DE60126115T2

DE60126115T2 - Oberflächentransfektion und expressionsverfahren

Info

Publication number: DE60126115T2
Application number: DE60126115T
Authority: DE
Inventors: D. Michael Ann Arbor UHLER
Original assignee: University of Michigan Medical School
Current assignee: University of Michigan Medical School
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2021-11-03
Also published as: CA2427916C; ATE351902T1; DE60126115D1; AU2002231281B2; US7056741B2; WO2002042447A2; CA2427916A1; US20020197720A1; WO2002042447A3; JP2005505231A; EP1330516A2; EP1330516B1; KR20030093185A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren der Zelltransfektion und im Besonderen das Auftragen von Zellen auf Nukleinsäuren, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind und dann die Zellen transfizieren. In einer Ausführungsform sind die Nukleinsäuren in einem Array immobilisiert.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Fülle der durch das Humangenomprojekt und andere Genomprojekte erzeugten Information hat die Forschung in vielen traditionellen Disziplinen wie Zellbiologie belebt und war die Geburtsstunde gänzlich neuer Disziplinen wie Bioinformatik und Proteomik. Die funktionelle Analyse der durch das Humangenomprojekt bereitgestellten Nukleotidinformation wird Fragen der Forschung über die nächsten mehreren Dekaden schüren und die komplette Sequenzbestimmung von dem menschlichen Genom sollte bis 2003 öffentlich zugänglich sein. Dieser erste Schritt in der Charakterisierung des menschlichen Genoms bietet unglaubliche Gelegenheiten, die Funktion von diesen Genen zu verstehen.
Eine bedeutende Erweiterung von den verschiedenen Genomsequenzierungs-Projekten ist die Sequenzierung der kurzen Nukleotid-Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden von cDNA-Klonen gewesen und die Erzeugung von Expressed-Sequence-Tag(EST)-Sequenzen zum Vergleich mit den von der genomischen DNA erhaltenen Sequenzen (Gill und Sanseau (2000) Biotechnol Annu Rev 5: 25–44). Die Anwesenheit von Sequenzen innerhalb einer EST-Datenbank beweist, dass ein Anteil von dem Gen in einer besonderen Zelle in mRNA und mit einem gewissen relativen Grad der Häufigkeit umgeschrieben wird. Die Sequenzierung von ESTs hat grundlegende Einsichten in die gewebespezifische und pathologische Regulation der Genexpression bereitgestellt. Für viele einzelne biomedizinische For scher hat die partielle Charakterisierung von ESTs die Klonierung und Expression der Gene von Interesse gefördert, da viele von den ESTs jederzeit aus öffentlichen oder kommerziellen Quellen erhältlich sind.
Eine Anzahl von Techniken, die im Moment entwickelt werden, um die Regulation der Genexpression zu verstehen, nutzen die umfangreichen genomischen Datenbanken und die Verfügbarkeit von ESTs aus. Eine solche bedeutende neue Technologie ist die Verwendung von DNA-Mikroarrays, um die Regulation der Gentranskription durch Quantifizierung der Genexpression zu studieren (Bittner et al. (1999) Nat Genet. 22(3): 213–215: Graves D J (1999) Trends Biotechnol. 17(3): 127–134; Watson und Akil (1999) Biol Psychiatry 45: 533–543; Brown und Botstein (1999) Nat Genet 21: 33–37; Duggan et al. (1999) Nat Genet 21: 10–14; Young (2000) Cell 102: 9–15). Bei dieser Methode werden sehr kleine Mengen an DNA auf die Oberfläche von Mikroskopie-Glasobjektträgern aufgetragen (Schena et al (1995) Science 270: 467–470). Normalerweise ist die DNA-Probe ein kurzes PCR-amplifiziertes Fragment, das mit einer bekannten Gen- oder EST-Sequenz übereinstimmt. Ungefähr 100 nl der DNA-Lösung, die 10 ng DNA enthalten, werden aufgetragen und auf dem Glasobjektträger fixiert. Das Auftragen der DNA kann automatisiert werden und Robotergeräte können 10.000 einzelne DNA-Proben auf einen einzelnen Mikroskopie-Objektträger punktförmig in Arrays von leicht identifizierbaren Mustern auftragen. Da der gesamte Prozess von Robotern durchgeführt wird, ist es möglich Dutzende oder Hunderte von Replikaten solcher Objektträger herzustellen. Für die Analyse der Genexpression werden die Objektträger mit fluoreszenzmarkierter cDNA hybridisiert, die von mRNA-Präparationen stammt, die aus verschiedenen Proben erhalten wurden. Nach dem Waschen zeigt die Menge der an den Glasobjektträger hybridisierten fluoreszierenden DNA die Menge der mRNA an, die komplementär zu dem einzelnen PCR-Fragment ist. Die Fluoreszenzintensität wird quantifiziert unter Ver wendung eines Array-Scanners für die Bestimmung des Fluoreszenzsignals bei den Wellenlängen der für die Markierung der cDNA benutzten Fluorophore.
Diese Technik ist angewendet worden auf die Charakterisierung von der transkriptionellen Reaktion von 8.600 einzelnen Genen in Fibroblasten, die auf eine Serumstimulation hin erfolgt (Iyer et al., 1999) und auf die Wirkung der viralen Infektion, radioaktiven Bestrahlung und von chemotherapeutischen Krebsmedikamenten auf die transkriptionelle Regulation (Brown und Botstein (1999) Nat Genet 21: 33–37; Zhu H et al., (1998) Proc Natl Acad Sci U. S. A. 95(24): 14470–5; Amundson S A et al., (1999) Oncogene 18(24): 3666–72; Huang F et al., (1999) Oncogene 18(23): 3546–52).
Trotz der Flut an Informationen, die möglicherweise durch die Verwendung von DNA-Sequenzen in Form von Arrays erzeugt werden kann, ist die Information auf den Nachweis der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen beschränkt, die bereits innerhalb der Zelle vorhanden sind. Folglich werden DNA-Mikroarrays gegenwärtig verwendet, um die Genexpression zu bestimmen. Sobald Änderungen in der Transkription beschrieben worden sind, ist die Information über relevante EST-Sequenzen oft eingeschränkt auf die Suche nach der Homologie zu anderen bekannten Genen; selbst wenn eine solche Homologie existiert, ist die Funktionsweise der durch die Sequenzen kodierten Proteine nicht bekannt, sondern kann nur gefolgert werden. Folglich sind gegenwärtige Methodiken beschränkt, da sie keinen Einblick in die Funktion von einem bestimmten Gen bereitstellen, insbesondere von solchen, die Proteine kodieren, die keine signifikante Homologie zu bekannten Genen zeigen. Eine grundlegende Aussage zur Ermittlung der Proteinfunktion, insbesondere von nicht beschriebenen Genen, benötigt die Expression von dem Protein und seine Charakterisierung. Eine noch stärkere Einschränkung von den gegenwärtigen Techniken, die DNA in der Form von Mikroarrays verwen den, ist, dass hauptsächliche Aspekte der zellulären Regulation durch Verwenden solcher Techniken nicht ermittelt werden können, da die überwiegende Regulation der Zellfunktion eher durch Modifikation der existierenden Proteinstruktur erfolgt als durch die Regulation der Gentranskription.
Was benötigt wird, ist die Entwicklung von einem Hochdurchsatz-Screeening-Assay für die funktionelle Charakterisierung der Genprodukte; vorzugsweise würde eine solche Technik auch die Vorteile in der DNA-Mikroarray-Technologie ausnutzen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Normalerweise schließt die Bestimmung von der Genfunktion die Transfektion von Zellen mit dem zu untersuchenden Gen ein. Gegenwärtig wird die Zelltransfektion praktiziert durch die Zugabe von Nukleinsäure-Komplexen zu den Medien, in denen die Zellen wachsen; folglich besteht keine räumliche Einschränkung für die Nukleinsäure-Komplexe, die die Zellen transfizieren. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, dass die funktionelle Charakterisierung von Proteinen erlaubt, aber auch die für die DNA-Mikroarray-Hybridisierung entwickelten technologischen Fortschritte ausnutzt.
Diese Zielvorstellungen werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt, die eine neues Transfektionsverfahren bereitstellt, in dem die Nukleinsäuren vor und bei Beginn der Transfektion räumlich eingeschränkt sind. Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, in dem die Zellen direkt auf immobilisierte Nukleinsäuren ausplattiert und durch die immobilisierten Nukleinsäuren transfiziert werden. Die Nukleinsäuren werden auf einer Oberfläche immobilisiert, auf der man die Zellen wachsen lassen kann und sie sind auf den ursprünglichen Bereich der Immobilisierung unter normalen Zellkulturbedingungen eingeschränkt. In einigen Aspekten der vorliegenden Erfindung ist die räumliche Anordnung der Nukleinsäuren ein Array; in bevorzugten Ausführungsformen ist der Array ein Mikroarray. In einigen Ausführungsformen ist der Array ein geordneter Array, in anderen Ausführungsformen ist der Array ein zufälliger Array. In bevorzugten Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung werden die Mikroarrays durch DNA-Arrayer hergestellt, die kommerziell erworben werden können.
In einem Aspekt stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiter die Expression der transfizierten DNA bereit; in noch einem zusätzlichen Aspekt umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Nachweis der exprimierten transfizierten Nukleinsäuren. In diesem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Wirkungen der transfizierten Nukleinsäuren sicher gemessen, wie zum Beispiel durch die Verwendung entsprechender fluoreszierender Reporterkonstrukte in den transfizierten Zellen und dem Nachweis der Fluoreszenz mit kommerziell erhältlichen Scannern. Die Nukleinsäuren schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ESTs, PCR-Produkte, genomische DNA, cDNA, RNA, Oligonukleotide und Antisensekonstrukte ein; solche Nukleinsäuren können innerhalb von Expressionsvektoren vorhanden sein. Die vorliegende Erfindung wird in ihren unterschiedlichen Aspekten als Oberflächentransfektions- und Expressions-Prozedur (STEP) bezeichnet.
Gegenwärtig ist STEP unmittelbar anwendbar auf die unzähligen existierenden Sets von ESTs, von denen viele in eukaryontischen Expressionsvektoren sind. Darüber hinaus kann STEP verwendet werden, um die Antisense-Techniken derart auszunutzen, dass die Funktion von einem Protein ohne die Verfügbarkeit einer cDNA in vollständiger Länge untersucht werden kann. Wie die differentielle Hybridisierung an EST-Arrays, ist STEP weitgehend anwendbar auf eine Vielfalt an zellulären Regulationswegen und ist eine wichtige und nützliche Technik, um Genomik und Proteomik miteinander zu verbinden.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transfektion von Zellen bereit, umfassend einen an eine Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplex, wobei der Komplex Nukleinsäure und einen ersten und einen zweiten Komplexbildner umfasst, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für Rezeptoren und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Protein und eine Zelle umfasst; und das Kontaktieren der Zelle mit der Nukleinsäure in dem immobilisierten Transfektionskomplex, unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle transfiziert wird. In einigen Ausführungsformen sind die Komplexbildner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Liganden für Rezeptoren, DNA-bindenden Molekülen und membranpermeablen Molekülen. In noch anderen Ausführungsformen umfasst der Transfektionskomplex weiter einen dritten Komplexbildner, wobei der dritte Komplexbildner ein membranpermeables Molekül umfasst. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Ligand für einen Rezeptor, der durch die Zellen endozytiert wird, das DNA-bindende Molekül ist ein kationisches Protein und das membranpermeable Molekül ist ein kationisches Lipid. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der erste Komplexbildner Transferrin und der zweite Komplexbildner umfasst Polylysin. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der erste Komplexbildner virales Protein und der zweite Komplexbildner umfasst Polylysin oder ein Histon; in noch bevorzugteren Ausführungsformen ist das virale Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Penton-Protein, HIV-Protein GP120, Pferde Rhinitus-A Virusprotein VPI, menschliches Adenovirus-Protein E3 und Epstein-Barr Virusprotein GP350. In anderen Ausführungsformen umfasst der Transfektionskomplex mindestens zwei Komplexbildner, wobei mindestens zwei der Komplexbildner kovalent miteinander verbunden sind. In einigen bevorzugten Ausführungformen umfasst der Komplexbildner einen Liganden, der kovalent mit einem kationischen Protein verbunden ist; in anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Komplexbildner Transferrin, das kovalent mit Polylysin verbunden ist, in noch anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Komplexbildner ein virales Protein, das kovalent mit Polylysin oder einem Histon verbunden ist. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Transfektionskomplex weiter einen dritten Komplexbildner, wobei der dritte Komplexbildner ein membranpermeables Molekül umfasst, das vorzugsweise ein kationisches Lipid ist. In noch anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Komplexbildner Transferrin, Polylysin und Lipofectamin^®, wobei Transferrin kovalent mit Polylysin verbunden ist. In anderen Ausführungsformen umfasst der Transfektionskomplex weiter mindestens einen zusätzlichen Komplexbildner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Targetmolekülen, nachfolgend Zielmoleküle genannt, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus und Zellwachstums- und Integritäts-Modulatoren. In anderen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ESTs, PCR-Produkten, genomischer DNA, cDNA, RNA, Oligonukleotide und Antisense-Konstrukte; solche Nukleinsäuren können innerhalb von Expressionsvektoren vorhanden sein. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst mindestens ein Transfektionskomplex einen Typ von Nukleinsäure. In einer weiteren Ausführungsform umfasst mindestens ein Transfektionskomplex mehr als einen Typ von Nukleinsäure.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung bilden die immobilisierten Transfektionskomplexe einen Array von oberflächenimmobilisierten Transfektionskomplexen, wobei die Transfektionskomplexe Nukleinsäuren umfassen und einen ersten und einen zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Protein umfasst. In einigen Ausführungsformen ist der Array ein Mikroarray. In einigen Ausführungsformen ist der Array geordnet, in anderen Ausfüh rungsformen ist der Array zufällig. In noch einem weiteren Aspekt weist die Oberfläche eine Konfiguration auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus flach, konkav, konvex, sphärisch und kubisch. In einigen Ausführungsformen ist die Oberfläche eine Multiwell-Gewebekulturplatte; in bevorzugten Ausführungsformen ist die Oberfläche eine 96-Well- oder 381-Well-Platte. In noch einem weiteren Aspekt ist die Oberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Objektträger, einem Bead, einem Kubus, einem Chip, einem Film und einer Membran. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Oberfläche hergestellt aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Plastik, Filmen und Membranen. In einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung ist die Oberfläche hergestellt aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Plastik, Filmen und Membranen. In einer Ausfühungsform ist die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polylysin, Fibronektin und Laminin.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung sind die Zellen eukaryontische Zellen. In einigen Ausführungsformen sind die Zellen Säugerzellen. In anderen Ausführungsformen sind die Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kultivierten Zellen und Zellen, die frisch aus einer Bezugsquelle erhalten wurden. In noch anderen Ausführungsformen sind die Zellen kultivierte Zellen, die aus der Gruppe bestehend aus Primärkulturen; Zelllinien und dreidimensional kultivierten Zellen ausgewählt wurden. In noch weiteren Ausführungsformen sind die Zellen in vivo Zellen; die Zellen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Gewebezellen, Organzellen und Tumorzellen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren den Schritt des Nachweises der Expression von den Nukleinsäuren in den transfizierten Zellen. In einigen Ausführungsformen ist das Nachweisen der Expression über eine Zeitspanne überwacht. In ande ren Ausführungsformen ist das Nachweisen der Expression in intakten Zellen untersucht. In anderen Ausführungsformen kodieren die Nukleinsäuren mindestens ein fluoreszierendes Reporter-Protein und die Expression ist nachgewiesen durch Fluoreszenz-Mikroskopie. In noch weiteren Ausführungsformen kodieren die Nukleinsäuren mindestens ein lumineszentes Reporter-Protein und die Expression ist nachgewiesen durch einen Licht-Detektor.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Transfektion von Zellen bereit, umfassend das Immobilisieren eines Transfektionskomplexes an eine Oberfläche, wobei der Komplex Nukleinsäure und einen ersten und einen zweiten Komplexbildner umfasst, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für Rezeptoren umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Protein und eine Zelle umfasst; und das Inkontaktbringen der Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure in dem Transfektionskomplex auf der Oberfläche, unter derartigen Bedingungen, dass die Zellen transfiziert werden. Die Ausführungsformen von den Transfektionskomplexen, die Form von den auf den Oberflächen immobilisierten Komplexen, die Oberfläche und die Zellen sind wie vorstehend beschrieben. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Exprimierens der Nukleinsäure in den transfizierten Zellen und in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Nachweisens der Expression von der Nukleinsäure in den transfizierten Zellen mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Transfizieren einer Zelle bereit, umfassend das Kombinieren der Nukleinsäure mit dem ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, um so mindestens einen Transfektionskomplex zu bilden, umfassend die Nukleinsäure und den ersten und zweiten Komplexbildner; Immobilisieren des Transfektionskomplexes auf einer Oberfläche, um so immobilisierte Nukleinsäure zu bilden; und Inkontaktbringen einer Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle transfiziert wird. Die Ausführungsformen von dem Transfektionskomplex, die Form von den auf der Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexen, die Oberfläche und die Zellen sind wie vorstehend beschrieben. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Exprimierens der Nukleinsäure in der transfizierten Zelle und in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Nachweisens der Expression der transfizierten Nukleinsäure in der transfizierten Zelle, mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Transfektion einer Zelle bereit, umfassend: das kovalente Verbinden von Transferrin mit Polylysin; das Kombinieren von Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Lipid mit dem kovalent verbundenen Polylysin und Transferrin, um so einen Transfektionskomplex zu bilden; das Immobilisieren des Transfektionskomplexes auf einer Oberfläche, um so immobilisierte Nukleinsäure zu bilden und das Inkontaktbringen der Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure, um so eine transfizierte Zelle zu bilden. In weiteren Aspekten der Erfindung umfasst das Verfahren das Exprimieren der Nukleinsäure in den transfizierten Zellen; und in noch weiteren Aspekten der Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Nachweisens der Expression von den Nukleinsäuren in den transfizierten Zellen. Die Ausführungsformen von den Transfektionskomplexen, die Form von den auf der Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren, die Oberfläche und die Zellen sind wie vorstehend beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Transfizieren einer Zelle bereit, umfassend das Bereitstellen der auf einer Oberfläche in einem zufälligen Array immobilisierten Transfektionskomplexe, wobei die Transfektionskomplexe Nukleinsäuren und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfassen, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül und eine Zelle umfasst; und das Inkontaktbringen der Zelle mit den immobilisierten Nukleinsäuren unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle transfiziert wird. Die Ausführungsformen von den Transfektionskomplexen, die Form von den auf der Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren, die Oberfläche und die Zellen sind wie vorstehend beschrieben. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Methode weiter den Schritt des Exprimierens der Nukleinsäure in der transfizierten Zelle und in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt des Nachweisens der Expression der transfizierten Nukleinsäure in der transfizierten Zelle, mit den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Immobilisieren der Nukleinsäure auf einer Oberfläche bereit, umfassend das Kombinieren der Nukleinsäure mit dem ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, um so mindestens einen Transfektionskomplex zu bilden; und das Inkontaktbringen von mindestens einem Transfektionskomplex mit der unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Nukleinsäure zu immobilisieren. Die Ausführungsformen von den Transfektionskomplexen, die Form von den auf der Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren und die Oberfläche sind wie vorstehend beschrieben. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Oberfläche bereit, umfassend immobilisierte Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäure mindestens in einem Transfektionskomplex immobilisiert ist, erzeugt durch jedes der vorstehend beschriebenen Verfahren. Folglich umfasst, in einigen Ausführungsformen, die Oberfläche immobilisierte Nukleinsäuren in einem Array von oberflächenimmobilisierten Nukleinsäuren; in einigen bevorzugten Ausführungsformen ist der Array ein Mikroarray. In einigen Ausführungsformen ist der Array geordnet; in anderen Ausführungsformen ist der Array zufällig. Die Ausführungsformen von den Transfektionskomplexen und der Oberfläche sind wie vorstehend beschrieben.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch einen an der Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplex bereit, der durch ein beliebiges der vorstehend beschriebenen Verfahren erzeugt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt auch weitere Aspekte bereit, in denen ein an eine Oberfläche der vorliegenden Erfindung immobilisierter Transfektionskomplex in jeder von einigen Anwendungen eingebaut worden ist; einige von diesen Aspekten sind in den folgenden Abschnitten beschrieben. In diesen weiteren Aspekten sind die Ausführungsformen von dem Transfektionskomplex, der Komplexbildner, Nukleinsäuren, die Immobilisierung von dem Transfektionskomplex an eine Oberfläche, eine Oberfläche und eine Zelle im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Protein-Protein Bindungspaares bereit, umfassend: das Bereitstellen eines Transfektionskomplexes, umfassend eine erste und eine zweite Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, wobei die erste Nukleinsäure ein erstes Protein kodiert und die zweite Nukleinsäure ein zweites Protein kodiert und die Nukleinsäuren in mindestens einem Expressionsvektor vorhanden sind, und eine Zelle umfasst; das Inkontaktbringen der Zelle mit den immobilisierten Nukleinsäuren unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle co-transfiziert ist mit der ersten und zweiten Nukleinsäure und die erste und zweite Nukleinsäure exprimiert werden und des Nachweisens der Anwesenheit von einem Protein-Protein Komplex, wobei mindestens ein Protein ein Protein ist, das durch mindestens eine der Nukleinsäuren kodiert ist.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Liganden von einem Rezeptor bereit, umfassend: das Bereitstellen eines an einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei der Komplex eine erste und eine zweite Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfasst, wobei die erste Nukleinsäure einen Rezeptor kodiert und die zweite Nukleinsäure ein Protein kodiert, wobei die erste und zweite Nukleinsäure mindestens in einem Expressionsvektor vorhanden sind und der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül und eine Zelle umfasst und das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Komplex unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle co-transfiziert ist mit den Nukleinsäuren und die Nukleinsäuren exprimiert werden und das Nachweisen der Anwesenheit von einem Liganden-Rezeptor Bindungspaar, wobei das Rezeptorprotein durch die erste Nukleinsäure kodiert ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von DNA-bindenden Proteinen bereit, umfassend: das Bereitstellen eines an einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei der Komplex eine erste und eine zweite Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfasst, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst, wobei die erste Nuklein säure ein Protein kodiert und in einem Expressionsvektor vorhanden ist, und eine Zelle; das Inkontaktbringen der Zelle mit den immobilisierten Nukleinsäuren unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle co-transfiziert ist mit den Nukleinsäuren und die Nukleinsäuren exprimiert werden und das Nachweisen der Anwesenheit der Bindung zwischen der zweiten Nukleinsäure und einem Protein, was an die zweite Nukleinsäure bindet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein verfahren zum Analysieren der Wirkung von einem Analyten bereit, umfassend: das Bereitstellen eines an einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei der Komplex Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfasst, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, wobei die Nukleinsäure ein Protein kodiert und die Nukleinsäure in einem Expressionsvektor vorhanden ist, und eine Zelle umfasst; das Inkontaktbringen der Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle transfiziert ist mit der Nukleinsäure und die Nukleinsäure exprimiert wird; Zugabe eines Analyten zu den transfizierten Zellen unter derartigen Bedingungen, dass der Analyt mit einem Protein, kodiert durch die transfizierte Aminosäure, interagiert; und dem Nachweisen der Wirkung des Analyten auf das Protein.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines post-translational modifizierten Proteins bereit, umfassend: das Bereitstellen eines an einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei der Komplex eine Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfasst, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, wobei die Nukleinsäure ein Protein kodiert und die Nukleinsäure in einem Expressi onsvektor vorhanden ist, und eine Zelle umfasst; das Inkontaktbringen der Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle transfiziert ist mit der Nukleinsäure und die Nukleinsäure exprimiert wird; und Nachweisen einer post-transkriptionalen Modifikation von dem Protein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Immobilisieren von Nukleinsäure an eine Oberfläche bereit, umfassend: das Kombinieren der Nukleinsäure mit dem ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, um so mindestens einen Transfektionskomplex zu bilden, wobei die Komplexbildner ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polysacchariden, Lipiden und Dendrimeren; und das Inkontaktbringen mindestens eines Transfektionskomplexes mit der Oberfläche unter Bedingungen, die ausreichend sind, die Nukleinsäure zu immobilisieren. Dieser Transfektionskomplex kann dann verwendet werden, eine Zelle durch jede der vorstehend beschriebenen Verfahren zu transfizieren; eine Sammlung von Transfektionskomplexen kann auch verwendet werden, um, wie vorstehend beschrieben, Arrays aus Transfektionskomplexen zu bilden. Die Erfindung stellt weiter Transfektionskomplexe bereit, umfassend Nukleinsäure und Komplexbildner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polysacchariden, Lipiden und Dendrimeren; und Oberflächen, umfassend solche immobilisierten Transfektionskomplexe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Transfizieren einer Zelle bereit, umfassend: das Bereitstellen eines an einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei der Komplex eine Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst und der zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül, und eine Zelle umfasst; und das Inkontaktbrin gen der Zelle mit dem an der Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplex unter derartigen Bedingungen, dass die Zelle unter Verwendung eines aktiven Transportprozesses transfiziert ist.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt ein Diagramm von STEP. Ein geordneter Array von Nukleinsäuren (vorzugsweise cDNA-Klone in eukaryontischen Expressionsvektoren) ist an eine Oberfläche immobilisiert, adhärente Zellen werden auf dem Nukleinsäure-Array ausgebracht und auf die STEP-Transfektion folgend, werden die transfizierten Zellen auf Wirkungen der Expression der transfizierten Nukleinsäure untersucht.
2 zeigt einen Nachweis von STEP-transfizierten Zellen von DNA-Arrays, die mit einem Mikroarrayspotter-Roboter aufgetragen wurden.
3 zeigt den Signalweg von der Aktivierung von Dopamin-1 (D-1)re durch Cl-APB, gekoppelt an Adenylatcyclase und nachfolgende Erzeugung von zyklischem AMP.
4 zeigt die Transfektion von zwei Zelltypen, wobei das adenovirale Protein Penton als ein Komplexbildner in den Transfektionskomplexen verwendet worden ist.
DEFINITIONEN
Um ein Verstehen der vorliegenden Erfindung zu fördern, sind eine Anzahl von den Bezeichnungen und Phrasen, wie hierin verwendet, nachstehend definiert.
Die Bezeichnung "Proteinkinase" bezeichnet Proteine, die die Addition von einer Phosphatgruppe von einem Nukleosidtriphosphat an eine Aminosäure-Seitenkette in einem Protein katalysieren. Kinasen umfassen die größte bekannte Enzym-Superfamilie und variieren weitgehend in ihren Zielproteinen. Kinasen können kategorisiert werden als Protein-Tyrosin-Kinasen (PTKs), die Tyrosin-Reste phosphorylieren und Protein-Serin/Threonin-Kinasen (STKs), die Serin- und/oder Threonin-Reste phosphorylieren. Einige Kinasen haben eine duale Spezifität für Serin/Threonin-Reste und Threonin-Reste. Fast alle Kinasen enthalten eine konservierte, 250–300 Aminosäuren umfassende katalytische Domäne. Diese Domäne kann weiter unterteilt werden in 11 Unterdomänen. Die N-terminalen Unterdomänen I–IV falten sich in eine doppelte Keulen-Struktur, die das ATP-Donormolekül bindet und ausrichtet, und Unterdomäne V verbindet die beiden Keulen. Die C-terminalen Unterdomänen VI–XI binden das Proteinsubstrat und übertragen das Gamma-Phosphat von ATP auf die Hydroxylgruppe von einem Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Rest. Jede von den 11 Unterdomänen enthält spezifische katalytische Gruppen oder Aminosäure-Motifs, die für diese Unterdomäne kennzeichnend sind. Zum Beispiel enthält Unterdomäne I ein aus 8 Aminosäuren bestehendes Glycin-reiches ATP-Bindungs-Konsensusmotif, Unterdomäne II enthält einen kritischen Lysin-Rest, der für die maximale katalytische Aktivität benötigt wird und die Unterdomänen VI bis IX umfassen den hochkonservierten katalytischen Kern. STKs und PTKs enthalten auch verschiedene Sequenz-Motifs in den Subdomänen VI und VIII, die Hydroxyamino-Spezifität verleihen können. Einige STKs und PTKs besitzen strukturelle Eigenschaften von beiden Familien. Darüber hinaus können Kinasen auch durch zusätzliche Aminosäure-Sequenzen klassifiziert sein, normalerweise zwischen 5 und 100 Resten, die entweder die Kinasedomäne flankieren oder innerhalb von ihr vorkommen.
Nicht-transmembranäre PTKs bilden Signalkomplexe mit den cytosolischen Domänen von Plasmamembranrezeptoren. Rezeptoren, die durch nicht-transmembranäre PTKs signalisieren, schließen Cytokin-, Hormon- und Antigen-spezifische lymphozytische Rezeptoren ein. Viele PTKs wurden zuerst als Onkogenprodukte in Krebszellen identifi ziert, in denen die PTK-Aktivierung nicht mehr länger der normalen zellulären Kontrolle unterworfen war. Tatsächlich kodieren etwa ein Drittel von den bekannten Onkogenen PTKs. Weiterhin ist die zelluläre Transformation (Onkogenese) oft durch eine erhöhte Tyrosinphosphorylierungs-Aktivität begleitet (siehe z. B. Carbonneau, H. und Tonks, Annu. Rev. Cell Biol. 8: 463–93 (1992)). Die Regulation der PTK-Aktivität kann daher eine wichtige Strategie in der Kontrolle von einigen Arten von Krebs sein.
Die Bezeichnungen "Protein" und "Polypeptid" beziehen sich auf Verbindungen, die Aminosäuren umfassen, miteinander verbunden mittels Peptidbindungen, und die austauschbar verwendet werden können.
Wie hierin verwendet, wo „Aminosäure-Sequenz" hier rezitiert wird, bezieht sie sich auf eine Aminosäure-Sequenz von einem Proteinmolekül. Eine „Aminosäure-Sequenz" kann von der Nukleinsäure-Sequenz, die dieses Protein kodiert, hergeleitet werden. Jedoch sind Bezeichnungen wie „Polypeptid" oder „Protein" nicht gemeint, die Aminosäuresequenz auf die hergeleitete Aminosäure-Sequenz zu beschränken, sondern schließt post-translationale Modifikationen von den hergeleiteten Aminosäure-Sequenzen, wie Aminosäure-Deletionen, Additionen und Modifikationen, wie Glykosylierungen und Hinzufügen von Lipid-Resten, ein.
Die Bezeichnung "Anteil", wenn sie in Bezug auf ein Protein verwendet wird (wie in "ein Anteil eines vorgegebenen Proteins") bezieht sich auf Fragmente von diesem Protein. Die Fragmente können in der Größe von vier Aminosäureresten bis zu der gesamten Aminosäure-Sequenz abzüglich einer Aminosäure reichen.
