelllinien, welche die monoklonalen Antikörper bilden. Geeignete Verfahren zum Erzeugen der immortalisierten Zelllinien und dem anschließlichen Screenen der Überstände sind dieselben, wie jene, die oben im Zusammenhang mit dem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung beschrieben sind. Insbesondere kann der Schritt des Detektierens der monoklonalen Antikörper die gleichzeitige Detektion der monoklonalen Antikörper und die Bestimmung dieses Isotyps, wie oben beschrieben, umfassen. Zusätzlich kann das Verfahren weiterhin die Charakterisierung der monoklonalen Antikörper, wie oben beschrieben, umfassen.
Die Erfindung stellt auch einen monoklonalen Antikörper bereit, der durch ein Verfahren dieses Aspekts der Erfindung hergestellt wurde. Wiederum kann dieser Aspekt der Erfindung verwendet werden, um eine Bank von Antikörpern, die zum Beispiel Antikörper mit Spezifitäten für die Proteine in einem gesamten Proteom eines Organismus umfassen, verwendet werden. Eine solche Bank aus Antikörpern stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Die Erfindung stellt auch eine immortalisierte Zelllinie, vorzugsweise eine Hybridom-Zelllinie, bereit, die einen monoklonalen Antikörper wie oben beschrieben bildet. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um eine Bank aus immortalisierten Zelllinien, vorzugsweise eine Bank aus Hybridom-Zelllinien zu erzeugen, die zum Beispiel Antikörper bilden, die ein gesamtes Proteom eines Organismus umfassen.
Gemäß eines fünften Aspekts der Erfindung können Anti-Ideotyp-Antikörper erzeugt werden, die an einen monoklonalen Antikörper gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung binden. Anti-Ideotyp-Antikörper sind nützlich, weil sie eine variable Region aufweisen, welche die Form des Moleküls nachahmt, gegen das der Original Antikörper angezogen wurde. Anti-Ideotyp-Antikörper können deshalb in der Therapie als Ersatzmittel für die Moleküle verwendet werden, gegen die der Original Antikörper angezogen wurde. Ein Anti-Ideotyp-Antikörper kann hergestellt werden durch das Einsetzen des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung oder des vierten Aspekts der Erfindung unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung als dem gereinigten Antigenkandidaten.
Folglich stellt dieser Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-Ideotyp-Antikörpers bereit, der an einen monoklonalen Antikörper gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung bindet, wobei das Verfahren die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung als einem gereinigten Antigenkandidaten in einem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung oder des vierten Aspekts der Erfindung umfasst. Die Erfindung schließt auch Anti-Ideotyp-Antikörper ein, die durch solche Verfahren erzeugt wurden.
Gemäß einem sechsten Aspekt der Erfindung können Anti-anti-Ideotyp-Antikörper erzeugt werden, die an einem Anti-Ideotyp-Antikörper binden, der gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung hergestellt wurde. Solche Anti-anti-Ideotyp-Antikörper können hergestellt werden durch das Einsetzen des Verfahrens des ersten Aspekts der Erfindung oder des vierten Aspekts der Erfindung unter Verwendung eines Anti-Ideotyp-Antikörpers, wie oben beschrieben, als dem gereinigten Antigenkandidaten. Dieser Aspekt der Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-anti-Ideotyp-Antikörpers bereit, der an einen Anti-Ideotyp-Antikörper bindet, der gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung erzeugt wurde, wobei das Verfahren das Verwenden eines Anti-Ideotyp-Antikörpers, wie oben beschrieben, als einen gereinigten Antigenkandidaten in einem Verfahren des ersten Aspekts der Erfindung oder des vierten Aspekts der Erfindung, umfasst.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden jetzt detaillierter beispielhaft beschrieben. Es wird erkannt werden, dass Modifikationen von Details durchgeführt werden, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu verlassen.
Kurzbeschreibung der Figuren:
1: Gesamtbild eines gescannten Chips, in dem grüne und rote Spots jeweils positive IgG und IgM bildende Überstände darstellen. Die Nahaufnahmen zeigen Details von spezifischen Bereichen des Chips, wo gute Spots gefunden werden können.
