DE60304345T2

DE60304345T2 - Screening-verfahren

Info

Publication number: DE60304345T2
Application number: DE60304345T
Authority: DE
Inventors: Kobenhavns Universitet Thomas JESPERSEN; Sophion Bioscience A/S Morten BECH; Sophion Bioscience A/S Jonatan KUTCHINSKY; Peter Soren OLESEN; Sophion Bioscience A/S Rafael TABORYSKI
Original assignee: Sophion Bioscience AS
Current assignee: Sophion Bioscience AS
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2023-06-07
Also published as: DK1511843T3; CA2488449A1; CN1665928A; EP1511843B1; ATE321851T1; AU2003251124A1; CN100335630C; WO2003104455A1; DE60304345D1; US20060121464A1; EP1511843A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Screeningverfahren und insbesondere Screeningverfahren für DNA-Bibliotheken zur Identifizierung von DNA-Molekülen, die dann, wenn sie in einer Wirtszelle exprimiert werden, zumindest eine Veränderung im Phänotyp der Wirtszelle verursachen.
DNA-Bibliotheken ermöglichen die bequeme Speicherung und Analyse von Polynukleotiden und ihrer transkribierten (mRNA) und exprimierten Produkte (Peptide, Polypeptide oder Proteine). Der Ausdruck „DNA-Bibliothek" wird hier verwendet, um eine Sammlung von DNA-Molekülen zu beschreiben, wobei die einzelnen Mitglieder der Bibliothek ein unterschiedliches einzelnes Gen und/oder Fragment und/oder eine Variante hiervon kodieren. Alternativ kodieren die einzelnen Elemente der Bibliothek unterschiedliche Gene und/oder Fragmente und/oder Varianten hiervon.
Das Screening von DNA-Bibliotheken untersucht herkömmlicherweise direkt die heterologe DNA-Sequenz und/oder ihr Expressionsprodukt unter geringer oder völlig fehlender Beachtung ihrer Wirkungen auf die Zellen. Zusätzlich sind die meisten bekannten Verfahren zum Screening von DNA-Bibliotheken nicht schnell, haben keinen hohen Durchsatz und sind nicht einfach zu verwenden.
Die Druckschrift WO02/24862 beschreibt Systeme zum Positionieren und/oder Analysieren von Proben wie z. B. Zellen, Bläschen, Zellorganellen und Fragmenten, Derivaten und Mischungen hiervon für die elektrische und/oder optische Analyse insbesondere bezüglich des Vorhandenseins und/oder der Aktivität von Ionenkanälen.
Die Druckschrift WO02/04943 beschreibt Vorrichtungen zum Messen des Widerstandswertes, der Leitfähigkeit, des Potentials und der Kapazität von Zellmembranen, die verwendet werden können, um die elektrische Zellaktivität zu ermitteln. Insbesondere sind automatisierte Vorrichtungen für eine Analyse verschiedener Zusammensetzungen, Liganden und Zellvorgängen mit hohem Durchsatz konstruiert worden, welche die elektrischen Zelleigenschaften modulieren (z. B. die Zellmembran-Zustände). Die automatisierten Geräte werden für die Ermittlung der Ionenkanalaktivität und für die schnelle Identifizierung von Verbindungen, Liganden oder Vorgängen verwendet, welche diese Aktivität verändern. Diese Druckschrift beschreibt auch Verfahren zum Messen von elektrischen Zelleigenschaften unter Verwendung der dort beschriebenen Vorrichtungen.
Die Druckschrift WO99/64582 beschreibt Screening-Einrichtungen und -Verfahren mit hohem Durchsatz um die Funktion des oder der Produkte von einer oder mehreren Proben-Nukleinsäuren zu ermitteln. Die Probe-Nukleinsäuren waren synthetische Oligo nukleotide, DNA oder cDNA und kodierten Polypeptide, gegensinnige Nukleinsäuren oder GSEs. Die Proben-Nukleinsäuren wurden in einem Wirt durch einen Träger exprimiert, um wenigstens einen Phänotyp des Wirtes zu verändern. Der oder die geänderten Phänotypen wurden als Mittel identifiziert, um dem oder den Produkten, die durch die Proben-Nukleinsäure(n) kodiert worden waren, eine biologische Funktion zuzuordnen.
WO01/73000 beschreibt Verfahren zum Identifizieren und Steuern der genetischen und metabolischen Wege, die komplexen Phänotypen zugrunde liegen. Gemeinsame bzw. verbundene Polynukleotidsegmente, die zu Elementen eines multigenen Phänotyps beitrugen oder diese auseinander rissen, wurden in interessierenden Zellen erzeugt und exprimiert. Verbundene Polynukleotidsegmente wurden rekombiniert und/oder mutiert, um Bibliotheken von rekombinanten Kontaktameren zu erzeugen, die in interessierenden Zellen exprimiert wurden. Bibliotheken von verbundenen Polynukleotidsegmenten und rekombinanten Kontaktameren wurden episomal oder in die DNA von Organellen oder Chromosomen integriert exprimiert. Die Zellen wurden gescreent oder selektiert, um Mitglieder der Zellpopulation zu identifizieren, welche einen gewünschten Phänotyp zeigten. Bibliotheken und Vektoren, die verbundene Polynukleotidsegmente und rekombinante Kontaktamere umfassten, sowie Zellen, die solche Bibliotheken und Vektoren oder ihre Komponenten exprimierten, wurden geschaffen. Ausrüstungsbausätze, die verbundene Polynukleotidsegmente, rekombinante Kontaktamere, Vektoren einschließlich solcher Polynukleotide und Zellen einschließlich solcher Polynukleotide und Vektoren umfassten, wurden erzeugt.
EP 1 143 013 beschreibt Zusammensetzungen und Verfahren, die auf das Screening gerichtet sind oder Zusammensetzungen charakterisieren, welche die Aktivität von Kalziumkanälen in Zellen, vorzugsweise von durch Kalzium-Freisetzung aktivierten Kanälen in Zellen modulieren. Die Zusammensetzungen und Verfahren werden verwendet, um Inhibitoren oder Aktivatoren der Kanäle zu erzeugen, die Leitungen oder mögliche therapeutische Medikamente für die Behandlung verschiedener pathologischer Zustände bilden. Das Verfahren umfasst die Schritte des (a) in Berührung Bringens einer Testverbindung und eines Kalziumkanal-Aktivators, vorzugsweise eines Icrac-Aktivators mit einer Population von Kalziumkanäle exprimierenden Zellen, vorzugsweise Icrac exprimierenden Zellen, die ein Reporter-Konstrukt enthaften, das ein Reporter-Gen unter der Steuerung eines NFAT-induzierbaren Promoters umfasst, und (b) Ermitteln der Aktivität der Testverbindung bezüglich des durch Freisetzung von Kalzium aktivierten Kanals durch Untersuchung der Reportergen-Expression in den Zellen.