Die Bezeichnung "chimer" wenn sie in Bezug auf ein Polypeptid verwendet wird, bezieht sich auf das Expressionsprodukt von zwei oder mehr kodierenden Sequenzen, die von unterschiedlichen Genen erhalten wurden, die zusammenkloniert wurden und die, nach der Translation, als eine einzige Polypeptidsequenz wirken. Chimere Polypeptide werden auch als „Hybrid-"Polypeptide bezeichnet. Die kodierenden Sequenzen schließen solche, die von derselben oder von unterschiedlichen Spezies des Organismus erhalten wurden, ein.
Die Bezeichnung "Fusion", wenn sie verwendet wird in Bezug auf ein Polypeptid, bezieht sich auf ein chimeres Protein, das ein Protein von Interesse enthält, das mit einem exogenen Proteinfragment (dem Fusionspartner) verbunden ist. Der Fusionspartner kann verschiedenen Funktionen dienen, einschließlich Erhöhung der Löslichkeit von dem Polypeptid von Interesse, sowie ein „Affinitäts-Tag" bereitstellen, um die Reinigung von dem rekombinanten Fusionspolypeptid aus einer Wirtszelle oder aus einem Überstand oder aus beiden zu gestatten. Falls gewünscht, kann der Fusionspartner von dem Protein von Interesse nach oder während der Reinigung entfernt werden.
Die Bezeichnung "Homolog" oder „homolog", wenn sie in Bezug auf ein Polypeptid verwendet werden, bezieht sich auf einen hohen Grad der Sequenzidentität zwischen zwei Polypeptiden oder auf einen hohen Grad der Ähnlichkeit zwischen der dreidimensionalen Struktur oder auf einen hohen Grad der Ähnlichkeit zwischen der aktiven Stelle und dem Mechanismus der Aktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein Homolog eine Sequenzidentität größer als 60% und insbesondere größer als 75% Sequenzidentität und noch bevorzugter größer als 90% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz auf.
Wie auf Polypeptide angewendet, bedeutet die Bezeichnung "grundlegende Identität", dass zwei Peptidsequenzen, wenn sie optimal angepasst sind, wie durch die Programme GAP oder BESTFIT unter Verwendung von vorgegebenen Werten für die Gewichtung der Lücken, mindes tens 80 Prozent Sequenzidentität sich teilen, vorzugsweise mindestens 90 Prozent Sequenzidentität, insbesondere mindestens 95 Prozent Sequenzidentität oder mehr (z. B. 99 Prozent Sequenzidentität). Vorzugsweise unterscheiden sich die Positionen der Reste, die nicht identisch sind, durch konservativen Aminosäure-Austausch.
Die Bezeichnungen "Variante" und "Mutante", wenn sie in Bezug auf ein Polypeptid verwendet werden, beziehen sich auf Aminosäure-Sequenzen, die sich durch eine oder mehrere Aminosäuren voneinander unterscheiden, gewöhnlich verwandte Polypeptide. Die Variante kann „konservative" Änderungen aufweisen, wobei eine ausgetauschte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften aufweist. Ein Typ des konservativen Aminosäureaustauschs bezieht sich auf die Austauschbarkeit von Resten, die ähnliche Seitenketten aufweisen. Eine Gruppe von Aminosäuren, die zum Beispiel aliphatische Seitenketten aufweisen, sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Hydroxyl-Seitenketten aufweisen, ist Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren, die Amid-enthaltende Seitenketten aufweisen, ist Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aromatische Seitenketten aufweisen, ist Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäure, die basische Seitenketten aufweisen, ist Lysin, Arginin und Histidin und eine Gruppe von Aminosäuren, die schwefelhaltige Seitenketten aufweisen, ist Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäureaustausch-Gruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin und Asparagin-Glutamin. Eine Variante mag eher selten „nicht-konservative" Änderungen aufweisen (z. B. Austausch von einem Glycin mit einem Tryptophan). Ähnliche kleinere Variationen können auch Aminosäure-Deletionen oder -Insertionen (Hinzufügungen, mit anderen Worten) oder beides einschließen. Eine Anleitung für die Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste ausge tauscht, hinzugefügt oder entfernt worden sein können, ohne die biologische Aktivität zu beseitigen, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Computerprogrammen, zum Beispiel, DNAStar-Software, erhalten werden. Die Varianten können in funktionellen Assays getestet werden. Bevorzugte Varianten weisen weniger als 10%, und vorzugsweise weniger als 5%, und noch bevorzugter weniger als 2% Änderungen auf (ob Substitutionen, Deletionen und so weiter).
Die Bezeichnung "Gen" bezieht sich auf eine Nukleinsäure (z. B. DNA oder RNA)-Sequenz, die kodierende Sequenzen umfasst, die notwendig sind für die Herstellung einer RNA, oder einem Polypeptid oder seinem Vorläufer (z. B. Proinsulin). Ein funktionelles Polypeptid kann durch eine vollständige kodierende Sequenz oder durch jeden Anteil der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange wie die gewünschte Aktivität oder funktionelle Eigenschaften (z.B. enzymatische Aktivität, Ligandenbindung, Signaltransduktion usw.) von dem Polypeptid erhalten bleiben. Die Bezeichnung "Anteil", wenn in Bezug auf ein Gen verwendet, bezieht sich auf Fragmente von diesem Gen. Die Fragmente können in der Größe von ein paar Nukleotiden bis zu der gesamten Gensequenz, abzüglich einer Nukleinsäure, reichen. Somit kann „ein Nukleotid, umfassend mindestens einen Anteil von einem Gen" Fragmente von dem Gen oder das gesamte Gen umfassen.
Die Bezeichnung "Gen" kann auch die kodierenden Regionen von einem strukturellen Gen umspannen und schließt Sequenzen ein, die benachbart zu der kodierenden Region sowohl an dem 5'-Ende als dem 3'-Ende in einer Entfernung von etwa 1 kb von jedem Ende derart lokalisiert sind, dass das Gen der Länge der vollständigen mRNA entspricht. Die Sequenzen, die am 5'-Ende der kodierenden Region lokalisiert sind und die in der mRNA vorhanden sind, werden als 5'-nichttranslatierte Sequenzen bezeichnet. Die Sequenzen, die am 3'-Ende oder „downstream" von der kodierenden Region lokalisiert sind und die in der mRNA vorhanden sind, werden als 3'-nichttranslatierte Sequenzen bezeichnet. Die Bezeichnung „Gen" umspannt beides, cDNA und genomische Formen von einem Gen. Eine genomische Form oder Klon von einem Gen enthält die kodierende Region, unterbrochen mit nicht-kodierenden Sequenzen, genannt „Introns" oder „intervenierende Regionen" oder „intervenierende Sequenzen". Introns sind Segmente von einem Gen, die in nukleare RNA (hnRNA) transkribiert werden; Introns können regulatorische Elemente, wie Verstärker, enthalten. Introns werden von dem nukleären oder primären Transkript entfernt oder „herausgespleißt"; Introns sind daher in dem Boten-RNA (mRNA)-Transkript abwesend. Die mRNA hat während der Translation die Funktion, die Sequenz oder Reihenfolge der Aminosäuren in einem entstehenden Polypeptid festzulegen.
Zusätzlich zu den in ihnen enthaltenen Introns können genomische Formen von einem Gen auch Sequenzen enthalten, die sowohl an den 5'-Enden als auch an den 3'-Enden der Sequenzen, die in dem RNA-Transkript vorhanden sind, lokalisiert sind. Diese Sequenzen werden als „flankierende" Sequenzen oder Regionen bezeichnet (diese flankierenden Sequenzen sind 5'- oder 3'- zu den nichttranslatierten Sequenzen lokalisiert, die in dem mRNA-Transkript vorhanden sind). Die 5'-flankierende Region kann regulatorische Sequenzen, wie Promotoren und Verstärker enthalten, die die Transkription des Gens kontrollieren oder beeinflussen. Die 3'-flankierende Region kann Sequenzen enthalten, die die Beendigung der Transkription, post-transkriptionelle Spaltung und Polyadenylierung steuern.
Die Bezeichnung "heterologes Gen" bezieht sich auf ein Gen, das einen Faktor kodiert, der nicht in seiner natürlichen Umgebung ist (d. h. der durch die Hand des Menschen verändert worden ist). Zum Beispiel schließt ein heterologes Gen ein Gen ein, das von einer Spezies in die andere Spezies eingeführt wurde. Ein heterologes Gen beinhaltet auch ein Gen, das in einem Organismus natürlich vorkommt, das auf irgendeine Weise geändert worden ist (z. B. mutiert, in multiplen Kopien hinzugefügt, verbunden mit einer nicht nativen Promotor- oder Verstärker-Sequenz, usw.). Heterologe Gene können Pflanzengen-Sequenzen umfassen, die cDNA-Formen von einem Pflanzengen umfassen; die cDNA-Sequenzen können entweder in einer Sense-(um mRNA zu erzeugen) oder in einer Antisense- Orientierung vorliegen (um ein Antisense-RNA Transkript zu erzeugen, das komplementär zu dem mRNA-Transkript ist). Heterologe Gene unterscheiden sich von endogenen Pflanzengenen dadurch, dass heterologe Gensequenzen normalerweise mit Nukleotidsequenzen verbunden sind, die regulatorische Elemente wie Promotoren umfassen, die nicht natürlich assoziiert mit dem Gen für das Protein, das durch das heterologes Gen kodiert wird, oder mit Pflanzengen-Sequenzen in dem Chromosom gefunden wird oder assoziiert sind mit Anteilen von dem Chromosom, die nicht in der Natur gefunden werden (z.B. Gene, die an Orten exprimiert werden, wo das Gen normalerweise nicht exprimiert wird).
Die Bezeichnung "Polynukleotid" bezieht sich auf ein Molekül, das zwei oder mehr Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfasst, vorzugsweise mehr als drei, und gewöhnlich mehr als zehn. Die exakte Größe wird von vielen Faktoren abhängig sein, die wiederum von der letztendlichen Funktion oder der Verwendung von dem Oligonukleotid abhängen. Das Polynukleotid kann in jeder Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese, DNA-Replikation, reverse Transkription oder einer Kombination davon. Die Bezeichnung „Oligonukleotid" bezieht sich allgemein auf eine geringe Länge von einer einzelsträngigen Polynukleotidkette, die gewöhnlich weniger als 30 Nukleotide lang ist, obwohl sie auch austauschbar mit der Bezeichnung „Polynukleotid" verwendet werden kann.
Die Bezeichnung "Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Polymer von Nukleotiden, oder ein Polynukleotid, wie vorstehend beschrieben. Die Bezeichnung wird verwendet, um ein einzelnes Molekül oder eine Sammlung von Molekülen zu kennzeichnen. Nukleinsäuren können einzelsträngig oder doppelsträngig sein und können kodierende Regionen und Regionen von verschiedenen Kontrollelementen einschließen, wie vorstehend beschrieben.
Die Bezeichnung "ein Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Gen kodiert" oder "eine Nukleinsäuresequenz, kodierend" für ein spezifisches Polypeptid bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, umfassend die kodierende Region von einem Gen oder mit anderen Worten, die Nukleinsäuresequenz, die ein Genprodukt kodiert. Die kodierende Region kann entweder in einer cDNA-, genomischen DNA- oder RNA-Form vorhanden sein. Wenn sie in einer DNA-Form vorhanden ist, kann das Oligonukleotid, Polynukleotid oder die Nukleinsäure einzelsträngig (d. h., der Sense-Strang) oder doppelsträngig sein. Geeignete Kontrollelemente wie Verstärker/Promotoren, Spleiß-Verbindungen, Polyadenylierungs-Signale usw. können in unmittelbarer Nähe zu der kodierenden Region des Gens platziert sein, falls benötigt, um die ordnungsgemäße Initiation der Transkription und/oder das korrekte Prozessieren von dem primären RNA-Transkript zu gestatten. Wahlweise kann die in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung verwendete kodierende Region endogene Verstärker/Promotoren, Spleißverbindungen, intervenierende Sequenzen, Polyadenylierungs-Signale usw. enthalten oder eine Kombination aus endogenen und exogenen Kontrollelementen.
Die Bezeichnung "rekombinant", wenn sie in Bezug zu einem Nukleinsäuremolekül gemacht wird, bezieht sich auf eine Nukleinsäuremolekül, das Segmente von Nukleinsäuren umfasst, die durch Mittel der molekularbiologischen Techniken miteinander verbunden wurden. Die Bezeichnung "rekombinant", wenn sie in Bezug zu einem Protein oder einem Polypeptid gemacht wird, bezieht sich auf ein Proteinmolekül, das unter Verwendung einer rekombinanten Nukleinsäure exprimiert wird.
Die Bezeichnungen "komplementär" und "Komplementarität" beziehen sich auf Polynukleotide (d.h. eine Sequenz von Nukleotiden), die durch die Regeln der Basenpaarung in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist die Sequenz „A-G-T" komplementär zu der Sequenz „T-C-A". Komplementarität kann „teilweise" sein, wobei nur einige von den Basen der Nukleinsäure gemäß den Regeln der Basenpaarung übereinstimmen. Oder, es kann „komplette" oder „totale" Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren vorhanden sein. Der Grad der Komplementarität zwischen den Nukleinsäure-Strängen besitzt signifikante Wirkungen auf die Effizienz und die Stärke der Hybridisierung zwischen den Nukleinsäure-Strängen. Dies ist von besonderer Wichtigkeit in Amplifikationsreaktionen sowie in Nachweismethoden, die von der Bindung zwischen Nukleinsäuren abhängig sind.
Die Bezeichnung "Homologie", wenn sie in Bezug zu Nukleinsäuren verwendet wird, bezieht sich auf einen Grad der Komplementarität. Es kann teilweise Homologie oder komplette Homologie (d. h. Identität) geben. „Sequenz-Identität" bezieht sich auf ein Maß der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Proteinen und wird in Prozent im Bezug auf die gesamte Vergleichslänge angegeben. Die Identitätsberechnung berücksichtigt solche Nukleotid- oder Aminosäure-Reste, die identisch sind und in denselben relativen Positionen in ihren entsprechend größeren Sequenzen sind. Berechnungen der Identität können mittels Algorithmen durchgeführt werden, die in Computerprogrammen wie „GAP" (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) und „ALIGN" (DNAStar, Madison, Wis.) enthalten sind. Eine teilweise komplementäre Sequenz ist eine, die mindestens teilweise die Hybridisierung einer komplett komplementären Sequenz an eine Zielnukleinsäure inhibiert (oder mit ihr kompetiert) und wird unter Verwendung der funktionellen Bezeichnung „grundsätzlich homolog" bezeichnet. Die Inhibierung der Hybridisierung von der komplett komplementären Sequenz an die Zielsequenz kann unter Verwendung eines Hybridisierungsassays (Southern- oder Northern-Blot, Lösungs-Hybridisierung und dergleichen) unter Bedingungen von niedriger Stringenz untersucht werden. Eine grundsätzlich homologe Sequenz oder Sonde wird mit der Bindung (d. h. Hybridisierung) von einer Sequenz, die komplett homolog zu einer Zielsequenz unter Bedingungen von niedriger Stringenz ist, kompetieren oder sie inhibieren. Dies soll nicht heißen, dass Bedingungen von niedriger Stringenz so sind, dass eine unspezifische Bindung gestattet ist, Bedingungen niedriger Stringenz benötigen, dass die Bindung von zwei Sequenzen aneinander eine spezifische (d.h. selektive) Interaktion ist. Die Abwesenheit der unspezifischen Bindung kann untersucht werden durch die Verwendung einer zweiten Zielsequenz, der sogar ein teilweiser Grad der Komplementarität (z. B. weniger als etwa 30% Identität) fehlt; in der Abwesenheit der unspezifischen Bindung wird die Sonde nicht mit der zweiten nicht-komplementären Zielsequenz hybridisieren.
Die folgenden Bezeichnungen werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehreren Polynukleotiden zu beschreiben: "Referenzsequenz", „Sequenzidentität"; „Prozent der Sequenzidentität" und „grundsätzliche Identität". Eine „Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, die als eine Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann eine Teilmenge von einer größeren Sequenz sein, zum Beispiel als ein Segment von einer vollständigen cDNA-Sequenz, die in einer Sequenzauflistung vorgegeben ist oder kann eine komplette Gensequenz umfassen. Im Allgemeinen ist eine Referenzsequenz mindestens 20 Nukleotide lang, häufig mindestens 25 Nukleotide lang und oft mindestens 50 Nukleotide lang. Da zwei Polynukleotide jeweils (1) eine Sequenz (d. h. einen Anteil von einer kompletten Polynukleotid-Sequenz) umfassen, die ähnlich zwischen den zwei Polynukleotiden sein kann und (2) die weiter eine Sequenz umfassen kann, die abweichend zwischen den zwei Polynukleotiden ist, werden normalerweise Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynukleotiden durchgeführt durch Vergleich der Sequenzen von zwei Polynukleotiden über ein „Vergleichsfenster", um lokale Regionen mit Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein konzeptionelles Segment von mindestens 20 zusammenhängenden Nukleotidpositionen, wobei eine Polynukleotidsequenz mit einer Referenzsequenz von mindestens 20 zusammenhängenden Nukleotiden verglichen werden kann und wobei der Anteil von der Polynukleotidsequenz in dem Vergleichsfenster Hinzufügungen oder Deletionen (d. h. Lücken) von 20 Prozent oder weniger, verglichen mit der Referenzsequenz (die keine Hinzufügungen oder Deletionen umfasst) für eine optimale Anpassung von den zwei Sequenzen umfassen kann. Die optimale Anpassung von Sequenzen zum Anpassen eines Vergleichsfensters kann durchgeführt werden mittels der lokalen Homologie-Algorithmen von Smith und Waterman (Smith und Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), durch den Homologie-Anpassungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), durch das Suchverfahren für Ähnlichkeiten nach Pearson und Lipman (Pearson and Lipman, ProC. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)), durch Computer-gestützte Implementationen von diesen Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA, und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) oder ausgewählt durch Überprüfung und der besten Anpassung (d. h. resultierend in dem höchsten Prozentsatz an Homologie über das Vergleichsfenster), die durch die verschiedenen Verfahren erzeugt wird. Die Bezeichnung "Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynukleotidsequenzen identisch sind (d. h. auf einer Nukleotid-für-Nukleotid Basis) über das Vergleichsfenster. Die Bezeichnung „Prozent der Sequenzidentität" ist berechnet durch Vergleichen von zwei über das Ver gleichsfenster optimal angepassten Sequenzen, der Bestimmung der Zahl der Positionen, bei denen die identischen Nukleinsäurebasen (z. B. A, T, C, G, U oder I) in beiden Sequenzen auftreten, um die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu ergeben, Dividieren der Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen in dem Vergleichsfenster (d. h. der Fenstergröße) und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100, um die Prozentzahl der Sequenzidentität zu ergeben. Die Bezeichnung "grundsätzliche Identität", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Eigenschaft von einer Polynukleotidsequenz, wobei das Polynukleotid eine Sequenz umfasst, die mindestens 85 Prozent Sequenzidentität aufweist, vorzugsweise mindestens 90 bis 95 Prozent Sequenzidentität, gewöhnlich mindestens 99 Prozent Sequenzidentität aufweist, verglichen mit einer Referenzsequenz über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Nukleotidpositionen, häufig über ein Fenster von mindestens 25–50 Nukleotiden, wobei die Prozentzahl der Sequenzidentität berechnet wird durch Vergleichen der Referenzsequenz mit der Polynukleotidsequenz, die Deletionen oder Hinzufügungen enthalten kann, die insgesamt 20 Prozent oder weniger von der Referenzsequenz über das Vergleichsfenster ausmachen. Die Referenzsequenz kann eine Teilmenge von einer größeren Sequenz, zum Beispiel, wie ein Segment von den vollständigen Sequenzen der in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Zusammensetzungen sein.
Wenn als Referenz für eine doppelsträngige Nukleinsäuresequenz, wie eine cDNA oder ein genomischer Klon, verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „grundsätzlich homolog" auf jede Sonde, die entweder mit einem Strang oder beiden Strängen von der doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen von niedriger bis hoher Stringenz, wie vorstehend beschrieben, hybridisieren kann.
Wenn in Bezug auf eine einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „grundsätzlich homolog" auf jede Sonde, die entweder mit einem Strang oder beiden Strängen von der doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz unter Bedingungen von niedriger bis hoher Stringenz, wie vorstehend beschrieben, hybridisieren kann.
Die Bezeichnung "Hybridisierung" bezieht sich auf die Paarung von komplementären Nukleinsäuren. Die Hybridisierung und die Stärke der Hybridisierung (d. h. die Stärke der Assoziation zwischen den Nukleinsäuren) ist in solchen Faktoren eingeschlossen wie dem Grad der Komplementarität zwischen den Nukleinsäuren, der Stringenz der einbezogenen Bedingungen, dem T_m von dem gebildeten Hybrid und dem G:C-Verhältnis innerhalb der Nukleinsäuren. Ein einzelnes Molekül, das eine Paarung von komplementären Nukleinsäuren innerhalb seiner Struktur enthält, wird als „selbst-hybridisiert" bezeichnet.
Die Bezeichnung "T_m" bezieht sich auf die „Schmelztemperatur" von einer Nukleinsäure. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der eine Population von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zur Hälfte in einzelne Stränge dissoziiert wird. Die Gleichung zur Berechnung der T_m von Nukleinsäuren ist dem Fachmann gut bekannt. Wie durch Standardverweise hingewiesen, kann eine einfache Abschätzung von dem T_m-Wert berechnet werden durch die Gleichung: T_m = 81,5 + 0,41 (% G + C), wenn eine Nukleinsäure sich in einer wässrigen Lösung bei 1 M NaCl befindet (siehe z. B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andere Verweise schließen anspruchsvollere Computerberechnungen ein, die sowohl strukturelle als auch Sequenzeigenschaften für die Berechnung von T_m berücksichtigen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Stringenz" auf die Bedingungen von Temperatur, Ionen stärke und die Gegenwart von anderen Verbindungen, wie organische Lösemittel, unter denen Nukleinsäurehybridisierungen durchgeführt werden. Mit „hohen Stringenz"– Bedingungen wird die Basenpaarung von Nukleinsäuren nur auftreten zwischen Nukleinsäurefragmenten, die eine hohe Frequenz der komplementären Basensequenzen aufweisen. Folglich sind Bedingungen von „niedriger Stringenz" oft nötig bei Nukleinsäuren, die aus Organismen erhalten wurden, die genetisch verschieden sind, da die Frequenz von komplementären Sequenzen gewöhnlich gering ist.
"Niedrig-stringente Bedingungen", wenn sie in Bezug auf die Hybridisierung von Nukleinsäuren verwendet werden, umfassen Bedingungen, die äquivalent sind zur Bindung oder Hybridisierung bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂O und 1.85 g/l EDTA, pH-Wert eingestellt auf 7.4 mit NaOH), 0.1% SDS, 5 X Denhardt's Reagenz [50 X Denhardt's enthält per 500 ml: 5 g Ficoll (Type 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraktion V; Sigma)) und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, gefolgt durch Waschen in einer Lösung, umfassend 5X SSPE, 0,1% SDS bei 42°C, wenn eine Sonde von etwa 500 Nukleotiden Länge verwendet wird.
"Mittel-stringente Bedingungen" ", wenn sie in Bezug auf die Hybridisierung von Nukleinsäuren verwendet werden, umfassen Bedingungen, die äquivalent sind zur Bindung oder Hybridisierung bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂O und 1.85 g/l EDTA, pH-Wert eingestellt auf 7.4 mit NaOH), 0.5% SDS, 5 X Denhardt's Reagenz und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, gefolgt durch Waschen in einer Lösung, umfassend 1,0 X SSPE, 1,0% SDS bei 42°C, wenn eine Sonde von etwa 500 Nukleotiden Länge verwendet wird.
"Hoch-stringente Bedingungen", wenn sie in Bezug auf die Hybridisierung von Nukleinsäuren verwendet werden, umfassen Bedingungen, die äquivalent sind zur Bindung oder Hybridisierung bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄ H₂O und 1.85 g/l EDTA, pH-Wert eingestellt auf 7.4 mit NaOH), 0,5% SDS, 5 X Denhardt's Reagenz und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA, gefolgt durch Waschen in einer Lösung, umfassend 0,1 X SSPE, 1,0% SDS bei 42°C, wenn eine Sonde von etwa 500 Nukleotiden Länge verwendet wird.
Es ist gut bekannt, dass unzählige äquivalente Bedingungen angewandt werden können, um die niedrig-stringenten Bedingungen zu umfassen, Faktoren wie die Länge und die Beschaffenheit (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) von der Sonde und die Beschaffenheit von dem Ziel (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung vorhanden oder immobilisiert usw.) und die Konzentrationen der Salze und anderer Verbindungen (z.B. die Anwesenheit oder Abwesenheit von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol) werden berücksichtigt und die Hybridisierungslösung kann variiert werden, um Bedingungen von niedrig-stringenter Hybridisierung zu erzeugen, die verschieden sind von, aber äquivalent zu, den vorstehend aufgelisteten Bedingungen. Zusätzlich kennt der Fachmann Bedingungen, die die Hybridisierung unter hoher Stringenz fördern (z. B. Erhöhung der Temperatur von den Hybridisierungs- und/oder Waschschritten, der Verwendung von Formamid in der Hybridisierungslösung usw.).
"Amplifikation" ist eine spezieller Fall der Nukleinsäure-Replikation, die eine Templatespezifität beinhaltet. Sie kontrastiert zu der unspezifischen Templatereplikation (d.h. Replikation, die Template-abhängig ist, aber nicht von einem spezifischen Template). Templatespezifität wird hier von Genauigkeit der Replikation (d. h. Synthese von der ordnungsgemäßen Polynukleotidsequenz) und der Nukleotid (Ribo- oder Desoxyribo-)-Spezifität unterschieden. Die Templatespezifität wird häufig als „Ziel"-Spezifität bezeichnet.
Zielsequenzen sind „Ziele" in dem Sinn, dass sie aus anderen Nukleinsäuren ausgesucht werden sollten. Amplifikationstechniken sind hauptsächlich für dieses Aussuchen entwickelt worden.
Templatespezifität wird mit den meisten Amplifikationstechniken erreicht durch die Wahl der Enzyme. Amplifikationsenzyme sind Enzyme, die, unter den Bedingungen, unter denen sie verwendet werden, nur spezifische Sequenzen von der Nukleinsäure in einem heterogenen Gemisch von Nukleinsäuren bearbeiten. Zum Beispiel in dem Fall der Q-Replikase ist MDV-1 RNA das spezifische Template für die Replikase (Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 3038 (1972)). Eine andere Nukleinsäure wird nicht durch dieses Amplifikationsenzym repliziert werden. Ähnlich weist im Falle der T7-RNA-Polymerease dieses Amplifikationsenzym eine stringente Spezifität für seine eigenen Promotoren auf (Chamberlin et al., Nature, 228: 227 (1970)). Im Falle der T4-DNA-Ligase wird das Enzym nicht die zwei Oligonukleotide oder Polynukleotide ligieren, bei denen eine Fehlübereinstimmung zwischen dem Oligonukleotid- oder Polynukleotidsubstrat und dem Template an der Ligationsverbindung vorhanden ist (Wu und Wallace, Genomics, 4: 560 (1989)). Zum Abschluss, für Tag- und Pfu-Polymerasen wurde, aufgrund ihrer Fähigkeit bei hoher Temperatur zu arbeiten, gefunden, dass sie eine hohe Spezifität für die gebundenen Sequenzen aufzeigen und somit durch die Primer definiert sind; die hohe Temperatur resultiert in thermodynamischen Bedingungen, die die Hybridisierung der Primer mit den Zielsequenzen und nicht die Hybridisierung mit den Nicht-Zielsequenzen fördern (H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (1989)).
Die Bezeichnung "amplifizierbare Nukleinsäure" bezieht sich auf Nukleinsäuren, die durch ein beliebiges Amplifikationsverfahren amplifiziert werden können. Es ist vorgesehen, dass „amplifizierbare Nukleinsäure" gewöhnlich „Proben-Template" umfasst.
Die Bezeichnung "Proben-Template" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die aus einer Probe stammt, die auf das Vorhandensein eines „Zieles" analysiert wird (nachfolgend definiert). Im Gegensatz dazu wird „Hintergrund-Template" verwendet in Bezug auf eine andere Nukleinsäure als das Proben-Template, die in einer Probe vorhanden oder nicht vorhanden sein kann. Hintergrund-Template ist sehr oft versehentlich. Es kann das Ergebnis von einer Verschleppung sein oder es kann durch die Anwesenheit von Nukleinsäure-Kontaminanten verursacht sein, die eigentlich von der Probe weggereinigt werden sollten. Zum Beispiel können Nukleinsäuren von anderen Organismen als solche, die nachgewiesen werden sollten, als Hintergrund in einer Testprobe vorhanden sein.
Die Bezeichnung "Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, unabhängig ob es natürlich vorkommt, wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch produziert, das in der Lage ist als ein Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, in welchen eine Synthese eines Primer-Extensionsproduktes, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induziert wird (d. h. in der Anwesenheit von Nukleotiden und einem induzierenden Agens wie DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und pH-Wert). Der Primer ist vorzugsweise für eine maximale Effizienz in der Amplifikation einzelsträngig, aber kann wahlweise doppelsträngig sein. Falls er doppelsträngig ist, muss der Primer zuerst behandelt werden, um seine Stränge vor der Verwendung für die Herstellung von Extensionsprodukten zu trennen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonukleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese der Extensionsprodukte in der Gegenwart von dem induzierenden Agens zu starten. Die genaue Länge von den Primern wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich Temperatur, Ursprung des Primers und dem verwendeten Verfahren.
Die Bezeichnung "Sonde" bezieht sich auf ein Oligonukleotid (d. h. eine Sequenz von Nukleotiden), unabhängig davon, ob es natürlich wie in einem gereinigten Restriktionsverdau vorkommt oder synthetisch, durch Rekombination oder durch PCR-Amplifikation produziert wird, das in der Lage ist an ein weiteres Oligonukleotid von Interesse zu hybridisieren. Eine Sonde kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sonden sind nützlich für den Nachweis, die Identifizierung und die Isolation von bestimmten Gensequenzen. Es ist vorgesehen, dass jede Sonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mit einem beliebigen „Reportermolekül" derart markiert wird, dass es in jedem Nachweissystem nachweisbar ist, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Enzymen (z.B. ELISA sowie Enzym-basierte histochemische Assays), fluoreszierenden, radioaktiven und lumineszenten Systemen. Es ist nicht beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung beschränkt wird auf irgendein bestimmtes Nachweissystem oder eine Markierung.
Die Bezeichnung "Ziel", wenn sie in Bezug auf die Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird, bezieht sich auf die Region von Nukleinsäuren, die durch die für die Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Primer gebunden ist. Folglich sollte das „Ziel" aus anderen Nukleinsäuresequenzen ausgesucht werden. Ein „Segment" ist definiert als eine Region von Nukleinsäuren innerhalb der Zielsequenz.