2: Vergleich zwischen der Chipanalyse und dem ELISA Screen. Das Bild ist eine negative Probe (Ia < 0,5), während die anderen positiv sind. Durchschnittliches Ic: durchschnittliche Gesamtintensität eines Spots auf 3 Chips. Ia: durchschnittlicher Beitrag des Spots zur Summe der Intensitäten über drei Chips (%).
3: Vergleich des Beitrags zur Gesamtintensität (%) von Kulturüberständen, die durch ELISA
oder durch Chipanalyse (⎕) hinsichtlich des Bindens an B5 Antigen (3A) gescreent wurden. Die Hintergrundwerte sind in 3B gezeigt. Eine Anzahl positiver Überstände, die durch Chipanalyse und/oder ELISA identifiziert wurde, ist gezeigt.
4: Vergleich des Beitrags zur Gesamtintensität (%) von Kulturüberständen, die durch ELISA
oder durch Chipanalyse (⎕) hinsichtlich des Bindens an B5 Antigen (4A) gescreent wurden. Die Hintergrundwerte sind in 4B gezeigt. Ein einzelner positiver Überstand, der durch Chipanalyse und/oder ELISA identifiziert wurde, ist gezeigt.
5: Vergleich des Beitrags zur Gesamtintensität (%) von Kulturüberständen, die durch ELISA
der durch Chipanalyse (⎕) hinsichtlich des Bindens an Ket94/95 Antigen (5A) gescreent wurden. Die Hintergrundwerte sind in 5B gezeigt. Eine Anzahl von positiven Überständen, die durch Chipanalyse und/oder ELISA identifiziert wurden, sind gezeigt.
6: Vergleich des Beitrags zur Gesamtintensität (%) von Kulturüberständen, die durch ELISA
der durch Chipanalyse (⎕) hinsichtlich des Bindens an Ket94/95 Antigen (6A) gescreent wurden. Die Hintergrundwerte sind in 6B gezeigt. Eine Anzahl von positiven Überständen, die durch Chipanalyse und/oder ELISA identifiziert wurden, sind gezeigt. Es wurden keine positiven Überstände durch entweder ELISA oder Chipanalyse identifiziert.
Beispiele
Beispiel 1: Immunisierung mit 10 Proteinantigenen
Immunisierung
Eine 8 Wochen alte weibliche Balb/c Maus wurde in die Milz mit 10 μg jedes der 10 Proteinantigene in 100 μl Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) injiziert. Am dritten folgenden Tag (Tag 3) wurde die Maus intraperitoneal mit 1 μg jeweils derselben 10 Proteinantigene in 100 μl PBS injiziert. Am Tag 5 wurde dieselbe Maus intravenös mit 0,1 μg jedes derselben 10 Proteinantigene injiziert. Am Tag 8 wurde die Maus durch zervikale Dislokation getötet und die Milz entfernt und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM: Life Technologie Inc.) gesammelt.
Fusion
Alle Schritte wurden unter sterilen oder aseptischen Bedingungen in einer laminar belüfteten Werkbank (engl.: laminar flow hood) durchgeführt. Die Milz wurde in eine Einzelzellsuspension durch mechanische Zerstörung zwischen zwei Glasmikroskop Objektträgern mit gefrorenen Enden überführt. Die Suspension wurde in ein 50 ml Gefäß mit konischem Boden und Barcode (BD Falcon) durch einen 70 μm Nylon Zellstrainer (BD Falcon) gefiltert und in das Robotersystem überführt.
Getrennt davon wurden SP2 Myelom Fusionspartner (ATCC) für fünf Tage vor der Fusion in HM20 (DMEM, 20 % definiertes fötales Rinderserum (Hyclone Defined), 10 mM L-Glutamin, 50 μM Gentamicin) kultiviert, und sie wurden am Tag der Fusion in HM20/HCF/2xOPI (HM20 enthaltend 10 % Hybridom Klonierungsfaktor (Origen) und 2 % OPI Klonierungsergänzung (Sigma) für mindestens eine Stunde bei 37°C in einen 5 % CO₂ Inkubator überführt.
Die Barcodes wurden durch ein Barcode Lesegerät ausgelesen, und das 50 ml Falkon Gefäß wurde in den Rotor durch den RoMa Arm auf dem Genesis Free dom System (Tecan) geladen. Der Rotor wurde in die Zentrifuge durch die Arbeitsoberfläche eingesetzt.