R. Gehwolf et al. beschreiben in ihrem Papier mit dem Titel „First Patch, then catch: measuring the activity and the mRNA transcripts of a proton pump in individual Lilium pollen protoplasts" (FEBS Letters, Band 512, Seiten 152–156, 13. Februar 2003) eine Kombination des Patch-Clamp-Verfahrens mit einer Einzelzellen-Revers-Transkriptions-Polymerase-Reaktion (scRT-PCR). Es wurde ein durch Fusicoccin induzierter Strom gemessen, der die Aktivität der Plasmamembran-H⁺-ATPase von Lilienpollen-Protoplasten wiedergibt, und danach wurden die die ATPase kodierenden mRNAs gesammelt und amplifiziert. Southern-bold-Signale wurden in allen „Patch-Catch"-Experimenten beobachtet und konnten sogar in 2560-fachen Verdünnungen des Pollengehalts gemessen werden. H⁺-ATPase-mRNAs waren nur in vegetativen, aber nicht in generativen Zellen von Pollen messbar, wie dies durch Immunolokalisierung bestätigt wurde.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Screening einer DNA-Bibliothek geschaffen, das folgende Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen eines Substrats zur Durchführung elektrophysiologischer Messungen, auf dem wenigstens eine Zelle angeordnet werden kann,
(ii) Bereitstellen einer Vielzahl von Zellen, wobei jede Zeile eine andere heterologe DNA-Sequenz aufweist, die von einer DNA-Bibliothek abgeleitet ist, wobei jede Zelle die heterologe DNA-Sequenz exprimiert, die sie umfasst,
(iii) Anordnen der Vielzahl von Zellen, die im Schritt (ii) bereitgestellt wurden, auf dem Substrat, um eine Erkennung und/oder Messung einer Änderung (im Vergleich zu einer Kontrollzelle) in der Elektrophysiologie einer jeden Zelle zu ermöglichen, wobei diese Änderung ein Ergebnis der Expression der heterologen DNA-Sequenz ist, und
(iv) Identifizieren wenigstens einer interessierenden Zelle, die wenigstens eine phänotypische Veränderung zeigt.

Das Screening von DNA-Bibliotheken gemäß dem Verfahren der Erfindung ermöglicht die genaue Untersuchung von Nukleotidsequenzen mit bekannter oder unbekannter Funktion einschließlich von Genen und ihrer exprimierten Peptide, Polypeptide und Proteine im Zusammenhang mit dem Zell-Phänotyp.
Vorzugsweise sind die interessierende Zelle und/oder das interessierende genetische Material isoliert, um eine weitere Untersuchung der heterologen DNA beispielsweise durch Sequenzieren zu ermöglichen.
Vorzugsweise werden die Ergebnisse weiterer Untersuchungen auf einem Informationsträger aufbewahrt. In besonders bevorzugter Weise ist der Informationsträger einer oder mehrere aus der folgenden Gruppe: Papier, E-Mail, Computer-Diskette bzw. Plattenlaufwerk und Internetseite.
Vorzugsweise wird das Screening einer Zellpopulation, die eine gegebene DNA-Bibliothek exprimiert, durch elektrophysiologische Messungen und/oder Fluoreszenz-Mikroskopie- und/oder mikroskopische Analysen von Änderungen im Zellvolumen und/oder in der Zellform durchgeführt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um elektrophysiologische Messungen durchzuführen.
Das Prinzip, Ionenkanäle in einem kleinen Membranbereich dadurch zu untersuchen, dass man einen Patch (Flecken) einer Membran unter Spannungs-Clamp-Bedingungen isoliert, wurde von Neher, Sakmann und Steinback in dem Artikel „The Extracellular Patch Clamp, A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels In Biological Membranes", Pflueger Arch. 375; 219–278, (1978) umrissen. Sie fanden, dass sie dadurch, dass sie eine Pipette, die Acetylcholin (ACh) enthielt, gegen die Oberfläche einer Muskelzellen-Membran pressten, diskrete Sprünge im elektrischen Strom feststellen konnten, die dem Öffnen und Schließen von durch ACh aktivierten Ionenkanälen zugeordnet werden konnten. Sie waren bei ihrer Arbeit jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass der Widerstand der Dichtung zwischen dem Glas der Pipette und der Membran (10–50 MΩ) sehr klein im Vergleich zum Widerstand des Kanals (10 GΩ) war. Das elektrische Rauschen, das sich aus einer solchen Dichtung ergibt, ist ausreichend groß, um die Ströme zu verdecken, die durch die Ionenkanäle fließen.
Es wurde dann erkannt, dass durch Feuerpolieren der Glaspipetten und durch Anlegen einer Saugwirkung an das Innere der Pipette eine Dichtung mit sehr hohem Widerstand (1–100 GΩ) mit der Oberfläche der Zelle erzielt werden konnte. Diese Giga-Dichtung verminderte das Rauschen um eine Größenordnung auf Pegel, bei denen die meisten Kanäle von biologischem Interesse untersucht werden können, und erweiterte den Spannungsbereich in starkem Maße, über den hinweg diese Studien durchgeführt werden konnten. Diese verbesserte Dichtung wird als „Giga"-Dichtung bezeichnet und die Pipette wird als „Patch"-Pipette bezeichnet. Eine detailliertere Beschreibung der Giga-Dichtung findet sich im Artikel von O.P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F. J. Sigworth mit dem Titel „Improved patch-clamp techniques for high resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches." Pflügers Arch. 391, 85–100, (1981).
Ionenkanäle sind transmembrane Proteine, die den Transport von anorganischen Ionen über die Zellmembranen hinweg katalysieren. Die Ionenkanäle nehmen an vielen zellulären Vorgängen teil, wie z. B. der Erzeugung und zeitlichen Steuerung von Aktionspotentialen, der synaptischen Übertragung, der Sekretion von Hormonen, der Kontraktion von Muskeln usw. Viele Medikamente üben ihre speziellen Wirkungen durch die Modulation von Ionenkanälen aus. Beispiele umfassen die antiepileptische Verbindung Phenytoin, das spannungsabhängige Na⁺-Kanäle im Gehirn blockiert, sowie das gegen Bluthochdruck wirkende Medikament Nifedipine, das die spannungsabhängigen Ca⁺⁺-Kanäle in glatten Muskelzellen blockiert. Zusätzlich zur chemisch induzierten Modulation der Ionenkanal-Aktivität hat das Patch-Clamp-Verfahren Wissenschaftler in die Lage versetzt, Manipulationen mit spannungsabhängigen Kanälen durchzuführen. Diese Verfahren umfassen das Einstellen der Polarität der Elektrode in der Patch-Pipette und die Änderung der Salzlösungs-Zusammensetzung, um die freien Ionenpegel in der Badlösung zu moderieren.
Vorzugsweise kann ein Screening für phänotypische Änderungen weiterhin in der Weise durchgeführt werden, dass die Effekte der heterologen DNA-Sequenz in Verbindung mit einem angelegten intra- und/oder extra-zellulären Testwirkstoff untersucht werden.
Besonders bevorzugt ist der Testwirkstoff wenigstens einer oder mehrere, der bzw. die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: kleine organische Moleküle (MW < 1000 g/mol), kleine Peptide (weniger als 100 Aminosäuren), Neurotransmitter, Hormone und Cytokine.
Vorzugsweise ist die Zelle, welche die heterologe DNA-Sequenz enthält, eine tierische oder menschliche Zelle, besonders bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die Human Embryonic Kidney 293 (HEK 293), Chinese Hamster Ovan (CHO), COS, MDCK, NG108, NIH3T3 oder T84 umfasst.
Wenn eine extrazelluläre Komponente (beispielsweise Ionenkonzentration, Temperatur- oder Ligandenprotein-Konzentration) oder eine intrazelluläre Komponente (beispielsweise Ionenkonzentration, Proteinkonzentration oder ein heterologes Protein) geändert wird, kann eine Änderung in den zellulären Bedingungen auftreten. Das Vorhandensein einer rekombinanten DNA-Sequenz kann daher die zellulären Bedingungen und den messbaren Phänotyp beeinflussen. Überwiegend wird die intrazelluläre Komponente beeinflusst, wobei die rekombinante DNA exprimiert wird und so die Proteinkonzentrationen geändert werden, und über die Funktion einiger dieser Proteine die Beeinflussung anderer zellulärer Vorgänge. Der Einfluss des exprimierten heterologen Proteins kann sich auch auf Effekte auf extrazelluläre Zustände erstrecken.
Ein Beispiel des Einflusses des exprimierten rekombinanten Proteins, das zelluläre Zustände beeinflusst, tritt auf, wenn das exprimierte rekombinante Protein ein ZellmembranIonenkanal ist. Sowohl die intrazellulären als auch die extrazellulären Zustände werden beeinflusst. Ein Ionenkanal ermöglicht und/oder veranlasst die Bewegung von Ionen über die Zellmembranen hinweg. Diese Bewegung ist entweder von der Außenseite der Zelle in die Zelle hinein oder umgekehrt gerichtet und ändert daher die Ionenkonzentration sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle.