Die Bezeichnung "Polymerase-Kettenreaktion" („PCR") bezieht sich auf das Verfahren von K. B. Mullis, U.S. Patentschriften Nr. 4,683,195,4,683,202, und 4,965,188, die ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration von einem Segment von einer Zielsequenz in einem Gemisch von genomischer DNA ohne Klonierung oder Reinigung beschrei ben. Dieser Prozess zur Amplifizierung der Zielsequenz besteht aus dem Einbringen eines großen Überschusses von zwei Oligonukleotid-Primern in das DNA-Gemisch, das die gewünschte Zielsequenz enthält, gefolgt durch eine präzise Abfolge von thermischen Zyklen in der Gegenwart von einer DNA-Polymerase. Die zwei Primer sind komplementär zu ihren entsprechenden Strängen von der doppelsträngigen Zielsequenz. Um die Amplifikation zu bewirken, wird das Gemisch denaturiert und die Primer dann mit ihren komplementären Sequenzen innerhalb des Zielmoleküls fest verbunden. Nach diesem festen Verbinden, nachfolgend Annealing genannt, werden die Primer mit einer Polymerase derart verlängert, dass sie ein neues Paar von komplementären Strängen bilden. Die Schritte der Denaturierung, der festen Verbindung der Primer und die Verlängerung durch die Polymerase können sehr oft wiederholt werden (d. h. Denaturierung, feste Verbindung und Verlängerung bilden einen „Zyklus", es können zahllose „Zyklen" sein), um eine hohe Konzentration von einem amplifizierten Segment von der gewünschten Zielsequenz zu erhalten. Die Länge von dem amplifizierten Segment der gewünschten Zielsequenz ist bestimmt durch die relativen Positionen von den Primern im Bezug zueinander, und deshalb ist diese Länge ein kontrollierbarer Parameter. Aufgrund der sich wiederholenden Merkmale von dem Prozess wird das Verfahren als „Polymerase-Kettenreaktion" (anschließend hierin „PCR") bezeichnet. Da die gewünschten amplifizierten Segmente von der Zielsequenz zu den vorherrschenden Sequenzen (im Sinne von Konzentration) in dem Gemisch werden, wird von ihnen gesagt, dass sie „PCR-amplifiziert" werden.
Mit der PCR ist es möglich, eine einzelne Kopie von einer spezifischen Zielsequenz in genomischer DNA auf ein Niveau zu amplifizieren, das durch unterschiedliche Methodiken (z. B. Hybridisieren mit einer markierten Sonde, Einbau eines biotinylierten Primern, gefolgt durch einen Nachweis mit einem Avidin-Enzym-Konjugat, Einbau von ³²P-markierten Desoxynukleotidtriphosphaten, wie dCTP oder dATP, in das amplifizierte Segment) nachweisbar ist. Zusätzlich zur genomischen DNA kann jede Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenz mit einem entsprechenden Set von Primermolekülen amplifiziert werden. Insbesondere sind die durch den PCR-Prozess amplifizierten Segmente selbst effiziente Templates für die nachfolgenden PCR-Amplifikationen.
Die Bezeichnungen "PCR-Produkt", "PCR-Fragment" und "Amplifikationsprodukt" beziehen sich auf das resultierende Gemisch von Verbindungen, nachdem zwei oder mehr Zyklen von den PCR-Schritten der Denaturierung, dem Annealing und der Verlängerung vollständig sind. Diese Bezeichnungen umspannen den Fall, wo eine Amplifikation von einem oder mehr Segmenten von einer oder mehreren Zielsequenzen stattgefunden hat.
Die Bezeichnung "Amplifikations-Reagenzien" bezieht sich auf solche Reagenzien (Desoxyribonukleotidtriphosphate, Puffer usw.), die für die Amplifikation benötigt werden, abgesehen von Primern, Nukleinsäure-Template und dem Amplifikationsenzym. Normalerweise werden Amplifikations-Reagenzien zusammen mit anderen Reaktionskomponenten in ein Reaktionsgefäß (Teströhrchen, Mikrovertiefung usw.) platziert und sind darin enthalten.
Die Bezeichnung "reverse Transkriptase" oder "RT-PCR" bezieht sich auf einen Typ von PCR, wobei das Startmaterial mRNA ist. Die Start-mRNA wird enzymatisch zur komplementären DNA oder „cDNA" unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Enzyms umgebaut. Die cDNA wird dann als ein „Template" für eine „PCR"-Reaktion benutzt.
Die Bezeichnung "Genexpression" bezieht sich auf den Prozess des Konvertierens von genetischer Information, die in einem Gen kodiert ist, in RNA (z. B. mRNA, rRNA, tRNA oder snRNA) durch „Transkription" von dem Gen (d. h. über die enzymatische Aktivität einer RNA-Polymerase) und in ein Protein durch „Translation" von mRNA. Die Genexpression kann auf vielen Stufen in dem Prozess reguliert werden. "Hochregulation" oder "Aktivierung" bezieht sich auf die Regulation, die eine Produktion von Genexpressions-Produkten (d. h. RNA oder Protein) erhöht, während „Herunterregulation" oder „Repression" sich auf die Regulation bezieht, die die Produktion vermindert. Moleküle (z. B. Transkriptionsfaktoren), die in die Hochregulation oder Herunterregulation eingebunden sind, werden auch oft „Aktivatoren" beziehungsweise „Repressoren" genannt.
Die Bezeichnungen " in operativer Kombination", "in operativer Anordnung" und „operativ verknüpft" beziehen sich auf die Verknüpfung von Nukleinsäuresequenzen in einer solchen Weise, dass ein Nukleinsäuremolekül produziert wird, das in der Lage ist, die Transkription eines vorgegebenen Gens und/oder die Synthese von einem gewünschten Proteinmolekül zu steuern. Die Bezeichnung bezieht sich auch auf die Verknüpfung von Aminosäuresequenzen in einer solchen Weise, dass ein funktionelles Protein produziert wird.
Die Bezeichnung "regulatorisches Element" bezieht sich auf ein genetisches Element, das einige Aspekte von der Expression von Nukleinsäuresequenzen kontrolliert. Zum Beispiel ist ein Promotor ein regulatorisches Element, das die Initiation der Transkription von einer operativ verbundenen kodierenden Region fördert. Andere regulatorische Elemente sind Spleißsignale, Polyadenylierungs-Signale, Terminations-Signale usw.
Transkriptionelle Kontrollsignale in Eukaryonten umfassen „Promotor-" und „Verstärker"-Elemente. Promotoren und Verstärker bestehen aus kurzen Reihen von DNA-Sequenzen, die spezifisch mit zellulären Proteinen interagieren, die an der Transkription beteiligt sind (Maniatis, et al, Science 236: 1237, 1987). Promotor- und Verstärker-Elemente sind von einer Anzahl an eukaryontischen Quellen, einschließlich Genen in Hefen, Insekten, Säugern und Pflanzenzellen, isoliert worden. Promotor- und Verstärker-Elemente sind auch von Viren isoliert worden und analoge Kontrollelemente, wie Promotoren, werden auch in Prokaryonten gefunden. Die Auswahl von einem bestimmten Promotor und Verstärker hängt von dem Zelltyp ab, der für die Expression des Proteins von Interesse verwendet wird. Einige eukaryontische Promotoren und Verstärker weisen einen breiten Wirtsbereich auf, während andere funktionell beschränkt sind auf eine Teilmenge von Zelltypen (als Übersichtsartikel siehe Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11: 287, 1986; und Maniatis, et al., supra 1987).
Die Bezeichnungen "Promotor-Element", Promotor" oder "Promotorsequenz", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine DNA-Sequenz, die an dem 5'-Ende (d. h. vorausgehend) der das Protein kodierenden Region von einem DNA-Polymer lokalisiert ist. Die Lokalisation von den meisten in der Natur bekannten Promotoren geht der transkribierten Region voraus. Der Promotor fungiert als ein Schalter, der die Expression von einem Gen aktiviert. Wenn das Gen aktiviert ist, sagt man, dass es transkribiert wird oder an der Transkription beteiligt ist. Die Transkription beinhaltet die Synthese der mRNA von dem Gen. Demzufolge dient der Promotor als ein transkriptionelles regulatorisches Element und stellt auch eine Stelle für die Initiation der Transkription von dem Gen in mRNA bereit.
Promotoren können gewebespezifisch oder zellspezifisch sein. Die Bezeichnung „gewebespezifisch", wenn angewendet auf einen Promotor, bezieht sich auf einen Promotor, der in der Lage ist, die selektive Expression von einer Nukleinsäuresequenz von Interesse auf einen spezifischen Typ von Gewebe (z. B. Samen) in der relativen Abwesenheit der Expression von derselben Nukleotidsequenz von Interesse in einem unterschiedlichen Gewebetyp (z. B. Blätter) zu steuern. Die Gewebespezifität von einem Promotor kann untersucht werden durch, zum Beispiel, durch operatives Verknüpfen von einem Reportergen mit der Promotorsequenz, um ein Reporterkonstrukt zu erzeugen, das Einfügen des Reporterkonstruktes in das Genom von einer Pflanze derart, dass das Reporterkonstrukt in jedes Gewebe der resultierenden transgenen Pflanze integriert wird und dem Nachweisen der Expression von dem Reportergen (z. B. Nachweis von mRNA, Protein oder der Aktivität von einem Protein, das durch das Reportergen kodiert ist) in verschiedenen Geweben der transgenen Pflanze. Der Nachweis von einem größeren Expressionslevel von dem Reportergen in einem oder mehreren Geweben relativ zu dem Expressionslevel von dem Reportergen in anderen Geweben zeigt, dass der Promotor für die Gewebe spezifisch ist, in denen größere Expressionslevel nachgewiesen wurden. Die Bezeichnung „zelltypspezifisch", wenn auf einen Promotor angewendet, bezieht sich auf einen Promotor, der in der Lage ist, die selektive Expression von einer Nukleotidsequenz von Interesse in einem spezifischen Zelltyp in der relativen Abwesenheit der Expression derselben Nukleotidsequenz von Interesse in einem unterschiedlichen Zelltyp innerhalb desselben Gewebes zu steuern. Die Bezeichnung „zelltypspezifisch", wenn sie auf einen Promotor angewendet wird, bedeutet auch einen Promotor, der in der Lage ist, die selektive Expression von einer Nukleotidsequenz von Interesse in einer Region innerhalb eines einzelnen Gewebes zu fördern. Die Zelltypspezifität von einem Promotor kann festgestellt werden unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, z. B. immunohistochemische Anfärbung. In Kürze, Gewebesektionen werden in Paraffin eingebettet und die Paraffinsektionen werden mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch ist für das Polypeptidprodukt, das durch die Nukleotidsequenz von Interesse, dessen Expression durch den Promotor kontrolliert wird. Einem markierten (z. B. Peroxidase-konjugiert) sekundären Antikörper, der für den primären Antikörper spezifisch ist, wird erlaubt an das geschnittene Gewebe zu binden und die spezifische Bindung mittels Mikroskopie nachgewiesen (z. B. mit Avidin/Biotin).
Promotoren können konstitutiv oder regulierbar sein. Die Bezeichnung „konstitutiv", wenn sie in Bezug auf einen Promotor gemacht ist, bedeutet, dass der Promotor in der Lage ist, die Transkription von einer operativ verknüpften Nukleinsäuresequenz in der Abwesenheit von einem Stimulus (z. B. Hitzeschock, Chemikalien, Licht usw.) zu steuern. Normalerweise sind konstitutive Promotoren in der Lage, die Expression von einem Transgen in grundsätzlich jeder Zelle und jedem Gewebe zu steuern. Beispielhafte konstitutive Pflanzenpromotoren schließen ein, aber sind nicht darauf beschränkt, SD Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV SD; siehe z. B., U.S. Patentschrift Nr. 5,352,605, hierin durch Verweis eingeschlossen), Mannopin-Synthase (mas), Octopin-Synthase (ocs), Superpromotor (siehe z. B., WO 95/14098) und ubi3-Promotoren (siehe z. B. Garbarino und Belknap, Plant Mol. Biol. 24: 119–127 (1994)). Solche Promotoren sind erfolgreich verwendet worden, um die Expression von heterologen Nukleinsäuresequenzen in transformiertem Pflanzengewebe zu steuern.
Im Gegensatz dazu ist ein „regulierbarer" oder „induzierbarer" Promotor, ein Promotor, der in der Lage ist, ein Transkriptionsniveau einer operativ verknüpften Nukleinsäure-Sequenz in Gegenwart eines Reizes (z. B. Hitzeschock, Chemikalien, Licht usw.) zu steuern, das sich von dem Transkriptionsniveau der operativ verknüpften Nukleinsäure-Sequenz in Abwesenheit des Reizes unterscheidet.
Der Verstärker und/oder Promotor kann „endogen" oder „exogen" oder „heterolog" sein. Ein „endogener" Verstärker oder Promotor ist ein Promotor, der mit einem vorgegebenen Gen in dem Genom natürlich verknüpft ist. Ein „exogener" oder „heterologer" Verstärker oder Promotor ist ein Promotor, der derart mittels Genmanipulation (d. h. Methoden der Molekularbiologie) neben einem Gen. platziert ist, dass die Transkription des Gens durch den verknüpften Verstärker oder Promotor gesteuert wird. Ein endogener Promotor in operativer Kombination mit einem ersten Gen kann zum Beispiel isoliert, entfernt und in operativer Kombination mit einem zweiten Gen platziert werden, wobei daraus ein „heterologer Promotor" in operativer Kombination mit dem zweiten Gen wird. Eine Vielzahl solcher Kombinationen wird betrachtet (z. B. können die ersten und zweiten Gene von der gleichen Art oder von verschiedenen Arten stammen).
Das Vorhandensein von „Spleißsignalen" bei einem Expressionsvektor führt oft zu höheren Expressionsniveaus des rekombinanten Transkripts in eukaryontischen Wirtszellen. Spleißsignale vermitteln das Entfernen von Introns aus dem primären RNA-Transkript und bestehen aus einer Spleiß-Donorstelle und -Akzeptorstelle (Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) S. 16.7–16.8). Eine gebräuchliche Spleiß-Donorstelle und -Akzeptorstelle ist die Spleiß-Verbindungsstelle der 16S-RNA von SV40.
Die effiziente Expression von rekombinanten DNA-Sequenzen in eukaryontischen Zellen erfordert die Expression von Signalen, die die effiziente Terminierung und Polyadenylierung des resultierenden Transkripts steuern. Terminierungssignale der Transkription befinden sich im Allgemeinen downstream des Polyadenylierungssignals und sind einige hundert Nukleotide lang. Die Bezeichnung „Poly(A)-Stelle" oder „Poly(A)-Sequenz", wie sie hier verwendet wird, bezeichnet eine DNA-Sequenz, die sowohl die Terminierung als auch die Polyadenylierung des naszierenden RNA-Transkripts steuert. Die effiziente Polyadenylierung des rekombinanten Transkripts ist wünschenswert, da die Transkripte, denen ein Poly(A)- Schwanz fehlt, instabil sind und schnell abgebaut werden. Das Poly(A)-Signal, das in einem Expressionsvektor verwendet wird, kann „heterolog" oder „endogen" sein. Ein endogenes Poly(A)-Signal ist ein Signal, das an dem 3'-Ende des kodierenden Bereichs eines vorgegebenen Gens in dem Genom natürlich vorkommt. Ein heterologes Poly(A)-Signal ist ein Signal, das aus einem Gen isoliert und 3' zu einem anderen Gen positioniert wurde. Ein gebräuchliches heterologes Poly(A)-Signal ist das SV40-Poly(A)-Signal. Das SV40-Poly(A)-Signal ist auf einem 237 by BamHI/BclI-Restriktionsfragment enthalten und steuert sowohl die Terminierung als auch die Polyadenylierung (Sambrook, supra, 16.6–16.7).
Die Bezeichnung „Vektor" bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, die DNA-Segment(e) von einer Zelle zu einer anderen transferieren. Die Bezeichnung „Vehikel" wird manchmal synonym für „Vektor" verwendet.
Die Bezeichnungen „Expressionsvektor" oder „Expressionskassette" beziehen sich auf ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine gewünschte Kodierungssequenz und geeignete Nukleinsäure-Sequenzen enthält, die für die Expression der operativ verknüpften Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Nukleinsäure-Sequenzen, die für die Expression in Prokaryonten notwendig sind, enthalten normalerweise einen Promotor, einen Operator (optional) und eine Ribosom-bindende Stelle, oft zusammen mit anderen Sequenzen. Eukaryontische Zellen verwenden bekanntermaßen Promotoren, Verstärker und Terminierungs- und Polyadenylierungssignale.
Die Bezeichnung „Transfektionskomplex" bezieht sich auf molekulare Aggregate von Molekülen, die Nukleinsäuren enthalten, die beim Eintritt in Zellen zu Veränderungen in der Genexpression führen werden. Die Anzahl der Nukleinsäuremoleküle und die Art der Nukleinsäuremoleküle kann mehr als eins/eine pro Aggregat sein. Normalerweise umfasst ein Transfektionskomplex Nukleinsäure mit einem oder mehreren Komplexbildnern.
Die Bezeichnung „Komplexbildner" bezieht sich auf eine Verbindung in einem Transfektionskomplex neben Nukleinsäure, deren Wirkung untersucht wird; normalerweise erleichtern solche Agentien die Transfektion mit Nukleinsäure. Einige Klassen der Komplexbildner binden sich durch elektrostatische, hydrophobe und/oder von Stearinsäure abgeleitete Wechselwirkungen an Nukleinsäuren, um ein molekulares Aggregat zu bilden; andere Klassen binden sich an andere Moleküle. Beispiele für solche Agentien sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Liganden für Rezeptoren, DNA-bindende Moleküle und membranpermeable Moleküle. Zusätzliche Komplexbildner sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Targeting-Moleküle, Transkriptionsmoleküle, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus und Modulatoren von Zellwachstum und -integrität.
Die Bezeichnung „Ligand für Rezeptoren" bezieht sich auf ein erstes Molekül, den Liganden, der sich an ein zweites Molekül wie ein Protein, Zucker oder Lipid binden kann, das mit einer Zellmembran verbunden ist. Wenn er in Bezug auf STEP verwendet wird, bindet sich der Ligand an einen Rezeptor, der sich in dem Plasmalemma befindet und durch die Zellen endozytosiert wird; vorzugsweise ist der Rezeptor ein Protein. Beispiele für solche Liganden sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Transferrin und Low-Density-Lipoproteinpartikel, die sich an LDL-Rezeptoren binden, sowie Virusproteine, die sich bekanntermaßen an Integrine binden. Andere Beispiele sind, jedoch nicht darauf beschränkt, andere Proteine, Kohlenhydrate, Hormone, kleine Moleküle und Arzneistoffe.
Die Bezeichnung „DNA-bindende Moleküle" bezieht sich auf Moleküle (z. B. kationische Proteine), die mit Nukleinsäure Komplexe bilden, um ihre Ladung zu neutralisieren und sie in ihrer Größe kompakter zu machen; diese Mole küle binden sich normalerweise durch elektrostatische, hydrophobe und/oder von Stearinsäure abgeleitete Wechselwirkungen an Nukleinsäuren, um ein molekulares Aggregat zu bilden. DNA-bindende Moleküle sind, aber nicht darauf beschränkt, Helix-Loop-Helix-Proteine (HLH), Zinkfingerproteine, DNA-Interkalatoren wie aromatische Moleküle, andere Nukleinsäuren, Schwermetalle wie Platin, Antibiotika wie Chromomycin A(3) und Mithramycin (MTR) sowie DNA-bindende Peptide wie das DNA-bindende Peptid mu aus dem Adenovirus. Besonders vorteilhafte DNA-bindende Moleküle sind kationische Proteine.
Die Bezeichnung „kationisches Protein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid mit einer elektrostatischen Ladung von mehr als null bei pH 7 in wässriger Lösung; es steht im Gegensatz zu einem „anionischen Protein", das ein Protein oder Polypeptid mit einer elektrostatischen Ladung von weniger als null unter den gleichen Bedingungen ist. In der vorliegenden Erfindung ist ein „kationisches Protein" eine Teilklasse der „DNA-bindenden Moleküle", die eine Teilklasse der „Komplexbildner" sind.
Die Bezeichnung „membranpermeable Moleküle" bezieht sich auf Moleküle, die in Zellmembranen permeabel sind und die STEP-Transfektion erleichtern. Während es nicht notwendig ist, den zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen, und während die Erfindung nicht auf einen bestimmten Mechanismus beschränkt ist, glaubt man, dass diese Moleküle die Transfektion durch die Verbesserung des Transports durch die Membran der Nukleinsäure in einem Transfektionskomplex in eine Wirtszelle erleichtern. Besonders vorteilhafte membranpermeable Moleküle sind kationische Lipide.
Die Bezeichnung „kationisches Lipid" bezieht sich auf ein hydrophobes Molekül, das lipidlöslich ist und einen positiv geladenen Bereich bei pH 7 enthält. Die vorliegende Erfindung betrachtet eine Vielzahl von solchen ka tionischen Lipiden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Lipofectamine^TM, Lipofectin^®, Lipofectamine Plus^TM, Cellfectin^® und Lipofectase^TM (erhältlich von Life Technologies). In der vorliegenden Erfindung ist ein „kationisches Lipid" eine Teilklasse der „membranpermeablen Moleküle", die eine Teilklasse der „Komplexbildner" sind.
Die Bezeichnung „Targeting-Moleküle" bezieht sich auf Moleküle, die einen Transfektionskomplex oder Teile davon, die die Nukleinsäure enthalten, zu dem geeigneten Zellkompartiment leiten, in dem die Expression oder die Wirkung der Nukleinsäure stattfindet; wenn die Nukleinsäure zum Beispiel DNA ist, kann das geeignete Kompartiment der Zellkern, ein Mitochondrium oder ein Plastid sein; wenn die Nukleinsäure RNA ist, kann das geeignete Kompartiment das Cytoplasma, ein Mitochondrium oder ein Plastid sein. Solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine, zum Beispiel das SV40 T-Antigen, die Kernlokalisierungssignale (NLS) enthalten, um die Proteine zu dem Kern der Zellen zu leiten.
Die Bezeichnung „Transkriptions-/Translationsmoleküle" bezieht sich auf Moleküle, die die Transkription von DNA oder die Translation von RNA unterstützen. Solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine, die als nicht-einschränkendes Beispiel Transkriptionsfaktoren, DNA-entspannende oder -entwindende Faktoren (z. B. Helikasen) und DNA-Polymerasen (z. B. TFIIA, TFIID) sind.
Die Bezeichnung „Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus" bezieht sich auf Moleküle, die als Nuklease-Inhibitoren wirken. Solche Moleküle erleichtern STEP, indem sie den Abbau der transfizierten Nukleinsäuren verhindern. Beispiele für solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine (z. B. DMI22) und Nichtprotein-Arzneistoffe.
Die Bezeichnung „Modulatoren von Zellgesundheit und -integrität" bezieht sich auf Moleküle, die die Adhäsion, das Wachstum, die Teilung und/oder Differenzierung von Zellen moduliert; vorzugsweise fördert solch eine Modulation diese Merkmale. Diese Moleküle erleichtern STEP, indem sie die Gesundheit und Integrität von Zellen, die mit STEP transfiziert wurden, modulieren und vorzugsweise fördern. Beispiele für solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine.
Die Bezeichnung „Dendrimer" bezieht sich auf ein natürliches oder synthetisches verzweigtes Molekül (z. B. Polypeptide, Nukleinsäuren oder synthetische Verbindungen).
Die Bezeichnung „Art der Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Merkmal oder eine Eigenschaft einer Nukleinsäure, das/die sie von einer anderen Nukleinsäure unterscheidet, wie zum Beispiel ein Unterschied in der Sequenz oder in der physikalischen Form, was in verschiedenen Expressionsvektoren oder bei dem Vorhandensein von DNA und RNA oder bei dem Vorhandensein von linearer und superhelikaler DNA oder bei dem Vorhandensein von kodierenden Bereichen, die verschiedene Proteine kodieren, oder bei dem Vorhandensein von verschiedenen Kontrollelementen oder Kontrollelementen, die untereinander verschieden sind, auftritt.
Die Bezeichnung „immobilisiert", wenn sie in Bezug auf Nukleinsäure verwendet wird, bezieht sich auf eine räumliche Beschränkung der Nukleinsäure auf einer Oberfläche, deren Beschränkung die Nukleinsäure daran hindert, in die Lösung, in der sich die Oberfläche befindet, einzudringen und in der Lösung frei zu werden; es erfordert die Bildung eines stabilen Komplexes, wobei der Komplex die Nukleinsäure umfasst und die Bildung des Komplexes zumindest teilweise durch elektrostatische Wechselwirkungen vermittelt wird. Die Bezeichnung „stabil", wenn sie in Bezug auf einen Komplex verwendet wird, der Nukleinsäure umfasst, bezieht sich auf die Aufrechterhaltung des Komplexes über einen Zeitraum, im Allgemeinen mindestens 72 bis 96 Stunden, in einer Lösung wie Gewebe- oder Zellkultur-Medien. Die immobilisierten Transfektionskomplexe sind auch stabil, wenn sie auf einer Oberfläche getrocknet sind; die Dauer der Stabilität im getrockneten Zustand liegt normalerweise bei mindestens mehreren Wochen bis zu mehreren Monaten.
Die Bezeichnung „Array" bezieht sich auf ein Muster, vorzugsweise derart, dass das Muster repliziert und/oder durch einen geeigneten Detektor nachgewiesen werden kann. Wenn es in Bezug auf immobilisierte Transfektionskomplexe der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst das Array „Spots", die immobilisierte Transfektionskomplexe enthalten. Ein Spot ist die Stelle einer einzelnen Probe von immobilisierten Transfektionskomplexen; ein Spot kann durch ein- oder mehrmaliges Auftragen der Probe auf die Stelle erzeugt werden. Obwohl jeder Spot eine einzelne Probe von immobilisierten Transfektionskomplexen umfasst, kann eine einzelne Probe von immobilisierten Transfektionskomplexen eine bis mehr als eine Art von Nukleinsäure umfassen. Außerdem können verschiedene Spots in einem Array die gleichen oder verschiedene Transfektionskomplexe umfassen; die Transfektionskomplexe können sich in dem vorhandenen Komplexbildner, der Art der vorhandenen Nukleinsäure oder beidem unterscheiden. Normalerweise unterscheiden sich verschiedene Spots in der Art der vorhandenen Nukleinsäure. Somit umfasst ein Array normalerweise Spots, von denen mindestens einige bis zu den meisten verschiedene Arten von Nukleinsäuren umfassen.
Ein „Mikroarray" bezieht sich auf ein Array, das auf einen kleinen Bereich beschränkt ist. Normalerweise sind solche Arrays auf nicht mehr als etwa 1 bis 3 Inch beschränkt, da sie häufig auf Mikroskop-Objektträgern erzeugt werden. Mikroarrays enthalten die maximale Anzahl an Spots, die innerhalb der Grenzen erzeugt werden können; normalerweise ist diese Anzahl für hand erzeugte Arrays geringer als die Anzahl für robotertechnisch oder maschinell erzeugte Arrays. Ein typisches maschinell erzeugtes Array enthält bis zu etwa 10.800 Spots.
Die Bezeichnung „geordnetes Array" bezieht sich auf ein Muster von Spots der vorliegenden Erfindung derart, dass sich die Spots in einer vorbestimmten geometrischen Anordnung auf der Oberfläche befinden; am häufigsten ist die geometrische Anordnung eine Gitteranordnung. Die Bezeichnung „Zufallsarray" bezieht sich auf ein Muster von Spots der vorliegenden Erfindung derart, dass sich die Spots nicht in einer vorbestimmten geometrischen Anordnung auf der Oberfläche befinden. Ein Zufallsarray kann durch einen mathematischen Algorithmus oder durch einen Zufallszahlengenerator bestimmt werden.
Die Bezeichnung „aktiver Transport" bezieht sich auf einen Prozess, in dem ein Molekül durch jeden Mechanismus von außerhalb einer Zelle ins Innere der Zelle transportiert wird, außer durch Liposom-vermittelten Eintritt (wie zum Beispiel von DNA, die mit Lipiden beschichtet ist), erleichterte Diffusion oder passive Diffusion. Aktiver Transport beinhaltet Endozytose, besonders Rezeptor-vermittelte Endozytose. Agentien, die den aktiven Transport von Nukleinsäure-Molekülen in die Zellen fördern, um den Transfektionsprozess zu unterstützen, sind Komplexbildner, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Liganden für Rezeptoren, DNA-bindende Moleküle und membranpermeable Moleküle.
Die Bezeichnung „Transfektion" bezieht sich auf die Einführung von Fremd-DNA in Zellen. Transfektion kann durch eine Vielzahl von in der Technik bekannten Methoden durchgeführt werden, einschließlich Co-Präzipitation von Calciumphosphat-DNA, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Polybren-vermittelte Transfektion, Glasperlen, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomenfusion, Lipofektion, Protoplastenfusion, Virusinfektion, Biolistik (d. h., Partikelbeschuss) und Ähnliches in bestimmte Typen von Zellen. Die Technik ist sich dieser zahlreichen Modifikationen wohl bewusst.
Die Bezeichnung „stabile Transfektion" oder „stabil transfiziert" bezieht sich auf die Einführung und Integration von Fremd-DNA in das Genom der transfizierten Zelle. Die Bezeichnung „stabiler Transfektant" bezieht sich auf eine Zelle, die Fremd-DNA in die genomische DNA stabil integriert hat.
Die Bezeichnung „vorübergehende Transfektion" oder „vorübergehend transfiziert" bezieht sich auf die Einführung von Fremd-DNA in eine Zelle, wobei sich die Fremd-DNA nicht in das Genom der transfizierten Zelle integriert. Die Fremd-DNA verbleibt für mehrere Tage in dem Zellkern der transfizierten Zelle. Während dieser Zeit unterliegt die Fremd-DNA den regulatorischen Kontrollen, die die Expression von endogenen Genen in den Chromosomen regeln. Die Bezeichnung „vorübergehender Transfektant" bezieht sich auf Zellen, die Fremd-DNA aufgenommen, aber diese DNA nicht integriert haben.
Die Bezeichnung „Co-Präzipitation von Calciumphosphat" bezieht sich auf eine Methode zur Einführung von Nukleinsäuren in eine Zelle. Die Aufnahme von Nukleinsäuren durch Zellen wird verbessert, wenn die Nukleinsäure als ein Co-Präzipitat von Calciumphosphat-Nukleinsäure dargelegt wird. Die ursprüngliche Methode von Graham und van der Eb (Graham und van der Eb, Virol., 52:456 (1973)) wurde durch mehrere Gruppen modifiziert, um die Bedingungen dafür zu optimieren.
