DE60305167T2

DE60305167T2 - Verwendung von l-alpha lysophosphatidylcholine zur in vitro differenzierung von monocyten in reifen dendritischen zellen

Info

Publication number: DE60305167T2
Application number: DE60305167T
Authority: DE
Inventors: Vincent Lotteau; Patrice Andre
Original assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Biomerieux SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-03-11
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2023-03-08
Also published as: EP1483374A2; AU2003227822A8; US7368287B2; WO2003076602A2; WO2003076602A3; EP1666039A1; JP2005530488A; US20110135684A1; US20050054095A1; ES2262994T3; EP1483374B1; JP4482683B2; FR2836829A1; ATE325866T1; DE60305167D1; FR2836829B1; AU2003227822A1; US20080176820A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen, bei welchem Monozyten zur Differenzierung in einem geeigneten Medium bereitgestellt werden, und wobei L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium hinzugefügt wird.
Dendritische Zellen sind bei der Entwicklung einer Immunantwort und bei der Auslösung einer spezifischen T-Lymphozytenantwort durch Erkennung, Aufnahme und Präsentation der Antigene, insbesondere infektiöse Stoffe, beteiligt (Steinman et al., 1997, Immuno. Rev., 156: 25–37; Cella et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9: 10–16). Während unreife dendritische Zellen die Antigene infektiöser Stoffe sehr effektiv aufnehmen und abbauen können, so können bestimmte Signale, wie bspw. bakterielle Stoffe oder entzündliche Zytokine, sie durch die Injizierung eines Reifungsprozesses aktivieren, welches den Anfangsschritt bei der Auslösung der adaptiven Immunantwort darstellt. Tatsächlich erlangen die dendritischen Zellen während dieser Aktivierung die Fähigkeit, in die lymphoiden Organe zu wandern, wo T-Lymphozyten vorliegen, und ferner die Fähigkeit, costimulierende Signale zu übermitteln, die für die Aktivierung der nativen T-Lymphozyten essentiell sind. Während dieser Reifung unterlaufen die dendritischen Zellen einer Reihe von funktionellen und phänotypischen Modifizierungen, wie beispielsweise:

• ein Anstieg in den Oberflächenmolekülen, die bei der Aktivierung der T-Lymphozyten beteiligt sind (wie bspw. CD40, CD80, CD83, CD86 sowie die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC, Klasse I und Klasse II),
• die Produktion proinflammatorischer Cytokine (wie bspw. die Interleukine IL-12, IL-1β, TNFα und IL-6),
• ein Abfall in deren Fähigkeit, das Antigen aufzunehmen und zu prozes

Auf Grund ihrer Fähigkeiten, eine Immunantwort zu entwickeln, und eine spezifische T-Lymphozyten-Antwort auszulösen, sind reife dendritische Zellen von besonderem therapeutischen Interesse, insbesondere im Gebiet der anti-infektiösen und Anti-Tumor-Impfung und im Gebiet der Immunotherapie (Austin. 1998, Curr. Opin. Hematol. 5: 3–15; Reise Sousa et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 392–399). Diese dendritischen Zellen sind auf Grund ihrer Fähigkeit, eine Immunotoleranz zu induzieren, auch dann ein vorteilhaftes Ziel, wenn es erwünscht ist, die Immunantwort eines Patienten zu inhibieren, insbesondere, um Autoimmunerkrankungen oder entzündliche Krankheiten zu bekämpfen.
Reife dendritische Zellen können in vitro aus Monozyen in Kultur gewonnen werden. Diese Monozyten sind in vivo zirkulierende Zellen, die, wenn sie insbesondere Gefäßendothelwände passieren, in Kontakt mit umgebenden Faktoren kommen, die deren Entwicklung auf eine Art und Weise beeinflussen, die immer noch schlecht verstanden wird. Schematisch gesehen bestehen dann für diese Monozyten drei Möglichkeiten

• sie verlassen die Gewebe und kehren in die Lymphknoten zurück,
• sie differenzieren in Makrophagen,
• sie differenzieren in unreife dendritische Zellen.

Der erste Schritt zur Gewinnung von reifen dendritischen Zellen aus Monozyten in Kultur besteht dann in der Induzierung der Differenzierung der Monozyten in unreife dendritische Zellen mit insbesondere Interleukin IL-4 und dem Faktor GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor). Nach 6 Tagen sind 95% der Zellen in Kultur unreife dendritische Zellen.
Der zweite Schritt besteht dann aus der Induzierung der Reifung der unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen, und zwar durch exogene Stoffe, wie beispielsweise bakterielle oder virale Stoffe. Auf diese Weise ist das KpOmpA-Protein aus Klebsiella pneumoniae dazu in der Lage, die Reifung dieser unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen zu induzieren (P. Jeannin et al., Nature Immunology, 2000, 1: 502–509). Erwähnt werden kann auch die Reifung der unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen durch andere exogene Moleküle, wie beispielsweise bakterielle Membranlipopolysaccharide (Dichman et al., Journal of Cellular Physiology, 2000, 185: 394–400). Die Verwendung exogener Moleküle, die von infektiösen Stoffen abgeleitet sind, führt jedoch zu Problemen hinsichtlich der Sicherheit und den Kosten (direkte oder indirekte Nebenwirkungen in vivo; äußerste Notwendigkeit zur Reinigung gemäß sehr strengen rechtlichen oder regulatorischen Vorschriften, etc.), wodurch die Verwendung dieser Arten Moleküle im Kontext der Impfung und Immunotherapie schwierig wird.
Kürzlich wurde von Perrin-Cocon et al., im Jahr 2001 beschrieben (Journal of Immunology, 167: 3785–3791), dass die Produktion reifer dendritischer Zellen aus Monozyten, die eine Differenzierung unterlaufen, mit endogenen Molekülen induziert werden kann, wie beispielsweise mit bestimmten oxidierten Plasmalipoproteinen, und noch genauer mit oxidierten „low density" Lipoproteinen (LDLs). Jedoch stellen die oxidierten LDLs komplexe Partikel dar, die aus Proteinen, Triacylglycerolen, Phospholipiden und freiem und verestertem Cholesterin bestehen, und sind daher nur schwer künstlich zu synthetisieren.
Mit der vorliegenden Erfindung sollen daher die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden, und zwar durch Bereitstellung eines proinflammatorischen Moleküls, einem endogenen Molekül, das einfach zu synthetisieren und relativ kostengünstig ist, und welches die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen stimuliert.
Überraschenderweise betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin zur Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen in vitro.
Der Ausdruck „L-α-Lysophosphatidylcholin" soll vorliegend ein Molekül bedeuten, welches die folgende Formel aufweist:
in welcher
eine lange Kette gesättigter Fettsäuren mit von 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von 16 bis 18, darstellt.
Tatsächlich ist eines der aktiven Moleküle, die während der LDL-Oxidierung generiert werden, L-α-Lysophosphatidylcholin, das nachstehend als LPC bezeichnet wird. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Bindung von LPC an den G2A-Rezeptor, der ein Rezeptor mit hoher Affinität für LPC ist, insbesondere die Proliferation und Aktivierung der T-Lymphozyten inhibiert, was vielmehr eine Rolle des LPC bei der Inhibierung der Auslösung einer Immunreaktion nahelegt (Carson & Lo, 2001, Science, 293: 618–619). Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, dass eine hohe LPC-Konzentration (50 μM) die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB (nucleärer Faktor κB) inhibiert, von welchem jedoch bekannt ist, dass er während der Reifung der dendritischen Zellen aktiviert wird. Darüber hinaus liegt LPC im Plasma in hohen Konzentrationen vor, was nahelegt, dass es im Plasma nicht aktiv ist, wodurch es von den Fachleuten für eine therapeutische Verwendung nicht in Betracht gezogen würde.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen, wonach:

A. Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden,
B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird,
C. L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium hinzugefügt wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden.