Diese Änderungen der Zellbedingungen sind phänotypische Änderungen, die gemessen und verwendet werden können, um das Vorhandensein eines interessierenden Genotyps anzuzeigen, d. h. die rekombinante DNA kodiert einen Genotyp, der eine messbare Änderung im Wirtszellen-Phänotyp verursacht. Die phänotypischen Änderungen werden im Vergleich zu Kontrollzellen gemessen, die aus der gleichen Zelllinie wie die Wirtszellen stammen, die transfiziert werden, wobei der Unterschied darin besteht, dass die Vergleichszellen nicht mit einer rekombinanten DNA-Sequenz transfiziert werden.
Die Änderung im Wirtszellen-Phänotyp kann unter Verwendung der hier beschriebenen Chip-Vorrichtung gemessen werden, wobei die Wirtszelle einer phänotypischen Untersuchung unterworfen wird, während sie in Berührung mit dem Substrat des Chips steht.
Die Konstruktion von zellulär exprimierten DNA-Bibliotheken für die Verwendung gemäß der Erfindung kann durch standardmäßige PCR- und Klonier-Verfahren in Kombination mit einer retroviralen Vektor-Technologie durchgeführt werden. Jedes Mitglied bzw. Element der DNA-Bibliothek wird in Wirtszellen derart eingeführt, dass jede Zelle nur ein rekombinantes DNA-Konstrukt enthält. Die Anwesenheit von zwei oder mehr heterologen rekombinanten Konstrukten schwächt jedes möglicherweise beobachtbare phänotypische Signal und die Charakterisierung des ursächlichen Genotyps für den beobachteten Phänotyp wird schwieriger. Eine stabile Integration eines einzelnen rekombinanten Konstrukts in jede Zelle kann dadurch erreicht werden, dass eine geringe Vielzahl von Infektion (MOI) der retroviralen Teilchen verwendet wird, wodurch ein niederer Infektionspegel der Wirtszellen sichergestellt wird, und in Kombination mit einer Selektion für ein Resistenzgen, das in dem retroviralen Vektor enthalten ist. Vorzugsweise ist das für die Selektion verwendete Resistenzgen eines der folgenden: Neomycin, Puromycin, Plasticidin D oder Zeomycin.
Bevorzugte Beispiele von zu untersuchenden DNA-Bibliotheken sind cDNA-Bibliotheken, randomisierte Bibliotheken, Polymorphismus-Bibliotheken und genomische Bibliotheken.
Unter „cDNA-Bibliotheken" werden hier DNA-Bibliotheken verstanden, die durch eine reverse Transkription zellulärer mRNA erhalten werden.
Vorteilhafterweise werden normalisierte cDNA-Bibliotheken verwendet, um eine Vorpolung von hoch exprimierten Genen zu beseitigen, und unter normalisierten cDNA-Bibliotheken werden hier cDNA-Bibliotheken verstanden, bei denen die hoch frequenten cDNAs in der Frequenz verringert werden, wodurch eine ungefähr gleichförmige Darstellung von cDNAs erzeugt wird.
Unter „randomisierten Bibliotheken" werden hier DNA-Bibliotheken eines einzelnen Polynukleotids verstanden, wobei jedes Element der Bibliothek von jedem anderen Element um ein oder mehrere Nukleotide verschieden ist und diese Variation künstlich erzeugt worden ist.
Unter „Polymorphismus-Bibliotheken" werden hier DNA-Bibliotheken eines einzelnen Polynukleotids verstanden, wobei jedes Element der Bibliothek von jedem anderen Element der Bibliothek um ein oder mehrere Nukleotide verschieden ist, wobei diese Variation ein natürliches und inhärentes Merkmal dieses Polynukleotids ist.
Unter „genomischen Bibliotheken" werden hier DNA-Bibliotheken verstanden, die durch die Fraktionierung der gesamten zellulären genomischen DNA erhalten werden.
DNA-Bibliotheken können durch mehrere verschiedene molekulare Verfahren konstruiert werden. Komplementäre DNA-Bibliotheken (cDNA), die am häufigsten verwendeten DNA-Bibliotheken, werden aus mRNA konstruiert, die aus eukaryotischen Zellen isoliert wurde. Die Struktur von mRNA umfasst einen 3'-Poly-A-Anhang (tail), der während der post-transkriptionalen Verarbeitung hinzugefügt wurde und die cDNA in die Lage versetzt, aus der verarbeiteten mRNA synthetisiert zu werden. Isolierte mRNA wird mit einem Überschuss von Poly-T-Oligonukleotiden und reversen Transkriptase-Enzymen inkubiert, wobei sich das Poly-T-Oligonukleotid an den komplementären Poly-A-Fortsatz anheftet. Das reverse Transkriptase-Enzym ist dann in der Lage, das Poly-T-Oligonukleotid als Primer zu verwenden, von dem aus die DNA-Synthese initiiert wird, wobei die mRNA als die Schablone (template) wirkt, um eine einsträngige DNA für eine nachfolgende Verwendung als Schablone für die Synthese einer doppelsträngigen cDNA zu erzeugen. Die cDNA kann in Standard-PCR-Reaktionen oder zum Klonen in Vektoren verwendet werden, um eine DNA-Bibliothek zu erzeugen [F M Ausubel et al., „Current protocols in Molecular Biology – Volume One" John Wiley & sons, Inc. (1995)].
Nachdem sie aus mRNA synthetisiert worden ist, unterscheidet sich die cDNA von der genomischen DNA insofern, als sie keine regulatorischen Sequenzen oder Introns enthält. Die erzeugte cDNA stellt den mRNA-Gehalt einer Zelle zu einem speziellen Zeitpunkt dar, und es ist unwahrscheinlich, dass sie in gleicher Weise jegliches Gen aus dem Genom der Mutterzelle wiedergibt. Somit enthalten cDNA-Bibliotheken eine ausgewählte Darstellung der zellulären mRNA, die überwiegend aus Organisationsgenen in Mehrfachkopien und in geringem Maße aus Expressionsgenen besteht, die mit wenigen oder keinen Kopien vorhanden sind. Darüber hinaus gibt es nicht exprimierte Gene, die sich nicht unter den cDNAs befinden, die produziert wurden.
Es ist möglich, durch ein Normalisationsverfahren cDNA-Bibliotheken mit einer gleichförmigeren Darstellung von zellulären mRNAs zu erzeugen [M B Soares et al., „Construction and characterisation of a normalised cDNA library", PNAS 91 Seiten 9228–32 (1994)]. Dieses Verfahren wird in der Weise durchgeführt, dass die komplementäre einsträngige cDNA als Anheftpartner verwendet wird und dass danach die freie einsträngige cDNA selektiert wird. Diese Vorgehensweise stellt sicher, dass hoch frequente cDNAs vorwiegend mit dem komplementären Strang assoziiert und in ihrer Frequenz bzw. Häufigkeit beträchtlich vermindert werden, während normalerweise eine geringe Häufigkeit aufweisende cDNAs nur mäßig vermindert werden. Eine Auswahl in dieser Weise kann wiederholt werden, um eine ungefähr gleichförmige Darstellung der cDNAs zu erzeugen.
Eine weitere DNA-Bibliothek ist eine genomische DNA-Bibliothek, die durch die direkte Fraktionierung zellulärer genomischer DNA und das Einfügen der sich ergebenden Fragmente in einen geeigneten Vektor konstruiert wird. Solche Bibliotheken enthalten DNA, bei der nicht kodierende Bereiche intakt sind. Typischerweise wird die Fraktionierung der genomischen DNA durch mechanische oder enzymatische Mittel erreicht.