Die Bezeichnungen „infizierend" und „Infektion", wenn sie mit einem Bakterium verwendet werden, beziehen sich auf die Co-Inkubation einer biologischen Zielprobe (z. B. Zelle, Gewebe usw.) mit dem Bakterium unter Bedingungen derart, dass die Nukleinsäure-Sequenzen, die in dem Bakterium enthalten sind, in eine oder mehrere Zellen der biologischen Zielprobe eingeführt werden.
Die Bezeichnungen „beschießend", „Beschuss" und „biolistischer Beschuss" beziehen sich auf den Prozess der Beschleunigung von Partikeln in Richtung einer biologische Zielprobe (z. B. Zelle, Gewebe usw.), um die Verletzung der Zellmembran einer Zelle in der biologische Zielprobe und/oder den Eintritt der Partikel in die biologische Zielprobe zu bewirken. Verfahren für den biolistischen Beschuss sind in der Technik bekannt (z. B. US-Patentschrift 5.584.807, deren Inhalte hier durch Verweise integriert sind) und handelsüblich (z. B. der Heliumgas-betriebene Mikroprojektilbeschleuniger (PDS-1000/He, BioRad)).
Die Bezeichnung „Mikroverletzung", wenn sie in Bezug auf Pflanzengewebe vorkommt, bezieht sich auf die Zufügung von mikroskopischen Verletzungen zu diesem Gewebe. Eine Mikroverletzung kann zum Beispiel durch, wie hier beschrieben, Partikelbeschuss erfolgen.
Die Bezeichnung „Transgen", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Fremd-Gen, das in einem Organismus platziert wird, indem das Fremd-Gen in frisch befruchtete Eier oder frühe Embryonen eingeführt wird. Die Bezeichnung „Fremd-Gen" bezieht sich auf jede Nukleinsäure (z. B. Gensequenz), die durch experimentelle Manipulationen in das Genom eines Tieres eingeführt wird, und kann Gensequenzen enthalten, die in diesem Tier zu finden sind, solange das eingeführte Gen nicht an der gleichen Stelle vorkommt wie das natürlich vorkommende Gen .
Die Bezeichnung „Wirtszelle" bezieht sich auf jede Zelle, die in der Lage ist, ein heterologes Gen zu replizieren und/oder transkribieren und/oder translatieren. Somit bezieht sich eine „Wirtszelle" auf jede eukaryontische oder prokaryontische Zelle (z. B. Bakte rienzelle wie E. coli, Hefezelle, Säugerzelle, Vogelzelle, Amphibienzelle, Pflanzenzelle, Fischzelle und Insektenzelle), egal, ob sie sich in vitro oder in vivo befindet. Wirtszellen können sich zum Beispiel in einem transgenen Tier befinden.
Die Bezeichnungen „Transformanten" oder „transformierte Zellen" umfassen die primären transformierten Zellen und Kulturen, die von dieser Zelle abgeleitet sind, ohne Rücksicht auf die Anzahl der Transfers. Alle Abkömmlinge können aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen nicht genau identisch im DNA-Inhalt sein. Mutant-Abkömmlinge, die die gleiche Funktionsweise aufweisen, wie sie in der ursprünglich transformierten Zelle untersucht wurde, sind in der Definition von Transformanten eingeschlossen.
Die Bezeichnung „selektionierbarer Marker" bezieht sich auf ein Gen, das ein Enzym mit einer Aktivität kodiert, die der Zelle, in der der selektionierbare Marker exprimiert wird, Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder einem Arzneistoff verleiht, oder die die Expression eines Merkmals ermöglicht, das nachgewiesen werden kann (z. B. Lumineszenz oder Fluoreszenz). Selektionierbare Marker können „positiv" oder „negativ" sein. Beispiele für positive selektionierbare Marker sind das Neomycin-Phosphotransferase(NPTII)-Gen, das Resistenz gegenüber G418 und Kanamycin verleiht, und das bakterielle Hygromycin-Phosphotransferase-Gen (hyg), das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin verleiht. Negative selektionierbare Marker kodieren eine enzymatische Aktivität, deren Expression zytotoxisch für die Zelle ist, wenn sie in einem geeigneten selektiven Medium gezogen wird. Das HSV-tk-Gen zum Beispiel ist gebräuchlich als ein negativer selektionierbarer Marker. Die Expression des HSV-tk-Gens in Zellen, die in Gegenwart von Gancyclovir oder Acyclovir gezogen wurden, ist zytotoxisch; somit sondert sich das Wachstum von Zellen in selektivem Medium, das Gancyclovir oder Acyclovir enthält, von Zellen ab, die in der Lage sind, ein funktionales HSV TK-Enzym zu exprimieren.
Die Bezeichnung „Reportergen" bezieht sich auf ein Gen, das ein Protein kodiert, das getestet werden kann. Beispiele für Reportergene sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Luciferase (siehe z. B. deWet et al, Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) und US-Patentschriften 6.074.859, 5.976.796, 5.674.713 und 5.618.682, die alle hier durch Verweise integriert sind), grün fluoreszierendes Protein (z. B. GenBank-Zugangsnummer U43284; eine Anzahl von GFP-Varianten sind handelsüblich von ClonTech Laboratories, Palo Alto, CA), Chloramphenicol-Acetyltransferase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Meerrettichperoxidase.
Die Bezeichnung „Wildtyp", wenn sie in Bezug auf ein Gen vorkommt, bezieht sich auf ein Gen, das die Merkmale eines Gens aufweist, das aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert wurde. Die Bezeichnung „Wildtyp", wenn sie in Bezug auf ein Genprodukt vorkommt, bezieht sich auf ein Genprodukt, das die Merkmale eines Genprodukts aufweist, das aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert wurde. Die Bezeichnung „natürlich vorkommend", wie sie hier als auf ein Objekt angewendet benutzt wird, bezieht sich auf den Fakt, dass ein Objekt in der Natur gefunden werden kann. Eine Polypeptid- oder Polynukleotid-Sequenz zum Beispiel, die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorhanden ist, der aus einer Quelle in der Natur isoliert werden kann, und die nicht absichtlich durch den Menschen im Labor modifiziert wurde, ist natürlich vorkommend. Ein Wildtyp-Gen ist das am häufigsten in einer Population beobachtete Gen und wird daher willkürlich als „Normal-" oder „Wildtyp-"Form des Gens bezeichnet. Im Gegensatz dazu bezieht sich die Bezeichnung „modifiziert" oder „Mutant", wenn sie in Bezug auf ein Gen bzw. ein Genprodukt auftritt, auf ein Gen bzw. Genprodukt, das Modifikationen in der Sequenz und/oder den funktionalen Eigenschaften (d. h. veränderte Merkmale) im Vergleich zu dem Wildtyp-Gen bzw. -Genprodukt aufweist. Es wird erwähnt, dass natürlich vorkommende Mutanten isoliert werden können; diese werden dadurch identifiziert, dass sie veränderte Merkmale im Vergleich zu dem Wildtyp-Gen oder -Genprodukt aufweisen.
Die Bezeichnung „Antisense" bezieht sich auf eine Desoxyribonukleotid-Sequenz, deren Sequenz von Desoxyribonukleotid-Resten sich in entgegengesetzter 5' zu 3'-Orientierung im Verhältnis zu der Sequenz von Desoxyribonukleotid-Resten in einem Sense-Strang eines DNA-Doppelstrangs befindet. Ein „Sense-Strang" eines DNA-Doppelstrangs bezieht sich auf einen Strang in einem DNA-Doppelstrang, der durch eine Zelle in ihrem natürlichen Zustand in eine „Sense-mRNA" transkribiert wird. Somit ist eine „Antisense"-Sequenz eine Sequenz mit der gleichen Sequenz wie der nicht-kodierenden Strang in einem DNA-Doppelstrang. Die Bezeichnung „Antisense-RNA" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das komplementär zu dem/der gesamten Ziel-Primärtranskript oder -mRNA oder Teilen davon ist und die Expression eines Zielgens abblockt, indem der Ablauf, der Transport und/oder die Translation seines Primärtranskripts oder seiner mRNA gestört wird. Die Komplementarität einer Antisense-RNA kann mit jedem Teil des spezifischen Gentranskripts erfolgen, d. h. an der 5'-nicht-kodierenden Sequenz, der 3'-nicht-kodierenden Sequenz, den Introns oder der kodierenden Sequenz. Außerdem kann Antisense-RNA, wie sie hier verwendet wird, Bereiche von Ribozym-Sequenzen enthalten, die die Wirksamkeit der Antisense-RNA erhöht, um die Genexpression abzublocken. „Ribozym" bezieht sich auf eine katalytische RNA und beinhaltet Sequenz-spezifische Endoribonukleasen. „Antisense-Hemmung" bezieht sich auf die Produktion von Antisense-RNA-Transkripten, die in der Lage sind, die Expression des Zielproteins zu verhindern.
Die Bezeichnung „Überexpression" bezieht sich auf die Produktion eines Genprodukts in transgenen Organismen, die die Produktionsniveaus in normalen oder nichttransformierten Organismen übersteigt. Die Bezeichnung „Co-suppression" bezieht sich auf die Expression eines Fremd-Gens, das eine wesentliche Homologie zu einem endogenen Gen aufweist, das in der Unterdrückung der Expression sowohl des Fremd-Gens als auch des endogenen Gens resultiert. Die Bezeichnung „veränderte Niveaus", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf die Produktion von Genprodukt(en) in transgenen Organismen in Mengen oder Proportionen, die sich von denen von normalen oder nicht-transformierten Organismen unterscheiden.
Die Bezeichnungen „Überexpression" und „überexprimierend" und grammatische Entsprechungen werden in Bezug auf mRNA-Levels verwendet, um ein Expressionsniveau anzugeben, das annähernd 3fach höher ist als das Niveau, das normalerweise in einem vorgegebenen Gewebe in einem Kontroll- oder Nicht-Transgen-Tier beobachtet wird. Die mRNA-Level werden unter Verwendung einer beliebigen Methode aus der Vielzahl von Methoden gemessen, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, der Northern Blot-Analyse (siehe Beispiel 10 für ein Protokoll zur Durchführung der Northern Blot-Analyse). Geeignete Kontrollen sind in dem Northern Blot enthalten, um auf Unterschiede in der Menge an RNA, die aus jedem analysierten Gewebe geladen wurde, zu untersuchen (z. B. die Menge von 28S rRNA, einem reichlich vorhandenen RNA-Transkript, das im Wesentlichen in der gleichen Menge in allen Geweben vorkommt, die in jeder Probe vorhanden ist, kann als ein Mittel zur Normalisierung oder Standardisierung des RAD50 mRNA-spezifischen Signals verwendet werden, das auf Northern Blots beobachtet wird).
Die Bezeichnungen „Southern Blot-Analyse" und „Southern Blot" und „Southern" beziehen sich auf die Analyse von DNA auf Agarose- oder Acrylamid-Gels, bei der DNA gemäß ihrer Größe separiert oder fragmentiert wird, gefolgt von dem Transfer der DNA aus dem Gel zu einem festen Träger wie Nitrozellulose oder eine Nylonmembran. Die immobilisierte DNA wird dann einer gekennzeichneten Sonde ausgesetzt, um die DNA-Arten nachzuweisen, die zu der verwendeten Sonde komplementär sind. Die DNA kann vor der Elektrophorese mit Restriktionsenzymen aufgespaltet werden. In Anlehnung an die Elektrophorese kann die DNA vor oder während dem Transfer auf einen festen Träger teilweise depuriniert und denaturiert werden. Southern Blots sind ein Standard-Hilfsmittel der Molekularbiologen (J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, S. 9.31–9.58).
Die Bezeichnungen „Northern Blot-Analyse" und „Northern Blot" und „Northern", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf die Analyse von RNA durch Elektrophorese von RNA auf Agarose-Gels, um die RNA gemäß ihrer Größe zu fraktionieren, gefolgt von dem Transfer der RNA aus dem Gel zu einem festen Träger wie Nitrozellulose oder eine Nylonmembran. Die immobilisierte RNA wird dann mit einer gekennzeichneten Sonde getestet, um die RNA-Arten nachzuweisen, die zu der verwendeten Sonde komplementär sind. Northern Blots sind ein Standard-Hilfsmittel von Molekularbiologen (J. Sambrook, et al. (1989) supra, S. 7.39–7.52).
Die Bezeichnungen „Western Blot-Analyse" und „Western Blot" und „Western" beziehen sich auf die Analyse von Protein(en) (oder Polypeptiden), die auf einem Träger wie Nitrozellulose oder einer Membran immobilisiert sind. Zuerst wird ein Gemisch, das mindestens ein Protein umfasst, auf einem Acrylamid-Gel separiert, und dann werden die separierten Proteine aus dem Gel zu einem festen Träger wie Nitrozellulose oder eine Nylonmembran transferiert. Die immobilisierten Proteine werden mindestens einem Antikörper mit einer Reaktionsfähigkeit gegenüber mindestens einem relevanten Antigen ausgesetzt. Die gebundenen Antikörper können durch mehrere Verfahren nachgewiesen werden, einschließlich der Verwendung von radioaktiv gekennzeichneten Antikörpern.
Die Bezeichnung „antigene Determinante", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf den Anteil eines Antigens, der mit einem bestimmten Antikörper einen Kontakt herstellt (d. h. ein Epitop). Wenn ein Protein oder Fragment eines Proteins dazu verwendet wird, ein Wirtstier zu immunisieren, können zahlreiche Bereiche des Proteins die Produktion von Antikörpern anregen, die sich gezielt an einen vorgegebenen Bereich oder eine dreidimensionale Struktur auf dem Protein binden; diese Bereiche oder Strukturen werden als antigene Determinanten bezeichnet. Eine antigene Determinante kann mit dem intakten Antigen (d. h. dem „Immunogen", das verwendet wird, um die Immunantwort hervorzurufen) um die Bindung an einen Antikörper konkurrieren.
Die Bezeichnung „isoliert", wenn sie in Bezug auf eine Nukleinsäure verwendet wird, wie in „ein isoliertes Oligonukleotid", bezieht sich auf eine Nukleinsäure-Sequenz, die aus mindestens einer kontaminierenden Nukleinsäure identifiziert und separiert wird, mit der sie in ihrer natürlichen Quelle üblicherweise verbunden ist. Isolierte Nukleinsäure ist in einer Form oder Umgebung vorhanden, die sich von der Form oder Umgebung, in der sie in der Natur vorkommt, unterscheidet. Im Gegensatz dazu kommen nicht-isolierte Nukleinsäuren wie DNA und RNA in dem Zustand vor, in dem sie in der Natur existieren. Eine vorgegebene DNA-Sequenz (z. B. ein Gen) kommt zum Beispiel auf dem Chromosom der Wirtszelle in der näheren Umgebung von benachbarten Genen vor; RNA-Sequenzen wie eine spezifische mRNA-Sequenz, die ein spezifisches Protein kodiert, kommen in der Zelle als ein Gemisch mit zahlreichen anderen mRNAs vor, die eine Vielzahl von Proteinen kodieren. Isolierte Nukleinsäure, die ein bestimmtes Protein kodiert, umfasst jedoch als Beispiel solche Nukleinsäure in Zellen, die üblicherweise das Protein exprimieren, wobei die Nukleinsäure sich an einer chromosomalen Stelle befindet, die sich von der Stelle von natürlichen Zellen unterscheidet, oder anderweitig durch eine unterschiedliche Nukleinsäure-Sequenz flankiert ist als der, die in der Natur vorkommt. Die/das isolierte Nukleinsäure oder Oligonukleotid kann in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form auftreten. Wenn eine/ein isolierte/s Nukleinsäure oder Oligonukleotid dazu verwendet werden soll, ein Protein zu exprimieren, wird das Oligonukleotid mindestens den Sense- oder Kodierungs-Strang enthalten (d. h. das Oligonukleotid kann einzelsträngig sein), kann aber sowohl die Sense- als auch die Antisense-Stränge enthalten (d. h. das Oligonukleotid kann doppelsträngig sein).
Die Bezeichnung „gereinigt" bezieht sich auf Moleküle, entweder Nuklein- oder Aminosäure-Sequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt, isoliert oder separiert werden. Eine „isolierte Nukleinsäure-Sequenz" ist daher eine gereinigte Nukleinsäure-Sequenz. „Im Wesentlichen gereinigte" Moleküle sind mindestens 60% frei, vorzugsweise mindestens 75% frei und noch besser mindestens 90% frei von anderen Komponenten, mit denen sie natürlich verbunden sind. Die Bezeichnung „gereinigt" oder „reinigen", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auch auf die Entfernung von Kontaminanten aus einer Probe. Die Entfernung von kontaminierenden Proteinen führt zu einer Erhöhung des prozentualen Anteils an relevantem Polypeptid in der Probe. In einem anderen Beispiel werden rekombinante Polypeptide in Wirtszellen von Pflanzen, Bakterien, Hefe oder Säugern exprimiert, und die Polypeptide werden durch die Entfernung der Wirtszellproteine gereinigt; der prozentuale Anteil an rekombinanten Polypeptiden wird dabei in der Probe erhöht.
Die Bezeichnung „Probe" wird in ihrem weitesten Sinne verwendet. In einer Hinsicht kann sie sich auf eine/ein Pflanzenzelle oder -gewebe beziehen. In einer anderen Hinsicht soll sie ein Muster oder eine Kultur enthalten, das/die aus einer beliebigen Quelle gewonnen wurde, sowie Bio- und Umweltproben. Bioproben können aus Pflanzen oder Tieren (einschließlich Menschen) gewonnen werden und umfassen Flüssigkeiten, Feststoffe, Gewebe und Gase. Umweltproben umfassen Umweltmaterial wie Oberflächensubstanzen, Erde, Wasser und industrielle Proben. Diese Beispiele sollen nicht als die Probenarten einschränkend verstanden werden, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind. Die Bezeichnung „Probe" wird in ihrem weitesten Sinne verwendet. In einer Hinsicht kann sie sich auf ein biopolymerisches Material beziehen. In einer anderen Hinsicht soll sie ein Muster oder eine Kultur enthalten, das/die aus einer beliebigen Quelle gewonnen wurde, sowie Bio- und Umweltproben. Bioproben können aus Tieren (einschließlich Menschen) gewonnen werden und umfassen Flüssigkeiten, Feststoffe, Gewebe und Gase. Bioproben umfassen Blutprodukte wie Plasma, Serum und Ähnliches. Umweltproben umfassen Umweltmaterial wie Oberflächenmaterial, Erde, Wasser, Kristalle und industrielle Proben. Diese Beispiele sollen nicht als die Probenarten einschränkend verstanden werden, die bei der vorliegenden Erfindung anwendbar sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren der Zelltransfektion und insbesondere zur Applikation von Zellen auf Nukleinsäuren bereit, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind und dann die Zellen transfizieren. In einem Aspekt umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Nukleinsäuren, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind; in einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung immobilisierende Nukleinsäuren auf einer Oberfläche. Die Nukleinsäuren sind in einem Transfektionskomplex immobilisiert, der die Nukleinsäure und einen ersten und zweiten Komplexbildner umfasst, wobei dieser erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, und dieser zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst. Vorzugsweise umfassen die Komplexbildner Liganden für einen Zellrezeptor, der durch die Zelle endozytosiert wird, und DNA-bindende Moleküle; noch mehr bevorzugt wird es, dass der Transfektionskomplex mindestens zwei Komplexbildner umfasst, die ein Ligand für einen Zellrezeptor, der durch die Zelle endozytosiert wird, und ein DNA-bindendes Molekül sind. Die Komplexbildner können weiterhin membranpermeable Moleküle umfassen, die den Durchgang von DNA-Komplexen durch Zellmembranen erleichtern. Zusätzliche Agentien, die optional in dem Transfektionskomplex vorkommen, umfassen Targeting-Moleküle, die den Komplex oder einen Teil des Komplexes, der die Nukleinsäure enthält, zu einem geeigneten Zellkompartiment leiten, wo die Nukleinsäure exprimiert werden kann, Transkriptionsmoleküle, die die Transkription der DNA verbessern, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus, die Moleküle sind, die den Nukleinsäureabbau hemmen, und Modulatoren von Zellgesundheit und -integrität, die Moleküle sind, die die Adhäsion, das Wachstum, die Teilung und/oder Differenzierung der Zellen modulieren und vorzugsweise verbessern oder fördern. Daher liefert die Erfindung in anderen Ausführungsformen Transfektionskomplexe und Verfahren zur Bildung von Transfektionskomplexen. In noch anderen Ausführungsformen werden Nukleinsäuren in einem Array immobilisiert; vorzugsweise ist das Array ein Mikroarray. In einigen Ausführungsformen ist das Array ein geordnetes Array; in anderen Ausführungsformen ist das Array ein Zufallsarray. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin die Expression der Nukleinsäuren in den transfizierten Zellen. In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin das Nachweisen der Expression der Nukleinsäuren in den transfizierten Zellen. Die Erfindung in ihren verschiedenen Aspekten wird als ein Oberflächentransfektions- und Expressionsverfahren (oder „STEP") bezeichnet. Zusätzliche Aspekte und Details sind wie folgt; in der folgenden Beschreibung wird das Wort „DNA", wenn es verwendet wird, als ein Beispiel von Nukleinsäuren benutzt, die in dem Verfahren, der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und soll nicht einschränkend sein.
Das STEP-Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt eine Verbesserung gegenüber anderen Formen der Transfektion dar. In STEP werden Nukleinsäuren zu Komplexen geformt, und die Komplexe werden auf die Oberfläche appliziert und auf ihr immobilisiert, auf der Zellen ausplattiert sind oder der Zellen ausgesetzt sind. Die Zellen stehen somit mit Nukleinsäure in einem immobilisierten Zustand in Kontakt. Dies steht im Gegensatz zu anderen Verfahren der Transfektion, bei denen Nukleinsäuren auf ein Medium appliziert werden, in dem Zellen gezogen werden, oder frei in dem Medium sind, in dem Zellen gezogen werden. In diesen anderen Verfahren stehen die Zellen in Kontakt mit Nukleinsäure, die frei in Lösung ist. STEP ermöglicht somit die Transfektion von Zellen an der gleichen Stelle, an der Nukleinsäure immobilisiert ist. Da die Nukleinsäuren räumlich begrenzt sind, ist es mit STEP möglich, unabhängige Transfektionen von so vielen verschiedenen Nukleinsäuren, wie auf einer einzelnen Oberfläche immobilisiert werden können, zu erreichen. Da die Nukleinsäuren räumlich begrenzt sind, ist es mit STEP möglich, Teile oder alles jedes bestimmten Arrays von immobilisierter Nukleinsäure so oft wie gewünscht zu replizieren.
Somit ähnelt STEP zum Beispiel in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung gebräuchlichen Anwendungen von DNA-Mikroarrays darin, dass mit STEP unter Verwendung der gleichen Robotervorrichtungen, wie sie gegenwärtig zur Erzeugung von DNA-Mikroarrays verwendet werden, DNA auf eine Oberfläche (wie einen Glas-Objektträger) appliziert werden kann. Des Weiteren können für viele STEP-Applikationen die gleichen Fluoreszenzscanner für Objektträger verwendet werden, um experimentelle Ergeb nisse zu quantifizieren. Hier enden jedoch die Ähnlichkeiten. Die DNA, die auf die Oberfläche wie einen Glas-Objektträger appliziert wird, wird nicht in vitro zur Hybridisierung verwendet, wie im Fall von gebräuchlichen Anwendungen von DNA-Mikroarrays. Stattdessen wird in STEP die DNA, die auf eine Oberfläche appliziert und auf ihr immobilisiert wird, dazu verwendet, lebende Zellen zu transfizieren, um die Expression oder Funktion von Proteinen innerhalb der Zellen zu verändern. Es ist die eigentliche Expression oder veränderte Funktion der Proteine innerhalb der Zelle, die nachgewiesen wird. Des Weiteren wird die DNA als ein Transfektionskomplex immobilisiert, der sowohl Nukleinsäure als auch mindestens einen Komplexbildner umfasst; solche Komplexbildner erleichtern normalerweise die DNA-Transfektion und -Expression. In einigen bevorzugten Ausführungsformen umfasst mindestens ein Komplexbildner Liganden für einen Zellrezeptor, der durch die Zelle endozytosiert ist; in anderen bevorzugten Ausführungsformen umfasst mindestens ein weiterer Komplexbildner DNA-bindende Moleküle; vorzugsweise umfasst der Transfektionskomplex sowohl Liganden für Zellrezeptoren als auch DNA-bindende Moleküle.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, mehr als 10.000 cDNAs auf einem einzelnen Mikroskop-Objektträger (solch ein Objektträger misst normalerweise aber nicht notwendigerweise 25 mm × 75 mm) funktionell zu untersuchen. Es bietet mehrere Vorteile, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, dem der Wirtschaftlichkeit durch Massenproduktion, dass es für viele Applikationen eine kontinuierliche Überwachung der Funktion in lebenden Zellen ermöglicht, dass es einfach und vollständig automatisiert wird, und dass die Replizierung einfach durchgeführt wird.
Obwohl STEP sehr einfach ist, glaubt man, dass die zellulären Prozesse von STEP mehrere Aspekte umfassen. Obwohl es nicht notwendig ist, den Mechanismus zu ver stehen, um die vorliegende Erfindung zu verwenden, und es nicht beabsichtigt wird, dass die Erfindung derart eingeschränkt wird, wird eine Reihe von Hypothesen dargelegt, um die beobachteten Ergebnisse zu erklären. Diese Hypothesen werden als Vorstellungen oder Gedanken präsentiert. Somit glaubt man, dass der erste Aspekt in STEP die zelluläre Adhäsion zu der Oberfläche ist, auf der die Nukleinsäuren immobilisiert werden. Einige kationischen Komplexbildner unterstützen die sofortige Anlagerung von Zellen an die immobilisierte Nukleinsäure in einem Transfektionskomplex, während andere die Zellen tatsächlich abstoßen. DNA allein, ohne jeglichen Komplexbildner, stößt die Zellen ab, wie es Komplexe mit niedrigen Molverhältnissen von Komplexbildner zu DNA tun. Es wird angenommen, dass der zweite Aspekt das Überleben der Zelle ist. Einige Komplexbildner scheinen zytotoxische Wirkungen aufzuweisen, sogar wenn sich die Zellen sofort anlagern können. Diese Toxizität trifft besonders auf bestimmte membranpermeable Moleküle zu, wie die lipophilen Transfektionsreagenzen wie Fugene und Lipofectamine in ihrer reinen Form. Diese beiden bestimmten Reagenzen sind gebräuchlich in Lösung für herkömmliche Transfektionsprozeduren und sind in Konzentrationen, die unter diesen Bedingungen verwendet werden, nicht als toxisch gemeldet. Wenn sie jedoch in STEP benutzt werden, sind diese Reagenzen toxisch, wenn sie in hohen Konzentrationen verwendet und vor dem Applizieren der Zellen getrocknet werden; sie können jedoch in geringeren Konzentrationen verwendet werden. Man glaubt, dass der dritte Aspekt die eigentliche Transfektion der DNA ist; die Effizienzen der Transfektion scheinen mit dem Zelltyp und dem kationischen Komplexbildner zu variieren. Es wird angenommen, dass der vierte Aspekt der Zerfall des Transfektionskomplexes ist, der teilweise Zell-vermittelt sein kann. Der Zerfall außerhalb einer adhärenten transfizierten Zelle führt zu der Erzeugung von falschen positiven Zellen außerhalb der unmittelbaren Umgebung des Bereichs, wo die immobilisierten Nukleinsäuren (Transfektionskomplexe) hinzuge fügt wurden. Viele Komplexe, wie zum Beispiel solche, die mit Histonen gebildet werden, sind für 24–48 Stunden stabil, und einige sind mehr als 96 Stunden stabil. Man glaubt, dass die Optimierung von STEP für verschiedene Zellen und Nukleinsäuren die Optimierung von jedem dieser hypothetischen Schritte durch Änderungen in der Beschaffenheit der Komplexbildner und der Nukleinsäuren sowie in den Proportionen und Verhältnissen dieser Komponenten in dem Transfektionskomplex erfordert. Richtlinien für solch eine Optimierung werden nachfolgend bereitgestellt.
Während der Entdeckung und Entwicklung von STEP wurden anfänglich einundzwanzig verschiedene Experimente durchgeführt, um mit der Charakterisierung der Parameter, die für STEP wichtig zu sein schienen, zu beginnen. Vierzehn verschiedene Zelllinien, fünf verschiedene Reporterplasmide und zweiundzwanzig verschiedene kationische Komplexbildner wurden verwendet. Die große Mehrheit der Experimente wurde durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert, obwohl Luciferase-Messungen der Transfektionseffizienz in einigen Fällen vorgenommen wurden. Parameter, die anfänglich die Transfektionseffizienz zu beeinflussen schienen, umfassten die Art und Weise, in der die DNA präpariert wurde, die DNA-bindenden Moleküle wie kationische Proteine, die zur Präparation des Transfektionskomplexes verwendet wurden, die verwendete Zelllinie, die Dauer der Aussetzung der Zellen zu den Transfektionskomplexen, das Substrat, auf dem die Zellen ausplattiert sind, das auch die Oberfläche ist, auf der die DNA immobilisiert ist (Glas, Plastik, Polylysinbeschichtetes Glas oder Plastik usw.) und die Dichte der Zellen, wenn sie ausplattiert werden.
Zwei wichtige Variablen, die durch das routinemäßige Experimentieren optimiert werden können, sind die zu transfizierende Zelllinie und das DNA-bindende Molekül (wie kationische DNA-bindende Proteine). Eine hohe Transfektionseffizienz wurde anfänglich mit einem Ex pressionsvektor beobachtet, der grün fluoreszierendes Protein (EGFP-C1, Clontech) unter Verwendung von COS-1-U3G1-Zellen der zweiten Generation kodiert. Diese Zellen wurden durch STEP-Transfektion von parentalen COS-1-U3-Zellen mit pNEW-NEO erzeugt, einem Plasmid, das das Neomycin-Phosphotransferase-Gen kodiert, das Resistenz gegenüber G-418 verleiht. Die nachfolgende Selektion mit G-418 brachte drei verschiedene Zelllinien hervor, von denen COS-1-U3G1-Zellen die beste Transfektionseffizienz aufwiesen, die annähernd 10fach höher lag als bei den parentalen COS-1-U3-Zellen. Es wurde auch herausgefunden, dass die Quelle der Zelllinie wichtig ist; mehrere unabhängige Linien von COS-1-Zellen, die aus anderen Quellen gewonnen wurden, haben nicht mit hoher Effizienz transfiziert.