Der Ausdruck „geeignetes Kulturmedium" soll vorliegend ein Medium bedeuten, welches alle Elemente aufweist, die für die Zelllebensfähigkeit benötigt werden. Als Beispiel kann das Medium RPMI 1640 und dessen Derivate erwähnt werden, sowie jedes andere Kulturmedium, das den Fachleuten hinreichend bekannt ist. Das Medium weist insbesondere mindestens einen Faktor zur Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen auf. Die Faktoren zur Differenzierung von Monozyten in dendritische Zellen sind den Fachleuten gut bekannt, insbesondere können Cytokine, wie beispielsweise – ohne jedoch begrenzend zu sein – die Interleukine IL-4, der Faktor GM-CFS (Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor), IL-13 oder TNF (Tumornekrosefaktor) erwähnt werden.
In Schritt C) wird L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium insbesondere mit einer Endkonzentration im Medium zwischen ca. 10 und 80 μM, vorzugsweise zwischen ungefähr 20 und 60 μM, und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM hinzugefügt. Ferner wird in Schritt C) L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium zwischen dem dritten und dem sechsten Tag der Monozyten-Differenzierung hinzuge fügt, vorzugsweise zwischen dem vierten und fünften Tag der Monozytendifferenzierung.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird zu dem Kulturmedium in Schritt C) mindestens ein Antigen, wie beispielsweise ein Molekül (oder mehrere Moleküle), das das Ziel einer Immunantwort ist, oder welches die Synthese dieses Ziels ermöglicht, hinzugefügt. Dieses Antigen kann aus bakteriellen, viralen, Hefe-, parasitären oder Pilz-Antigenen ausgewählt werden, ferner aus Tumorantigenen und aus Lysaten autologer und/oder heterologer Tumorzellen. Der Ausdruck „autologe Tumorzellen" soll vorliegend Tumorzellen bedeuten, die einem Individuum zugerechnet werden, der ein bestimmtes Arzneimittel einnimmt. Die Tumorzellen können durch Entnahme einer Probe von Krebsgewebe gewonnen werden, insbesondere durch eine Biopsie oder eine chirurgische Resektion. Der Ausdruck „heterologe Tumorzellen" soll vorliegend Zellen bedeuten, die aus Tumoren abgeleitet sind, die aus einem Individuum herrühren, das sich von demjenigen unterscheidet, der ein bestimmtes Arzneimittel einnimmt. Die Verwendung von heterologen Zellen ermöglicht es insbesondere, ein Arzneimittel zur Behandlung von Patienten zu erhalten, die an Krebs leiden, und bei welchen es nicht möglich ist, eine Tumorzellprobe zu gewinnen. Dies ermöglicht es auch, eine Standardquelle von Tumorantigenen zu verwenden. Der Ausdruck „Zelllysat" soll vorliegend eine Mischung zellulärer und/oder Membranantigene bedeuten, die durch die Lyse der Zellen gemäß einem, den Fachleuten bekannten Protokoll gewonnen wurden, wie beispielsweise durch eine mechanische, chemische oder enzymatische Lyse. Dieses Antigen kann auch eine Nucleinsäure sein, die zumindest für ein Antigen codiert, das aus bakteriellen, viralen, Hefe-, parasitären oder Pilz-Antigenen sowie Tumorantigenen ausgewählt ist. Der Ausdruck „Tumorantigene" soll vorliegend ein Antigen bedeuten, das aus Tumorzellen abgeleitet ist, wie beispielsweise ein Tumor-bezogenes Peptid, insbesondere ein Peptid, das mit Klasse I-Molekülen wechselwirkt, und das CD8-T-Lymphozyten präsentiert wird. Erwähnt werden können ferner – wiederum ohne einschränkend zu sein – die folgenden Tumorantigene: MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, das carcinoembryogene Antigen (CEA), TAG-72, die Eierstock-assoziierten Antigene OV-TL3 und MOV18, TUAN, alpha- Fetoprotein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, das Nierentumor-assoziierte Antigen G250, EGP-40 (oder EpCAM), S100 (malignes Melanom-assoziiertes Antigen), p53, Prostatakrebs-assoziierte Antigene (beispielsweise PSA und PSMA) und p21ras.
Daher ermöglicht es die Hinzufügung dieses Antigens zu dem Kulturmedium, reife dendritische Zellen zu erhalten, welche wiederum die Aktivierung der T-Lymphozyten ermöglichen, die gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet sind. Diese reifen dendritischen Zellen, die in vitro gewonnen werden, können anschließend in vivo injiziert werden. Darüber hinaus ist es möglich, in Schritt C) eine Verbindung zu verwenden, die äquivalent zu L-α-Lysophosphatidylcholin ist, also ein Molekül, das gemäß den gleichen zellulären Wirkungsmechanismen wie L-α-Lysophosphatidylcholin wirkt, das heißt, über die gleichen Membranrezeptoren, insbesondere über G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren, wie beispielsweise die Rezeptoren G2A, GPR4 oder der PAF (plättchenaktivierender Faktor)-Rezeptor und/oder über die gleichen nucleären Rezeptoren, wie beispielsweise die PPAR-Rezeptoren (Peroxisom-Proliferations-aktivierter Rezeptor). Diese äquivalente Verbindung kann daher insbesondere ein Agonist für die oben erwähnten Rezeptoren sein (wie beispielsweise insbesondere O-Methyl-PAF, Carbamyl-PAF oder 2-O-Methyl-PAF), jedoch auch PAF selbst. Diese Verbindung kann ferner auch ein PPARδ-Agonist sein, wie beispielsweise insbesondere L165041 (Merck Research), GW-501516 (Glaxo), Carboprostacyclin (Cayman) oder ein PPARγ-Antagonist, wie beispielsweise insbesondere Bisphenol-A-Diglycidylethyl (Sigma) oder Diclofenac^®. Die L-α-Lysophosphatidylcholin-äquivalente Verbindung kann alleine verwendet werden, oder aber zusammen mit L-α-Lysophosphatidylcholin. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das L-α-Lysophosphatidylcholin zusammen mit dem plättchenaktivierenden Faktor (PAF) verwendet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro-Aktivierung von T-Lymphozyten, bei welchem:

A. Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden,
B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird,
C. L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium hinzugefügt wird und reife dendritische Zellen erhalten werden,
D. ein wie oben definiertes Antigen zu dem Medium hinzugefügt wird und die in Schritt B erhaltenen reifen dendritischen Zellen werden gegen das Antigen gerichtet,
E. die reifen dendritischen Zellen, die gemäß Schritt C gegen das Antigen gerichtet sind, werden mit T-Lymphozyten in Kontakt gebracht, und T-Lymphozyten, die gegen das Antigen gerichtet sind, werden erhalten,

Schritt C) kann wie oben beschrieben ausgeführt werden. Ein solches Verfahren ermöglicht es daher, T-Lymphozyten, die gegen einen bestimmten biologischen Stoff gerichtet sind, in vitro zu gewinnen, die anschließend in einen Patienten in vivo injiziert werden können, insbesondere einem immunsupprimierten Patienten.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reifung von dendritischen Zellen in vitro, bei welchem:

A. unreife dendritische Zellen in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden,
B. L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium hinzugefügt wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden.