Das Gefäß wurde bei 100 g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert und der Rotor aus der Zentrifuge entnommen. Das Gefäß wurde aus dem Rotor entnommen, und der Barcode wurde wiederum ausgelesen, um ihn von dem Ausgleichsgefäß zu unterscheiden. Die Zellen wurden in 5 ml Red Cell Lysis Puffer (Sigma) für 9 Minuten bei RT resuspendiert. HM20 wurde auf 50 ml hinzugefügt und das Gefäß nochmals für 10 mm bei RT ohne Bremse zentrifugiert. Die Überstandlösung wurde zu Abfall aspiriert und die Zellen in DMEM resuspendiert, das vorher auf 37°C erwärmt wurde. Die Zellen wurden noch zweimal durch die Schritte der Zentrifugation und der Resuspension gewaschen. 50 μl der Zellsuspension wurden mittels eines Roboters in ein 1,5 ml Mikrozentrifugengefäß pipettiert. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Hämocytometer Zählkammer gezählt.
Gleichzeitig wurden die SP2 Zellen dreimal in derselben Weise gewaschen, und ein gleiches Aliquot (50 μl) wurde in ein 1,5 ml Gefäß für das hämocytometrische Zählen "eingebracht". Die SP2 Myeloma- und Milzzellen wurden in einem Verhältnis von 1:5 (SP2:Milz) gemischt und wiederum bei 100 g für 10 mm ohne Bremse zentrifugiert.
Die Überstandlösung wurde vollständig zu Abfall aspiriert, und Polyethylenglykol 1500 in 50 % HEPES (PEG: Roche Molecular Biochemicals), das auf 37°C vorerwärmt wurde, wurde vorsichtig mittels eine Roboters pipettiert und schrittweise über 1 mm unter Bewegung bei 450 rpm auf einem Te-Shake Schüttler (Tecan AG) bewegt, um ein gleichmäßiges Mischen sicherzustellen. Die Zell/PEG Mischung wurde für 1 mm bei 37°C mit vorsichtiger Bewegung inkubiert. 1 ml DMEM wurde gleichzeitig über 1 mm bei 37°C mit gleicher Bewegung hinzugefügt. Die Mischung wurde für 1 mm bei 37°C mit vorsichtiger Bewegung inkubiert. Ein weiterer 1 ml DMEM wurde mittels eines Roboters über 1 mm bei 37°C mit vorsichtiger Bewegung hinzugefügt und auf gleiche Weise für eine weitere Minute inkubiert. 7 ml HM20 wurden mittels eine Roboters über 3 mm bei 37°C mit vorsichtiger Be wegung hinzugefügt. Das Gefäß wurde anschließend bei 90 g für 5 min mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde zu Abfall aspiriert und das Pellet in 20 ml HM20/HCF/OPI/AH (HM20/HCF/OPI plus 10 % Azaserinhypoxanthin (Sigma)) resuspendiert.
Das konische Gefäß wurde wiederum in die Roboterarbeitsfläche gestellt, und der Postfusionszellschlamm wurde mit jeweils einem von 8 weit geöffneten Pipettenspitzen des Flüssigkeitshandhabungsarms des Roboters aspiriert. 200 μl des Zellschlamms wurden anschließend in jede Vertiefung einer Vertiefungsplatte mit 96 tiefen Vertiefungen (Greiner Masterblock) pipettiert.
Die Platte mit den tiefen Vertiefungen wurde anschließend mittels eines Roboters zu einem TeMo 96 vertiefungspipettierenden Roboter transferiert, der in die Genesis Arbeitsfläche integriert war, und wurde als eine Quellplatte verwendet, um in die 20 sterilen 96 Vertiefungsgewebekulturplatten auszuplattieren.
Die Postfusionsmischung wurde anschließend mittels eines Roboters in 20 96 vertiefungssterile Platten (Nunc) ausplattiert, die auf einem Karussell angeheftet versorgt wurden und in den Roboter bei 100 μl/Vertiefung integriert waren und mittels eines Roboters zu einem integrierten 37°C Inkubator mit 10 % CO₂ durch den integrierten Luftausschluss transferiert wurden. Die Platten wurden in einem Karussell gelagert, das in dem Inkubator enthalten war.