Komplexbildner sind notwendig, um die Nukleinsäuren zu immobilisieren; DNA zum Beispiel, die allein auf die Oberfläche appliziert wurde, schien sich von der Oberfläche abzutrennen, was zu sehr geringen Transfektionseffizienzen führte. Wenn kationische Proteine allein einen Komplex mit Nukleinsäuren bildeten, schienen Histone der beste Komplexbildner zu sein, was zu einer annähernd 5fachen Erhöhung der Transfektionseffizienzen im Vergleich zu ursprünglich verwendetem Poly-L-Lysin (70–150 kd) führte. Unter Verwendung von COS-1-U3G1-Zellen und Histonen wurde anfänglich eine 20–30%ige Transfektionseffizienz erreicht, wobei eine 100%ige Effizienz anzeigt, dass jeder „Spot" von applizierter DNA mindestens eine mit ihr verbundene positive Zelle aufweist. Diese geringen Transfektionseffizienzen deuteten jedoch an, dass sich die meiste DNA in den Histon:DNA-Komplexen abtrennte, was zu geringen Transfektionseffizienzen führte. Erhöhte Transfektionseffizienzen wurden durch den Einschluss eines Liganden, der sich an einen Zellrezeptor bindet, der endozytosiert wird, in den Transfektionskomplex erreicht; vorzugsweise wird der Ligand mit dem kationischen Protein konjugiert. Wenn zum Beispiel 293-HEK-Zellen verwendet wurden, führte Polylysin, das mit Transferrin verknüpft wurde, zu hohen Transfektionseffizienzen.
Weitere Erhöhungen der Transfektionseffizienzen wurden mit dem Einschluss von mindestens einem kationischen Lipid beobachtet. Die Optimierung der Parameter führt dazu, dass in jedem Nukleinsäure-„Spot" mehrere positive Zellen mit ihr verbunden sind.
Immobilisierte Nukleinsäuren
In der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuren auf eine Oberfläche als Transfektionskomplexe appliziert; danach wird die Nukleinsäure innerhalb des Komplexes auf der Oberfläche immobilisiert. Transfektionskomplexe werden durch das Hinzufügen von ersten und zweiten Komplexbildnern zu der Nukleinsäure gebildet, wobei dieser erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, und dieser zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst; vorzugsweise umfassen die Komplexbildner Liganden für einen Rezeptor, der durch die zu transfizierende Zelle endozytosiert wird, und DNA-bindende Moleküle wie kationische Proteine. Zusätzliche Komplexbildner sind, jedoch nicht darauf beschränkt, membranpermeable Moleküle wie kationische Lipide. Der Transfektionskomplex kann zusätzliche Agentien umfassen, die einen beliebigen aus der Anzahl der zusätzlichen Prozesse modulieren oder verbessern, die die Expression der Nukleinsäure beeinflussen; solche Prozesse umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt, den Transfer der Nukleinsäure zu der geeigneten zellulären Stelle, an der ihre Wirkung ausgeübt werden soll, die Hemmung des Nukleinsäureabbaus, Modulatoren der Transkription oder Translation und Modulatoren von Zellwachstum und -integrität. Die Nukleinsäuren innerhalb des Transfektionskomplexes werden durch Anlagerung an die Oberfläche, auf die sie appliziert werden, immobilisiert.
Obwohl es nicht notwendig ist, den Mechanismus zu verstehen, um die vorliegende Erfindung zu verwenden, und es nicht beabsichtigt ist, dass die vorliegende Erfindung derart eingeschränkt wird, ist es von Nutzen, die Nukleinsäure als ein „Gerüst" zu betrachten, zu dem die verschiedenen Komplexbildner hinzugefügt werden. Wenn sie vorhanden sind, lagern sich DNA-bindende Moleküle wie kationische Proteine des Komplexes an die Nukleinsäuren an, interagieren im Allgemeinen aber nicht mit den Liganden. Die Liganden sind deshalb auf eine bestimmte Art an die DNA allein oder an die DNA-bindenden Moleküle, wenn sie vorhanden sind, gebunden; vorzugsweise sind die Liganden kovalent an DNA-bindende Moleküle gebunden, die vorzugsweise kationische Proteine sind. Die Liganden binden sich auch vorzugsweise an Rezeptoren auf der Zellmembran, die endozytosiert werden, um die Endozytose der Nukleinsäuren zu erleichtern. Wenn sie vorhanden sind, lagern oder binden sich kationische Lipide an die Nukleinsäuren (an) und erleichtern auch den Übergang der Nukleinsäure in die Zellen. Letztendlich lagern sich die Zellen über den Liganden an die Nukleinsäuren des Transfektionskomplexes sowie an die Oberfläche, auf der die Nukleinsäuren immobilisiert sind, an. Im Allgemeinen ist die Oberfläche, auf der Nukleinsäuren immobilisiert sind, beschichtet. Man glaubt, dass sich die Zellen an die Oberfläche, mit oder ohne vorhandene Beschichtung, mit einer geringeren Affinität anlagern, als sie sich an den Liganden des Transfektionskomplexes anlagern.
Man glaubt ebenso, dass das Vorhandensein eines Liganden für einen Rezeptor zu einem aktiven Transport der Nukleinsäure in die Wirtszelle führt. Mit „aktiver Transport" im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Prozess gemeint, durch den ein Molekül durch einen beliebigen Mechanismus von außerhalb einer Zelle ins Innere der Zelle transportiert wird, außer durch Liposomentransport, erleichterte Diffusion oder passive Diffusion. Der aktive Transport beinhaltet Endozytose, besonders Rezeptor-vermittelte Endozytose. Agentien, die den aktiven Transport von Nukleinsäuremolekülen von außerhalb ins Innere der Zellen fördern, um dem Transfektionsprozess gemäß der vorliegenden Erfindung zu unterstützen, umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt, Komplexbildner, die Liganden für Rezeptoren wie Proteine, Kohlenhydrate, Hormone, kleine Moleküle und Arzneistoffe umfassen, DNA-bindende Moleküle und membranpermeable Moleküle.
A. Nukleinsäuren
Nukleinsäuren, die in STEP verwendet werden können, sind beliebige Sequenzen, für die die Transfektion in eine lebende Zelle erwünscht ist. Solche Nukleinsäuren sind, jedoch nicht darauf beschränkt, ESTs, PCR-Produkte, genomische DNA, cDNA, RNA, Oligonukleotide und Antisense-Konstrukte; solche Nukleinsäuren können in Expressionsvektoren vorkommen. Die Nukleinsäuren umfassen isolierte natürlich vorkommende sowie synthetische Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, die durch rekombinante Technologie hergestellt wurden.
Besonders nützliche Nukleinsäuren in der vorliegenden Erfindung umfassen Gene; solche Gene umfassen alles, dessen Expression entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Beispielhafte Gene sind Transkriptionsfaktoren, Zytoskelett-Proteine, Hormone, Onkogene, metabolische Enzyme, Ionenkanäle und Reportergene. Ein Reportergen kann jedes fluoreszierende Protein, jedes Enzym, für das der immunozytochemische Nachweis möglich ist (β-Galactosidase, β-Lactamase usw.), oder jedes Protein oder Epitop-markierte Protein sein, für das spezifische Antikörper verfügbar sind. Genprodukte können direkt, wie durch die Produkte eines Enzyms oder durch Antikörperbindung, oder indirekt nachgewiesen werden, wie durch gekoppelte Enzymassays oder durch Wirkungen, die die Zellfunktion verändern. Eine veränderte Zellfunktion, die nachgewiesen werden kann, umfasst Veränderungen in der Zellpolarität, dem Zell-pH-Wert, der Zellmorphologie oder der Fähigkeit einer Zelle, bestimmte Verbindungen zu binden. Der Nachweis erfolgt meist normalerweise durch Fluoreszenz oder Lumineszenz.
In verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehr als eine Art von Nukleinsäure in einem einzelnen Transfektionskomplex vorhanden sein. „Art der Nukleinsäure" bezieht sich auf ein Merkmal oder eine Eigenschaft einer Nukleinsäure, das/die sie von einer anderen Nukleinsäure unterscheidet, wie zum Beispiel ein Unterschied in der Sequenz oder in der physikalischen Form, was in verschiedenen Expressionsvektoren oder bei dem Vorhandensein von DNA und RNA oder bei dem Vorhandensein von linearer und superhelikaler DNA oder bei dem Vorhandensein von kodierenden Bereichen, die verschiedene Proteine kodieren, oder bei dem Vorhandensein von verschiedenen Kontrollelementen oder Kontrollelementen, die untereinander verschieden sind, auftritt. Dies ermöglicht kombinatorische Analysen von Sets von Nukleinsäuresammlungen sowie Analysen mit zugehörigen Prozessen wie Transaktivatoren der Genexpression oder Schritte eines metabolischen Signalwegs. In einer Ausführungsform sind vier verschiedene Expressionsvektoren in einem einzelnen Transfektionskomplex vorhanden; eine beispielhafte Ausführungsform wird in Beispiel 4 beschrieben.
Die Nukleinsäuren werden im Allgemeinen, obwohl nicht notwendigerweise, für die Transfektion in hohem Maße gereinigt. Ein annehmbares Maß der Reinheit ist ein Absorbierungsverhältnis von 260 nm/280 nm von mehr als oder gleich etwa 1,6 und ein Absorbierungsverhältnis von 260 nm zu 270 nm von weniger als oder gleich etwa 1. Entweder CsCl-Reinigung oder ein Ionenaustauschchromatographie-Verfahren (Qiagen) führen im Allgemeinen zu isolierten Nukleinsäuren von ausreichender Reinheit. Einfache alkalische Lyse und Phenolextraktion von Bakterienextrakten, die Plasmide enthalten, führen im Allgemeinen zu Nukleinsäure-Präparaten von ungenügender Reinheit. In alternativen Ausführungsformen sind Nukleinsäuren Produkte von PCR-Reaktion, die aus dem Reaktionsgemisch, in dem die PCR-Produkte gebildet werden, gereinigt oder nicht gereinigt werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird superhelikale DNA verwendet, die eine hohe STEP-Transfektionseffizienz erzeugt und normalerweise durch Gleichgewichts-Dichtegradientenzentrifugation in Gegenwart von 1 mg/ml Ethidiumbromid isoliert. Die gelöste superhelikale DNA wird mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen, und durch Präzipitation mit Ethanol in Gegenwart von Natriumacetat isoliert. DNA kann auch durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von kationischen Chromatographiemedien und der Elution mit NaCl isoliert werden.
1. Expressionsvektoren
Die Nukleinsäuren können in Expressionsvektoren enthalten sein. Somit kann zum Beispiel eine Nukleinsäure-Sequenz in einem beliebigen der Vielzahl von Expressionsvektoren zum Exprimieren eines Polypeptids enthalten sein, und mehr als eine relevante Nukleinsäure kann in einem Expressionsvektor enthalten sein. Alternativ dazu, können Teile eines Gens oder einer Nukleinsäure in separaten Vektoren enthalten sein. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Vektoren, jedoch nicht darauf beschränkt, chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen (z. B. Derivate von SV40, Bakterienplasmide, Phagen-DNA, Baculoviren, Hefeplasmide, Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitet sind, und Viren-DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudorabies). Es wird erwogen, dass jeder Vektor solange verwendet werden kann, wie er replizierbar und brauchbar in den Wirtszellen ist.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Konstrukte einen Vektor, wie ein Plasmid oder Virus-Vektor, in den eine gewünschte Nukleinsäure-Sequenz eingeführt wurde, in einer Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung. Die gewünschte Nukleinsäure-Sequenz wird durch jede beliebige der Vielzahl der Prozeduren in den Vektor eingeführt. Im Allgemeinen wird die Nukleinsäure-Sequenz in eine geeignete Restriktionsendonuklease-Stelle(n) durch in der Technik bekannte Prozeduren eingeführt.
Eine große Anzahl von geeigneten Vektoren sind dem Fachmann bekannt und handelsüblich. Solche Vektoren sind, jedoch nicht darauf beschränkt, die folgenden Vektoren: pCDNA3.1, pCMV.5, pZEM3, pSI, pCMV.Neo und pTetOn. Jedes/r andere Plasmid oder Vektor kann solange verwendet werden, wie es/er replizierbar und brauchbar in den Wirtszellen ist. In einigen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die Expressionsvektoren einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Verstärker und auch beliebige notwendige Ribosom-bindende Stellen, Polyadenylierungsstellen, Spleiß-Donorstellen und -Akzeptorstellen, transkriptionale Terminierungssequenzen und 5'-flankierende nichttranskribierte Sequenzen. In anderen Ausführungsformen können DNA-Sequenzen, die von dem SV40-Spleiß abgeleitet sind, und Polyadenylierungsstellen verwendet werden, um die erforderlichen nichttranskribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure-Sequenz in dem Expressionsvektor operativ mit einer geeigneten Expressionskontroll-Sequenz(en) (Promotor) verknüpft, um die mRNA-Synthese zu steuern. Eine große Vielzahl von Promotoren kann in Abhängigkeit von dem Zelltyp, der in STEP benutzt wird, verwendet werden. Promotoren können konstitutiv, induzierbar oder transaktiviert sein. Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind, jedoch nicht darauf beschränkt, der LTR- oder SV40-Promotor, die E. coli lac oder trp, die Phagen-lambda PL- und PR-, T3- und T7-Promotoren und der Cytomegalovirus(CMV)-Immediate-Early-, Herpes-Simplex-Virus(HSV)-Thymidinkinase- und Maus-Metallothionein-I-Promotor und andere Promotoren, die bekanntermaßen die Genexpression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrolliert. Die folgenden Promotoren haben sich in STEP als besonders nützlich erwiesen: der menschliche CMV-Promotor, der Rous-Sarkom-Virus-LTR-Promotor, der SV40-late-Promotor, der menschliche Enkephalin-Promotor, der menschliche Chroriongonadotropin-Promotor, der Säuger-Tetrazyklin-induzierbare Promotor (Gossen et al, Science 268: 1766–1769, 1995) und mehrere synthetische Promotoren. Zusätzliche Promotoren sind CRE-CAT- und ENK72-Promotoren (Huggenvick et al., Mol Endocrinol 5: 921–930 (1991)).
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und selektionierbare Marker, die die Transformation der Wirtszelle zulassen (z. B. Dihydrofolatreduktase- oder Neomycin-Resistenz für eine eukaryontische Zellkultur oder Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli).
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Transkription der relevanten Nukleinsäure durch höhere Eukaryonten mittels Einführen einer Verstärker-Sequenz in den Vektor erhöht. Verstärker sind cis-wirkende Elemente von DNA normalerweise von etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Verstärker, die in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind, jedoch nicht darauf beschränkt, der SV40-Verstärker auf der late-Seite des Replikationsursprungs bp 100 bis 270, ein Cytomegalovirus-Early-Promoter-Verstärker, der Polyoma-Verstärker auf der late-Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Verstärker.
In anderen Ausführungsformen enthält der Expressionsvektor auch eine Ribosom-bindende Stelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptions-Terminator. In noch anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Vektor auch geeignete Sequenzen zur Verstärkung der Expression enthalten.
2. Polynukleotide
Jedes Polynukleotid oder Oligonukleotid kann in STEP verwendet werden; beispielhafte Olgionukleotide sind, jedoch nicht darauf beschränkt, gerade Oligonukleotide und Zucker-modifizierte Oligonukleotide, die eine erhöhte intrazelluläre Stabilität aufweisen. Polyoligonukleotide oder Oligonukleotide können auf eine Art Komplexe bilden, die ähnlich den Expressionsvektoren ist, obwohl das genaue Verhältnis von Nukleinsäuren zu Komplexbildnern für spezifische Längen von Oligonukleotiden und die chemische Form (Phosphorothioat-, Phosphat-, usw. Verknüpfungen) experimentell optimiert werden sollte.
3. RNA
RNA kann auch in einer Art, die analog zur Expressionsvektor-DNA ist, für die Verwendung mit Zellen Komplexe bilden. In einer Ausführungsform wird iRNA verwendet, um S2-Drosophila-Zellen zur iRNA-Expressionshemmung zu transfizieren (Clemens et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 97(12): 6499–6503, 2000). Beim Eintritt in eine Zelle führt iRNA zu einer Reduktion des entsprechenden Wirtszell-Proteins auf etwa null; somit könnte in dieser Ausführungsform jedes der etwa 20.000 Gene systematisch und effizient mit STEP untersucht werden. In noch anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird STEP in kombinatorischen Analysen verwendet, in denen Kombinationen von verschiedenen iRNAs verwendet werden können, um eine Einzelzelle zu transfizieren.
4. PCR-Produkte
Nukleinsäuren, die Produkte der PCR sind, können auch direkt in STEP verwendet werden. „Direkt" bedeutet, dass die Nukleinsäuren nicht gereinigt werden müssen, bevor sie verwendet werden, um einen Transfektionskomplex zu präparieren. In einigen Ausführungsformen wird das Reaktionsgemisch, in dem lineare DNA durch PCR hergestellt wird, direkt verwendet, um Transfektionskomplexe herzustellen, wie beschrieben in Beispiel 14.
B. Komplexbildner
In der vorliegenden Erfindung werden Komplexbildner verwendet, um eine Reihe von Funktionen zu erfüllen. Diese umfassen das Immobilisieren der Nukleinsäuren und das Erleichtern der DNA-Endozytose durch die Zellen; zusätzliche Funktionen sind das Targeting der DNA zu dem geeigneten Zellkompartiment, in dem die Nukleinsäure exprimiert werden kann, das Unterstützen der Expression der Nukleinsäure, das Hemmen des Nukleinsäureabbaus und das Unterstützen von Wirtszellwachstum und -integrität. Eine große Vielzahl an Komplexbildnern wurde in STEP verwendet; die folgenden allgemeinen Klassen von Verbindungen erleichtern die STEP-Transfektion.
1. Liganden für Rezeptoren
Liganden für Rezeptoren, die durch die relevanten Zellen endozytosiert werden, erleichtern die DNA-Endozytose durch Bindung an geeignete Zelloberflächen-Rezeptoren, die endozytosiert werden. Für diesen Zweck ist Transferrin besonders nützlich, obwohl andere Liganden dieser Klasse auch verwendet werden können. Andere Liganden sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Low-Density-Lipoprotein(LDL)-Partikel, die sich an LDL-Rezeptoren binden, und Virusproteine, die sich bekanntermaßen an Integrine binden. Integrine sind Transmembranproteine, die die Hauptrezeptoren für extrazelluläre Matrixproteine darstellen. Nicht einschränkende Beispiele solcher Virusproteine sind das Pentonprotein, das ein Adenovirus-Protein ist, das HIV-Protein GP120, das Protein VP1 des Rhinitis-A-Virus des Pferdes, das menschliche Adeno virus-Protein E3 und das Epstein-Barr-Virus-Protein GP350. Ein Vorteil solcher Virusproteine ist es, dass sie eine geringere Zellgenauigkeit als andere Liganden aufweisen und daher auf eine größere Vielzahl von Wirtszellen anwendbar sind.
2. DNA-bindende Moleküle
DNA-bindende Moleküle (z. B. kationische Proteine) bilden mit Nukleinsäure Komplexe, um ihre Ladung zu neutralisieren und sie in ihrer Größe kompakter zu machen. DNA-bindende Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Helix-Loop-Helix-Proteine (HLH), Zinkfingerproteine, DNA-Interkalatoren wie aromatische Moleküle, andere Nukleinsäuren, Schwermetalle wie Platin, Antibiotika wie Chromomycin A(3) und Mithramycin (MTR) sowie DNA-bindende Peptide wie das DNA-bindende Peptid mu aus dem Adenovirus. Kationische Proteine sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Polylysine, Histone, Transkriptionsfaktoren, Polyhistidine, Polyarginine, Spermine und Spermidine. Vorzugsweise sind die kationischen Proteine Polyamine; noch mehr bevorzugt werden Polylysine. Spermine und Spermidine waren nicht so wirksam mit HEK-293-Zellen; es wird angenommen, dass diese Verbindungen zu kurz sind.
3. Membranpermeable Moleküle
Die Verwendung von membranpermeablen Molekülen (z. B. kationischen Lipiden) erleichtert die STEP-Transfektion; die Art und Mengen des membranpermeablen Moleküls, das in dem Komplex vorhanden ist, sind vorzugsweise für den Zelltyp optimiert. Besonders vorteilhafte membranpermeable Moleküle sind kationische Lipide. Kationische Lipide sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Lipofectamine^TM, Lipofectin^®, Lipofectamine Plus^TM, Cellfectin^® und Lipofectase^TM (alle von Life Technologies). Normalerweise umfassen diese kationischen Lipide ein Gemisch aus ausgewählten Teilmengen von etwa 50 natürlich vorkommenden und synthetischen kationischen Lipiden, die in Verhältnissen formuliert sind, die für die Verwendung mit spezifischen Zelltypen optimiert sind. In einer Ausführungsform ist Lipofectamine^TM besonders nützlich, und in anderen Ausführungsformen sind andere ähnliche Verbindungen bei geringerer Häufigkeit wirksam, unter den Bedingungen, die beispielsweise in Beispiel 1 beschrieben sind.
4. Targeting-Moleküle
Moleküle, die den Komplex zu dem Zellkern oder zu anderen subzellulären Stellen leiten, erleichtern ebenso STEP; solche Stellen sind geeignet für die Expression oder Wirkung der transfizierenden Nukleinsäure, wie zum Beispiel der Zellkern, Mitochondrien, Plastide oder das Cytoplasma. Solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine, zum Beispiel das SV-40 T-Antigen, die Kernlokalisierungssignale (NLS) enthalten, um die Proteine zu dem Kern der Zellen zu leiten. Polylysin enthält eine ähnliche Sequenz, die in ähnlicher Weise den Komplex zu dem Zellkern leiten kann.
5. Transkriptions-/Translationsmoleküle
Moleküle, die die Transkription von DNA oder die Translation von RNA unterstützen, erleichtern auch STEP. Solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine, die als nicht-einschränkendes Beispiel Transkriptionsfaktoren, DNA-entspannende oder -entwindende Faktoren (z. B. Helikasen) und DNA-Polymerasen (z. B. TFIIA, TFIID) enthalten.
6. Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus
Moleküle, die als Nuklease-Inhibitoren wirken, erleichtern auch STEP, indem sie den Abbau der transfizierten Nukleinsäuren verhindern. Beispiele für solche Moleküle sind Proteine (z. B. DMI22) und Nichtprotein-Arzneistoffe.
7. Promotoren von Zellgesundheit und -integrität
Moleküle, die die Adhäsion, das Wachstum und/oder die Differenzierung von Zellen unterstützen, erleichtern auch STEP, indem sie die Gesundheit und Integrität von Zellen fördern, die mit STEP transfiziert wurden. Beispiele für solche Moleküle sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Proteine. Proteine, die die Adhäsion von Zellen, die in Kultur gezogen wurden, zu der Kulturoberfläche fördern, sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Polylysin, Fibronektin und Kollagen. Proteine, die das Wachstum von Zellen fördern, sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixproteine. Proteine zur Förderung der Differenzierung von Zellen sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Nervenwachstumsfaktoren, die die Differenzierung von PC-12 Phäochromozytom-Zellen von Ratten stimuliert.
Einer oder mehrere Komplexbildner, die in dem Transfektionskomplex vorhanden sind, können kovalent mit einem oder mehreren anderen Komplexbildner verknüpft sein, um die Zuordnung der gewünschten Eigenschaften der Proteine zu unterstützen. Transferrin und Polylysin können zum Beispiel derart chemisch vernetzt sein, dass die Bindung an den Transferrin-Rezeptor und die Verinnerlichung von Transferrin das Polylysin (und die damit verbundenen Nukleinsäuren) in die gleichen Endosome wie Transferrin ergänzen wird. Alternativ dazu kann die Verknüpfung der Komplexbildner durch die Expression der beiden (oder mehr) Komplexbildner als Fusionsproteine in Bakterien oder eukaryontischen Zellen durchgeführt werden.
C. Immobilisierung
Die vorliegende Erfindung liefert Methoden zur Immobilisierung von Nukleinsäure auf einer Oberfläche durch die Bildung eines Transfektionskomplexes, der die Nukleinsäure und erste und zweite Komplexbildner umfasst, wobei dieser erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, und dieser zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst, sowie zum Inkontaktbringen des Transfektionskomplexes mit der Oberfläche derart, dass die Nukleinsäure in dem Transfektionskomplex immobilisiert ist. Somit liefert die Erfindung auch Transfektionskomplexe, die die Nukleinsäure und erste und zweite Komplexbildner umfasst, wobei dieser erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, und dieser zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst, und die Erfindung liefert Oberflächen, auf denen Nukleinsäuren in solchen Transfektionskomplexen immobilisiert werden. Transfektionskomplexe werden durch das Kombinieren von Nukleinsäure mit ersten und zweiten Komplexbildnern gebildet, wobei dieser erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfasst, und dieser zweite Komplexbildner ein DNA-bindendes Molekül umfasst, das vorzugsweise einen Liganden umfasst. Zusätzliche Komplexbildner, die vorzugsweise in dem Transfektionskomplex vorhanden sind, sind DNA-bindende Moleküle und membranpermeable Moleküle; vorzugsweise sind solche Agentien kationische Proteine und kationische Lipide. Alternativ dazu umfasst ein Transfektionskomplex der vorliegenden Erfindung mindestens zwei Komplexbildner, die ein Ligand und ein DNA-bindendes Molekül sind, vorzugsweise kationische Proteine; zusätzliche Komplexbildner, die vorzugsweise in dem Transfektionskomplex vorhanden sind, sind membranpermeable Moleküle, vorzugsweise kationische Lipide. Der Ligand ist vorzugsweise an das DNA-bindende Molekül gebunden, wenn es vorhanden ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuren gemäß der folgenden Schritte immobilisiert; diese Schritte sind für die Verwendung mit Expressionsvektoren der HEK-293-Zellen optimiert. Es ist eine Frage des routinemäßigen Experimentierens, die Immobilisierung für die Verwendung mit anderen Zellen zu optimieren.
Normalerweise werden die Nukleinsäuren, gereinigt oder anderweitig, zu einer geeigneten Konzentration in einer Lösung verdünnt. Bevorzugte Konzentrationen liegen bei etwa 0,1 bis 10 mg/ml, während am meisten die Konzentration von 0,12 mg/ml bevorzugt wird. Die Lösungen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt, Puffer wie Tris und HEPES und andere Verbindungen bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 9; am meisten wird es bevorzugt, wenn die Lösung destilliertes Wasser ist.
Ein Volumen der verdünnten Nukleinsäure wird zu einer Mischungskammer hinzugefügt. Geeignete Kammern sind, jedoch nicht darauf beschränkt, Zentrifugenröhrchen (wie Polypropylen), Mikrotiterplatten (wie Polystyren) und Teströhrchen (wie Glas). Vorzugsweise ist die Kammer eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
Ein Komplex aus kationischem Protein und Ligand wird gebildet, wie in einer Ausführungsform durch Oxidation des Transferrin, was zur Bildung von Aldehyd führt, das sich dann mit dem Protein vernetzt. Es ist wichtig, den Liganden (Transferrin) vor der Bildung des Transfektionskomplexes mit dem kationischen Protein (Polylysin) kovalent zu verknüpfen; solch eine Verknüpfung wurde für Standard-Transfektionen in Lösungen gemeldet (Wagner et al, Bioconjugate Chemistry 2: 226–231, 1991). Dieser Komplex wird dann in einer geeigneten Konzentration zu den verdünnten Nukleinsäuren hinzugefügt. Bevorzugte Konzentrationen liegen bei etwa 0,1 bis 10 mg/ml, während am meisten die Konzentration von etwa 0,4 mol Polylysin als dem kationischen Protein pro Mol Transferrin mit Fe als dem Liganden bevorzugt wird. Ein geeignetes Volumen des Komplexes wird zu der Nukleinsäure hinzugefügt; das Volumen des Komplexes liegt bei etwa 0,1 bis 10 mal dem Nukleinsäurevolumen; vorzugsweise wird etwa ein gleiches Volumen des Komplexes zu den Nukleinsäuren hinzugefügt. Dieses erste Nukleinsäure-Gemisch wird vermischt und über einen geeigneten Zeitraum bei einer geeigneten Temperatur inkubiert. Der Zeitraum liegt bei etwa 30 Sekunden bis etwa 4 Stunden, aber vorzugsweise bei etwa 5 Minuten; die Temperatur liegt bei etwa 0 bis 37°C, aber vorzugsweise bei Raumtemperatur (etwa 18–22°C).
Alternativ dazu können andere Zelloberflächen-Liganden verwendet werden, um Zellen zu transfizieren, die geringe Niveaus von Transferrin-Rezeptor aufweisen, oder wenn die Transferrinspiegel in den Kulturmedien mit den STEP-Transfektionskomplexen konkurrieren. Ein nichteinschränkendes Beispiel solcher Proteine ist das Adenovirale Pentonprotein, das sich an Zelloberflächen-Integrine bindet und anstelle von Transferrin verwendet werden kann, um viele Zelltypen zu transfizieren, die weniger als optimale Transfektionseffizienzen unter Verwendung von Transferrin in den Transfektionskomplexen aufweisen. In diesen Ausführungsformen wird das Pentonprotein in Konzentrationen von etwa 0,02 mg/ml bis 1,0 mg/ml verwendet. Wenn es vorhanden ist, ist das Pentonprotein vorzugsweise mit einem DNA-bindenden Molekül verbunden oder verknüpft; vorzugsweise ist das DNA-bindende Molekül ein kationisches Protein; am meisten wird es bevorzugt, wenn das kationische Protein Polylysin oder Histon ist.
Wenn es vorhanden ist, wird dann ein membranpermeables Molekül zu dem ersten Nukleinsäure-Gemisch in einer geeigneten Konzentration hinzugefügt, wodurch ein zweites Nukleinsäure-Gemisch gebildet wird; vorzugsweise ist das membranpermeable Molekül ein kationisches Lipid. Bevorzugte Konzentrationen von kationischen Lipiden liegen bei etwa 0,2 bis 4 mg/ml, vorzugsweise liegt die Konzentration bei etwa 1 mg/ml, wenn Lipofectamine das kationische Lipid ist. Ein geeignetes Volumen des kationischen Lipids wird zu dem zweiten Gemisch hinzugefügt, wobei das Volumen des Lipids bei etwa 0,1 bis 10 Volumen des ersten Nukleinsäure-Gemischs liegt; vorzugsweise wird etwa ein gleiches Volumen zu dem Gemisch hinzugefügt. Dieses zweite Gemisch wird dann vermischt und über einen geeigneten Zeitraum bei einer geeigneten Temperatur inkubiert. Der Zeitraum liegt bei etwa 30 Sekunden bis 4 Stunden, aber vorzugsweise bei etwa 5 min; die Temperatur liegt bei etwa 0 bis 37°C, aber vorzugsweise bei Raumtemperatur (etwa 18–22°C). Dieses zweite Nukleinsäure-Gemisch umfasst Transfektionskomplexe.