Den Fachleuten sind dendritische Zellen und deren verschiedene Reifungsstadien hinreichend bekannt.
In Schritt B) wird L-α-Lysophosphatidylcholin zu dem Medium insbesondere mit einer Endkonzentration im Medium von zwischen ungefähr 10 und 80 μM hinzugefügt, vorzugsweise zwischen ungefähr 20 und 60 μM und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM. Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird zumindest ein wie oben definierter biologischer Stoff ebenfalls zu dem Kulturmedium in Schritt B) hinzugefügt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das darin gekennzeichnet ist, dass es L-α-Lysophosphatidylcholin mit einer Endkonzentration von zwischen ungefähr 10 und 80 μM, vorzugsweise zwischen ungefähr 20 und 60 μM und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM aufweist, sowie mindestens einen wie oben definierten Differenzierungsfaktor.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist das Kulturmedium ferner ein wie oben definiertes Antigen auf, das insbesondere ein bakterielles, virales, Hefe-, parasitäres oder Pilz-Antigen ist, ein autologes und/oder heterologes Tumorzelllysat-Antigen, ein Tumorantigen, eine Nucleinsäure, die für ein bakterielles, virales, Hefe-, parasitäres oder Pilz-Antigen codiert, oder aber eine Nucleinsäure, die für ein Tumorantigen codiert.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems. Der Ausdruck „Mittel zur Aktivierung" soll vorliegend ein Molekül bedeuten, das in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die Effekte eines Medikaments induziert, oder aber das die Effekte des Hauptmedikaments verstärkt oder komplettiert. Im Falle einer Impfzusammensetzung spielt L-α-Lysophosphatidylcholin dann die Rolle eines Adjuvans, das die Immunantwort des Wirtsorganismus gegen ein bestimmtes Antigen stimuliert. Daher betrifft die Erfindung auch eine Impfzusammensetzung, die dadurch charakterisiert ist, dass sie L-α-Lysophosphatidylcholin als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems aufweist, welches dann die Rolle eines Adjuvans spielt, und ferner ein wie oben definiertes Antigen, gegen welches die Immunantwort des Patienten stimuliert werden soll.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird L-α-Lysophosphatidylcholin als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems verwendet, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung und/oder die Prävention einer bakte riellen, viralen, Pilz- oder parasitären Infektion, oder aber einer Infektion, die durch eine Hefe verursacht wird, und/oder für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prävention von Krebs.
Als Beispiel für eine bakterielle Infektion können insbesondere Infektionen erwähnt werden, die durch Staphylococcen, Mycobakterien, Bakterien des Genus Neisseria, durch Legionellen, Salmonellen etc. hervorgerufen werden.
Als Beispiel für eine virale Infektion können insbesondere Infektionen erwähnt werden, die durch HIV (human immunodeficiency virus), Hepatitisviren, das Masernvirus, das Rötelnvirus, das Poliovirus, das Flavi-Virus etc. hervorgerufen werden.
Als Beispiele für eine Pilzinfektion können insbesondere die Aspergillose, Candidose etc. erwähnt werden.
Als parasitische Infektion kann insbesondere Malaria, Leishmaniose etc. erwähnt werden.
Der Ausdruck „Krebs" soll vorliegend alle Krankheiten bedeuten, die auf eine abnormale Vervielfältigung von Zellen zurückzuführen ist, und insbesondere – wiederum nicht einschränkend auf – Myelome, Lymphome, Leukämien, Nieren-, Gehirn-, Darm-, Prostata-, Rektal-, Bauchspeicheldrüsen-, Eierstock-, Lungen-, Leber- und Brustkarzinome, Hautkrebs, ausgewählt aus Keratinomen und Karzinomen, sowie Melanome.
Das Arzneimittel gemäß der Erfindung kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger bereitgestellt werden, die den Fachleuten hinreichend bekannt sind. In den pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung kann für eine orale, sublinguale, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, topische, intratracheale, rektale oder transdermale Verabreichung das L-α-Lysophosphatidylcholin in einer Einheitsdosierungsform oder als eine Mischung mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern verabreicht werden, und kann beispielsweise – wenn eine orale Verabreichung beabsichtigt ist – beispielsweise in Form einer Tablette, einer Gelkapsel, einer oralen Lösung etc. vorliegen, oder für eine rektale Verabreichung in Form eines Zäpfchens, für eine parenterale Verabreichung insbesondere in Form einer injizierbaren Lösung, beispielsweise für eine intravenöse, intradermale oder subkutane Injektion, etc., und zwar gemäß herkömmlichen Vorschriften, die den Fachleuten hinreichend bekannt sind. Für eine topische Auftragung kann das L-α-Lysophosphatidylcholin in Cremes, Salben, Lotionen oder Augenlotionen eingesetzt werden.
Für den Fall, dass eine feste Zusammensetzung in Form von Tabletten hergestellt wird, wird L-α-Lysophosphatidylcholin mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Exzipienten gemischt, der auch als pharmazeutisches „Vehikel" bezeichnet wird, wie beispielsweise Gelatine, Stärke, Lactose, Magnesiumstearat, Talk, Gummi Arabicum oder Ähnlichem. Die Tabletten können mit Sucrose, mit einem Zellulosederivat oder mit anderen geeigneten Materialien beschichtet sein. Sie können ferner auch derart behandelt sein, dass sie eine verlängerte oder verzögerte Aktivität besitzen, und auch derart, dass sie eine vorbestimmte Menge des L-α-Lysophosphatidylcholin kontinuierlich freisetzen. Es ist auch möglich, ein Gelkapselpräparat zu erhalten, in dem L-α-Lysophosphatidylcholin mit einem Verdünnungsmittel vermischt wird und die Mischung in weiche oder harte Gelkapseln gegossen wird. Es ist auch möglich, ein Präparat in Form eines Sirups zu erhalten, oder aber zur Verabreichung in Form von Tropfen, in welchen das L-α-Lysophosphatidylcholin mit einem Süßungsmittel, einem Antiseptikum, wie beispielsweise insbesondere Methylparaben und Propylparaben vorliegt, und ferner einem geeigneten Geschmacksstoffverstärker oder Farbstoff. Wasserdispergierbare Pulver oder Granulate können L-α-Lysophosphatidylcholin als eine Mischung mit Dispersionsmitteln oder benetzenden Mitteln enthalten, oder aber mit suspendierenden Mitteln, die den Fachleuten hinreichend bekannt sind. Für eine parenterale Verabreichung werden wässrige Suspensionen eingesetzt, isotonische Salinelösungen oder sterile und injizierbare Lösungen, die Dispersions mittel oder benetzende Mittel enthalten, pharmakologisch kompatibel sind, wie beispielsweise insbesondere Propylenglycol oder Butylenglycol.
1 zeigt den Titrationsverlauf, der die Absorption (Abs) als Funktion des Logarithmus der Verdünnung des Serums einer Gruppe von Mäusen zeigt, denen LPC gemischt mit Hühnerei-Lysozym (HEL, 1 mg/ml) oder HEL alleine verabreicht wurde.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise einschränkend sein. Anhand der Beispiele wird es möglich sein, die Erfindung besser zu verstehen.
Beispiel 1 – Differenzierung von Monozyten in Kultur in dendritische Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von L-α-Lysophosphatidylcholin (LPC)
Isolierung, Platzierung in Kultur und Initiierung der Differenzierung der Monozyten – Die Monozyten werden aus menschlichem peripheren Blut mittels einer ersten Dichtegradientenzentrifugation (620 g; 20 Minuten) in Ficoll-Hypaque isoliert, worauf eine zweite Zentrifugation (770 g; 20 Minuten) in einer 50% Percoll-Lösung folgt. Anschließend werden die Monozyten durch eine immunomagnetische Depletion (Dynal, Oslo, Norwegen) gereinigt, und zwar unter Verwendung eines Cocktails aus Anti-CD19 (Hybridom 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), Anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville, MD) und Anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) monoklonalen Antikörpern. Die auf diese Weise erhaltenen Monozyten werden anschließend auf mindestens 90% gereinigt, wie durch die Abwesenheit der CD1A-Marker und das Vorliegen des CD14-Markers bestätigt wurde. Die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen wird mit 40 ng/ml des rekombinanten humanen GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und 250 U/ml an rekombinantem menschlichen Interleukin IL-4 gestartet.
Die Monozyten werden in Kultur in RPMI 1640-Medium gegeben (Life Technologies, Rockeville, MD, USA), das mit 2 mM Glutamin (Life Technologies), 10 mM Hepes (Life Technologies), 40 ng/ml Gentamycin (Life Technologies) und 10% eines Lipoprotein-depletierten fötalen Kälberserums (LPDS, Sigma, St. Quentin-Fallavier, Frankreich) angereichert ist.
Es sollte erwähnt werden, dass das in diesem Beispiel verwendete Kulturmedium ein LPDS-Kulturmedium ist. Vergleichbare Ergebnisse können unter Verwendung anderer Kulturmedien gewonnen werden, wie beispielsweise einem FCS-Medium, das heißt, einem Medium mit 10% nicht-Lipoprotein-depletiertem fötalem Kälberserum; vergleichbare Ergebnisse könnten auch unter Verwendung irgendeines synthetischen Kulturmediums erhalten werden, das den Fachleuten bekannt ist.
Behandlung der Monozyten mit LPC – 5 Tage nach Start der Differenzierung der Monozyten wurde 40 μM LPC (L-α-Lysophosphatidylcholin; Sigma, St. Quentin-Fallavier, Frankreich) zu dem Kulturmedium über 24 Stunden hinzugefügt. Ferner wurden Kontrollzellen in Abwesenheit von LPC in Kulturmedium gewonnen.
„Kontroll"-Zellen und „LPC"-Zellen wurden anschließend erhalten.
Beispiel 2 – Phänotyp der gemäß Beispiel 1 gewonnenen Zellen
Die in dieser Analyse verwendeten Zellen sind diejenigen, die am 6. Tag der Differenzierung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden.
Der Phänotyp der „Kontroll"- und „LPC"-Zellen wird durch Flusszytometrie auf einem FACS Calibur (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA) unter Verwendung von FITC(Fluoresceinisothiocyanat)-konjugiertem Anti-CD14, Anti-HLA-DR, Anti-CD80 und PE (Phycoerythrin)-konjugiertem Anti-CD1a, Anti-CD83, Anti-CD86 und Anti-CD40 (Beckman Coulter) analysiert. Gemäß dem Stand der Technik haben Monozyten vorzugsweise einen CD14⁺CD1a^–-Phänotyp, unreife dendritische Zellen haben vorzugsweise einen CD14⁺CD1a⁺CD86^–-Phänotyp und reife dendritische Zellen haben vorzugsweise einen CD14^–CD1a-intermediären-CD86⁺-Phänotyp.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 – Expression der CD83-, HLA-DR- und CD86-Marker in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von LPC
Die „LPC"-Zellen, die nach Initiierung der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von LPC gewonnen wurden, zeigen einen Phänotyp, der zu demjenigen von reifen dendritischen Zellen vergleichbar ist, wie insbesondere durch die Induktion der CD86-Marker und dem Anstieg in HLA-DR gezeigt wurde, verglichen zum Phänotyp der „Kontroll"-Zellen.
Beispiel 3 – Internalisierungs-Fähigkeit der gemäß Beispiel 1 gewonnen Zellen
Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die in dieser Analyse verwendet wurden, sind diejenigen, die nach 6 Tagen der Differenzierung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden. Diese Zellen werden bei 37°C inkubiert:

• 30 Minuten mit 1 mg/ml FITC-T70-Dextran (Sigma), um die Fähigkeit dieser Zellen, durch Endozytose zu internalisieren, einzuschätzen,
• 30 Minuten mit 1 mg/ml Lucifer-Gelb (Ref. L0259, Sigma, St. Quentin-Fallavier, Frankreich), um die Fähigkeit dieser Zellen, durch Pinozytose zu internalisieren, einzuschätzen,
• 3 Stunden mit Carboxylat-modifiziertem, gelb-grünem FluoSperen (Handelsname, 0,45 μm, Molecular Probes, Leiden, Niederlande), um die Fähigkeit dieser Zellen, durch Makropinozytose zu internalisieren, einzuschätzen.

Die Internalisierung wird auf Eis mit einem kalten PBS-Puffer gestoppt, der 0,1% BSA (Rinderserumalbumin) und 0,05% NaN₃ enthielt. Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen werden dreimal bei 4°C in diesem gleichen Puffer gewaschen und die Fluoreszenz mittels FACS Calibur (Handelsname, Becton Dickinson) quantifiziert.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, werden die Fähigkeiten für die Internalisierung durch Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose durch das Hinzufügen des LPC zu dem Kulturmedium am 5. Tag der Differenzierung der Monozyten stark gesenkt, im Vergleich zu den Kontrollzellen, die in Abwesenheit des LPC differenzierten. TABELLE 2 – Fähigkeit zur Internalisierung durch Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose der Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart des LPC differenzierten

Das Absenken in den Fähigkeiten zur Internalisierung ist eine der Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Gegenwart des LPC die Monozyten eine starke Tendenz besitzen, in reife dendritische Zellen zu differenzieren.

Beispiel 4 – Fähigkeit der gemäß Beispiel 1 gewonnenen Zellen, T-Lymphozyten zu stimulieren
Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die bei dieser Analyse verwendet wurden, sind diejenigen, die nach 6 Tagen Differenzierung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden.
Native allogene T-Lymphozyten werden aus menschlichem peripherem Blut isoliert. Periphere Blut-mononucleäre Zellen werden mittels Dichtegradientenzentrifugation (600 g, 20 Minuten) mit Ficoll-Hypaque isoliert. Nach Eliminierung der Monozyten auf einem Percoll-Gradienten werden die peripheren Blutlymphozyten in der dichten Fraktion gefunden. Die T-Lymphozyten werden durch immunomagnetische Depletion unter Verwendung einer Mischung aus Anti-CD19 (Antikörper 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), Anti-CD16 (Antikörper 3G8), Anti-CD56 (Antikörper NKH1), Antiglycophorin A (Antikörper 11E4B7.6) und Anti-CD14 (Antikörper RMPO52) monoklonalen Antikörpern identifiziert, die von Beckman Coulter käuflich erworben wurden.
Die gereinigten T-Lymphozyten werden in flachen 96-Well-Kulturplatten entweder mit „Kontroll"- oder „LPC"-Zellen kultiviert.
2 × 10⁵ T-Zellen werden in 200 μl Kulturmedium mit einem Verhältnis von 1:5, 1:10 oder 1:20 differenzierte Monozyten in Gegenwart oder Abwesenheit von LPC/T-Zellen kultiviert (Verhältnis DC/LT). Nach 4 Tagen wurden 50 μl des Kulturüberstands dazu eingesetzt, um die Sekretion von IL-2 (Interleukin 2) und von IFNλ (Interferon Gamma) unter Verwendung eines ELISA-Kits (Endogen, Woburn, MA, USA) zu bestimmen.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, wird die Sekretion von IL2 und von IFNλ durch T-Lymphozyten, die gewöhnlich mit dem Verhältnis der dendritischen Zellen/T-Lymphozyten (DC/LT-Verhältnis) ausgedrückt wird, durch die Zellen stark stimuliert, die aus der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart des LPC herrühren, das 5 Tage nach der Initiierung der Monozytendifferenzierung („LPC"-Zellen) hinzugefügt wurde, im Vergleich zu den Kontrollergebnissen („Kontroll"-Zellen). TABELLE 3 – Stimulation der Sekretion von IL2 und von IFNγ durch T-Lymphozyten, induziert durch die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart von LPC differenzierten Monozyten