Zellkultur
Am dritten Tag nach der Fusion wurden die Zellen mittels eines Roboters aus dem Inkubator auf die Arbeitsfläche transportiert, und weitere 100 μl HM20/HCF/OPI/AH wurden mittels eines Roboters zugegeben. Die Platten wurden anschließend mittels eines Roboters in den Inkubator zurückgeführt.
Am Tag 7 wurden die Platten nochmals auf gleiche Weise von dem Inkubator auf die Arbeitsfläche transferiert, und 200 μl/Vertiefung der Kulturüberstände wurden zu Abfall aspiriert und mit 150 μl frischem HM20/HCF ersetzt.
Am Tag 11 wurden die Platten erneut mittels eines Roboters auf die Arbeitsfläche transportiert, und 30 μl des Überstands wurden aus jeder Vertiefung (Temo Kopf: Tecan Inc.) gesammelt und auf 384 Vertiefungsplatten transferiert, die auf der Arbeitsfläche von einem Karussell Plattenstapler (Tecan Inc.) bereitgestellt wurden.
Mikroarray Screenen
Aminosilan beschichtete Glasobjektträger wurden gleichmäßig mit gereinigtem Antigen durch Auftropfen von 40 μl ddH₂O enthaltend 1-5 μg Antigen beschichtet und mit einem 22·60 mm Deckel für 60 min in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur bedeckt.
Die beschichteten Objektträger wurden kurz in PBS gespült und für 60' in 5 % Milch in PBS, 0,1 % Tween, blockiert, anschließend für 10' in PBS gewaschen. Die Chips wurden anschließend durch Zentrifugation getrocknet, 10'' bei 2000 rpm.
Die Zellkulturüberstände wurden in 384 Vertiefungsplatten unter Verwendung eines Beckman Biomek FX Roboters konsolidiert.
Die Zellkulturüberstände wurden einzeln auf drei identische Antigen-beschichtete Objektträger bei einer Dichte von 9600 Spots pro Chip und einer Spotgröße von 120 μm unter Verwendung eines GeneMachines OmniGrid Mikroarray Druckers aufgedruckt.
Die Mikroarray-Chips wurden in einer feuchten Kammer für 60', bei RT, inkubiert und anschließend 5 × 5' in PBS – 0,1 % Tween (PEST) gewaschen.
40 μl Cy3 konjugierter Ziege Anti-Maus IgG spezifischer und Cy5 konjugierter Ziege Anti-Maus IgM spezifischer Antikörper wurden 1:1000 in PEST verdünnt, gemischt und gleichzeitig auf die Chips aufgetragen und mit 22 × 60 mm Deckgläschen bedeckt und in einer feuchten Kammer für 30' bei RT inkubiert. Die Chips wurden anschließend 2 × 10' in PEST, 2 × 10' in PBS und 1 × 10' in ddH₂O gewaschen. Die Chips wurden anschließend durch Zentrifugation bei 2000 rpm für 10'' getrocknet.
Picken der Hits
Die Chips wurden mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon Instruments), bei einer Auflösung von 10 μm·Pixel^–1 gescannt. Die PMT Spannungen betrugen 540 V und 610 V für jeweils die Cy3 und Cy5 Kanäle. Beide Laser wurden auf 100 % Intensität gesetzt. Jeder gescannte Chip wurde einem ausgestatteten Gitter zugewiesen, und alle Spots wurden durch das GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments) analysiert.
Alle Chips wurden durch die GenePix Pro 3.0 Software analysiert, und für jeden Chip wurde die Information relativ zu der korrigierten Intensität (I_c) jedes Spots (Median der Intensitäten – Hintergrund) für die Cy3 und Cy5 Kanäle gesammelt. Aus diesen Daten erhielten wir für jeden Chip den Beitrag jedes Spots zu der gesamten korrigierten Intensität jedes Kanals
Aus den drei Werten jedes Kanals wurde für jeden Spot ein Durchschnitt gebildet, und diese durchschnittliche korrigierte Intensität (Ia) wurde für die Endanalyse des Datensatzes verwendet. Wir erachteten als "wahrscheinlich positive" Proben jene, die einen Wert über 0,5 % und als "sicher positive" alle Proben, die einen Wert über 1,5 % zeigen.