Das Transfektionskomplex-Gemisch wird dann auf eine Oberfläche appliziert. Verschiedene Oberflächen-Konfigurationen werden betrachtet; in der vorliegenden Erfindung reichen Oberflächen, jedoch nicht darauf beschränkt, von flach über konkav, konvex und sphärisch bis kubisch. Die Art der Konfiguration hängt von der nachfolgenden Applikation ab. In einer Ausführungsform ist die Oberfläche ein flacher Objektträger. In einer anderen Ausführungsform ist die Oberfläche ein Kügelchen. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Oberfläche ein Würfel; in einer zugehörigen Ausführungsform werden verschiedene Transfektionskomplexe auf verschiedenen Seiten oder Flächen des Würfels immobilisiert, und in noch einer anderen zugehörigen Ausführungsform werden verschiedene Zelltypen auf verschiedenen Seiten oder Flächen eines Würfels ausplattiert. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Oberfläche eine Multiwell-Gewebekulturplatte, und der Transfektionskomplex wird auf der Oberfläche von mindestens einer der Vertiefungen immobilisiert; in einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche eine 96-Well- oder 384-Well-Gewebekulturplatte.
Verschiedene Oberflächenmaterialien werden auch betrachtet; in der vorliegenden Erfindung umfassen Materialien, jedoch nicht darauf beschränkt, Glas, Plastik (wie Polypropylen, Polystyren), Filme (wie Zelluloseacetat) und Membranen (wie Nylonblätter). Die Art des Materials hängt von der nachfolgenden Applikation ab.
Die Oberfläche ist im Allgemeinen, obwohl nicht notwendigerweise, mit einer Verbindung beschichtet, an die sich sowohl die Nukleinsäuren als auch die Zellen anlagern werden. verschiedene Beschichtungen werden betrach tet; in der vorliegenden Erfindung umfassen Beschichtungen, jedoch nicht darauf beschränkt, Polylysin, Fibronektin und Laminin. Die Art der Beschichtung hängt sowohl von den Nukleinsäuren als auch von den Zellen ab. vorzugsweise ist die Beschichtung für HEK-293-Zellen und -Expressionsvektoren Polylysin.
Das Transfektionsgemisch kann durch eine Reihe von Mitteln appliziert werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, dem direkten Pipettieren, dem Aerosolsprühen, der elektrostatischen Auftragung und der mechanischen Auftragung, wie mit festen Pins. Applikationen sind Einzelapplikationen und Mehrfachapplikationen eines einzelnen Transfektionskomplex-Gemischs auf einen einzelnen Spot. Mehrfachapplikationen scheinen mehrere Schichten des Transfektionskomplexes zu ergeben und führen zu einer erhöhten Transfektionseffizienz. Man glaubt, dass die Erhöhung der Effizienz teilweise aus der höheren Affinität der Zellen zu dem Transfektionskomplex im Vergleich zu der Affinität der Zellen zu der Oberfläche allein resultiert; bei mehreren Schichten des Transfektionskomplexes glaubt man, dass sich, da eine Schicht des Transfektionskomplexes endozytosiert wird, die Zellen an das nächsttiefere Niveau des Transfektionskomplexes binden und anfangen, die Endozytose dieses Komplexes durchzuführen. Vorzugsweise wird das Transfektionskomplex-Gemisch unter Verwendung von festen Pins und Mehrfachapplikationen (2–5 Applikationen) auf einen Objektträger appliziert. Die Menge an Nukleinsäure in einem Spot hängt von der anfänglichen Nukleinsäure-Konzentration und dem bei jeder Applikation applizierten Volumen und der Anzahl der Applikationen ab; vorzugsweise liegt die Menge an Nukleinsäure bei 2 bis 500 ng, und am meisten werden 20–150 ng bevorzugt. Die Bedingungen des Applizierens des Transfektionskomplex-Gemischs sind vorzugsweise hohe Luftfeuchtigkeit; am meisten wird eine Luftfeuchtigkeit von 70–80% bevorzugt.
Die Spots des Transfektionskomplex-Gemischs werden dann getrocknet. Bedingungen für das Trocknen variieren und umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt, das Trocknen bei Raumtemperatur (wie in einer Kammer oder in einem Gewebekultur-Abzug), in einem Vakuum, das Trocknen durch die Anwendung von Infrarotlicht und das Trocknen durch Erhitzen auf etwa 50 bis 200°C. Vorzugsweise trocknen die Spots auf einer Oberfläche wie einem Glas-Objektträger in einer 10 cm Gewebekultur-Schale in einem Gewebekultur-Abzug ohne ultraviolettes Licht.
Normalerweise wird mehr als eine Probe des Transfektionskomplex-Gemischs auf eine einzelne Oberfläche appliziert, wobei jedes Gemisch in einen Spot appliziert wird und jeder Spot nur ein Gemisch umfasst, das einfach oder mehrfach appliziert werden kann. Das Ergebnis ist ein Array aus Spots von immobilisierten Transfektionskomplexen auf der Oberfläche, wobei das Array ein Muster von Spots ist, vorzugsweise derart, dass das Muster repliziert und/oder durch einen geeigneten Detektor nachgewiesen werden kann. Obwohl jeder Spot im Allgemeinen eine einzelne Probe von immobilisierten Transfektionskomplexen umfasst, kann eine einzelne Probe von immobilisierten Transfektionskomplexen eine bis mehr als ein Art von Nukleinsäure umfassen. Außerdem können verschiedene Spots in einem Array die gleichen oder verschiedene Transfektionskomplexe umfassen; die Transfektionskomplexe können sich in dem vorhandenen Komplexbildner, der Art der vorhandenen Nukleinsäure oder beidem unterscheiden. Normalerweise unterscheiden sich verschiedene Spots in der Art der vorhandenen Nukleinsäure. Somit umfasst ein Array normalerweise Spots, von denen mindestens einige bis die meisten eine spezifische Art von Nukleinsäure pro Spot umfassen. Diese spezifischen und verschiedenen Arten von Nukleinsäuren werden dann normalerweise verschiedene Wirkungen in den Zellen aufweisen, die durch sie transfiziert werden; die Wirkungen variieren in Abhängigkeit von der Verwendung, für die STEP gedacht ist. Die Wirkungen der transfizierten Nukleinsäuren werden dann durch einen Detektor gemessen, und die Identifikation der Nukleinsäuren, die eine bestimmte Wirkung aufweisen, wird durch die Stelle der Nukleinsäure in dem Array bestimmt.
ZELLEN: TYPEN, PRÄPARATIONEN, AUSPLATTIEREN UND KULTUR
A. Zelltypen
Zellen, die auf immobilisierte Nukleinsäuren in STEP angewendet wurden, können als Wirtszellen angesehen werden. Die vorliegende Erfindung ist sowohl auf kultivierte Zellen als auch frisch aus einer Quelle (wie zum Beispiel frisch aus einem Gewebe oder Organ präpariert) erhaltene ausgerichtet. Kultivierte Zellen schließen Primärkulturen, Zelllinien und dreidimensional kultivierte Zellen ein. Die vorliegende Erfindung ist auch auf Zellen in vivo ausgerichtet.
In einigen Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine höhere eukaryontische Zelle (z. B. eine Säugerzelle). In anderen Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung ist die Wirtszelle eine niedere eukaryontische Zelle (z. B. eine Hefezelle). In noch anderen Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung kann die Wirtszelle eine prokaryontische Zelle (z. B. eine Bakterienzelle) sein. Spezifische Beispiele von den Wirtszellen schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis und verschiedene Spezies innerhalb der Genera Pseudomonas, Streptomyces, und Staphylococcus, sowie Saccharomycees cerivisiae, Schizosaccharomycees pombe, Drosophila S2 Zellen, Spodoptera Sf9 Zellen, Ovarzellen des Goldhamsters (CHO), COS-7 Zelllinien von Fibroblasten aus Affennieren, (Gluzman, Cell 23: 175 (1981)), 293T-, C127-, 3T3-, HeLa- und BHK-Zelllinien, NT-1 (Tabakkultur-Zelllinie), Wurzelzellen und kultivierte Wurzeln in Rhizosekretion (Gleba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 5973–5977 (1999)). Die Verwendung von Pflanzenzellen in STEP kann die Entfernung der Zellwände durch Techniken nötig machen „ die dem Fachmann bekannt sind.
Hohe Transfektionseffizienzen sind beobachtet worden mit HEK-293T Zellen, HEK-293 Zellen und NIH-3T3 Zellen. Andere Zelltypen wie COS-1 können auch verwendet werden.
B. Zellkultur und Kulturphasen
In der vorliegenden Erfindung werden die Zellen vor der Transfektion gemäß den Verfahren kultiviert, die dem Fachmann bekannt sind, wie zum Beispiel durch die bevorzugten Verfahren wie definiert durch die American Tissue Culture Collection oder wie beschrieben (zum Beispiel Morton, H. J., In Vitro 9: 468–469 (1974)). In einem Aspekt von der Erfindung werden die Zellen dann typischerweise behandelt, bevor sie zu den immobilisierten Transfektionskomplexen hinzugefügt werden; vorzugsweise ist die Behandlung eine Trypsinierung.
In einer Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung werden HEK-293T Zellen in Dulbecco's Modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das 10% fötales Kälberserum enthält, bei 37°C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 5% CO₂ gehalten. Zellen werden auf Plastik oder Glas vor ihrer Verwendung in der STEP-Transfektion wachsen lassen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen, werden sie passagiert durch Behandlung mit 0,25% Trypsin in 1 mM EDTA, um die Zellen von dem Wachstumssubstrat abzulösen.
Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 × g pelletiert und das Trypsinierungsmedium wird entfernt. Das Zellpellet wird in DMEM resuspendiert und die Zellen auf ungefähr das vierfache des ursprünglichen Wachstumsvolumens verdünnt, um eine Konfluenz von 20% zu ergeben. In anderen Ausführungsformen werden NIH-3T3 und COS-1 Zellen in einer ähnlichen Weise behandelt.
Die Zellen in der G2/M-Phase transfizieren mit der höchsten Effizienz, so ist in einigen Ausführungsformen die Transfektionseffizienz am höchsten mit Zellen, die synchronisiert wurden durch doppelte Thymidin-Blockade, Aphidocolin-Behandlung oder Nocodazol-Behandlung, wie beschrieben (Mortimer et al., Gene Ther 6: 401–411 (1999); Tseng et al., Biochim Biophys Acta 1445: 53–64)).
C. Zelldichte
Die Zelldichte ist ein wichtiger Faktor in der STEP-Transfektion; in Ausführungsformen, in denen Nicht-dreidimensionale Zellkulturen verwendet werden, sind anfängliche Ausplattierungsdichten von 10 bis 10⁵ Zellen/cm² bevorzugt. Je höher die Zelldichte, desto früher wird die Hauptexpression auftreten, was vermutlich auf die Kontaktinhibierung bei höheren Dichten zurückzuführen ist.
D. Transfizierte Zellen
Die Zelllinien, die kürzlich unter Verwendung von STEP transfiziert und mit den entsprechenden Selektionsagentien ausgewählt wurden, haben verstärkte Transfektionseffizienzen gezeigt (ungefähr 5- bis 10-fach). Solche Zellen sind vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden.
E. Ausplattieren
Die vorbereiteten Zellen werden zu den immobilisierten Nukleinsäuren durch dem Fachmann gut bekannte Methoden hinzugefügt. In einigen Aspekten der Erfindung, die nicht-dreidimensionale Zellkulturen und frisch erhaltene Zellen verwenden, sind die Zellen normalerweise in einem Medium in einer bestimmten Dichte vorhanden; die Menge an Medium und die Zelldichte werden für jeden Zelltyp und jede Nukleinsäure bestimmt. Vorzugsweise reicht die Menge an zugesetztem Medium von etwa 5 bis 30 ml/10 cm Gewebekulturschale; am meisten bevorzugt werden etwa 20 ml Medium hinzugefügt. Die Zellkonzen tration reicht von etwa 10³ bis 10⁸/20 ml ausplattiert, vorzugsweise werden 10⁶ Zellen per 20 ml hinzugefügt. Die Zahl der Zellen, die auf jeden Spot des immobilisierten Transfektionskomplexes aufgetragen werden, wird von der Konzentration der auf die immobilisierten Transfektionskomplexe ausplattierten Zellen, der Anzahl der Spots an immobilisierten Transfektionskomplexen und der Dichte von den Spots der immobilisierten Transfektionskomplexe, über die die Zellen ausplattiert werden, abhängen. Vorzugsweise werden etwa 1 bis 1000 Zellen pro Spot des Transfektionskomplexes ausplattiert, insbesondere werden etwa 20 bis 100 Zellen pro Spot ausplattiert. Vorzugsweise werden HEK-293 Zellen frisch trypsiniert, bevor sie zu den immobilisierten Nukleinsäure-Spots hinzugefügt werden.
Die Zellen werden für eine entsprechende Zeitdauer bei einer entsprechenden Temperatur unter entsprechenden atmosphärischen Bedingungen kultiviert. Die Temperatur und die atmosphärischen Bedingungen werden von dem Zelltyp und den Nukleinsäuren abhängen; für HEK-293 zellen ist die Inkubationstemperatur vorzugsweise 37°C bei 5% CO₂.
Die Zellen werden zu einer entsprechenden Zeit während der Kultur transfiziert; diese Zeit hängt von dem verwendeten Transfektionstyp ab. Normalerweise reicht die zeit von etwa einer Stunde bis 30 Tage, aber ist vorzugsweise etwa 24 bis 72 Stunden.
In anderen Aspekten der Erfindung, die dreidimensional kultivierte Zellen verwenden, wird die Oberfläche, an der die Nukleinsäuren immobilisiert sind auf die Zellen aufgetragen. Beide, die Oberfläche und die dreidimensionale zelluläre Struktur werden derart markiert, dass der Array der immobilisierten Nukleinsäuren mit dem Muster der nachgewiesenen Wirkungen korreliert werden kann. Die Zellen werden unter Bedingungen, die zweckmäßig für eine solche Zellkultur ist, transfiziert; vorzugsweise geschieht die Transfektion passiv.
In noch anderen Aspekten von der Erfindung wird die Oberfläche, an der die Nukleinsäuren immobilisiert sind, an einem Gewebe oder Organ oder einer anderen implantierbaren Oberfläche in vivo angewendet. Solch eine Anwendung beinhaltet, aber ist nicht beschränkt auf chirugische Implantation. In einigen Ausführungsformen, ist die Oberfläche ein Film oder eine Membran; beide, die Oberfläche und das Gewebe oder Organ werden derart markiert, dass der Array der immobilisierten Nukleinsäuren mit dem Muster der nachgewiesenen Wirkungen korreliert werden kann. Die Zellen werden unter Bedingungen transfiziert, die zweckmäßig für das spezifische Organ oder Gewebe in vivo sind; vorzugsweise geschieht die Transfektion passiv. In einer Ausführungsform ist das Gewebe ein Tumor und die nachgewiesene Wirkung ist das Wachstum der Tumorzellen nach der Transfektion mit den Nukleinsäuren.
TRANSFEKTION
A. Verfahren
In einigen Ausführungsformen werden verschiedene Verfahren verwendet, um die Transfektion von den Zellen zu verstärken. Diese Verfahren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf osmotischen Schock, Temperatur-Schock und Elektroporation und Druckbehandlung. In der Druckbehandlung werden ausplattierte Zellen in eine Kammer unter einen Kolben gestellt und erhöhtem atmosphärischen Druck ausgesetzt (zum Beispiel, wie beschrieben in Mann et al., Proc Natl Acad Sci USA 96: 6411–6 (1999)). Die Elektroporation der Zellen in situ, die nach dem Ausplattieren erfolgt, kann verwendet werden, um die Transfektionseffizienz zu erhöhen. Die Plattenelektroden für diesen Zweck sind erhältlich von BTX/Genetronics.
In Ausführungsformen, die HEK-293 Zellen verwenden, werden die Zellen vorzugsweise passiv durch die immobilisierten Nukleinsäurekomplexe transfiziert.
B. Verstärkungen
In einigen Ausführungsformen werden Verbindungen während der Transfektion eingeschlossen, um die Expression zu erhöhen. Solche Verbindungen beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf lysosomale Inhibitoren wie Chloroquin und Nuklease-Inhibitoren wie DMI22.
GENEXPRESSION: NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG
In verschiedenen Aspekten von der vorliegenden Erfindung wird die Genexpression durch eine beliebige von mehreren Verfahren zu entsprechenden Zeiten nach der Transfektion nachgewiesen. Die Zeit nach der Transfektion hängt ab von den Zellen und den Nukleinsäuren; für HEK-293 Zellen werden die Zellen für mindestens 16 Stunden ungestört nach dem Ausplattieren kultiviert, zu diesem Zeitpunkt kann die Genexpression nachgewiesen werden.
A. Fluoreszenz
Die Fluoreszenz von einer großen Zahl an Proteinen (GFP, DsRed, Aequorin) wird direkt unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie oder Mikroarray-Objektträger-Scannern, nach entsprechender Fixierung von den Objektträgern, gemessen. Die Fluoreszenzmikroskopie gestattet die kontinuierliche Überwachung von derselben Zelle über einen Zeitverlauf, um die Proteinexpression zu untersuchen, während Scanner eine schnellere und genaue Quantifizierung der Fluoreszenz gestatten, aber die Zellen müssen fixiert werden.
Die Enzymaktivitäten können auch gemessen werden unter Verwendung von chromogenen oder fluoreszenten Substraten in lebenden oder fixierten Zellen.
B. Antikörper
Antikörper (M2-Flag sowie andere) werden auch verwendet, um die Expression von STEP-transfizierten Proteinen nachzuweisen.
C. Reporter-Assays
Reporter-Assays müssen im Allgemeinen für die STEP-Transfektion optimiert werden und die optimalen Bedingungen können verschieden sein zu denen, die mehr in Standardtransfektions-Prozeduren verwendet werden. Wichtige Parameter zum Ändern sind die Menge des Reportervektors, die Zeitdauer der Reporterexpression und die proteolytische Halbwertszeit von dem verwendeten Reporterprotein.
D. Selektion
Die genetische Selektion wird verwendet, um stabil transfizierte Zellen unter Verwendung von STEP zu isolieren. Hygromycon-, G418- und Puromycin-Selektion sind alle mit hoher Effizienz verwendet worden. Die Selektion auf stabile Transformanten in HEK-293 Zellen kann etwa 48 Stunden nach dem Ausplattieren beginnen, falls gewünscht.
ANWENDUNG VON STEP
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung weist unzählige Anwendungen auf. Die folgenden sind zur Veranschaulichung angegeben und nicht beschränkend gemeint.
A. Screening der Funktion neuartiger cDNA Klone
In einem Aspekt von der vorliegenden Erfindung werden STEP-Arrays mit Tausenden von Expressionsvektoren, die neue Mitglieder von der Proteinkinase-Familie kodieren, leicht auf ihre Fähigkeit, die Expression von spezifischen Verstärkerelementen zu regulieren, unter Verwendung spezifischer Fluoreszenz-Reporterkonstrukte überprüft. In anderen Aspekten von der vorliegenden Erfindung werden neuartige Transkriptionsfaktoren in einer ähnlichen Weise gescreent. In noch anderen Aspekten von der vorliegenden Erfindung wird die Funktion von vielen unterschiedlichen Klassen von Proteinen unter Verwendung der STEP-Transfektion festgestellt. In einer Ausführungsform ist eine typische Analyse von einer kleinen Familie von Proteinkinasen und transkriptionellen Antwortelementen in Beispiel 13 beschrieben.
B. Arzneistoff-Screening
In einem Aspekt von der vorliegenden Erfindung werden STEP-Arrays aus Expressionsvektoren für Protein-Tyrosinkinasen mit verschiedenen Arzneistoff-Kandidaten behandelt und die in vivo-Aktivität von den Kinasen durch Fixieren und Anfärben der Zellen mit Antiphosphotyrosin-Antikörpern bestimmt. Da Tausende von Objektträger-„Kopien" von dem Array leicht robotertechnisch unter Verwendung von DNA-Arrayer erzeugt werden können, werden Tausende Arzneistoffe auf ihre in vivo-Inhibierung gescreent. Subsets von den Kinasen werden durch die Behandlung von den STEP-transfizierten Zellen in der Kultur mit verschiedenen Wachstumsfaktoren aktiviert.
In anderen Aspekten von der vorliegenden Erfindung sind Hunderte von unterschiedlichen Arzneistoff-Assays, die STEP-Transfektion in einer ähnlichen Weise einsetzen, vorgesehen.
In noch anderen Aspekten von der vorliegenden Erfindung wird STEP verwendet, um den Metabolismus von Arzneistoffen zu analysieren. Falls Arzneistoffe identifiziert werden, die einen Signalweg ändern, der unter Verwendung von STEP gemessen wird, dann können Expressionsvektoren für verschiedene Enzyme, für die bekannt ist, dass sie für den Arzneistoff-Metabolismus verantwortlich sind, z. B. die Cytochrom-P450 Familie, in STEP eingeschlossen werden. Falls ein bestimmtes Cytochrom-P450 für den Metabolismus des Arzneistoffes verantwortlich war, dann sollte die Co-Transfektion von dem P450-Enzym die Wirkung von dem Arzneistoff auf den STEP-Assay vermindern. Aufgrund von einem nicht-einschränkenden Beispiel, die Wirkung von Cytochrom-P450 auf den Arzneistoff PD 098059, einem potenten Inhibitor von der MAP-Kinase Kaskade, wird gemessen. Überexpression von RasV12 aktiviert den Elk-1 Reporter in STEP-transfizierten Zellen und PD 098059 inhibiert diese Aktivierung. Transfektion mit verschiedenen Mitgliedern von der Cytochrom-P450 Familie, in Kombination mit RasV12 und dem Elk-1 Reporter, kehrt die Inhibierung von dem Elk-1 Reporter durch PD 098059 um, falls das transfizierte Cytochtom-P450 in der Lage ist, das PD 098059 zu einer inaktiven Verbindung zu metabolisieren.
In weiteren Aspekten von der vorliegenden Erfindung kann STEP verwendet werden, um Liganden und Arzneistoffe zu identifizieren, die als Agonisten und Antagonisten von bekannten oder Orphan-Rezeptoren wirken.
C. Mutagenese-Studien
In einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung werden STEP-Arrays für das Screening von Zufallsmutationen von Proteinen mit ausreichend sensitiven Reporter-Assays verwendet, um die Aktivität von den mutierten Proteinen zu bestimmen. In einer Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird die Mutagenese von der autoinhibitorischen Domäne der cGMP-abhängigen Proteinkinase untersucht, da die Mutagenese von dieser Kinase zur konstitutiven Aktivierung führt, und ein Transaktivierungs-Assay, der die transkriptionelle Regulation von einem cAMP-Antwortelement – grün fluoreszierendem Protein (CRE-GFP)-Reporterkonstrukt beinhaltet, wird zur Identifizierung konstitutiv aktiver Mutanten verwendet. Auf diesem Weg werden Tausende von Mutanten auf einem einzigen Objektträger überprüft und mehrfache Wiederholungsexperimente werden leicht erzeugt. Die Sammlung von Mutanten wird verwendet, um eine inhibitorische Domäne innerhalb des Aminoterminus von cGK zu definieren. In anderen Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung werden viele unterschiedliche Typen von Proteinen, für die Einzelzell-Assays verfügbar oder erfunden sind für die funktionelle Anzeige, der Mutagenese und der Analyse in einer ähnlichen Art und Weise unterworfen.
In einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung werden STEP-Arrays verwendet, um Proteine zu identifizieren, die die DNA-Reparatur beeinflussen. In einer Ausführungsform werden Reportermoleküle erzeugt, die eine einzelne Basenfehlpaarung an oder nahe bei dem Startkodon (ATG) für das GFP-Reporterkonstrukt enthalten. Das Reportermolekül enthält die ordnungsgemäße Base (ATG) in dem kodierenden Strang von der DNA, aber eine mutierte Base (CAC im Gegensatz zu der normalen CAT) in dem nicht-kodierenden Strang. Die Reparatur von der Fehlpaarung auf dem nicht-kodierenden Strang führt zu der Transkription von mRNAs mit der ordnungsgemäßen RNA-Sequenz, um ein funktionelles GFP-Molekül zu erzeugen. Falls der DNA-Reparatur-Reporter mit einem potentiellen DNA-Reparaturenzym unter Verwendung von STEP co-transfiziert ist, dann wird die Fähigkeit von dem DNA-Reparaturenzym, die DNA-Fehlpaarung zu reparieren, durch die Zellfluoreszenz angezeigt.
D. Antisense-Screening
In einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung enthalten STEP-Arrays Tausende von Antisense-Oligonukleotiden und Antisense-Expressionsvektoren werden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Expression von individuellen Proteinen zu inhibieren. In einer Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem für diese Anwendung unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen und Antisense-Oligonukleotiden sowie Antisense-Konstrukten entwickelt worden, wie in Beispiel 12 beschrieben. In anderen Ausführungsformen von der vorliegenden Erfindung mit einer breiteren Anwendbarkeit werden Fusionsprotein-Konstrukte zwischen Zielproteinen und fluoreszierenden Reportern in dem Screeningprozess verwendet. Die Verwendbarkeit von der vorliegenden Erfindung zum Überprüfen nach und der Identifizierung von wirksamen Antisense-Werkzeugen weist dramatische und positive Auswirkungen auf die praktische Verwendung der Antisense-Technologie auf.
E. Proteininteraktionen in vivo
Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) wurde für den in vivo Nachweis von Proteininteraktionen beschrieben und ist leicht in dem DNA-Mikroarray-Format unter Verwendung von Mikroskopie nachzuweisen. Eine Anzahl von in vivo Verfahren sind berichtet worden, um unter Verwendung von FRET die Protein-Protein Assoziation von genetisch kodierten Varianten von dem grün fluoreszierenden Protein zu bestimmen (Zaccolo et al. (2000) Nat Cell Biol 2: 25–29; Pollack und Heim (1999) Trends Cell Biol 9: 57–60). In noch einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung werden Bibliotheken von Expressionsvektoren für Fusionsproteine zwischen nicht-charakterisierten Sequenzen von Interesse und einem Fluoreszenz-Donorprotein erzeugt und dann die in vivo Interaktionen nachgewiesen durch Co-Transfektion von einem Expressionsvektor mit einem entsprechenden „Köder"-Protein, verbunden mit einem Fluoreszenz-Akzeptormolekül aus solch einer Bibliothek von Fusionsproteinen.
F. Identifikation von Protein-Protein-Komplexen und post-translationalen Modifikationen
In noch einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung wird STEP verwendet für die Identifizierung von post-translationalen Modifikationen von Proteinen und zum Identifizieren von Protein-Protein-Interaktionen. In diesem Aspekt, wird eine DNA, die ein Protein kodiert, das leicht gereinigt, vorzugsweise in situ, und seine Masse gemessen werden kann, vorzugsweise auch in situ, unter Verwendung von STEP in Zellen transfiziert. In einer Ausführungsform wird STEP an einer Polylysinbeschichteten Celluloseacetat-Membran durchgeführt und mindestens eine transfizierende DNA kodiert ein Protein mit einem Hexahistidinepitop-Tag. Das exprimierte Protein wird dann gereinigt durch einen in situ-Transfer auf eine Nickel/NTA-Affinitätsmembran; nur das mit dem Hexahistidin-Tag versehene Protein (und daran gebundene Proteine) binden an die Nickel/NTA-Affinitätsmembran, während all die anderen zellulären Proteine weggewaschen werden. Das Molekulargewicht von dem gereinigten Protein (und beliebigen assoziierten Proteinen) wird dann durch MALDI-Massenspektrometrie bestimmt. Post-translationale Modifikationen von dem mit dem Hexahistidin-Tag versehenen Protein (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Phosphorylierung, Glykosylierung, proteolytische Spaltung) werden durch ein erhöhtes Molekulargewicht angezeigt. In einer weiteren Ausführungsform ist mindestens eine zweite DNA, die ein zweites Protein kodiert, co-transfiziert mit einer ersten DNA, die ein erstes Protein mit einem Hexahistidin-Tag kodiert, und die exprimierten Proteine werden gereinigt und die Molekulargewichte, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Die Bindung von mindestens einem zweiten Protein an das erste mit einem Hexahistidin-Tag versehene Protein wird auch durch ein erhöhtes Molekulargewicht angezeigt.
G. In vivo Zelltransfektion
Die Verwendbarkeit der STEP-Transfektion ist breit gefächert, da sie nicht auf die Transfektion von Zelllinien in der Kultur eingeschränkt ist. In noch einem weiteren Aspekt von der vorliegenden Erfindung wird STEP auf die Transfektion von Primärkulturen von Zellen aus einer Vielzahl von Geweben und Organismen durch Standardkulturverfahren, die für Primärkulturen verwendet werden, angewendet. In weiteren Aspekten von der Erfindung wird die STEP-Transfektion in vivo verwendet durch Implantation von Oberflächen, wie Celluloseacetat-Membranen, an denen Transfektionskomplexe immobilisiert worden sind. In einem Set von Ausführungsformen umfassen die Transfektionskomplexe Expressionsvektoren oder Antisense-Oligonukleotide; die Membranen werden in solide Tumore in Gesamtorganismen implantiert und die Wirkung der STEP-Transfektion auf das lokale Tumorzellwachstum oder Lebensfähigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Implantation bestimmt.
EXPERIMENTELLES
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte von der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren und weiter zu veranschaulichen und sind nicht interpretiert, den Bereich/Umfang davon zu beschränken.
In der experimentellen Offenbarung, die folgt, gelten die folgenden Akkürzungen: N (Normal); M (Molar); mM (millimolar); μM (mikromolar); mol (Mol); mmol (Millimol); μmol (Mikromol); nmol (Nanomol); pmol (Picomol); g (Gramm); mg (Milligramm); μg (Mikrogramm); ng (Nanogramm); l oder L (Liter); ml (Milliliter); μl (Mikroliter); cm (Centimeter); mm (Millimeter); μm (Mikrometer); nm (Nanometer); °C (Grad Celsius); Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); CRE (cAMP-Antwortelement); CREB (cAMP-Antwortelement bindendes Protein); ATP (Adenosin 5'-triphosphat); STK (Protein-Serin-Threonin-Kinase); PTK (Protein-Tyrosin-Kinase); mRNA (Boten-RNA); hnRNA (heteronukleare RNA); cDNA (komplementäre DNA); DEAE (Diethylaminoethyl); G418 (Geneticin); GFP (grün-fluoreszierendes Protein); EGFP (verstärkt grünfluoreszierendes Protein); FRET (Fluoreszenzresonanz-Energietransfer); DMEM (Dulbecco's modifieziertes Eagle's Medium); CMV (Cytomegalovirus); VASP (Vasodilator- und A kinasestimulates Phosphoprotein); PEST (Prolin-, Glutamat-, Serin- und Threonin-reich); Neo (Neomycin-Phosphotransferase); Ca (alpha-Isoform von der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase); PKA (cAMP-abhängige Proteinkinase); PKG (cGMP-abhängige Proteinkinase); RRC (ratiometrisch reagierende Zellen); SGK (Serum- und Glucocorticoid-induzierte Proteinkinase); PKCα, (alpha-Isoform von Proteinkinase C); CaMKII (die Typ-II Isoform der Calcium/Calmodulin-abhängigen Proteinkinase).