Diese Ergebnisse zeigen einen Anstieg in den Fähigkeiten der Monozyten, die in Gegenwart des LPC differenzierten, allogene T-Lymphozyten zu stimulieren, was eine Eigenschaft reifer dendritischer Zellen darstellt. Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, wenn LPC in Ethanol gelöst wird, oder in Form einer Lipidemulsion vorlag.

Beispiel 5 – Eigenschaften der gemäß Beispiel 1 gewonnenen Zellen: Vergleich mit reifen dendritischen Zellen, die durch Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von oxidierten LDLs gewonnen wurden
Das Ziel dieses Beispiels ist es zu zeigen, dass der Wirkungsmechanismus, der bei der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen in Gegenwart von LPC beteiligt ist, unterschiedlich zu demjenigen sein könnte, der bei der Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen in Gegenwart von oxidierten LDLs beteiligt ist (Perrin-Cocon et al., The Journal of Immunology, 167: 3785–3891, 2001).
In diesem Beispiel werden die als „Kontroll"- und „LPC"-Zellen bezeichneten Zellen, die in Beispiel 1 gewonnen wurden, verwendet und ferner „LDLox"-Zellen, die wie in der wissenschaftlichen Veröffentlichung (Perrin-Cocon et al., The Journal of Immunology, 167: 3785–3891, 2001) beschrieben, gewonnen wurden, das heißt, nach Differenzierung der Monozyten in Kultur in Gegenwart von oxidierten LDLs, die 5 Tage nach der Initiierung der Differenzierung zu dem Medium hinzugefügt wurden.
Die Erfinder untersuchten, ob die Inhibitoren der Wirkung von oxidierten LDLs auf die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen auch die Wirkung von LPC auf die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen inhibierte.
Aus diesen Gründen wurde eine Lösung aus Intralipid^® (50 μg/ml Phospholipide, Fresenius Kabi, Sèvres, Frankreich) oder eine Lösung aus synthetischen Molekülen mit Lipid-Eigenschaft (Lipoïd E-80^®, Lipoïd AG, Ludwigshafen, Deutschland, 50 μg/ml Phospholipide), zu dem Kulturmedium am 5. Tag der Differenzierung hinzugefügt. Die Expression von CD86 durch die „LPC"- und „LDLox"-Zellen in Gegenwart dieser Inhibitoren wird gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 wiedergegeben. TABELLE 4 – Inhibierung (in %) der Expression von CD86 durch LPC- und LDLox-Zellen durch Intralipid^® und Lipoïd E-80

Die Hinzufügung von Intralipid^® inhibiert die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen durch die oxidierten LDLs und durch LPC auf eine vergleichbare Art und Weise (Inhibierung bei etwa 80%).

Auf der anderen Seite induziert überraschenderweise die Hinzufügung des Lipoids E-80 eine 81%ige Inhibierung der CD86-Expression, wenn die Monozyten in Gegenwart der oxidierten LDLs kultiviert werden, obgleich diese Inhibierung lediglich 24% beträgt, wenn die Monozyten in Gegenwart von LPC kultiviert werden.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Wirkungsmechanismus des LPC hinsichtlich der Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen unterschiedlich zu dem Wirkungsmechanismus von oxidierten LDLs ist.
Beispiel 6 – Zelluläre Mechanismen, die bei der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen in Gegenwart von LPC beteiligt sind.
Um bei der Suche nach den zellulären Wirkungsmechanismen von LPC bei der Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen weiterzukommen, untersuchten die Erfinder, welche der Rezeptoren beteiligt sein könnten.
Um zunächst zu bestimmen, ob die bei der Wirkung von LPC auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen beteiligten Rezeptoren zu der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehörten, wurde PTX (Pertussistoxin; 100 ng/ml), von dem bekannt ist, dass es Gi-Proteine blockiert, zu dem Kulturmedium für 3 Stunden hinzugefügt. Das Kulturmedium wurde anschließend ausgetauscht und das LPC, wie in Beispiel 1 beschrieben, hinzugefügt.
Die in der Tabelle 5 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, dass die Vorinkubation der Monozyten mit PTX den durch LPC induzierten Anstieg in CD86 blockiert, was nahelegt, dass bei der Wirkung des LPC Gi-Protein-gekoppelte Rezeptoren beteiligt sind. TABELLE 5 – Inhibition der Expression von CD86 durch die „LPC"-Zellen durch PTX
Diese Rezeptoren könnten insbesondere die folgenden Rezeptoren sein:

• G2A-Rezeptor (G2A-R): erst kürzlich wurde gezeigt, dass LPC ein Ligand mit hoher Affinität für das G2A-Protein ist, welches ein G-Protein ist, das an einen Rezeptor gekoppelt ist, der in Lymphozyten exprimiert wird. Darüber hinaus induziert die Stimulierung von G2A durch LPC die Phosphorylierung einer extrazellulären Kinase (ERK1/2: extrazelluläre Signal-bezogene Kinasen). Diese Phosphorylierung kann darüber hinaus auch dann beobachtet werden, wenn LPC zu dem Kulturmedium hinzugefügt wird, was die Beteiligung des G2A-Rezeptors bei der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen durch das LPC nahelegt,
• PAF-Rezeptor (PAF-R), wie oben beschrieben: bestimmte Effekte des LPC könnten die Beteiligung des PAF-Rezeptors bei verschiedenen Zelltypen implizieren,
• GPR4-Rezeptor: LPC ist auch ein Ligand für das GPR4-Protein, das ein anderes G-Protein darstellt, welches an einen Rezeptor gekoppelt ist, der eine hohe Affinität für Sphingosylphosphorylcholin besitzt.