Verarbeitung nach dem Screenen
Zellen aus positiven Vertiefungen wurden in der Vertiefung resuspendiert, und 20 μl wurden in eine 96 Vertiefungsplatte transferiert, die zuvor mit 1,5 ml HM20/HCF aufgefüllt wurde und für 48 Stunden bei 37°C, 5 % CO₂ in den Inkubator zurückgegeben.
1,4 ml jedes Kulturüberstandes wurde in eine andere Vertiefungsplatte überführt, und die verbleibenden 100 μl wurden verwendet, um die Zellen zu resuspendieren, die anschließend in Gefriergefäß mit 90 % fötalem Rinderserum/10 % DMSO (Sigma) überführt und auf –80°C für 2 Stunden überführt und von dort in ein Lager mit flüssigem Stickstoff überführt wurden. Der Kulturüberstand wurde anschließend zur Bewertung und weiteren Charakterisierung des erzeugten monoklonalen Antikörpers verwendet.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse des Mikroarray Screenens sind in 1 gezeigt. Diese Figur zeigt, dass eine Anzahl von positiven monoklonalen Antikörpern als an Antigenkandidaten auf dem Objektträger bindend detektiert wurden. Die grünen Spots sind IgG monoklonale Antikörper, die an die Antigenkandidaten binden, während die roten Spots IgM monoklonale Antikörper sind, die an die Antigenkandidaten binden. 1 zeigt somit, dass das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, um gleichzeitig monoklonale Antikörper, die an die Antigenkandidaten binden und die Isotypen von diesen monoklonalen Antikörpern zu identifizieren.
Wenn ein Vergleichsexperiment unter Verwendung eines ELISA anstelle eines Protein-Chips durchgeführt wurde, wurde eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern, die als an die Antigenkandidaten bindend in dem Mikroarray screenen identifiziert wurden, nicht als Antigenkandidaten bindend unter Verwendung des ELISA identifiziert, wie in 2 gezeigt ist (siehe Vergleich von Mikroarray Ergebnissen mit ELISA Ergebnissen). Ein Überstand, der unter Verwendung des Mikroarray Screenen (Ia: 0,234) als negativ befunden wurde, wurde auch un ter Verwendung des ELISAs als negativ befunden. Jedoch wurden von vier Überständen, die unter Verwendung des Mikroarray Screenens (Ia: 5,18, 1,96, 3,64 und 2,02) als positiv befunden wurden, wurden nur zwei unter Verwendung des ELISA als positiv befunden (siehe 2). Es ist wichtig anzumerken, wie die Überstände, die in dem ELISA experiment negativ waren, tatsächlich positive Proben sein können, wie durch den akkurateren und sensitiveren Mikroarray Ansatz detektiert wurde.
Beispiel 2: Immunisierung mit neun Antigenen
Immunisierung:
Eine Maus wurde mit 25 μg von neun Antigenen, einschließlich 25 μg einer Fusion der Antigene B5 und Ket94/95 immunisiert, wobei jedes Antigen mit 10 μg CpG DNA gemischt und an Alaun Adjuvans (Imject Alum von Pierce) adsorbiert war. Die Hälfte jedes Antigens wurde intraperitoneal und die Hälfte subkutan verabreicht.
Die Maus wurde 21 Tage später mit 10 μg jedes Antigens geboostet, das mit 10 μg CpG DNA gemischt und an Alaun Adjuvans adsorbiert war, wobei die Hälfte davon intraperitoneal und die Hälfte subkutan verabreicht wurde.
Fünf Tage nach dem Boost wurde die Milz entfernt.
Fusion und Zellkultur
Die Fusionen und Zellkultur wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Mikroarray Screenen von Antikörper gegen B5 und Ket94/95
Ein Aminosilan Glasobjektträger wurde gleichmäßig mit gereinigtem B5 durch Auftropfen von 40 μl ddH₂O enthaltend 5 μg gereinigtes B5 und Bedecken mit einem 22·60 mm Deckgläschen für 60 min bei Raumtemperatur, beschichtet. Dasselbe Verfahren wurde verwendet, um einen Aminosilan Glasobjektträger, der mit gereinigtem Ket94/95 beschichtet war, herzustellen.