BEISPIELE
BEISPIEL 1
STEP: Oberflächentransfektions- und Expressionsprozedur
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung das folgende Verfahren bereit; dieses Verfahren ist in den folgenden Verfahren verwendet worden, wenn nichts anderes vermerkt ist:
1. Herstellung von Transfektionskomplexen

a. Plasmid-DNAs auf 0,12 mg/ml in dH₂O verdünnen.
b. 1 Volumen der Plasmid-DNA in eine Vertiefung von einer Mikrotiterplatte hinzufügen.
c. 1 Volumen des Transferrin-Polylysin-Komplexes von 1 mg/ml (0,4 Mol Polylysin pro Mol Transferrin mit Fe) hinzufügen, Mischen und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
d. 1 Volumen 2 mg/ml Lipofectamin hinzufügen, Mischen und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

2. Immobilisieren von Nukleinsäuren

a. Mischung auf Objektträger bei hoher Luftfeuchtigkeit (70–80%) unter Verwendung fester Stifte und von Mehrfachauftragungen (2–5 Auftragungen) punktförmig auftragen.
b. Komplexe auf dem Mikroskopie-Objektträger in 10-cm Gewebekulturschale in einem Gewebekultur-Abzug ohne ultraviolettes Licht trocknen lassen.

3. Ausplattieren und Kultur von HEK-293 Zellen

a. 20 ml Medium hinzufügen, die 106 frisch trypsinierte, exponentiell wachsende HEK-293 Zellen enthalten.
b. bei 37°C bei 5% CO₂ inkubieren.
c. Zellen ohne Störung für mindestens 16 Stunden nach dem Ausplattieren kultivieren.

4. Nachweis der Expression
Die Expression von Proteinen kann schon nach 16 Stunden nachgewiesen werden.
5. Selektion von Transformanten (falls gewünscht)
Innerhalb von 48 Stunden nach dem Ausplattieren mit dem Auswählen von stabilen Transformanten beginnen.
Vor ihrer Verwendung in STEP werden HEK-293T Zellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das 10% fötales Kälberserum enthält, bei 37°C in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 5% CO2 gehalten. Die Zellen wurden auf Glas oder Plastik vor ihrer Verwendung in der STEP-Transfektion angezogen. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80% erreichen, werden sie durch Behandlung mit 0,25% Trypsin in 1 mM EDTA passagiert, um die Zellen von dem Wachstumssubstrat abzulösen. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 × g pelletiert und das Trypsinierungsmedium entfernt. Das Zellpellet wird in DMEM resuspendiert und die Zellen werden zu ungefähr dem vierfachen des ursprünglichen Wachstumsvolumens verdünnt, um eine Konfluenz von 20% zu ergeben. NIH-3T3 und COS-1 Zellen werden auf eine ähnliche Art und Weise behandelt (Morton, HJ. In Vitro 9: 468–469, (1974)).
Die Nukleinsäuren sind vorzugsweise superhelikale DNA, die die höchste STEP-Transfektionseffizienz produziert und normalerweise durch Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifugation in der Gegenwart von 1 mg/ml Ethidiumbromid isoliert wird. Die aufgelöste superhelikale DNA wird mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen und durch Präzipitation mit Ethanol in der Gegenwart von Natriumacetat isoliert. Die DNA kann auch durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von kationischen Chromatographiemedien und Elution mit NaCl isoliert werden.
BEISPIEL 2
Entwicklung des STEP-Transfektionsprotokolls
Grün fluoreszierendes Protein(GFP)-Expressionsvektoren (pEGFP-Cl, Clontech) und COS-1 oder HEK-293 Zellen wurden anfänglich verwendet, um ein STEP-Transfektionsprotokoll zu entwickeln. Anfängliche Versuche, die Zellen in Kultur mit direkt zu Polylysin-beschichteten Platten hinzugefügter DNA zu transfizieren, resultierte in sporadischen, niedrigen Transfektionseffizienzen von weniger als 1 in 10⁷ Zellen. Dies wurde hauptsächlich verursacht durch Verlust der DNA von der Oberfläche der Platte oder des Objektträgers, wie durch die Überwachung des Schicksals der fluoreszierend markierten DNA während der Auftragungs- (spotting) und Kulturprozeduren. Die Komplexbildung von der DNA mit kationischen Proteinen wie Polylysin oder Histonen, resultierte in höheren Transfektionseffizienzen von 1 in 10³ bis 1 in 10⁴, jedoch wurden auch eine große Anzahl von fasch-positiven Zellen beobachtet. Diese falsch-positiven Zellen wurden außerhalb der Bereiche gefunden, auf denen die DNA aufgetragen wurde. Aus der sorgfältigen Beobachtung über den Zeitraum der Transfektion wurde bestimmt, dass die falsch-positiven Zellen aus der Fragmentierung der DNA-Komplexe und der nachfolgenden Transfektion von Zellen außerhalb des DNA-Anwendungsbereiches resultierten. Chemische Vernetzung von den DNA-Komplexen resultierte in einer Abnahme in der Anzahl der falsch-positiven Klone, jedoch verminderte es auch dramatisch die Transfektionseffizienzen für die auf dem Komplex ausplattierten Zellen.
Die Verwendung von kationischen Lipid/DNA-Komplexen resultierte in einer Toxizität für die zellen und einem Fehlen der Expression von auf der DNA ausplattierten Zellen. Diese Toxizität war in einem ternären Komplex aus DNA, kationischem Lipid und Histon oder Polylysin reduziert. Die Transfektionseffizienzen waren noch immer niedrig, in dem Bereich von 1 in 10² bis 1 in 10³. Jedoch resultierte, wie kürzlich von anderen berichtet, die Einbeziehung von Transferrin in den Komplex und seine kovalente Kopplung an den Komplex in einer großen Zunahme in der Transfektionseffizienz in der Lösungsphase, wie durch die berichtete Gentransfektion bestimmt (Zenke, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3655–9 (1990); Cheng, P. W., Hum Gene Ther 7: 275–82 (1996).
Die Zelllinien, die effizient durch das STEP-Protokoll transfiziert werden konnten, schließen NIH-3T3 Fibroblasten, HEK-293 und HEK-293T Zellen und mit niedrigerer Effizienz COS-1- und COS-7 Zellen ein. Zelllinien, die bis jetzt keine effiziente Transfektion gezeigt haben schließen C6 Glioma, NIE-115 Neuroblastoma, NG-108 Neurobastoma-Glioma, C361 und SY5Y Zellen ein. Die Erhöhung der Anzahl der Zelllinien, die mit hoher Effizienz unter Verwendung von STEP transfiziert werden, ist in Beispiel 11 beschrieben. Die Beschaffenheit der Zellen, die ausplattiert werden sollen und ihre Dichte sind beide wichtig für die Effizienz von STEP. Die auszuplattierenden Zellen werden vorzugsweise exponentiell wachsen lassen, bei einer Konfluenz von 30–50% vor der Trypsinierung und werden vorzugsweise bei einer Dichte von 1–5 × 10⁴ Zellen/cm² auf die aufgetragenen DNA-Komplexe ausplattiert.
Letztendlich, in diesem Beispiel, benötigt eine effiziente STEP-Transfektion, dass die Oberfläche, auf die der DNA-Komplex aufgetragen wird, mit Polylysin vorbehandelt wird und das der DNA-Komplex aufgetragen wird unter Bedingungen von kontrollierter Luftfeuchtigkeit von 70 bis 80% und einer Temperatur von etwa 18 bis 22°C. Wenn sie richtig gebildet werden, sind die DNA-Komplexe in Medien unter Gewebekulturbedingungen für 72 Stunden und länger stabil.
Unter Verwendung optimierter STEP-Bedingungen werden Transfektionseffizienzen von 20 bis 70% der auf die DNA ausplattierten Zellen, mit sehr niedriger Inzidenz von falsch-positiven (< 1%), routinemäßig erreicht. Spezifische Beispiele werden nachfolgend gezeigt.
BEISPIEL 3
Nachweis von STEP-transfizierten Zellen unter Verwendung von DsRed-Reporterexpression
HEK-293T Zellen wurden mit einem Expressionsvektor für DsRed gemäß STEP in Beispiel 1 und wie nachfolgend transfiziert. HEK-293T Zellen sind HEK-293 Zellen, die ein SV40-T Antigen exprimieren, was eine hohe Kopienreplikation der Expressionsvektoren gestattet, die einen SV40-Replikationsstartpunkt enthalten. Zweihundert Nanoliter von einer Lösung, bestehend aus pDsRed-Cl Plasmid-DNA (Clontech, 20 ng), Lipofectamin (130 ng), Transferrin (20 ng) und Polylysin (40 ng) wurden auf die Oberfläche von einem Polylysin-beschichteten Mikroskopie-Objektträger aufgetragen. Die Lösung wurde für 30 Minuten trocknen lassen und der Mikroskopie-Objektträger wurde zu einer 10-cm Gewebekulturschale überführt. In diesem Fall wurden HEK-293T Zellen auf dem Mikroskopie-Objektträger in DMEM, das 10% FCS und die Zellen enthält, ausplattiert und die Zellen wurden in einem befeuchteten 5% CO₂-Inkubator für 48 Stunden inkubiert. Die Expression von DsRed (einem rot fluoreszierenden Protein von einer marinen Koralle; Fradkov, et al., FEBS Lett 479: 127–130 (2000)), wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Die Zellen wurden unter Hellfeld oder Fluoreszenz unter Verwendung eines Rhodamin-Filters fotografiert. Die Kontur von dem DNA-Spot kann in der Hellfeld-Abbildung gesehen werden und der DNA-Spot selbst nimmt die untere Hälfte von der Abbildung ein. Die Zelldichte über dem DNA-Spot ist niedriger als die Zelldichte außerhalb des Spots, teilweise dadurch, dass die Zellen weniger effektiv an dem DNA-Spot anhaften als an dem Polylysin, das den Spot umgibt und teilweise dadurch, dass die zelluläre Replikation in den transfizierten Zellen inhibiert ist. In diesem Experiment wurde eine Transfektionseffizienz von 30% bestimmt und die falsch-positive Rate war weniger als 0,1%.
BEISPIEL 4
Simultane Expression und Nachweis von mehr als einem Gen
A. Zwei Proteine: GFP und DsRed
Expressionsvektoren für beide, GFP und DsRed (Fradkov, et al., FEBS Lett 479: 127–130 (2000)) wurden verwendet um die Effizienz der Co-Expression während der STEP-Transfektion gemäß zu der Prozedur in Beispiel 1 und wie folgt zu bestimmen. Die Transfektionskomplexe wurden entweder aus zwei Expressionsvektoren separat gebildet oder aus einem Gemisch von den zwei Expressionsvektoren. Drei DNA-Spots wurden auf einen Standard-Mikroskopie-Objektträger unter Verwendung von STEP aufgetragen. Der linke Spot enthielt nur pDsRedCl-Expressionsvektor (20 ng), der Spot im Zentrum enthielt nur pEGFPCl-Expressionsvektor (20 ng) und der dritte Spot enthielt ein entsprechendes Gemisch aus pEGFPCl- und pDsRedCl-Vektoren (jeweils 10 ng). Die Zellen wurden auf die DNA-Spots ausplattiert und nach 24 Stunden wurden Fluoreszenz-Mikrofotografien unter Verwendung des Rhodamin-Filtersets (A) oder des Fluoreszein-Filtersets (B) erzeugt, um die DsRed-, beziehungsweise GFP-Expression nachzuweisen. Beide fluoreszierenden Proteine wurden in mehr als 50% der Zellen über den DNA-Spots nachgewiesen und 100% der DsRed-positiven Zellen waren auch GFP-positiv. Nur 85% der GFP-positiven Zellen waren auch DsRed-positiv, aufgrund der größeren intrinsischen Fluoreszenz des GFP-Proteins verglichen mit dem DsRed-Protein. Folglich zeigen diese Ergebnisse, dass Zellen beide Proteine mit einer Effizienz von 100% co-exprimieren, obwohl die Sensitivität des Nachweises für EGFP höher ist als diejenige für den DsRed-Expressionsvektor. Diese hohe Effizienz der Co-Transfektion demonstriert, dass Transaktivierungsassays und andere Assays, die die Interaktion von zwei oder mehr transfizierten Proteinen in derselben Zelle benötigen, die STEP-Transfektion anwenden können.
B. Vier Proteine: EGFP, DsRed, β-Galaktosidase und Puromycin-Resistenz
Mindestens vier verschiedene Expressionsvektoren sind unter Verwendung der STEP-Transfektion gleichzeitig in Zellen eingeführt worden. Die Transfektionskomplexe wurden aus einem Gemisch von allen vier Expressionsvektoren zusammen gebildet. Einzelne Zellen werden durch STEP gleichzeitig transfiziert mit EGFP (pEGFP-Cl; Clontech), DsRed (pDsRed-Cl; Clontech), β-Galaktosidase (CMV.βgal; Huggenvik et al, Mol Endocrinol 5: 921–930 (1991)) und Puromycin-Resistenz (pPUR; Clontech); die Expression von allen vier Proteinen wurde dann, auf die Expression folgend, beobachtet. Die Expression von diesen vier Proteinen wurde nachgewiesen durch gleichzeitige grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz, zytochemische β-Galaktosidase-Anfärbung und Wachstum in der Gegenwart von Puromycin.
BEISPIEL 5
Nachweis von STEP-transfizierten Zellen unter Verwendung nicht-fluoreszierender Techniken
Obwohl die Fluoreszenz eine der schnellsten und sensitivsten Techniken für den Nachweis der Genexpression darstellt, können STEP-transfizierte Zellen auch unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Verfahren nachgewiesen werden. In einem Verfahren werden DNA-Komplexe, die das pTK-Hyg-Plasmid enthalten, das die Expression des Hygromycin-Resistenzgens steuert, auf einen Glas-Objektträger aufgetragen und Zellen auf dem Objektträger ausplattiert. Achtundvierzig Stunden nach dem Ausplattieren wurde Hygromycin (100 mg/ml) zu dem Medium hinzugefügt und die Zellen wurden für weitere zehn Tage mit Mediumwechsel alle 3 Tage inkubiert. Der überwiegende Teil der Zellen starb und wurde weggewaschen, aber eine Mikrofotografie zeigte eine „Kolonie" von lebenden Zellen direkt über dem STEP-transfizierten Spot.
Diese Ergebnisse zeigten, dass transfizierte Zellen selektiert werden können unter der Verwendung der ge wöhnlichen Selektionsmarker, die zur Etablierung stabiler Transformanten, einschließlich Hygromycin-Resistenz, G418-Resistenz und Puromycin-Resistenz, verwendet wurden. In einem weiteren Verfahren wurde das CMV-βgal-Plasmid (hergestellt wie beschrieben in Angelotti et al, Journal of Neuroscience 13: 1418–1428 (1993)), das die Expression der β-Galaktosidase steuert, in der STEP-Transfektion verwendet. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Zellen fixiert und mit X-gal angefärbt (wie beschrieben in Sanes et al. EMBO J. 5: 3133–3142 (1986)). Eine Mikrofotografie zeigte sowohl einen Teil von dem Spot an der linken Seite von der Abbildung und auch die Ecke von dem DNA-Spot. Die Expression von beta-Galaktosidase wurde angezeigt durch die dunkelblaue Anfärbung von Zellen innerhalb der Fläche von dem DNA-Spot. Diese Ergebnisse zeigten, dass enzymatische Nachweisverfahren, die zytochemische Anfärbetechniken wie beta-Galaktosidasefärbung anwenden, auch verwendet werden können, um die STEP-Transfektion zu demonstrieren.
BEISPIEL 6
Immunzytochemischer Nachweis der Proteinexpression unter Verwendung von STEP
Um die in vivo Funktion von Proteinen zu untersuchen und die Effizienz von Effektorproteinen wie Proteinkinasen in Transaktivierungsassays zu vergleichen, wird es notwendig sein, die Expression von den anderen Effektorproteinen zu demonstrieren und zu quantifizieren. Ein Verfahren, um dies zu tun beinhaltet den immunozytochemischen Nachweis der Proteine. Solche Techniken können wirksam in der STEP-Transfektion verwendet werden, wie es durch die folgenden Experimente demonstriert wird.
DNA-Komplexe wurden entweder gebildet mit pCMV-Neo Leervektor-DNA (Vektor) oder mit pFlagVASP-DNA (pFlag-VASP), die ein mit Flag-versehenes VASP-Protein kodiert (Collins, et al., J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)), einem Substrat für die Phosphorylierung durch cGMP- abhängige Proteinkinase. Für die Zielsetzung von diesem Experiment diente das pFlagVASP nur als ein Expressionsvektor, der die Expression von einem Protein steuert, das das Flagepitop-Tag trägt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion durch STEP wurden die Zellen fixiert und mit monoklonalem primären M2-Antikörper angefärbt, gefolgt durch einen Rhodamin-konjugierten sekundären Ziege Anti-Maus-Antikörper. In einer Hellfeld-Abbildung von den Zellen waren die DNA-Spots für beide, die pFlagVASP- und Vektor-Spots, deutlich sichtbar. Dasselbe Set an Spots konnte auch in einer zweiten Abbildung unter Verwendung von Fluoreszenzbeleuchtung und einem Rhodamin-Filterset zum Nachweis des Rhodaminkonjugierten sekundären Antikörpers beobachtet werden. Fluoreszenz wurde nur in Zellen über Spots nachgewiesen, die den pFlagVASP-Expressionsvektor enthielten, wie durch den Vergleich der beiden Abbildungen bewiesen. Es konnte auch gesehen werden, dass die Expression von dem STEP-transfizierten pFlagVASP am höchsten an dem Rand von den Spots war, weil diese Spots bei einer niedrigeren als der optimalen Luftfeuchtigkeit erzeugt wurden. Folglich bewiesen die Ergebnisse, dass die Expression von einem mit einem Flag-Tag versehenen Protein spezifisch in Zellen nachgewiesen werden kann unter Verwendung der STEP-Transfektion, einem monoklonalen primären M2-Antikörper und einem Rhodamin-konjugierten sekundären Antikörper. Dieser Nachweis von Epitop-versehenen Proteinen wird nachfolgend in Beispiel 8 verwendet, um die Expression von Proteinen in Transaktivierungsassays zu einwandfrei festzustellen und zu quantifizieren.
BEISPIEL 7
Transaktivierungs-Assay unter Verwendung eines Tetracyclin-induzierbaren Systems
Um zu bestimmen, ob die STEP-Transfektion modifiziert werden könnte, um die induzierbare Expression von einem Protein hervorzubringen, wurde das durch Bujard und Mitarbeiter entwickelte Tetracyclin-induzierbare System angewendet (Baron et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1013–1018). Diese Experimente demonstrieren die Induktion der EGFP-Expression durch Doxycyclin in HEK-TetOn Zellen, die nach einer STEP-Transfektion erfolgt.
Zwei DNA-Komplexe wurden für dieses Experiment hergestellt, einer der das pBi-EGFP-Plasmid (Clontech) enthält, das die Expression von EGFP unter der Kontrolle von einem Tetracyclin-responsiven Element steuert, und ein weiterer Komplex, der pEGFP-Cl Plasmid-DNA (Clontech) enthält, mit der EGFP-Expression unter der Kontrolle von dem starken Promotor des menschlichen frühen Cytomegalovirus. Spots für jeden von diesen Komplexen wurden nebeneinander auf jeden von den beiden unterschiedlichen Mikroskopie-Objektträgern aufgetragen und HEK-TetOn Zellen wurden auf jedem Objektträger in getrennten 10-cm Kulturschalen ausplattiert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurde eine Platte in DMEM und 10% FCS inkubiert, während die andere in dem selben Medium, das 10 mg/ml Doxycyclin enthielt, inkubiert wurde. Fluoreszenzmikrofotografien wurden 48 Stunden nach dem Ausplattieren der Zellen aufgenommen. Eine Mikrofotografie zeigte die Fluoreszenzabbildung von der Kontrollplatte, die kein Doxycyclin erhalten hatte, und in der zwei Spots zu sehen waren; der linke Spot stimmte mit den mit pBi-EGFP gebildeten Komplexen überein und der rechte Spot stimmte mit dem mit pEGFP gebildeten Komplex überein. In der Abwesenheit von Doxycyclin waren keine der Zellen auf dem pBi-EGFP-Spot fluoreszierend, während ungefähr 30% von den Zellen auf dem pEGFP-Cl-Spot fluoreszierend waren. Eine zweite Mikrofotografie zeigte die Fluoreszenz von den Zellen von dem mit Doxycyclin behandelten Objektträger. Die Behandlung mit Doxycyclin resultierte in einer nachweisbaren GFP-Expression in 20% von den Zellen auf dem pBi-EGFP-Spot, was vergleichbar war zu der GFP-Expression, die für den pEGFP-Cl-Spot auf dem selben Objektträger gesehen wurde.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Expression von GFP in HEK-TetOn Zellen unter Verwendung des Tetracyclin-Analogons Doxycyclin induziert werden konnte. In diesem Experiment war der TetOn-Transkriptionsfaktor stabil in allen ausplattierten Zellen exprimiert und das Reporter-Plasmid pBi-EGFP wurde speziell in den STEP-Komplex eingesetzt, der auf den Objektträger aufgetragen wurde. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Induktion der GFP-Fluoreszenz durch Doxycyclin.
BEISPIEL 8
Transaktivierung von einem zyklisches-AMP-gesteuerten Promotor durch eine cAMP-abhängige Proteinkinase
Ein Transkriptions-Aktivierungsassay (Hall, et al, J Biol Chem 274: 3485–95 (1999); Taylor, et al, J Biol Chem 275: 28053–62 (2000)) zur Messung der in vivo Kinaseaktivität ist adaptiert und für die Verwendung mit der STEP-Transfektion modifiziert worden. Für die katalytische (C) Untereinheit von der cAMP-abhängigen Proteinkinase ist durch unzählige Forscher gezeigt worden, dass sie die den cAMP-Antwortelement-Bindungsprotein („CREB")-Transkriptionsfaktor phosphoryliert und zu Erhöhungen in der Transkription von Genpromotoren führt, die das cAMP-Antwortelement („CRE") enthalten, an das CREB als ein Dimer bindet. Die kanonische CRE-Nukleotidsequenz besteht aus der palindromen Nukleotidsequenz TGACGTCA. Ein Reporter-Plasmid, das entwickelt wurde, um Zunahmen in der CREB-Aktivität nachzuweisen, bezeichnet als pCRE-d2EGFP (Clontech), das einen CRE-Verstärker enthält und ein destabilisiertes Derivat von EGFP (d2EGFP) kodiert, ist beschrieben worden (Li, et al, J Biol Chem 273: 34970–5 (1998)). Dieses destabilisierte Derivat enthält eine PEST-Sequenz, erhalten von der Ornithin-Carboxylase, welche die normale proteolytische Halbwertszeit von EGFP von 24 Stunden auf 2 Stunden ändert (Li, et al, J Biol Chem 273: 34970–5 (1998)). Dieses destabilisierte EGFP gestattet mehr quantitative Messungen der transkriptionellen Regulation, ohne die Probleme, die einem Protein mit langer Halbwertszeit innewohnen.
Das pCRE-d2EGFP wurde als ein Reporter-Plasmid verwendet, um zu bestimmen, ob die Co-Transfektion von der konstitutiv aktiven katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase die Transkription von pCRE-d2EGFP regulieren würde und in einer erhöhten Fluoreszenz resultiert, verglichen mit den Kontrollzellen, die keinen C-Untereinheit-Vektor erhalten hatten. Die folgenden Experimente beschreiben die transkriptionelle Regulation von einem CRE-enthaltenden Expressionsvektor in STEP-Assays. Die Transfektionskomplexe wurden mit einem Gemisch aus pCMV.Neo (2 ng, hergestellt wie beschrieben durch Huggenvick et al, Mol Endocrinol 5: 921–930 (1991)) und pCRE-d2EGFP (18 ng) oder pCMV.Ca (2 ng, hergestellt wie beschrieben durch Huggenvick et al, Mol Endocrinol 5: 921–930 (1991)), das die C-Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase kodiert und pCRE-d2EGFP (18 ng) und die Komplexe wurden auf die Oberfläche eines Polylysin-beschichteten Mikroskopie-Objektträgers aufgetragen. HEK-293T Zellen wurde ausplattiert und 24 Stunden später wurden Fluoreszenzmikrofotografien unter Verwendung eines 4X-Objektives und Hellfeldbelichtung oder Fluoreszenzbelichtung unter Verwendung eines Fluorescein-Filtersets erhalten. Auf Fluoreszenz-Abbildungen, erhalten unter Verwendung eines 10X-Objektivs, von einem Spot, der pCMV.Neo enthält, und einem weiteren, der pCMV.Ca enthält, konnten einzelne positive Zellen identifiziert werden. Diese zwei Fluoreszenz-Abbildungen wurden durch eine Pixeldichte-Histogrammanalyse analysiert, um eine 16- bis 20-fache Zunahme in der Fluoreszenzintensität in der STEP-Transfektion mit pCMV.Ca, verglichen mit der von pCMV.Neo, zu beweisen.
Diese Ergebnisse zeigten, dass eine Co-Transfektion von der konstitutiv aktiven, katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase in der Tat die Transkrip tion von pCRE-d2EGFP reguliert und in erhöhter Fluoreszenz resultiert, verglichen mit den Kontrollzellen, die keinen C-Untereinheits-Vektor erhielten. Zellen, die auf STEP-Spots ausplattiert wurden, die pCRE-d2EGFP und den Leervektor pCMV.Neo enthielten, zeigten eine niedrigere Durchschnittsfluoreszenz. Jedoch zeigten die Zellen, die auf STEP-Spots ausplattiert wurden, die den pCMV.Ca-Expressionsvektor, der die C-Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase kodiert, sowie pCRE-d2EGFP enthalten, eine höhere Durchschnittsfluoreszenz. Die Fluoreszenz von den mit pCMV.Ca und pCRE-d2EGFP transfizierten Zellen ist ähnlich zu der, die für pEGFP-Cl gesehen wurde, das den starken konstitutiven CMV-Promotor enthält. Die detaillierte Untersuchung von den Hellfeld-Abbildungen zeigt, dass gleiche Zahlen von Zellen an beiden DNA-Spots anhaften. Die Quantifizierung von der Zunahme in der GFP-Fluoreszenz unter Verwendung der Microcomputer Imaging Device (MCID) Software ließ darauf schließen, dass das zelluläre Fluoreszenzsignal 16- bis 20-fach erhöht war.
BEISPIEL 9
Verwendung von Fluoreszenz-Objekträger-Scannern zum Nachweis der STEP-Transfektion
Die meisten der vorhergehenden Beispiele, die Aspekte der STEP-Transfektionseffizienzen beschreiben, haben Fluoreszenzmikroskopie beinhaltet. GFP-positive Zellen wurden nicht nachgewiesen, weil die verfügbaren Scanner nicht den blauen Argon-Anregungslaser für den optimalen GFP-Nachweis aufwiesen. Jedoch weist das DsRed-fluoreszierende Protein Anregungs- und Emissions-Maxima von 558 nm und 583 nm auf, die gut mit dem Cy3-Marker überlappen, der gewöhnlich für die Hybridisierung von DNA-Arrays zur Quantifizierung der Genexpression verwendet wird.
Die Expression von DsRed in STEP-transfizierten Zellen wurde unter Verwendung eines automatisierten Scanning-Fluoreszenz-Mikroarray-Analysators, wie in den folgenden Experimenten beschrieben, nachgewiesen. Die DNA-Komplexe wurden unter Verwendung des pDsRed-Cl-Expressionsvektors für die STEP-Transfektion hergestellt.
Acht DNA-Spots wurden beobachtet, wo die Fluoreszenzintensitäten für beide, Cy5-Filtersets (ex 649 nm, em 670 nm) und Cy3-Filtersets (ex 550 nm, em 570 nm) aufgezeigt wurden. Die Spots sind ungefähr 0,5 bis 1 mm im Durchmesser. Die aufgetragenen DNA-Komplexe unterschieden sich in ihren Verhältnissen nach Gewicht von Polylysin, Transferrin und Lipofectamin^® zu der DNA. Diese Verhältnisse waren für jede 120 ng DNA: 200 bis 20 ng Polylysin, 800 bis 80 ng Transferrin und 2000 bis 200 ng Lipofectamin^®. Nur zwei DNA-Spots resultierten in einer effizienten STEP-Transfektion der Zellen; diese Spots enthielten die Verhältnisse; pro 120 ng DNA: 200, 800 und 2000 ng und 100, 400 und 1000 ng von Polylysin, Transferrin, beziehungsweise Lipofectamin^®. Das Fluoreszenzsignal von diesen Zellen wurde nur mit dem Cy3-Filterset beobachtet. Eine 5X-Vergrößerung von einem der Spots wurde von einem TIFF-Dokument erzeugt.
Fluoreszenz- Mikrofotografien von dem selben Spot und eine Mikrofotografie zeigen, dass einzelne fluoreszierende Zellen erkennbar sind. Dieselben fluoreszierenden Zellen wurden deutlich sowohl mikroskopisch als auch mit dem Objektträger-Scanner nachgewiesen.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass STEP-transfizierte Zellen unter Verwendung von DNA-Array-Fluoreszenzanalysatoren und Fluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen werden können. Die Fluoreszenz, die für einzelne Zellen nachgewiesen wurde, war für den Cy3-Filterset spezifisch und wurde nicht unter Verwendung des Cy5-Filtersets gesehen. Dieselben Zellen wurden mikroskopisch unter Verwendung des Rhodamin-Filtersets an einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Quantifizierung von STEP-transfizierten Zellen auf die Mikroarray-Fluoreszenzanalyse für die Hochdurchsatz-Datenanalyse von STEP-Experimenten adaptiert werden kann.
BEISPIEL 10
Herstellung von STEP-transfizierten Zellen unter Verwendung von Roboter-Arrayer
Die DNA-Komplexe sind erfolgreich aufgetragen worden unter Verwendung von Roboter-Arrayer, um die Komplexe punktförmig auf Objektträger aufzutragen, wie in dem folgenden Experiment beschrieben. Ein 4 × 4-Gitter aus 16 Spots wurde unter Verwendung einer robotertechnischen Spot-Station (Genomic Solutions Flexisys) erzeugt. Nach dem Trocknen wurden HEK-293T Zellen auf den Mikroskopie-Objektträgern ausplattiert und 48 Stunden später Fluoreszenz-Mikrofotografien aufgenommen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. In Feld (A) wurde die Fluoreszenz von EGFP unter Verwendung eines Fluorescein-Filtersets bei 40X Vergrößerung nachgewiesen. In Feld (B) wurde die Fluoreszenz von DsRed unter Verwendung eines Rhodamin-Filtersets bei 40X Vergrößerung nachgewiesen. In Feld (C) der Nachweis von EGFP und etwas minimaler „durchblutender" DsRed-Fluoreszenz unter Verwendung eines Bandpass-Fluorescein-Filtersets bei 100X Vergrößerung. Die Pfeile weisen auf die äußere Begrenzung von den DNA-Spots hin, die gerade so sichtbar sind, verursacht durch den Einschluss von Spuren von Fluorescein in den DNA-Komplex. In Feld (D) zeigt ein Schema den Typ der mit dem Arrayer erzeugten DNA-Spots; die vier Spots in der ersten und dritten Reihe enthielten DsRed-Cl-Plasmid-DNA und die vier Spots in der zweiten und vierten Reihe enthielten pEGFP-Cl.