In einem nächsten Schritt untersuchten die Erfinder die Transkriptionsfaktoren, die bei dem durch LPC induzierten Reifungsprozess beteiligt sind. Um zu bestimmen, ob PPARs bei der LPC-induzierten Reifung beteiligt sind, wurde die Bindungsfähigkeit der beiden Transkriptionsfaktoren PPARγ und PPARδ untersucht, und zwar unter Verwendung der Gelshifttechnik. 3 Isotypen der nucleären PPAR-Rezeptoren (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor) existieren: α, γ und δ. PPARγs stellen die Ziele für Moleküle der Thiazolidindion-Klasse dar, wie beispielsweise. Ciglitazon, das bei der Behandlung von Typ II-Diabetes eingesetzt wird. PPARδs werden stärker exprimiert und können PPARγs reprimieren. Die Monozyten, die eine Differenzierung untergehen, werden zwei Stunden mit einer Lösung von LPC (40 μM) („LPC"-Zellen) inkubiert. Die „Kontroll"-Zellen werden ebenfalls in Abwesenheit des LPC in Kulturmedium gewonnen. Nach Abernten der Zellen werden die nucleä ren Proteine mit dem Nuclear Extract Kit (Sigma) extrahiert. Anschließend wurden die nucleären Proteine mit einer radioaktiv markierten Sonde in Kontakt gebracht, die ein von den PPARs erkanntes „response"-Element enthielten. Nach dem Wandern durch ein nicht-denaturierendes Gel wurde eine Bande, die PPARγ enthielt und eine doppelte Bande, die PPARδ enthielt unter Verwendung von Antikörpern durch die Supershifttechnik identifiziert. Die Bindungsaktivität von PPAR wurde durch Messung der Intensität dieser Banden bestimmt. Diese Aktivitäten werden als Prozentsatz hinsichtlich der Kontrollzellen ausgedrückt. Tabelle 6 – Modulation der Aktivität von PPARγ und PPARδ durch LPC

Die Behandlung mit LPC induziert ein starkes Absenken in der Bindungsaktivität von PPARγ, was zu einem vollständigen Verschwinden führen kann, und stimuliert die Aktivität von PPARδ stark.

Anschließend verwendeten die Erfinder einen PPARγ-Agonisten, nämlich Ciglitazon. Eine Lösung an Ciglitazon (Sigma, 50 μM) wurde am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und zwar 15 Minuten vor Hinzufügung einer LPC-Lösung (40 μM für 2 Stunden). Die gewonnenen Zellen werden als „LPC + Ciglitazon"-Zellen bezeichnet. „Ciglitazon"-Zellen wurden nach dem gleichen Protokoll erhalten, jedoch in Abwesenheit von LPC, und „LPC"-Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten, in Abwesenheit von Ciglitazon.
Die Aktivität der PPARγ- und PPARδ-Transkriptionsfaktoren wurde in diesen Zellen mittels der Gelshifttechnik wie oben beschrieben gemessen. Tabelle 7 – Ciglitazon blockiert die Inaktivierung von PPARγ und reduziert den LPC-induzierten Anstieg in PPARδ

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ciglitazon, das PPARγ aktiviert, den Effekt von LPC auf PPARγ und PPARδ stark inhibiert, und dass es als Ergebnis die LPC-induzierte Reifung der dendritischen Zellen blockiert.

Die funktionelle Fähigkeit dieser Zellen („Kontrolle"-, „Ciglitazon"- und „LPC + Ciglitazon"-Zellen) T-Lymphozyten (LT) zu stimulieren, wurde anschließend untersucht. Diese Zellen wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, kultiviert, in Gegenwart von gereinigten allogenen 7-Lymphozyten. Die Sekretion von IFNγ wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, gemessen. Tabelle 8 – Gemischte Leukozytenreaktion: Messung der durch dendritische Zellen induzierten Sekretion von IFNγ durch T-Lymphozyten

All diese Ergebnisse verdeutlichen die wichtige Rolle der PPARs bei der LPC-induzierten Reifung der dendritischen Zellen, ebenso wie die Wichtigkeit des PPARγ/PPARδ-Verhältnisses bei der Produktion von funktionell reifen, dendritischen Zellen. Dieses Verhältnis wird durch LPC und Ciglitazon moduliert.

Beispiel 7 – Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen in Gegenwart von LPC-äquivalenten Verbindungen
Die Erfinder bestimmten, ob Verbindungen, die zu LPC äquivalent sind, das heißt Verbindungen, bei denen für die gleichen zellulären Wirkungsmechanismen die gleichen Membran- oder intrazellulären Rezeptoren beteiligt sind, ebenfalls die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen induzieren konnten.
Hierzu untersuchten die Erfinder, ob die Hinzufügung von PAF zu dem Kulturmedium die Wirkung von LPC auf die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen erhöhen konnte.
Daher wurde eine Lösung aus PAF (Sigma, 5 μM) am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die Expression von CD86 durch die „Kontroll"-Zellen und die „LPC"-Zellen, welche in Gegenwart oder in Abwesenheit von PAF erhalten wurden, wurde gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert, und die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 wiedergegeben. TABELLE 9 – Expression des CD86-Markers (mittlere Fluoreszenzintensität) durch die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen in Gegenwart oder in Abwesenheit von PAF

Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAF alleine eine leichte Überexpression von CD86 induziert, anders als LPC, das einen 470%igen Anstieg in der CD86-Expression induziert. Auf der anderen Seite ist es wichtig zu bemerken, dass PAF in Synergie mit LPC wirkt, da die Wirkung der beiden Verbindungen einen 1200%igen Anstieg in der CD86-Expression induziert.

Um die Idee, dass der PAF-Rezeptor beteiligt ist, zu bekräftigen, untersuchten die Erfinder die Wirkung eines Antagonisten für diesen Rezeptor auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen durch LPC.
Daher wurde eine Lösung des PAF-Antagonisten BN52021 (Biomol, Plymouth Meeting, USA, 100 μM) am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die Expression von CD86 durch die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die in Gegenwart oder in Abwesenheit von BN52021 gewonnen wurden, wurde gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert und die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben. TABELLE 10 – Expression von CD86 durch die „LPC"-Zellen in Gegenwart des Antagonisten BN52021

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkung von LPC eindeutig den PAF-Rezeptor involviert, sie legen jedoch auch nahe, dass bei der Wirkung von LPC auch andere Rezeptoren beteiligt sein könnten.

Die Erfinder zeigten also, dass der Antagonist BN52021, der zu dem Kulturmedium am 5. Tag der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen hinzugefügt wurde, welche durch oxidierte LDLs induziert wurden, eine 100%ige Inhibierung der Wirkung der oxidierten LDLs induzierte, was hier wiederum nahelegt, dass die Wirkungsmechanismen von LPC und von oxidierten LDLs unterschiedlich sind.
Beispiel 8 – In vivo-Stimulation der Immunantwort gegen ein Antigen durch LPC
Das Ziel dieses Beispiels ist es zu zeigen, dass LPC ein Molekül ist, das ein Adjuvans des Immunsystems ist, und das im Kontext einer Immunisierung verwendet werden kann, um die spezifische T-Antwort gegen ein Antigen zu steigern.
LPC ist ein entzündliches Produkt – In diesem Beispiel wurde eine Lösung aus 100 bis 500 nmol LPC, gelöst in 50 μl PBS, in den Fußballen von BALB/c-Mäusen (Charles River Laboratories) am Tag 0 injiziert. Die Fußballen werden mit einem Mikrometer vor und nach der Injektion gemessen, und zwar bis zum 10. Tag, sowie anschließend mit den Fußballen der „Kontroll"-Mäuse verglichen, die durch Injektion mit PBS (50 μl) erhalten wurden. Die Entzündungsintensität wird durch die Schwellung des Fußes reflektiert. Die maximale Schwellung wird am 1. Tag beobachtet, 24 Stunden nach der Injektion. Tabelle 11 – Entzündung des Fußballens, induziert durch LPC-Schwellung des Fußes nach 24 Stunden (in mm)

Diese Ergebnisse zeigen, dass LPC eine Entzündung induziert, und zwar in Abhängigkeit von der injizierten Dosis.