Die beschichteten Objektträger wurden gespült, blockiert, gewaschen und getrocknet wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 3 % BSA in PBS anstelle von 5 % Milch in PBS verwendet wurde, um den Objektträger zu blockieren.
Die Kulturüberstände wurden in 384 Vertiefungsplatten konsolidiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und wurden dreifach auf den Objektträger gedruckt, der mit B5 beschichtet war und auf den Objektträger, der mit Ket94/95 beschichtet war, in einer Dichte von ungefähr 16000 Spots pro Chip und einer Spotgröße von – 150 μm unter Verwendung eines Microgrid II 610 Micorarray Druckers (ApogentDiscoveries).
Die Mikroarray-Chips wurden inkubiert, und Cy3 konjugierter Ziege Anti-Maus IgG spezifischer und Cy5 konjugierter Ziege Anti-Maus IgM spezifischer Antikörper wurden auf die Chips aufgebracht, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Picken der Hits
Die Chips wurden unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 gescannt. Eine durchschnittliche korrigierte Intensität (Ia) wurde für jeden Satz aus drei Kulturüberständen berechnet.
Vergleich von Mikroarray Screenen und ELISA
Ein Vergleichsbeispiel wurde durchgeführt, indem jeder Kulturüberstand mittels ELISA überprüft wurde. Jeder Kulturüberstand wurde zu einer Vertiefung enthaltend 200 ng B5 oder Ket94/95 Antigen zugegeben, und die Gegenwart eines mo noklonalen Antikörpers, der an das Antigen in dem Kulturüberstand gebunden war, wurde unter Verwendung eines herkömmlichen ELISA detektiert.
Eine Woche wurde benötigt, um 5376 Kulturüberstände unter Verwendung eines ELISA zu screenen, was 5376 Ergebnisse lieferte, eines für jeden Überstand. Im Gegensatz dauerte es unter 48 Stunden, um dieselben 5376 Kulturüberstände dreifach unter Verwendung eines Mikroarray-Chips zu screenen, was 16128 Ergebnisse lieferte, was die Wirksamkeit des Mikroarray Screenens im Vergleich zum ELISA zeigt.
Darüber hinaus wurden nur 5 μg B5 Antigen und 5 μg Ket/94/95 Antigen benötigt, um das Mikroarray Screenen durchzuführen, 5 μg Antigen pro Chip. Im Gegensatz dazu wurden 96 μg Antigen für jede ELISA Platte benötigt, und fünf ELISA Platten wurden benötigt, um jedes Antigen zu screenen. Das Screenen mittels ELISA ist somit signifikant teurer und zeitaufwändiger als das Mikroarray Screenen.
Die Daten, die für jede ELISA Platte erhalten wurden, wurden normalisiert, um eine prozentuale Verteilung der Gesamtintensität für jeden Kulturüberstand bereitzustellen. Die durchschnittlichen wiederholten Intensitäten für dieselben Kulturüberstände, die durch Mikroarray Screenen erhalten wurden, wurden ebenfalls normalisiert, um einen Vergleich mit den ELISA Daten zu erlauben.
Wenn die Kulturüberstände unter Verwendung eines ELISA hinsichtlich der Bindung von monoklonalen Antikörpern an B5 gescreent wurden, wurden 53 positive Überstände über fünf ELISA Platten identifiziert. Das Screenen derselben Kulturüberstände unter Verwendung des Mikroarray Screenens identifizierte 48 positive Überstände, 90,57 % der Überstände, die durch den ELISA identifiziert wurden. Das Mikroarray Screenen identifizierte auch 4 neue positive, die durch den ELISA nicht identifiziert wurden.