Ein weiterer Typ einer DNA-Bibliothek ist eine randomisierte Bibliothek, wobei die Bibliothek Klone enthält, die ein einzelnes Gen kodieren, wobei jeder Klon eine andere Abwandlung eines oder mehrerer Nukleotide enthält, die typischerweise, aber nicht ausschließlich den gleichen spezifischen Peptidbereich des untersuchten Proteins entsprechen. Solche randomisierten Bibliotheken können unter Verwendung des PCR-Verfah rens konstruiert werden [T Ohmichi et al., „Efficient bacterial transcription of DNA nanocircle vectors with optimised single-stranded promoters", PNAS 99, Seiten 54–59 (2002); T Jespersen et al. „Efficient non-PCR mediated overlap extension of PCR fragments by exonuclease "end-polishing", Biotechniques 23, Seiten 48–52 (1997)]. Die randomisierte(n) Abwandlung(en) werden in das Zielnukleotid über PCR-Primer eingeführt, welche die randomisierte(n) Nukleotidsequenz(en) umfassen, wodurch die Modifikationen) auf spezielle Aminosäure-Positionen gerichtet werden.
Eine weitere Art einer DNA-Bibliothek ist eine polymorphe Bibliothek. Viele Gene innerhalb der Population eines gegebenen Organismus sind polymorph, d. h. natürliche Varianten des gleichen Gens, das ein spezielles Protein kodiert. Beispielsweise enthalten Major Histocompatability Komplex-Proteine (MHC) Polymorphismen von Aminosäuren innerhalb des Peptid-Bindespalts, so dass der Bindespalt unterschiedlich und somit für die Variation zwischen Individuen in der Fähigkeit ihrer MHC-Proteine verantwortlich ist, sich an spezielle Ziele zu binden. [P J Bjorkman und P Parham „Structure, function and diversity of class I Major Histocompatability Complex molecules" Ann. Rev. Biochem. 59 Seiten 253–288 (1990)].
Eine polymorphe Bibliothek umfasst daher jedes Element der Bibliothek, das eine andere polymorphe Kopie eines einzelnen Gens kodiert. Solche Bibliotheken sind vor allem für das Medikamenten-Screening nützlich, um differenzierte Reaktionsmuster und mögliche Nebeneffekte zu studieren, die mit speziellen polymorphen Formen eines Gens verbunden sind.
Verfahren zum Einführen der DNA in Zellen sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt [Sambrook & Russel, „Molecular cloning; A laboratory manual" 3. Ausgabe Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)] und umfassen eine Elektroporation, durch Liposom vermittelte Übertragung, Kalziumphosphat-Co-Ausfällung und Mikroinjektion.
Die Elektroporation wird durch die Anlegung eines kurzen elektrischen Impulses an eine Lösung erzielt, welche DNA und die Zellen enthält, die transfiziert werden sollen [Überblick – K Shigekawa & W J Dower „Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: a general approach to the introduction of macromolecules into cells", Biotechniques 6, Seiten 742–751 (1988)]. Der elektrische Impuls verursacht ein vorübergehendes Durchlässigmachen der Zellmembran, während derer die DNA in der Lage ist, in das Zell-Cytosol einzutreten. Eine Fraktion dieser DNA wird danach im Kern gefunden, wo eine vorübergehende Expression der eingeführten Gene auftritt, typischerweise mit einem Scheitel zwischen 24 und 72 Stunden nach der Transfektion.
Eine durch Liposome vermittelte Übertragung (Lipofektion) verwendet Bläschen mit künstlichen Lipidmembranen, die natürlichen Lipidzellmembranen (Liposomen) ähneln, um eine rekombinante DNA zu transportieren. Das Liposom ist in der Lage, spontan mit Zellmembranen zu fusionieren und dabei seinen Inhalt im Zell-Zytoplasma freizusetzen.
[Übersicht – R J Mannino und S Gould-Fogerite, „Liposome mediated gene transfer", Biotechniques, 6, Seiten 682–690 (1988)]
Eine Kalziumphosphat-Co-Ausfällung wurde von F L Braham und A J van der Eb in „A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA" Virol., 52, Seiten 456–467 (1973), beschrieben, um die Genübertragung in Wirtszellen stark zu erhöhen. Die DNA wird mit einer Phosphat-Pufferlösung gemischt, der Kalziumchlorid hinzu gegeben wird. Dies erzeugt ein feines Präzipitat von Kalziumphosphat und DNA, das auf die Wirtszellen angewendet wird, und die Zellen nehmen die ausgefällte DNA über mehrere Stunden hinweg in ihr Cytosol auf.
Rekombinante DNA wird in zuverlässiger Weise in Wirtszellen durch das Verfahren der Mikroinjektion eingeführt. Dieses Verfahren erfordert eine dünne Nadel, um in die Zelle einzudringen und die DNA wird direkt in das Zell-Cytosol injiziert [M Capecchi, „High efficiency transformation by direct microinjection into cultured mammalian cells", Cell, 22, Seiten 479–488 (1980)]. Eine Mikroinjektion kann mit rechnergesteuerten Vorrichtungen durchgeführt werden, wodurch die Genauigkeit und Geschwindigkeit des Verfahrens erhöht werden.
Die DNA-Sequenz, die in die Zielzelle eingeführt wird, ist eine heterologe DNA, worunter hier eine DNA-Sequenz verstanden wird, die in die Zelle über und zusätzlich zum normalen DNA-Gehalt der Zelle eingeführt worden ist, wobei sich jedes heterologe DNA-Element der DNA-Bibliothek von jedem anderen Element durch ein oder mehrere Nukleotide unterscheidet.
Eine zuverlässige Expression der heterologen DNA-Sequenz wird durch eine stabile Integration der klonierten DNA in die DNA der Wirtszelle erzielt. Dies wird beispielsweise dadurch in zuverlässiger Weise erreicht, dass retrovirale Transduktionssysteme verwendet werden, die auf der natürlichen Fähigkeit von Retroviren basieren, ihr Genom stabil in die DNA der Wirtszelle zu integrieren [Mann et al. „Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus", Cell 33, Seiten 153–159 (1983)] {1}. In solch einem System wird die klonierte DNA in das virale Genom eingeführt. Retrovirale Transduktionssysteme enthalten herkömmlicherweise zwei funktionale Elemente, nämlich Cis-Elemente und Trans-Elemente. Die Trans-Elemente kodieren virale Pack-Proteine; die Cis-Elemente kodieren andere wesentliche virale Nukleotidsequenzen. Die klonierte DNA wird in das Genom der Wirtszelle so eingeführt, dass sie von Cis-Elementen als rekombinante provirale DNA umgeben ist, die nicht in der Lage ist, ihre eigenen Packproteine zu erzeugen, so dass die provirale DNA in eine Verpackungszelle transfiziert wird. Verpackungszellen enthalten die Trans-Elemente und erzeugen die viralen Überzüge, in welche die klonierte provirale DNA verpackt wird, um infektiöse Teilchen zu erzeugen.
Die infektiösen Teilchen werden von der Wirtszelle freigesetzt und können eingesammelt werden, um die Zielzellen-Kultur zu transfizieren, in der das virale Genom einschließlich der darin enthaltenen klonierten DNA stabil integriert wird. Die klonierte DNA kann daher in der Zielzelle exprimiert werden und der Retrovirus ist nicht in der Lage, sich weiter zu vermehren, da dem rekombinanten viralen Genom die erforderlichen viralen Gene fehlen [Übersicht – J M Coffin „Retroviridiae: The viruses and their replication, Seiten 1767–1845" in D M Knipe et al. (ed.) „Fields virology" Lippencott-Raven Herausgeber (1996)].