Um zu zeigen, dass LPC die Reifung und daher die Migration der dendritischen Zellen in die Lymphknoten in vivo induziert, wurde eine LPC-Lösung (0,1 M in Dibutylphthalat) auf die Haut der Ohren der BALB/c-Mäuse (Charles River Laboratories) aufgetragen, und zwar 10 Minuten vor Auftragung einer FITC-Lösung (Sigma) mit 1,5% in 1:1 Dibutylphthalat/Aceton. Dieser fluoreszierende Marker wird durch die dendritischen Zellen der Haut aufgenommen. Nach 24 Stunden werden die Ohr- und Kiefer-Lymphknoten entfernt und die Zellen in eine Suspension gegeben. Die Zellsuspension wird durch eine Metrizamid-Gradientenzentrifugation (Sigma) hinsichtlich dendritischer Zellen angereichert. Die Zellen werden mit einem Antikörper (Pharmingen) markiert, der die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) erkennt, und anschließend ermöglichte es die Analyse durch Flusszytometrie, den Prozentsatz der großen Zellen (dendritischen Zellen) zu quantifizieren, die MHC-Klasse II-Moleküle exprimieren und die FITC aufweisen. Diese Zellen stellen Zellen dar, die das FITC in der Peripherie aufgenommen haben, und die in die Lymphknoten gewandert sind. Tabelle 12 – Stimulation der dendritischen Zell-Migration durch LPC

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Auftragung von LPC die Wanderung der dendritischen Zellen der Haut in die Lymphknoten stimuliert.

LPC stimuliert die T-Antwort, spezifisch für ein co-injiziertes lösliches Antigen. LPC, gelöst in PBS (250 oder 500 nmol in 50 μl) wird mit Hühnerei-Lysozym (HEL, 50 Mg) gemischt und anschließend wird diese Mischung in den Fußballen von BALB/c-Mäusen injiziert. Nach 7 Tagen werden die Lymphknoten entfernt und deren Zellen dreifach in vitro restimuliert, und zwar in einem Kulturmedium mit 30 μM HEL-Antigen oder in Abwesenheit von HEL. Nach 3 Tagen wurde die T-Lymphozytenproliferation durch Einbau von pulverisiertem Thymidin über 16 Stunden hinweg gemessen. Tabelle 13 – Proliferation von HEL-spezifischen T Zellen (Einbau von pulverisiertem Thymidin in CPM; Mittelwert der Dreifachansätze)

Diese Ergebnisse zeigen, das LPC, co-injiziert mit dem Antigen, die Aktivierung von T-Lymphozyten in vivo fördert, die für dieses Antigen spezifisch sind.

LPC stimuliert die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen ein co-injiziertes lösliches Antigen. LPC, gelöst in PBS (350 nmol in 50 μl) wird mit Hühnerei-Lysozym (HEL, 1 mg/ml) gemischt, und anschließend wird diese Mischung in den Fußballen von BALB/c-Mäusen injiziert. Die „HEL + LPC"-Gruppe der Mäuse erhielt 50 μl dieser Mischung in die Fußballen der beiden Hinterfüße. Die „HEL"-Gruppe der Mäuse erhielt 50 μl der HEL-Lösung (1 mg/ml in PBS) in die beiden Füße. Nach 15 Tagen wurde in die zwei Flanken subkutan eine "Wiederholungs"-Injektion verabreicht. Die „HEL + LPC"-Gruppe erhielt, auf jeder Seite der Beine, 100 μl einer Lösung an LPC (5 mM) und an HEL (1 mg/ml) in PBS. Die „HEL"-Gruppe erhielt, an jeder Seite der Beine, 100 μl einer Lösung aus HEL (1 mg/ml in PBS. Nach zwei Wochen wurde den Mäusen Blut entnommen, und die IgGs, die spezifisch für das HEL-Antigen waren, mittels ELISA hinsichtlich einem Standard-IgG-Lösungsbereich analysiert. Die Titrationskurven, die die Absorption (Abs) als Logarithmusfunktion der Serumverdünnungen darstellen, sind in 1 dargestellt.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass LPC, co-injiziert mit dem Antigen, die Aktivierung des Immunsystems fördert, und die Synthese von Antikörpern induziert, die für das Antigen spezifisch sind, wohingegen eine Injektion des Antigens alleine keine Antwort induziert. LPC induziert eine humorale Antwort gegen das Antigen, wodurch seine Adjuvans-Fähigkeit unterstrichen wird.
LPC kann eine CD8⁺ T-Lymphozytenantwort in vivo induzieren. In diesem Beispiel wurde ein Test für eine verzögerte Kontakt-Hypersensitivität für Haptene eingesetzt. Bei diesem Modell werden BALB/c-Mäuse durch Einsatz eines Haptens, nämlich DNFB (1-Fluor-2,4-dinitrobenzol, 0,5% Lösung in 1:1 Olivenöl/Aceton) im Rücken sensitiviert. Fünf Tage später wurde eine nicht-irritierende Dosis DNFB (0,2% Lösung in 1:1 Olivenöl/Aceton) auf das linke Ohr aufgetragen, auf das rechte Ohr hingegen lediglich das Lösungsmittel. In dieser Reizungsphase werden CD8⁺-T-Lymphozyten, die spezifisch für die haptenisierten Proteine sind, rekrutiert und diese wandern anschließend in das Ohr ein, wobei gleichzeitig IFNγ sekretiert und ein Ödem produziert wird.
Eine „Kontroll"-Gruppe der Mäuse wurde mit DNFB alleine sensitiviert, eine andere Gruppe („LPC"-Mäuse) erhielten 500 nmol LPC durch Auftragung auf die Haut des Rückens mit 20 μl einer ethanolischen Lösung von LPC, und zwar 10 Minuten vor der Auftragung von DNFB. Fünf Tage später wurden die zwei Gruppen auf die gleiche Art und Weise für die Reizungsphase behandelt, und ein Anschwellen der Ohren wurde unter Verwendung eines Mikrometers 48 Stunden nach der Auftragung gemessen. Tabelle 14 – Ausmessung des Ohrödems

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Auftragen des LPC 10 Minuten vor dem Hapten während der Sensitivierungsphase das Öden steigern lässt, welches während der zweiten Auftragung des Haptens (Reizung) induziert wurde. Dies bedeutet, dass LPC die Antwort stimuliert, die durch die CD8⁺-T-Lymphozyten weitergegeben wird.

Beispiel 9 – Wirkung einer Lipidemulsion, wie beispielsweise Intralipid^®, auf die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen
Da in Beispiel 5 gezeigt werden konnte, dass eine Lipidemulsion wie beispielsweise Intralipid^® die LPC-induzierte Produktion reifer dendritischer Zellen blockiert, untersuchten die Erfinder ferner, ob diese Blockierung von einer indirekten Wirkung dieser Lipidemulsion über die Inhibierung der Wirkung des LPC herrührt und/oder von einer direkten Wirkung dieser Lipidemulsion.
Intralipid^® reguliert PPARs in vitro. Zunächst wurde eine Intralipid^®-Lösung (50 μg/ml Phospholipide) am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt, und zwar gemäß einem Protokoll, das zu dem in Beispiel 6 beschriebenen vergleichbar ist. Die Zellen wurden nach 1 h, 2 h oder 8 h Inkubation mit Intralipid^® geerntet, die nucleären Proteine wurden extrahiert und die Aktivität von PPARγ und PPARδ wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben, bestimmt. Tabelle 15 – Modulierung der Aktivität von PPARγ und PPARδ der eine Differenzierung unterlaufenden Monozyten durch Intralipid^®

Diese Ergebnisse zeigen, dass Intralipid^® allein PPARγ aktiviert und die Aktivität von PPARδ inhibiert. Diese Wirkung von Intralipid^® ist derjenigen von LPC entgegengesetzt.