Wenn die Kulturüberstände unter Verwendung eines ELISA hinsichtlich der Bindung von monoklonalen Antikörpern an Ket94/95 gescreent wurden, wurden 15 positive Überstände auf einer einzelnen ELISA Platte identifiziert. Das Screenen derselben Kulturüberstände unter Verwendung des Mikroarray Screenens identifizierte 13 positive Überstände, 88,66 % der positiven Überstände, die durch den ELISA identifiziert wurden. Das Mikroarray Screenen identifizierte auch 8 neue positive, die durch den ELISA nicht identifiziert wurden.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, dass Mikroarray Screenen mindestens so wirksam ist wie ein ELISA im Identifizieren monoklonaler Antikörper, die an ein spezifisches Antigen binden. Tatsächlich legt die Identifizierung von positiven Überständen, die nicht durch den ELISA identifiziert wurden, nahe, dass das Mikroarray Screenen sensitiver ist als der ELISA. Das Mikroarray Screenen weist den weiteren signifikanten Vorteil auf, dass es den IgG oder IgM Isotyp der monoklonalen Antikörper identifiziert.
3A zeigt die normalisierten Werte des prozentualen Beitrags zu der Gesamtintensität für jeden Kulturüberstand in einer ELISA Platte
enthaltend positive Proben, die B5 binden, im Vergleich zu den normalisierten Werten der prozentualen Verteilung für dieselben Kulturüberstände, die durch Mikroarray Screenen eines B5 beschichteten Objektträgers (⎕) erhalten wurden. 3B zeigt das Niveau des Hintergrundwertes in diesen Experimenten. Es kann beobachtet werden, dass positive Überstände einen größeren prozentualen Beitrag zu der Gesamtintensität unter Verwendung von Mikroarray Screenen im Vergleich zu dem ELISA zeigten. Als ein Ergebnis gab es einen größeren Unterschied zwischen dem Hintergrundwert und einem positiven Überstand in dem Mikroarray Screenen im Vergleich zu dem ELISA, was es erlaubt, dass positive Überstände einfacher und akkurater identifiziert werden können.
4A vergleicht die normalisierten Werte der prozentualen Verteilung gegenüber der Gesamtintensität für jeden Kulturüberstand in einer ELISA Platte
enthaltend eine einzige positive Probe, die B5 bindet, im Vergleich zu den normalisierten Werten des prozentualen Beitrags für dieselben Kulturüberstände, die durch Mikroarray Screenen auf einen B5 beschichteten Objektträger (⎕) erhalten wurden. Das Niveau des Hintergrundwerts ist in 4B gezeigt, und es kann erkannt werden, dass die positive Probe einfacher über dem Hintergrundwert unter Verwendung des Mikroarray Screenens im Vergleich zu dem ELISA detektiert werden konnte.
5A vergleicht die normalisierten Werte des prozentualen Beitrags zur Gesamtintensität für jeden Kulturüberstand in der ELISA Platte, von denen gefunden wurde, dass sie positive Überstände enthalten, die Ket94/95
binden, im Vergleich zu den normalisierten Werten des prozentualen Beitrags für dieselben Kulturüberstände, die durch Mikroarray Screenen auf einen Ket94/95 beschichteten Objektträger (⎕) erhalten wurden. Die positiven Überstände waren einfacher über dem Hintergrundwert unter Verwendung des Mikroarray Screenens im Vergleich zu dem ELISA detektierbar, wie in 5B gezeigt ist.
6A vergleicht die Daten, die aus einer ELISA Platte
erhalten wurden, in der es keine positiven Überstände gab, mit Daten, die unter Verwendung des Mikroarray Screenens (⎕) derselben Kulturüberstände erhalten wurden. Wie in 6B gezeigt, gehen die Auslesungen in beiden Fällen auf den Hintergrundwert zurück.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, um gleichzeitig monoklonale Antikörper gegen mehr als ein Antigen zu identifizieren. Die Verwendung von Mikrorarray Screenen in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist schneller, billiger und akkurater als die Verwendung von herkömmlichen Verfahren zum Screenen von Antikörpern, wie einem ELISA.