Beschreibung der Zeichnung
Spezielle Ausführungsformen der Erfindung werden nunmehr unter Bezugnahme auf die unten beschriebenen Figuren erläutert:
1: Schematisches Diagramm, das die Konstruktion und die zelluläre Expression einer DNA-Bibliothek unter Verwendung retroviraler Vektoren zeigt. Der Vektor enthält die interessierende heterologe DNA (Gen), einen Widerstandsmarker (Neo – Neomycin-Widerstandsfähigkeit) und eine interne Ribosom-Einfügestelle (IHRES). Die heterologe DNA ist von Cis-Elementen flankiert, welche die langen Abschlussrepeats (long terminal repeats = LTR) umfassen. Die Transkription dieses Konstruktes erzeugt mRNA, die sowohl die heterologe DNA als auch die Widerstandsmarker enthält. Eine Randomisierung einer speziellen Sequenz wird durch PCR erreicht, auf welche eine Überlappungs-Erweiterung folgt. Der Primer #2 enthält randomisierte Nukleotide, um Nukleotidänderungen an speziellen Stellen einzuführen. Die aus der PCR enthaltenen Fragmente werden in Überlappungserweiterung gemischt, um einen Vektor mit voller Länge für das retrovirale Vektor-Übertragungssystem zu erhalten. Die Vektorkonstrukte werden in Verpackungszellen transfiziert, in denen eine Übergangsexpression einen Überstand erzeugt, der dann, wenn er extrahiert wird, Viren enthält, die auf die Ziel-Zellen angewendet werden können.
2: Schematisches Diagramm, das seine einzelne Ziel-Zelle wiedergibt, die an einem Testplatz auf dem Chip angeordnet ist. Die Zelle Exprimiert ein einzelnes genomisches Konstrukt. Unter der Zelle befindet sich eine kleine Öffnung zwischen dem Testplatz und der Vertiefung und die Zellmembran an diesem Platz ist für eine elektrophysiologische Analyse perforiert oder entfernt. Andere phänotypische Analysen sind dargestellt (gestrichelte Linien). Die Detektion des Genotyps wird ebenfalls durch extrahieren der mRNA durch die Öffnung durchgeführt, über der die Zellmembran unvollständig ist.
3 Schematisches Diagramm des bevorzugten Chip-Konstrukts. Dieses besteht aus:

1: einem Chipgehäuse,
2: einer mikrostrukturierten Einheit,
3: einer Glas/Silizium-Membran auf der mikrostrukturierten Einheit,
4: einen Kanal bzw. ein Kompartment, der bzw. die die Zelle aufnimmt und eine ex
: trazelluläre Pufferlösung und eine Verbindung enthält,
5: einen Kanal, der eine intrazelluläre Pufferlösung und mRNA von der Zelle in der
: Ganzzellen-Konfiguration enthält,
6: eine Einlass-Durchgangs/Pipettier-Vertiefung zum Einführen von Zellen und der
: Verbindung,
7: eine Zell-Erfassungsstelle, die aus einer Öffnung in der Membran 3 besteht. Die
: Öffnung ist geeignet geformt, um eine Giga-Dichtung und eine Gesamtzellen-
: Formation zu ermöglichen,
8: eine Zelle in Suspension und
9: Mikropumpen.

4 Schematisches Diagramm, das Verfahren zum Screening des Zell-Phänotyps wiedergibt. Eine Zelle mit einem stabil integrierten Vektor zum Exprimieren von cDNA, aus der ein an die Membran gebundenes Protein erzeugt wird (beispielsweise einen Ionenkanal).
5 Schematisches Diagramm, das die Phänotyp-Untersuchung einer randomisierten Peptid-DNA-Bibliothek wiedergibt. Das Screening wird für Peptid-Modulator-Verbindungen (Kodiersequenz – XXX) durchgeführt, die mit einem bekannten Membranprotein Wechselwirken. Die modulatorischen Effekte von Peptiden, die dieses Membranprotein beeinflussen, können gemessen werden.
6 Schematisches Diagramm, das die Phänotyp-Untersuchung der Peptid-Randomisierung von größeren Protein-Zell-Modulatoren zeigt. Ein Modulator mit geringerer Effizienz wurde randomisiert, um seine Bindungseffizienz an ein bekanntes Membranprotein zu erhöhen. X ist ein randomisiertes Konstrukt aus der DNA-Bibliothek.
7 Schematisches Diagramm, das eine Phänotyp-Untersuchung der Peptid-Randomisierung eines Rezeptors für größere Protein, beispielsweise ScFv zeigt. Die ScFV-Bindungsstellen-Randomisierung (geänderte Bereiche sind durch X gekennzeichnet) kann die Bindungsaffinität beeinflussen und diese Affinität kann dann phänotypisch gemessen werden.
Beispiele
Beispiel 1 – Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Vorhersagebeispiel: Konstruktion einer Genom-Bibliothek, die in einer Zelllinie exprimiert ist. Das Ziel dieses Experimentes könnte es sein, die Bindung eines gegebenen Liganden an einen speziellen Ionenkanal zu verbessern. Dies wird durch Randomisierung spezieller Aminosäuren innerhalb des Ionenkanals durchgeführt, von dem bekannt ist, dass sich der Ligand an ihn bindet, Einführen dieser randomisierten Genprodukte in Zellen und Durchführung von Tests in dem Mikro-Array-System. Beispiele von Mikro-Array-Tests sind in den Beispielen 3, 4 und 5 dargestellt.
Das Ionenkanal-Gen wird in einen bi-cistrionischen, retroviralen Vektor eingefügt, der alle retroviralen Cis-Elemente enthält, die für die Überführung von Zielzellen erforderlich sind, sowie eine interne Ribosom-Eingangsstelle von EMCV, worauf ein Neomycin-Selektionsgen folgt (Morgan RA, Couture L, Elroy-Stein O, Ragheb J, Moss B, Anderson WF-Retroviral vectors containing putative internal ribosome entry sites: development of a polycistronic gene transfer system and applications to human gene therapy. NAR 1992, 20:1293–9). Wenn das Ionenkanal-Gen oberhalb des IRES-Elements eingefügt wird, werden sowohl das Ionenkanal-Gen als auch das Neo-Gen auf den gleichen mRNA-Transkripten gefunden, die sich aus dieser retroviralen Vektor-Transkriptionseinheit ergeben. Das Ionenkanal-Gen wird dann durch einen Cap-Scanning-Mechanismus translatiert, während die Neo-Translation vom IRES-Element eingeleitet wird. Die Randomisierung von vier Aminosäuren in dem Ionenkanal wird durch ein zwei Schritte umfassendes, auf PCR basierendes Verfahren durchgeführt (siehe 1) (Efficient non-PCR-mediated overlap extension of PCR fragments by exonuclease „end polishing". Jespersen T, Duch M, Pedersen FS Biotechniques 1997 Jul; 23(1):48, 50, 52). Im ersten Schritt werden zwei parallele PCRs durchgeführt, wobei jedes Ende der Transkriptionseinheit (retroviraler Vektor) amplifiziert wird. Der Primer #2 kodiert zwölf randomisierte Nukleotide (was vier Aminosäuren entstehen lässt) unmittelbar nach dem die 3'-Sequenz an den DNA-Strang angebunden hat. Wenn diese randomisierten Nukleotide in die Kodierungssequenz des Ionenkanals aufgenommen werden, werden bis zu 204 verschiedene Genotypen erzeugt. Die Primer #2 und #3 sind zueinander im 5'-Ende des Primers komplementär und Sequenzen, die durch diese Primer eingeführt werden, können dadurch in einem Überlappungs-Extensions-Verfahren verwendet werden. PCR sollte mit den folgenden Komponenten durchgeführt werden: 0,5 μM Primer (Oligonukleotide), 100 ng Schablone/100 μl Reaktionslösung, 2,5 Einheiten Proofreading-Polymerase-Enzym (wie z. B. Pfu (Stratagene) oder Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Life Technologies)) mit dem entsprechenden Puffer und 200 μM dNTP. PCR-Bedingungen (15 Zyklen): 95 °C für 30 s, 50 °C für 15 s, 72 °C für 3 min, wobei zwei Minuten bei 95 °C vorausgehen und 5 min bei 72 °C folgen.