Als nächstes wurde eine Lösung von Intralipid^® (50 μg/ml Phospholipide) am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt, und zwar 15 Minuten vor der Hinzufügung einer LPC-Lösung (40 μM) („LPC + Intralipid"-Zellen). „Intralipid"-Zellen wurden auch in Abwesenheit von LPC erhalten. „LPC"-Zellen wurden in Abwesenheit von Intralipid^® erhalten. Die Zellen wurden nach 2 h Inkubation geerntet, die nucleären Proteine extrahiert und die PPARγ- und PPARδ-Aktivität, wie in Beispiel 6 beschrieben, bestimmt. Tabelle 16 – Intralipid^® blockiert die LPC-induzierte Generierung reifer dendritischer Zellen durch Modulierung der Aktivität von PPARγ und PPARδ

Intralipid^® blockiert auch die Wirkung von LPC durch Modulierung der Aktivität von PPARγ und PPARδ.

Intralipid^® blockiert in vivo die durch LPC induzierte Entzündung und Immunantwort. In diesem Beispiel wurden 3 Gruppen an BALB/c-Mäusen durch Injektion von 50 μl Lösung in den Fußballen gegen das Hühnerei-Lysozym(HEL)-Antigen immunisiert. Die „HEL"-Kontrollgruppe erhielt 50 μg HEL, die „HEL + Intralipid"-Gruppe erhielt eine Mischung aus Intralipid^® (45 μl) und aus 50 μg HEL (5 μl einer Lösung mit 10 mg/ml). Die „HEL + LPC"-Gruppe erhielt 50 μg HEL mit 350 nmol LPC, gelöst in PBS. Die „HEL + LPC + Intralipid"-Gruppe erhielt 50 μg HEL, gemischt mit 350 nmol LPC, gelöst in 45 μl Intralipid^®. Nach 24 Stunden wurde die Anschwellung der Fußballen unter Verwendung eines Mikrometers gemessen und mit den Messungen verglichen, die vor der Injektion vorgenommen wurden. Der Unterschied in der Schwellung ist proportional zu der Intensität der Entzündung. Tabelle 17 – Intralipid reduziert in vivo die durch LPC induzierte Entzündung

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Injizierung von Intralipid^® zur gleichen Zeit wie LPC die LPC-induzierte Entzündung des Fußballens um 70% reduziert.

Sieben Tage nach der Injektion werden die Kniekehlen-Lymphknoten entfernt und deren Zellen in vitro dreifach restimuliert, und zwar in einem Kulturmedium mit 10 μM HEL oder in Abwesenheit von HEL. Nach 3 Tagen wurde die Proliferation der HEL-spezifischen T-Lymphozyten durch Einbau von pulverisiertem Thymidin über 16 Stunden hinweg gemessen. Tabelle 18 – Proliferation der HEL-spezifischen T-Zellen (Mittelwert der Mäuse)

Diese Ergebnisse zeigen, dass das zur gleichen Zeit wie LPC ijizierte Intralipid^® die LPC-induzierte Stimulierung der T-Antwort blockiert

All diese Ergebnisse zeigen, das Intralipid^® die LPC-induzierte Generierung reifer dendritischer Zellen durch eine indirekte Wirkung des Intralipid^® über eine Inhibierung der Wirkung von LPC blockiert, jedoch auch über eine direkte Wirkung von Intralipid auf PPARs, einem Antagonisten für LPC. Diese Ergebnisse zeigen, dass Intralipid^® alleine eine entzündungshemmende Rolle besitzt.
All diese Ergebnisse zeigen die Wichtigkeit des PPARγ/PPARδ-Verhältnisses bei der Generierung funktionell reifer dendritischer Zellen. Dieses Verhältnis wird durch LPC moduliert, jedoch auch auf eine umgekehrte Weise durch eine Lipidemulsion, wie beispielsweise Intralipid^® oder Ciglitazon.

Claims

Verfahren zur in-vitro-Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen, in welchem A. Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden, B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird, C. L-α-Lysophosphatidylcholin dem Medium hinzugefügt wird und die reifen dendritischen Zellen gewonnen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem in Schritt b) dem Medium L-α-Lysophosphatidylcholin in einer Endkonzentration im Medium zwischen ungefähr 10 und 80 μM hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem in Schritt b) L-α-Lysophosphatidylcholin zwischen dem dritten und dem sechsten Tag der Monozyten-Differenzierung in das Medium gegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) zusätzlich zumindest ein Antigen in das Medium hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein bakterielles Antigen ist, ein Virus-Antigen, ein Hefe-Antigen, ein Parasiten-Antigen, ein Pilz-Antigen ist, ein Antigen eines Lysats aus autologen und/oder heterologen Tumorzellen, ein Tumorantigen, eine Nukleinsäure, welche für ein bakterielles Antigen, ein Virus-Antigen, ein Hefe-Antigen, ein ParasitenAntigen, ein Pilz-Antigen kodiert, oder eine Nukleinsäure, die für ein Tumor-Antigen kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt C) zusätzlich ein Plättchen-Aktivierungsfaktor (PAF) in das Medium gegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Differenzierungsfaktor ausgewählt ist aus Interleukin 4, GM-CSF, Interleukin 13 und TNF.
Verfahren zur in-vitro-Aktivierung von T-Lymphozyten, in welchem A. Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden, B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird, C. dem Medium L-α-Lysophosphatidylcholin hinzugefügt wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden, D. dem Medium ein Antigen hinzugefügt wird und die in Schritt C gewonnenen reifen dendritischen Zellen gegen das Antigen ausgerichtet werden, E. die gegen das Antigen gerichteten reifen dendritischen Zellen, die in Schritt D gewonnen wurden, mit T-Lymphozyten in Kontakt gebracht werden und T-Lymphozyten gewonnen werden, die gegen das Antigen gerichtet sind.
Verfahren zur in-vitro-Reifung dendritischer Zellen, in welchem A. unreife dendritische Zellen in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden, B. dem Medium L-α-Lysophosphatidylcholin hinzugefügt wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden.
Kulturmedium, welches dadurch charakterisiert ist, dass es L-α-Lysophosphatidylcholin in einer Endkonzentration in dem Medium zwischen 10 und 80 μM und welches einen Faktor zur Differenzierung von Monozyten in dendritische Zellen aufweist.
Kulturmedium nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich ein Antigen aufweist.
Kulturmedium nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein bakterielles Antigen ist, ein Virus-Antigen, ein Hefe-Antigen, ein Parasiten-Antigen, ein Pilz-Antigen, ein Antigen eines Lysats aus autologen und/oder heterologen Tumorzellen, ein Tumor-Antigen, eine Nukleinsäure, die für ein bakterielles Antigen, ein Virus-Antigen, ein Hefe-Antigen, ein Parasiten-Antigen, ein Pilz-Antigen kodiert, eine Nukleinsäure, die für ein Tumor-Antigen kodiert.
Kulturmedium nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Differenzierungsfaktor ausgewählt ist aus Interleukin 4, GM-CSF, Interleukin 13, und TNF.
Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention einer bakteriellen, viralen, Pilz-, parasitären Infektion, oder einer Infektion, die durch Hefen hervorgerufen wird.
Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin als Aktivierungsmittel des Immunsystems zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Krebs.
Impf-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie L-α-Lysophosphatidylcholin als Aktivierungsmittel des Immunsystems und ein Antigen aufweist.