Referenzen

Kilpatrick et al. (1997) Hybridoma 16: 381-389
Kohler G., Milstein C. (1975) Nature 7: 256: 485-7
Lindley et al. (2000) J. Immunol Methods 234: 123-135
Ziaudin J., Sabatini D. (2001) Nature 411: 107-110
Zimmermann U. (1990) J. Immunol Methods Nov. 6; 134(1): 43-50

Claims

Hochdurchsatzverfahren zur Herstellung einer Vielzahl monoklonaler Antikörper, von denen jeder an einen verschiedenen Antigenkandidaten bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) das Einführen einer Vielzahl gereinigter Antigenkandidaten in ein nicht humanes Tier oder nicht humane Tiere, b) das Rückgewinnen Antikörperproduzierender Zellen aus dem Tier oder den Tieren und das Vereinen dieser Zellen in eine Einzelzellsuspension, c) das Erzeugen immortalisierter Zelllinien aus der Einzelzellsuspension, d) das Screenen des Überstands der immortalisierten Zelllinien gegen einen Protein-Chip, auf welchem die Antigenkandidaten dargestellt sind, und e) das Auswählen monoklonaler Antikörper, welche an die Antigenkandidaten binden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Tier eine Maus, eine Ratte, ein Meerschweinchen oder ein Kaninchen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei zwischen zwei und fünfzig verschiedene gereinigte Antigenkandidaten in das Tier oder die Tiere eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei zwischen 0,001 und 1000 Mikrogramm jedes Antigens in das Tier oder die Tiere eingeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend den zusätzlichen Schritt des Versorgens des Tieres oder der Tiere mit einer Boosterdosis von einigen oder allen der Antigene, welche vor dem Entfernen Antigen produzierender Zellen in das Tier oder die Tiere eingeführt wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Antikörperprodzierenden Zellen B-Zellen, T-Zellen oder Stammzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Antikörperproduzierenden Zellen durch das Entfernen von Milzgewebe, Lymphknoten oder Knochenmark des Tieres oder der Tiere rückgewonnen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die immortalisierte Zelllinie eine Hybridom-Zelllinie ist, welche durch somatische Verschmelzung der Zellen in der Einzelzellsuspension zu Myelomzellen hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Protein-Chip ein einfacher Glas-Objektträger, ein 3D Gelpolster-Chip, ein Mikrovertiefungs-Chip oder ein Zell-Chip ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Schritt des Detektierens der an die Antigene gebundenen monoklonalen Antikörper weiter das Isotypisieren der monoklonalen Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Schritt des Detektierens und Isotypisierens der monoklonalen Antikörper das Hinzufügen Isotyp-spezifischer Antiimmunglobulin-Antikörper zu dem Protein-Chip, wobei jeder Antiimmunglobulin-Antikörper mit einer verschiedenen Isotyp-Spezifität eine verschiedene Markierung aufweist, und das Detektieren der Gegenwart der Markierungen, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiter umfassend das Bewerten der Spezifität, mit welcher jeder isolierte monoklonale Antikörper an ein Antigen bindet, unter Verwendung eines das Antigen umfassenden Protein-Chips.
Verfahren zum Identifizieren einer Vielzahl monoklonaler Antikörper, von denen jeder an einen verschiedenen Antigenkandidaten bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) das Screenen des Überstands immortalisierter Zelllinien gegen einen oder mehrere Protein-Chip(s), auf welchem die Antigenkandidaten dargestellt sind, und b) das Auswählen als die monoklonalen Antikörper von Antikörpern, welche an die Antigenkandidaten binden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass sie immortalisierten Zelllinien aus einer Einzelsuspension von Antikörperproduzierenden Zellen, welche Antikörper gegen eine Vielzahl von Antigenen herstellen, erzeugt werden.
Verfahren zur Herstellung einer Bank von immortalisierten Zelllinien, welche eine Vielzahl monoklonaler Antikörper von Interesse bilden, von denen jeder an einen verschiedenen Antigenkandidaten bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) das Einführen einer Vielzahl verschiedener Antigenkandidaten in ein nicht humanes Tier oder nicht humane Tiere, b) das Rückgewinnen Antikörper-produzierender Zellen aus dem Tier oder den Tieren und das Vereinen dieser Zellen in eine Einzelzellsuspension, c) das Erzeugen immortalisierter Zelllinien aus der Einzelzellsuspension, d) das Screenen des Überstands der immortalisierten Zelllinien gegen einen Protein-Chip, auf welchem die Antigenkandidaten dargestellt sind, und e) das Auswählen als immortalisierte Zelllinien, die Überstände bilden, welche an Antigenkandidaten bindende Antikörper enthalten.