Die in dem Überlappungs-Extensions-Verfahren erhaltene genomische Bibliothek wird in die Zielzellen durch retrovirale Verpackungszellen wie z. B. BOSC23 eingeführt (Pear WS, Nolan GP, Scott ML, Baltimore D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection" Proc Natl. Acad. Sci USA 1993, Sept. 15, 90 (18):8392–6)(Coftin JM (1996) Retroviridae). Wenn die PCR-Produkte (beispielsweise mit Lipofectamine (Life Technologies) gemäß den Anweisungen der Hersteller) in die Verpackungszellen-Linie transfiziert werden, wird die DNA in RNA transkribiert, welche in die retroviralen Teilchen verpackt wird, die durch die Verpackungszellen erzeugt werden. 72 Stunden nach der Transfektion sollten die Medien gefiltert werden (0,5 μm Filter) und direkt den Zielzellen zugegeben werden (Transduktion). 48 Stunden nach der Transduktion sollten Selektionsmedien (Neomycin) den Zellen zugegeben werden. Nach 14 Tagen sind nicht transduzierte Zellen abgestorben und die transduzierten Zellen erscheinen als Kolonien. Die Kolonien sollten gemischt werden (trypisiniert), um eine Population zu erhalten, welche die genomische Bibliothek enthält. Diese Population kann jetzt entweder sofort bei Screening-Experimenten verwendet oder bei –80 °C gespeichert werden.
Beispiel 2 – Chip für die Phänotyp-Analyse
Ein geeigneter Chip für Patch-Clamp-Experimente wird in WO02/29402 beschrieben. Für eine Verwendung mit der vorliegenden Erfindung wird dieser Chip modifiziert, um die Extraktion von mRNA aus den Zellen zu ermöglichen und erhält die in 3 gezeigte Form.
Der Chip umfasst ein ebenes Substrat, das einen ersten Oberflächenteil und einen gegenüberliegenden zweiten Oberflächenteil aufweist, wobei der erste Oberflächenteil eine Vielzahl von Plätzen besitzt, von denen jeder geeignet ist, eine Ionenkanäle enthaltende Struktur festzuhalten.
Jeder Platz umfasst eine ihm zugeordnete Messelektrode, wobei das Substrat eine oder mehrere Referenzelektroden trägt, wobei die Messelektrode und die entsprechende(n) Referenzelektrode(n) in der Lage sind, dann, wenn sie miteinander in elektrolytischem Kontakt stehen und wenn zwischen ihnen eine Potentialdifferenz angelegt wird, durch Abgabe von Ionen durch die eine Elektrode und die Aufnahme von Ionen durch die andere Elektrode zwischen sich einen Strom zu erzeugen.
Jeder der Plätze ist geeignet, eine Dichtung mit einem hohen elektrischen Widerstand zwischen einer Ionenkanäle enthaltenden Struktur, die an dem Platz festgehalten wird, und einem Oberflächenteil des Platzes zu bilden. Wenn diese Dichtung gebildet wird, trennt sie einen Bereich, der auf der einen Seite der Ionenkanäle enthaltenden Struktur liegt und in elektrolytischem Kontakt mit der Messelektrode steht, von einem Bereich, der auf der anderen Seite der Ionenkanäle enthaltenden Struktur vorhanden ist und in elektrolytischem Kontakt mit der entsprechenden Referenzelektrode steht. Die Dichtung ermöglicht es, einen Strom, der durch die Ionenkanäle der Ionenkanäle enthaltenden Struktur zwischen den Elektroden fließt, zu messen und/oder zu überwachen. Die Elek troden der Erfindung sind in das Substrat integriert und wurden durch ein Waver-Herstellverfahren erzeugt.
Eine Ionenkanäle enthaltende Struktur (beispielsweise eine tierische Zelle) in einer Lösung kann zu einem Platz auf einem Substrat entweder durch aktive oder durch passive Mittel geführt werden. Wenn die Ionenkanäle enthaltende Struktur mit dem Platz in Berührung kommt, beispielsweise mit dem Substrat um eine Elektrode herum, bilden die Kontaktoberflächen eine Dichtung mit hohem elektrischem Widerstand (eine Giga-Dichtung) an dem Platz, d. h. eine Dichtung, welche die Elektrode umgibt, so dass eine elektrophysiologische Eigenschaft des Ionenkanals unter Verwendung der betreffenden Elektrode gemessen werden kann. Eine solche elektrophysiologische Eigenschaft kann der Strom sein, der durch den Teil der Membran der Ionenkanäle enthaltenden Struktur geleitet wird, der von der Giga-Dichtung umgeben ist.
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „Giga-Dichtung" allgemein eine Dichtung mit wenigstens 1 GOhm, und dies ist die Größe einer Dichtung, die normalerweise als Minimum angezielt wird, doch können bei bestimmten Arten von Messungen, bei denen die Ströme größer sind, niedrigere Werte als Schwellenwerte ausreichend sein.
Vorzugsweise wird das Verfahren der Gesamtzellenkonfiguration des Patch-Clampings verwendet. Diese Konfiguration kann dadurch erreicht werden, dass zwischen der Messelektrode, die jedem zugelassenen Platz zugeordnet ist, und einer Referenzelektrode eine Reihe von sekundären elektrischen Potentialdifferenz-Impulsen angelegt wird, dass ein zweiter Strom überwacht wird, der zwischen der Messelektrode und der Referenzelektrode fließt, und dass die Reihe von sekundären elektrischen Potentialdifferenz-Impulsen immer dann unterbrochen wird, wenn der besagte sekundäre Strom einen vorbestimmten Schwellenwert übersteigt, wodurch der Teil der Ionenkanäle enthaltenden Struktur aufgerissen wird, der sich am nächsten bei der Messelektrode befindet.
Alternativ kann die Gesamtzellen-Konfiguration dadurch erzielt werden, dass der Teil der Ionenkanäle enthaltenden Struktur, der sich am nächsten bei der Messelektrode befindet, der Wechselwirkung mit einer Poren bildenden Substanz ausgesetzt wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Ganzzellen-Konfiguration" nicht nur Konfigurationen bezeichnet, in denen eine ganze Zelle mit dem Substrat an einem Messplatz in Berührung gebracht und punktiert worden oder mit Hilfe einer Poren bildenden Substanz für einen elektrischen Kontakt mit dem Zelleninneren geöffnet worden ist, sondern auch Konfigurationen, bei denen ein ausgeschnittener Zellmembranfleck so angeordnet worden ist, dass die äußere Fläche der Membran „nach oben" zu einer anzuwendenden Testprobe weist.
Da die Messelektrode, die einem Platz zugeordnet ist, eine von einer Vielzahl von Elektroden auf dem Substrat ist, und da die Ionenkanäle enthaltende Struktur eine von vielen in einer Lösung ist, ist es vorzuziehen, dass eine Vielzahl von Messplätzen auf einem einzelnen Substrat vorhanden ist. Die Vielzahl von Messplätzen ermöglicht es, eine Vielzahl von Testzellen gleichzeitig zu analysieren.
Beispiel 3 – Elektrophysiologische Messungen
Elektrophysiologische Messungen können unter Verwendung einer Chip-Konstruktion durchgeführt werden, die aus dem oben beschriebenen und in 3 dargestellten Substrat besteht, um eine Patch-Clamp-Untersuchung durch das Anlegen von Spannungsänderungen an die Testzelle durchzuführen.
Eine typische Messung umfasst die Zugabe einer spezifischen Testprobe zu einer Messanordnung und aus diesem Grund ist jede Messanordnung von anderen Messanordnungen getrennt, um eine Vermischung der Testproben und eine elektrische Leitung zwischen den einzelnen Anordnungen zu vermeiden. Zusätzlich werden Vergleichszellen, die nicht mit einer heterologen DNA-Sequenz transformiert worden sind, getestet, um eine phänotypische Vergleichsmessung für diese Zelllinie durchzuführen.
Eine Reihe von Testzellen kann zu jedem Zeitpunkt gleichzeitig untersucht werden, und die elektrophysiologischen Messungen werden durchgeführt und analysiert, um anzuzeigen, welche der Testzellen, wenn überhaupt eine, einen Phänotyp zeigt, der von dem der Vergleichszellen verschieden ist.
Elektrophysiologische Messungen, die durch die Anlegung von Spannungsänderungen an die Testzelle erzeugt worden sind, werden verwendet, um eines oder mehrere der folgenden phänotypischen Zellmerkmale zu analysieren: Stromamplitude (der Maximalstrom, der während eines Depolarisations-Impulses gemessen wird), Aktivierungskinetik (Zeitkonstanten, welche der Strom während es Depolarisations-Impulses erhöht), Inaktivierungskinetik (die Zeitkonstanten, die der Strom während eines Depolarisations-Impulses vermindert), Deaktivationskinetik (die Zeitkonstanten, die der Strom nach einem Depolarisations-Impuls vermindert), Aktivierungsschwellenwert (Spannungspotential, das die ionendurchlässigen Poren in der Zellmembran öffnet) und Nachwirkstrom (der Strom, der nach einem Depolarisations-Impuls gemessen wird). (Hille B. „Ion channels of excitable membranes. Dritte Ausgabe 2001, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, USA)
Beispiel 4 – Auf Fluoreszenz basierendes Screening
Es ist von gewissen fluoreszierenden Proben bekannt, dass sie sich an Zellmoleküle binden, um einen oder mehrere aus einer Reihe von Zellparametern anzuzeigen, zu dehnen, ohne hierauf beschränkt zu sein, der pH-Wert (beispielsweise H⁺-spezifische Proben), das Membranpotential und die Konzentrationsströme von Ionen (beispielsweise Ca²⁺ (fura2) und Mg²⁺ (mag-fluo4) spezifische Proben gehören (Molecular Probes, Inc., The Netherlands)) (Methods Cell Biol 1989; 30:157–92 Bright GR, Fisher GW, Rogowska J, Taylor DL. „Fluorescence ratio imaging microscopy") (Inoue S. "Progress in video microscopy." Cell Motil Cytoskeleton 1988; 10(1–2):13–7.)
Wenn Spannungsänderungen an die auf dem Substrat angeordnete Testzelle angelegt werden, bindet sich dann, wenn fluoreszierende Proben zusätzlich zugegeben worden sind, die fluoreszierende Probe an ihr spezifisches Zielmolekül, wenn dieses in der Testzelle vorhanden ist, was die Induktion eines Fluoreszenzsignals bewirkt. Das Fluoreszenzsignal kann durch Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden (Methods Cell Biol 1989; 30: 157–92 Bright GR, Fisher GW, Rogowska J, Taylor DL. „Fluorescence ratio imaging microscopy") (Inoue S. "Progress in video microscopy." Cell Motil Cytoskeleton 1988; 10(1–2): 13–7.) und dadurch in eine direkte Messung des intrazellulären Zustandes umgesetzt werden, der als solcher gemessen wird, und die Testzelle wird mit Vergleichszellen verglichen, um diejenigen Testzellen zu identifizieren, die unterschiedliche Phänotypen zeigen.
Beispiel 5 – Größen- oder Formmessungen
Die Messung von Änderungen in der Größe oder der Form von Zellen, welche die DNA-Bibliothek exprimieren, ermöglichen die Charakterisierung von Polynukleotiden und/oder Genen und/oder Peptiden und/oder Polypeptiden und/oder Proteinen, welche die physikalische Gesamt-Ausbildung der Wirtszelle im Vergleich zu den Vergleichszellen beeinflusst haben. Die Messungen werden durch automatische mikroskopische Erkennung durchgeführt (Foskett JK. [Ca2+]i Modulation of Cl-content controls cell volume in single salivary acinar cells during fluid secretion. Am J Physiol 1990 Dec; 259(6 Pt1): C998–1004) (S Muallem, BX Zhang, PA Loessberg, und RA Star Simultaneous recording of cell volume changes and intracellular pH or Ca2+ concentration in single osteosarcoma cells UMR-106-01. J. Biol. Chem. 1992 267: 17658–17664).
Beispiel 6 – Isolation von mRNA und Charakterisierung eines „Treffers"
Zellen, die ein „positives" Ergebnis oder einen „Treffer" liefern, sind solche Zellen, die im Vergleich zu den nicht transformierten Vergleichszellen aus der gleichen Zelllinie einen geänderten Phänotyp zeigen.
Wenn eine positive Zelle identifiziert worden ist, ist die Charakterisierung des Genotyps der nächste Schritt beim Screening von heterologen DNA-Sequenzen. Die Charakterisierung des einem positiven Phänotyp-Signal zugrunde liegenden Genotyps wird dadurch analysiert, dass die mRNA der positiven Zelle isoliert wird. Die mRNA kann durch ein oder mehrere Verfahren extrahiert werden, zu denen das Pipetieren, die Auflösung der Zelle und ein mechanisches Entfernen gehören.
Das Pipetieren erfolgt in der Weise, dass entweder eine Pipette, eine Spritze, eine Nadel oder ein ähnliches Werkzeug in die Zelle eingeführt und ein Teil des Cytosols extrahiert wird. Ein bevorzugtes Verfahren zum Pipetieren wird durch die Extraktion von Zell-Cytosol durch den Kanal an den Zellerfassungsort des Testsubstrates des Chips (siehe 2 und 3) erzielt. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Entfernen der mRNA durch diesen Kanal durch eine Saugwirkung erzielt wird, die durch die Mikropumpen (9) ausgeübt wird, oder durch das Einführen einer Pipette, einer Spritze, einer Nadel oder eines ähnlichen Werkzeuges in die Zelle, nachdem dieses Werkzeug durch diesen Kanal hindurch geführt worden ist.
Die Auflösung (Lysis) wird durch das Hinzugeben eines Lysis-Puffers (beispielsweise 0,2 M NaOH, 1 % SDS) zu der Kammer erzielt, welche die Zelle enthält, wodurch die Zellmembran aufgebrochen wird und die Zellkomponenten freigegeben werden.
Das mechanische Verfahren der mRNA-Extraktion wird in der Weise durchgeführt, dass die Zelle aus der Kammer unter Verwendung eines Werkzeugs herausgeschabt wird, das speziell für das Entfernen der Zelle aus dem Loch in der Anordnung konstruiert ist. Das Verfahren des Ausschabens der Zelle aus der Kammer zerreißt die Zelle und setzt den Zellinhalt frei, aus dem danach die mRNA extrahiert wird.
Eine weitere Charakterisierung des Polynukleotids, Peptids, Polypeptids und/oder Proteins, das durch den angelegten Stimulus beeinflusst wurde, wird durch RT-PCR-Charakterisierung (reverse Transkriptase PCR) der mRNA durchgeführt, die aus der Testzelle isoliert wurde.
Um nur die interessierenden Nukleotide zu amplifizieren, erfordert die Konstruktion des RT-PCR-Primers zuvor die Kenntnis der interessierenden Nukleotidsequenzen oder der Sequenzen, welche die interessierenden Nukleotide flankieren. Bei dieser Erfindung sind die Bereiche, welche die interessierenden Nukleotide flankieren, bekannt, da sie die Bereiche des viralen Vektors umfassen, der die heterologe DNA-Sequenz umgibt.
Nachdem die mRNA aus der positiven Zelle isoliert worden ist, werden die RT-PCR-Primer, die so konstruiert wurden, dass sie zu den viralen Bereichen komplementär sind, welche die interessierenden Nukleotide flankieren, verwendet, um eine reverse Transkriptions-Reaktion durchzuführen, um eine einsträngige cDNA zu synthetisieren. Diese cDNA wird weiterhin als die Schablone (template) in einer herkömmlichen PCR-Reaktion verwendet, wobei die Primer für diese bekannte Restriktionsstellen enthalten, so dass die doppelsträngigen Produkte aus der PCR einfach in einen weiteren Vektor subkloniert werden können.
Dieser neue Vektor, der die interessierenden Nukleotide enthält, kann in Sequenzier-Reaktionen und bei der Expression geeigneter Produkte verwendet werden, um die interessierenden Nukleotide und gegebenenfalls ihre Expressionsprodukte besser zu charakte risieren. Weiterhin kann die Charakterisierung der Expressionsprodukte beispielsweise durch ein herkömmliches Patch-Clamp- oder Fluoreszenz-Testverfahren erzielt werden.
Das Verfahren der Analyse von zellulär exprimierten cDNA-Bibliotheken auf dem Chip ermöglicht das Screening einer Vielzahl von bekannten und unbekannten Proteinen. Die bei einem speziellen Screening verwendeten Parameter werden auf die Proteinfunktion eingestellt, die untersucht wird, beispielsweise wenn das Screening für neue spannungsbetätigte Ionenkanäle erfolgt, wird das Screeningverfahren vorzugsweise elektrophysiologische Parameter umfassen.
Beispiel 7 – Anwenden eines Test-Wirkstoffs
Die bevorzugte Ausführungsform kann weiterhin einen Schritt umfassen, bei dem die Testzellen einem Test-Wirkstoff ausgesetzt werden, der den Phänotyp in Verbindung mit der heterologen DNA-Sequenz beeinflussen kann oder auch nicht. Die Phänotypen der Testzellen werden mit Vergleichszellen verglichen, die zusätzlich dem Test-Wirkstoff ausgesetzt worden sind.
Vorzugsweise ist der Teststoff wenigstens einer aus der folgenden Gruppe: kleine organische Moleküle, kleine Peptide, Neurotransmitter, Hormone und Cytokine.
Beispiel 8 – Weitere Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung
Die Hauptverwendung der Erfindung ist das Screening von DNA-Bibliotheken, für das es eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten gibt. Mögliche Anwendungsfälle für die Erfindung sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Identifizierung und/oder Charakterisierung und/oder Synthetisierung von neuen therapeutischen Verbindungen und neuen Medikamenten-Zielen.
Weitere Anwendungsfälle umfassen die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Molekülen, die bei zellulären Kaskaden- und/oder Übertragungs-Pfaden eingebunden sind oder diese beeinflussen; die Identifizierung und/oder Charakterisierung von Aminosäuren eines Bindeproteins, das bei der Bindung an ein Zielmolekül eine Rolle spielt und/oder hierfür erforderlich ist.
Ein weiterer Anwendungsfall der Erfindung ist das Screening von randomisierten und/oder polymorphen Bibliotheken zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Varianten mit verbesserter und/oder verminderter Funktion.
Beispiel 9 – Randomisierte Bibliotheken als Ausgangspunkt
Die Expression von randomisierten Peptiden ist sowohl für die mögliche Entdeckung neuer Medikamente als auch beim Studium der Funktions- und Wechselwirkungs-Muster von kleinen Peptiden (5) von besonderem Interesse.
Die Proteinfunktion und zelluläre Pfade können durch bestimmte kleine Peptide durch ihre Bindung an spezielle Peptid-Bereiche innerhalb von Proteinen modifiziert werden. Insoweit besitzen solche kleinen Peptide die potentielle Fähigkeit zur Behandlung von Krankheiten. Weitere Untersuchungen solcher gemäß der Erfindung aufgefundenen Peptide können einen in-vivo-Funktionsmangel zeigen. Aus der isolierten mRNA und den exprimierten Produkten ist es jedoch weiterhin möglich, ein Strukturmodell des Peptids zu erzeugen, aus dem eine synthetische organische Verbindung erzeugt werden kann, welche die Funktion des Peptids nachahmt.
Darüber hinaus wurde eine Reihe von kleinen Peptiden mit unbekannter Funktion gefunden, sowohl extra- als auch intrazellulär in vivo. Die Expression von randomisierten Peptiden wird ein Verfahren zur Entschlüsselung der Funktion von solchen Peptiden sein.
Beispiel 10 – Randomisierte Bibliotheken von größeren Proteinen als Ausgangspunkt
Weiterhin können Randomisierte Bibliotheken die Randomisierung von örtlichen Peptid-Bereichen innerhalb eines größeren Proteins umfassen (6 und 7). Bindungsproteine enthalten Bereiche mit unterschiedlichen Funktionen, d. h. einen Bindungsbereich und üblicherweise einen Effektorbereich. Von einer Reihe solcher Bindungsproteine ist bekannt, dass sie sich an ihre Ziele mit einer relativ geringen Affinität binden, und daher erzeugt die Randomisierung des Bindungsbereiches zur Vergrößerung (beispielsweise Antikörper) oder Verkleinerung (beispielsweise zur Verminderung von Nebeneffekten) der Affinität zwischen dem Liganden und den Zielproteinen eine für eine Untersuchung wünschenswerte Bibliothek.
Beispiel 11 – Polymorphe Bibliotheken als Ausgangspunkt
Viele Gene, die beim Menschen vorhanden sind, sind polymorph. Polymorphe Bibliotheken sind beim Screening von potentiellen Medikamenten in Bezug auf Nebeneffekte und die differenzierte Reaktionsmuster von Interesse. Wenn die polymorphe Bibliothek groß ist und/oder nicht alle polymorphen Sequenzen bekannt sind, kann es nützlich sein, Screeningverfahren mit Hilfe der Chiptechnologie wegen der vereinfachten Untersuchungsmöglichkeiten durchzuführen.

Claims

Verfahren zur Durchführung von elektrophysiologischen Messungen, das folgende Schritte umfasst: (i) Bereitstellen eines Substrats für die Durchführung der elektrophysiologischen Messungen, auf dem zumindest eine Zelle angeordnet werden kann, (ii) Bereitstellen einer Vielzahl von Zellen, von denen jede eine andere heterologe DNA-Sequenz aufweist, die von einer DNA-Bibliothek abgeleitet ist, wobei jede Zelle die heterologe DNA-Sequenz exprimiert, die sie enthält, (iii) Anordnen der Vielzahl von im Schritt (ii) bereitgestellten Zellen auf dem Substrat, um eine Detektion und/oder Messung einer Änderung im Vergleich zu einer Vergleichszelle in der Elektrophysiologie einer jeden Zelle zu ermöglichen, wobei diese Änderung ein Ergebnis der Expression der heterologen DNA-Sequenz ist, und (iv) Identifizieren von wenigstens einer interessierenden Zelle, die wenigstens eine phänotypische Änderung zeigt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin die Schritte umfasst, Isolieren der interessierenden Zelle und/oder von genetischem Material, das von ihr stammt, und Isolieren von mRNA von der im Schritt (iii) identifizierten interessierenden Zelle.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt der Sequenzierung des genetischen Materials umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, das weiterhin den Schritt des Speicherns oder Aufzeichnens der Sequenzinformation auf einem Informationsträger, wie z.B. einer Rechnerdiskette umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die DNA-Bibliothek eine cDNA-Bibliothek ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Änderung in der Elektrophysiologie der Zelle durch Patch Clamping erkannt und/oder gemessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zelle vor dem Schritt (iii) mit einem Test-Wirkstoff behandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Test-Wirkstoff wenigstens einer aus der folgenden Gruppe ist: Kleine organische Moleküle, kleine Peptide, Neurotransmitter, Hormone und Zytokine.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zelle eine tierische oder menschliche Zelle ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die tierische oder menschliche Zelle eine der folgenden Zellen ist: Menschliche embryonale Nierenzelle 293 (HEK293), Eierstockzelle des chinesischen Hamsters (CHO), COS, MDCK, NG108, NIH3T3 oder T84.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Zellen an voneinander beabstandeten Orten in oder auf dem Substrat angeordnet sind.