Die Ergebnisse beweisen, dass etwa 90% von den Spots mindestens eine positive Zelle zeigten und 50% mindestens 5 oder mehr positive Zellen zeigten. Jeder Spot war mit ungefähr 25 bis 30 Zellen in Kontakt, wenn Hellfeld-Abbildungen untersucht wurden. Es gibt einige wichtige Parameter in der Verwendung von robotertechnischen Spot-Geräten in diesem Experiment. Erstens, die Luftfeuchtig keit für das punktförmige Auftragen sollte mindestens 70% betragen, andernfalls wird die Flüssigkeit an der Spitze von dem punktförmigen Auftragestift trocknen, bevor sie effizient auf den Glas-Objektträger übertragen werden kann. Zweitens, mehrfache Auftragungen von DNA-Komplex auf denselben Spot ergibt signifikant größere Transfektionseffizienzen, vielleicht verursacht durch die Bildung von Schichten aus DNA-Komplexen. Drittens, massive Stifte sind im Allgemeinen effizienter und reproduzierbarer als geschlitzte Stifte in der Herstellung von transfizierten Zellen, möglicherweise weil die DNA-Komplexe viskös genug sind, den effizienten Flüssigkeitstransfer den Schlitz hinunter zu verhindern.
BEISPIEL 11
Anwendung der STEP-Transfektion auf Mutationsanalyse der Proteinfunktion
Optimierung von STEP-Transfektion und Quantifizierung
Die STEP-Transfektion kann für das Studium von Proteinstruktur und Funktion eingesetzt werden. Gegenwärtig beinhalten die meisten der Proteinstruktur-Studien die Deletion von vorausberechneten Domänen und die Charakterisierung von diesen Deletionen hinsichtlich der in vitro und, weniger oft, der in vivo Funktion von dem Protein. Normalerweise wird die Rolle von einzelnen Aminosäuren innerhalb einer Domäne eines Proteins aus der Homologie zu anderen Proteinen abgeleitet. In diesem Beispiel ist eine Domäne der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PGK) zufällig mutiert worden und selektiert für „gain of function"-Mutanten, um eine inhibitorische Region der Kinase zu definieren. STEP gestattet das funktionelle Überprüfen von 1.000 Mutanten auf die Mutations-Aktivierung in vivo unter Verwendung eines Transkriptionsaktivierungs-Assays. Dieses Beispiel stellt auch die Optimierung von dem STEP-Verfahren für die Anwendung auf eine Vielzahl von anderen Struktur/Funktions-Studien kurz dar.
A. Optimierung von STEP-Transfektion und Quantifizierung
Die STEP-Transfektion ist leicht für zahllose Anwendungen zu optimieren. Die Experimente in diesem Beispiel identifizieren wichtige Bereiche, di optimiert werden können.
Solche Optimierungen von der STEP-Prozedur nutzen, was gegenwärtig über molekulare Ereignisse rund um die Transfektion bekannt ist. Die Transfektion wird im Allgemeinen angesehen, aus drei Abschnitten zu bestehen (Bally, et al., Adv Drug Deliv Rev 38: 291–315 (1999)). In der ersten Phase wird die DNA durch Endozytose in die Zelle aufgenommen. Während der endozytotischen Aufnahme kann die DNA entweder in der flüssigen Phase oder adsorbiert an der Oberfläche der Zellmembranen sich befinden. Die Einschluss von Transferrin in STEP erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die DNA an die Transferrin-Rezeptoren an der Membran adsorbiert ist und in endozytotische Vesikel eintreten wird. Die zweite Phase der Transfektion beinhaltet das Entrinnen der DNA aus dem normalen lysosomalen Abbau, der mit den meisten lysosomalen Inhaltsstoffen erfolgt. Wiederum mag Transferrin helfen, die DNA zu einer Subpopulation von endozytotischen Vesikeln zu steuern, für die es wahrscheinlicher ist, der Fusion mit Lysosomen zu entrinnen und Polylysin kann Hilfestellung leisten zum Schutz der DNA vor der lysosomalen Nuklease. Letztendlich, der letzte Schritt in der Transfektion ist der Transport von der DNA zu dem Kern, wo sie durch RNA-Polymerasen transkribiert werden kann. Die Effizienz von jedem von diesen Schritten ist äußerst abhängig von der Form von dem DNA-Komplex und dem Zelltyp, der transfiziert werden soll.
1. Einfluss des Zellzyklus auf die STEP-Transfektion
Es wird bevorzugt, nahezu 100% Transfektionseffizienz für alle Zellen auf dem DNA-Komplex zu haben. Die folgenden Strategien erhöhen weiter die Transfektionseffizienz. Anfängliche Experimente mit STEP haben darauf hingewiesen, dass Zellen, die für die STEP- Transfektion ausplattiert werden, vorzugsweise in einer Phase des exponentiellen Wachstums sein sollen, was mit anderen Berichten in Übereinstimmung ist (Mortimer, et al., Gene Ther 6: 401–411 (1999); Tseng, et al., Biochim Biophys Acta 1445: 53–64 (1999); Brunner, et al., Gene Ther 7: 401–407 (2000)), das Spitzen-Transfektionseffizienzen mit Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus erhalten wurden. In diesen Untersuchungen variierten die Transfektionseffizienzen bis zu 500-fach über die Dauer des Zellzyklus. Deshalb wurden HEK-293T zellen in der G2/M-Phase durch unterschiedliche Verfahren angereichert. In einem Verfahren wird die zentrifugale Auswaschung verwendet, um Zellen basierend auf ihrer Größe zu fraktionieren und die größeren G2/M-Phase-Zellen anzureichern (Brunner, et al., Gene Ther 7: 401–407 (2000)). Zellfraktionen werden gesammelt und direkt für das Ausplattieren in den STEP-Transfektions-Experimenten verwendet. In einem weiteren Verfahren werden HEK-293T Zellen mit einer doppelten Thymidinblock-Behandlung synchronisiert, um Zellen an der G1-Phase zu synchronisieren und dann auf STEP-transfizierte Zellen zu unterschiedlichen Zeiten nach Entfernung des zweiten Thymidinblocks ausplattiert (Tseng, et al., Biochim Biophys Acta 1445: 53–64 (1999)). In noch einem weiteren Verfahren wird ein Gebrauch gemacht von entweder Nocodazol (1 mg/ml), das den G2/M-Übergang durch Zerreißen der Mikrotubuli unterbricht, oder von Aphidicolin (5 mg/ml), was die DNA-Polymerase inhibiert und Zellen in der S-Phase arretiert (Mortimer, et al., Gene Ther 6: 401–411 (1999)). Diese Zellzyklus-angereicherten Populationen werden dann verwendet in STEP-Transfektionsexperimenten mit pEGFP-Cl oder pDsRedCl mit einer Zeitdauer, die zum Untersuchen der Expression wie in den vorhergehenden Beispielen 3 und 4 verwendet wurde. Eine 4- bis 5-fache Zunahme in der Transfektionseffizienz wird vorzugsweise unter Verwendung der Zellen beobachtet, die in der G2/M-Phase angereichert sind, verglichen mit asynchron wachsenden Zellen (Mortimer, et al., Gene Ther 6: 401–411 (1999)). Dies bedeu tet für HEK und NIH-3T3 Zellen, dass 80–90% der Zellen routinemäßig STEP-transfiziert werden.
2. Behandlung während der Transfektion
Es mag zu bevorzugen sein, die Transfektionseffizienzen durch Behandeln der Zellen während des Transfektionsprozesses zu erhöhen. Solche Behandlungsmethoden schließen die Elektroporation ein. Die Elektroporation wird im Allgemeinen als eine Transfektionstechnik verwendet und funktioniert durch transientes Permeabilisieren der Zellmembran, um den Eintritt der DNA zu gestatten (Neumann, et al., Bioelectrochem Bioenerg 48: 3–16 (1999)). In den meisten Standardanwendungen werden Zellen in Küvetten in der Gegenwart von DNA elektroporiert. Jedoch sind Plattenelektroden für die Elektroporation von Zellen während sie auf Oberflächen angewachsen sind, erhältlich (BTX/Genetronics) und diese Technik ist verwendet worden, um menschliche Nabelschnurzellen (HWECs) zu transfizieren, mit Effizienzen, die vergleichbar mit der Elektroporation in der Küvette sind (Lewis, et al., Gene Ther 6: 1617–1625 (1999)). HEK-293T Zellen werden auf Objektträgern unter Verwendung des Standard-STEP-Protokols ausplattiert und dann der Elektroporation nach 1, 4, 12 und 24 Stunden nach dem Ausplattieren unterworfen, um die Verstärkung der EGFP-Expression zu bestimmen. Die Elektroporationsbedingungen sind essentiell solche, die kürzlich definiert wurden (Lewis, et al., Gene Ther 6: 1617–1625 (1999)), obwohl Parameter wie Pulslänge und Spannung um die berichteten Optima herum variiert wurden (450 V und 20 msec). Positive Zellen werden identifiziert durch Zellzählung unter Verwendung der Fluoreszenz-Mikroskopie und die Effizienz der Transfektion wird bestimmt durch das Zählen der gesamten Zellen bei Hellfeld-Beleuchtung.
Die Transfektionseffizienz wird auch erhöht durch das Verhindern des Abbaus von DNA in den Lysosomen. In einem Verfahren wird Chloroquindiphosphat verwendet, das in die Lysosomen eintritt und die Ansäuerung von den Lysosomen derart verhindert, dass die abbauende Aktivität der Enzyme verringert wird. Chloroquin wird auf eine Endkonzentration von 100 mM nach einer Dauer von 0,5 bis 4 Stunden nach dem Ausplattieren zu dem Medium hinzugefügt. In einem weiteren Verfahren wird der Nuklease-Inhibitor DMI-2 verwendet, von dem berichtet worden ist, dass er die Transfektionseffizienz 10-fach erhöht (Ross, et al., Gene Ther 5: 1244–50 (1998)). DMI-2 ist ein Polyketid-Metabolit von Streptomyces und seine Verwendung benötigt die Reinigung von DMI-2, wobei die Prozedur dafür zielgerichtet ist und etwa drei Tage benötigt (Nagao et al., J Enzyme Inhib 10: 115–124 (1996)). Die Reinheit von der Verbindung wird durch Massenspektrometrie mit einem erwarteten Molekulargewicht von 854 Da bestimmt. Eine 10-fache Verstärkung der Transfektion wird beobachtet bei DMI-2 Konzentrationen von 250–750 ng/ml, in Übereinstimmung mit Ergebnissen berichtet von Ross et al., Gene Ther 5: 1244–50 (1998).
3. Zelltyp
Die STEP-Transfektion ist für die Anwendung auf eine große Vielzahl von Zelllinien optimiert. Jede Zelllinie stellt ein unterschiedliches Milieu für die Proteinexpression dar, und der Vergleich von individuellen Zelltypen bringt maximale Mengen an Informationen aus den STEP-Experimenten hervor.
Bei der Quantifizierung der Effizienz der STEP-Transfektion wird die Effizienz als der prozentuale Anteil der Gesamtzellen über der applizierten DNA definiert, die nachweisbar fluoreszent sind. HEK-293T-, HEK-293- und NIH-3T3-Zellen weisen regelmäßig Transfektionseffizienzen von mehr als 30% auf. COS-1-, COS-7- und CV-1-Zellen haben Transfektionseffizienzen von annähernd 1–5% gezeigt. Andere getestete Zelllinien (C6-Gliom-, N1E-115-, NG-108-, C361- und SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen) zeigten weniger als 1%. Die STEP-Transfektion wurde für HEK-293T-Zellen optimiert, die anfängliche hohe Effizienzen aufwiesen. Im Allgemeinen umfasst die Optimierung die Verwendung von zweidimensionalen Arrays von Spots, in denen Komponenten des DNA-Komplexes entlang einer der Dimensionen des Arrays in Konzentrationen der Art variiert werden. Somit wird in einem typischen Experiment ein Array von 100 Spots erzeugt, die die Konzentration der Expressionsvektor-DNA und des kationischen Lipids je um einen Faktor von 100 variieren, während die Konzentrationen von Transferrin und Polylysin konstant bleiben. Diese Gitteranordnungen können von Hand aufgetragen werden, wobei jeder Spot einen Durchmesser von annähernd 1–2 mm hat, sodass wir nach dem Ausplattieren der Zellen nur 200–400 Zellen auf jedem Spot haben. Bei diesen Prozeduren glaubt man, dass Transfektionseffizienzen im Bereich von 0,01 bis 1% für viele der Zelllinien mit geringer Effizienz existieren, aber mit diesen Prozeduren nicht nachweisbar sind. Sobald die Transfektionseffizienzen nachweisbar sind, ist es möglich, die Transfektion zu optimieren, indem die Parameter, wie die Zeit der Vorinkubation von verschiedenen Komponenten, variiert oder die Zelldichte verändert wird.
Zelllinien werden mit geringfügiger Abänderung des Protokolls, das in Beispiel 1 beschrieben ist, auf STEP-Transfektion mit hoher Effizienz analysiert. Diese Zelllinien umfassen, jedoch nicht ausschließlich, die oben beschriebenen Zelllinien sowie andere Zelltypen einschließlich CHO-, HeLa-, MCF-7-, A431-, BHK- und AtT-20-Zellen. Für diese Assays werden größere Mengen von DNA-Komplexlösung hinzugefügt, sodass der Bereich der DNA-Spots einen Durchmesser von 1–2 cm hat und 10.000 Zellen auf jeden DNA-Spot ausplattiert werden. Dies wird die Bestimmung der Transfektionseffizienz mit größerer Sensitivität in dem Bereich von 0,01 bis 1% ermöglichen. Für HEK-293T-Zellen wurde das Verhältnis von DNA, kationischem Protein, kationischem Lipid und Transferrin für die Komplexbildung optimiert. Ähnliche Optimierungen werden für andere Zelllinien durchgeführt. Die optimalen Bedingungen, die für HEK-293-Zellen bestimmt wurden, werden als ein Ausgangspunkt für die Analyse anderer Zelllinien verwendet, einschließlich jener, bei denen anfänglich eine niedrigere Transfektionseffizienz beobachtet wurde (COS-1, COS-7 und CV-1).
4. Genetische Selektion von Zellen, die für die STEP-Transfektion zuständig sind
Schließlich wird die genetische Selektion dazu verwendet, Klonzellen mit hohen STEP-Transfektionseffizienzen nach der STEP-Transfektion auszuwählen. HEK-293T-, NIH-3T3-, CV-1- und CHO-Zellen werden zum Beispiel auf DNA-Spots ausplattiert, die den Expressionsvektor pTK-Hyg enthalten, wodurch die Selektion von stabil transfizierten Zellen in Gegenwart von Hygromycin ermöglicht wird. Stabile Zellen wurden nach der STEP-Transfektion und der Behandlung mit Hygromycin ausgewählt (siehe vorherige Beispiele). Es wird geglaubt, dass der Prozess der Transfektion und Selektion eine Unterpopulation von Zellen anreichert, die für die STEP-Transfektion geeigneter sind als die parentale Zellpopulation. Vor dem Einschluss von Transferrin in den STEP-Komplexen wurden COS-1-Zellen unter Verwendung einer G418-Selektion isoliert, die mit einer höheren Effizienz transfizierten; diese erhöhte Effizienz wurde jedoch nicht aufrechterhalten, da sie schnell zwischen 5 und 10 Passagen verloren ging.
Eine zweite Reihe von Experimenten erzeugt Zellen, die stabil mit einem konstitutiv exprimierten DsRed-Konstrukt und dem pCRE-d2EGFP-Plasmid transfiziert wurden. Diese Transfektionen führen zur Isolation einer Zelllinie mit einem mäßigen Niveau der DsRed-Expression und einer kaum nachweisbaren Expression von d2EGFP im Grundzustand. Diese Zellen haben das Potenzial, ein viel sensitiveres Maß der Induktion des CRE-EGFP-Reporters zu liefern, wobei das Verhältnis der Fluoreszenz bei der maximalen Wellenlänge für EGFP zu der Fluoreszenz bei der maximalen Wellenlänge für DsRed verwendet werden kann. Diese Zellen, die als Ratiometrisch-Reagierende Zellen (RRC) bezeichnet werden, normalisieren die Unterschiede in der Zellmorphologie, die zu einer Veränderung der Fluoreszenzintensität führen können, die in STEP-transfizierten Zellen beobachtet wurde. Die RRCs werden verwendet, um den Grad der Sensitivität für oder den Umfang des dynamischen Reaktionsbereichs auf die sekundäre Transfektion mit der C-Untereinheit von PKA zu bestimmen, einer Zelle, die das CRE-d2EGFP-Plasmid stabil exprimiert. Die Ergebnisse mit RRCs werden mit Expressionsexperimenten verglichen, bei denen sowohl der Reporter (pCRE-d2EGFP) als auch der Expressionsvektor der C-Untereinheit transient transfiziert werden (wie beschrieben in Beispiel 8). Die RRC-Zelllinien werden für die Quantifizierung der Fluoreszenzinduktion verwendet, wie unten beschrieben in Abschnitt B.
5. Erhöhung der Nachweiseffizienz über GFP hinaus
GFP, seine Mutanten mit veränderten Spektraleigenschaften und andere fluoreszierende Proteine haben die Art der Durchführung von vielen Experimenten der Genexpression und zellulären Lokalisierung grundlegend verändert (TSien, R. Y., Annu Rev Biochem 67: 509–44 (1998)). Auf der Zellebene sind diese fluoreszierenden Proteine jedoch relativ ineffizient in ihrem Nachweis, da sie annähernd mikromolare Niveaus erreichen müssen, bevor sie in Zellen nachweisbar sind. Reportermoleküle, die den zellulären Zusammenbruch erfordern, wie Luciferase, können im Allgemeinen in vitro bei 10- bis 100-fach niedrigeren Expressionsniveaus nachgewiesen werden als solche, die die GFP-Expression in vivo nachweisen müssen. Es wird geglaubt, dass mehr Zellen während der STEP-Prozedur transfiziert werden, als wir unter Verwendung des Fluoreszenzprotein-Nachweises nachweisen können. Daher wird ein alternatives Reportersystem für die Verwendung in der STEP-Transfektion wie folgt entwickelt.
Vor kurzem beschrieben Tsien und seine Mitarbeiter ein neuartiges Reporterexpressions- und Nachweissystem, das das E. coli-b-Lactamase-Enzym als einen Reporter benutzt (Zlokarnik, et al, Science 279: 84–8 (1998)). Der neue Aspekt dieses Systems war der Mechanismus des Enzymnachweises, der ein neues Substratmolekül für beta-Lactamase, genannt CCF2/AM, einen zellpermeanten Acetoxymethyl(AM)-Ester, umfasste. Sobald er in der Zelle ist, werden die AM-Gruppen durch zelluläre Esterasen aufgespalten, um das CCF2-Molekül in hohen Konzentrationen in den Zellen einzuschließen. CCF2 selbst hat zwei fluoreszierende Reste (ein 7-Hydroxycumarin-Donorfluorophor und ein Fluorescein-Akzeptorfluorophor), die nahe beieinander liegen und interagieren, um den Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) einzugehen, um eine grüne Emission (520 nm) zu erzeugen. Wenn CCF-2 jedoch durch beta-Lactamase gespalten wird, findet FRET nicht mehr statt, und die Fluoreszenzemission aus dem 7-Hydroxycumarin-Fluorophor liegt nun in den blauen Wellenlängen (447 nm). Der Nachweis von beta-Lactamase mit CCF2/AM soll 1.000-fach sensitiver sein als der Nachweis von grün fluoreszierendem Protein auf der Grundlage von einem Molekül pro Zelle. Des Weiteren hat das beta-Lactamase-Protein eine Halbwertszeit von annähernd 3 Stunden und ermöglicht eine größere Sensitivität auf Veränderungen in der Gentranskription als GFP (Halbwertszeit von 24 Stunden).
Daher werden Zellen mit einem Expressionsvektor der CMV-beta-Lactamase (Aurora Biosciences) STEP-transfiziert, und 24 oder 48 Stunden später bei Raumtemperatur mit CCF2/AM inkubiert (Aurora Biosciences). Fluoreszenzbestimmungen benutzen die Fluoreszenzmikroskopie mit der Anregung bei 409 nm, und das Emissionsverhältnis bei 447 nm (Produkt) wird mit der Emission bei 520 nm (Substrat) verglichen, um die Menge der b-Lactamase-Expression zu bestimmen. Die Fixierung der Zellen mit Formaldehyd, Glutaraldehyd oder anderen Reagenzien kann die quantitative Bestimmung der CCF2-Fluoreszenz in fixierten Zellen derart verbessern, dass die CCF2-Spaltung in Verbindung mit DNA-Mikroarray-Objektträger-Scannern verwendet werden kann. Jene Bedingungen, unter denen sich die Sensitivität der β-Lactamase als deutlich höher als die in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen GFP-Reporter erweist, und bei denen die CCF2-Quantifizierung an Fluoreszenz-Scanner angepasst wird, werden angewendet, wenn eine erhöhte Sensitivität erwünscht ist.
6. Quantifizierung der Reporterfluoreszenzinduktion durch PKA
Die quantitativen Aspekte von STEP werden wie folgt entwickelt. Bildanalyseprogramme wurden verwendet, um Transaktivierungsassays mit der C-Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase und einer konstitutiv aktiven Form der cGMP-abhängigen Proteinkinase (PKG) mit den Bildanalyseanwendungen Microcomputer Imaging Devise (MCID) und NIH-Image zu charakterisieren. Unter Verwendung der Pixeldichte-Histogrammanalyse dieser Programme werden die Fluoreszenzintensitäten über den STEP-DNA-Spots 16- bis 20fach erhöht durch den Einschluss einer konstitutiv aktiven Kinase mit dem CRE-d2EGFP-Reporterplasmid. Zwei verschiedene konstitutiv aktive Kinasen wurden für diese Experimente verwendet, entweder die C-Untereinheit von PKA (Gamm, et al, J Biol Chem 271: 15736–42 (1996)) oder die cGKIbS79D-Mutante von PKG (Collins, et al, J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)). Große Mengen des Reporter-Expressionsvektors (90–95% der gesamten DNA) können für eine erhebliche Induktion durch den Expressionsvektor der C-Untereinheit erforderlich sein (siehe vorhergehende Beispiele).
Die transkriptionellen Antworten nach der STEP-Transfektion werden in Transfektionsexperimenten charakterisiert, die variierende Mengen des Expressionsvektors der C-Untereinheit umfassen (von 0,1% der gesamten DNA bis 5%). Die Linearität der Antworten auf ansteigende Mengen des Expressionsvektors der C-Untereinheit wird durch die Quantifizierung der Erhöhung der zellulären Fluoreszenz unter Verwendung der Dichtehistogrammanalyse bestimmt. Die Quantifizierung des Signals aus der STEP-Transfek tion unterscheidet sich erheblich von der für DNA-Array-Hybridisierungsexperimente, da nur ein geringer Teil des STEP-Spotbereichs ein Fluoreszenzsignal erzeugt. In Analysen von STEP-Spots werden Dichtehistogramme für alle Pixel innerhalb der beiden zu vergleichenden DNA-Spots erzeugt. Diese Histogramme werden verglichen und die 2% der Pixel mit der höchsten Intensität werden aus jedem Abbild für die Quantifizierung ausgewählt. Eine etwa lineare Erhöhung mit dem Expressionsvektor der C-Untereinheit wird beobachtet, eventuell mit einer Minderung bei höheren Konzentrationen aufgrund der Veränderungen in der Zellmorphologie, die speziell durch die C-Untereinheit induziert werden (Huggenvik, et al, Mol Endocrinol 5: 921–30 (1991); Collins, et al, J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)). Die gleiche Analyse wird auch mit einer Kinase-defekten Form der C-Untereinheit durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Wirkung in der Kinaseaktivität der C-Untereinheit begründet ist (Brown, et al, J Biol Chem 265: 13181–13189 (1990)). Sobald die RRCs wie oben beschrieben erzeugt wurden, wird die gleiche Analyse durchgeführt, bei der nur der Expressionsvektor der C-Untereinheit und ratiometrische Bildverarbeitung verwendet werden, die die DsRed-Fluoreszenz als einen internen Standard für die Expression benutzt.
B. Die hemmende Domäne der cGMP-abhängigen Proteinkinase wird unter Verwendung der STEP-Transfektion identifiziert, um eine Mutations-Expressionsbibliothek zu analysieren.
Diese Experimente beschreiben die Anwendung von STEP für die Analyse der Proteinstruktur und -funktion. Gegenwärtig wenden eine Mehrzahl der Studien einfache Deletionsanalysen von Proteinen an, um funktionelle Domänen zu definieren, und sie verwenden dann die Homologie zwischen diesen Domänen und bekannten Proteinen, um vorherzusagen, die Funktion welcher Aminosäuren darin wichtig ist. Die STEP-Transfektion und -Analyse kann dazu ver wendet werden, eine umfassendere Mutagen-Analyse der Proteinstruktur und -funktion zu ermöglichen.
Die cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG) wird als ein beispielhaftes Ziel für Mutagenese und STEP-vermitteltes funktionelles Screening ausgewählt. Sie ist ein besonders nützliches Ziel, da es einen Mangel an Kenntnissen in Bezug auf die Struktur dieses Proteins im Verhältnis zu den cAMP-abhängigen Proteinkinasen (PKAs) gibt. Die folgenden Absätze bieten kurze Hintergrundinformationen zu den PKAs und PKGs.
Eine große Anzahl an Liganden für sieben Transmembranrezeptoren (z. B. Epinephrin) verändern die Transkription in ihren Zielzellen, indem sie die intrazelluläre Konzentration von cAMP erhöhen. Die Wirkungen von cAMP werden durch cAMP-abhängige Proteinkinasen (PKA) vermittelt. cAMP bindet sich an die regulatorischen (R) Untereinheiten von PKA, was zu der Freisetzung der aktiven katalytischen (C) Untereinheit führt, sodass sie zelluläre Proteine phosphorylieren kann. Es ist sehr viel über die Wechselwirkungen zwischen den R- und C-Untereinheiten von PKA und darüber, wie die cAMP-Bindung die hemmende Wirkung der R-Untereinheit unterstützt, bekannt (Taylor, et al, Pharmacol Ther 82: 133–41 (1999)).
Viele Gene, die durch cAMP reguliert werden, enthalten eine palindrome Sequenz von Nukleotiden (TGACGTCA), die die transkriptionelle Induktion vermittelt und als zyklisches AMP-Antwortelement (CRE) bekannt ist. Das CRE-Bindungsprotein (CRE) bindet sich als ein Dimer an das CRE und vermittelt nur die transkriptionelle Regulation, wenn es durch die C-Untereinheit auf Ser 133 phosphoryliert wird. Dieser Signalweg hat sich in vielen Zelltypen gut bewährt (Shaywitz, et al, Anna Rev Biochem 68: 821–61 (1999).
Atriale natriuretische Peptide und Stickoxide verändern nicht die cAMP-Spiegel, sondern erhöhen eher die Spiegel von cGMP in glatten Muskelzellen und Neuronen. Die Mehrzahl der zellulären Wirkungen von cGMP wird durch die cGMP-abhängige Proteinkinase (PKG) vermittelt, die in Struktur und Funktion der cAMP-abhängigen Proteinkinase ähnelt, mit der Ausnahme, dass die katalytische Komponente der Kinase eigentlich mit der regulatorischen Komponente als Teil der gleichen Polypeptidkette verschmolzen ist. Obwohl viel über die Wechselwirkungen zwischen den R- und C-Untereinheiten von PKA bekannt ist, ist wenig über die Wechselwirkungen zwischen den regulatorischen und katalytischen Domänen von PKG bekannt. Sobald sich jedoch das cGMP an PKG bindet, ist es in der Lage, Proteine einschließlich CREB zu phosphorylieren, um Veränderungen in der Gentranskription auf eine Weise, die analog zu, aber quantitativ verschieden von PKA ist, zu vermitteln (Collins, et al, J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)).
Die Experimente in diesem Beispiel beschreiben den inhibierenden Bereich der regulatorischen Domäne von PKG. Diese Information ist auch für den Entwurf von spezifischen Inhibitoren für PKG nützlich, die PKA nicht inhibieren. Der pCMV.FLAG-cGKIb-Expressionsvektor, der die FLAG-markierte mausspezifische cGMP-abhängige Proteinkinase kodiert (Collins, et al., J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)), wird unter Verwendung einer Kombination aus Natriumnitrit- und Ameisensäurebehandlungen wie zuvor beschrieben mutiert (Orellana, et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4726–30 (1992)). Nach der Mutagenese wird die DNA als eine Vorlage für die Verstärkung mit Hilfe von Primern verwendet, die gegen das Initiationskodon und das Kodon für Tyr 135 gerichtet sind, das die Transition zwischen der aminoterminalen regulatorischen Domäne und der zyklischen Nukleotid-bindenden Domäne darstellt. Die PCR-verstärkten Fragmente werden in Bg1II/NheI-Verdau von pCMV.cGKIb subkloniert, und die resultierenden Plasmide werden als eine Mutations-Bibliothek für das Screening verwendet. Bevor die Bibliothek analysiert wird, werden 12 Klone zur Sequen zierung zufällig ausgewählt, um die Mutations-Häufigkeit in der Bibliothek zu bestimmen. Aus vorherigen Charakterisierungen der Mutagenese-Prozedur werden durchschnittlich etwa 2–3 Nukleotidsubstitutionen in jedem Mutantenklon beobachtet. Annähernd 5–10% der Mutanten enthalten Nonsensmutationen, und diese Plasmide exprimieren keine funktionelle Kinase, da die Translation vor dem kodierenden Bereich der katalytischen Domäne aufhört. Etwa 80–90% der Klone enthalten Missensmutationen. Da etwa 15 Reste die autoinhibitorische Domäne ausmachen, zeigen 4–5% der Gesamtzahl der Klone eine konstitutive Kinaseaktivierung. Ein Pool von 1.000 Klonen wird unter Verwendung der STEP-Transfektion untersucht, was zu der Beobachtung von etwa 40–50 individuellen Mutanten mit konstitutiver Kinaseaktivität führt. Für die Klone, die eine konstitutive Aktivierung aufweisen, wird die Stelle der Mutationen bestimmt, indem der mutierte Bereich sequenziert und die konstitutive Aktivierung der Mutanten mittels Standard-Kinaseaktivitätsmessungen und in vivo Luciferaseassays bestätigt wird.
In dem Screeningprozess der Mutantensammlung mit der STEP-Transfektion wird das STEP-Protokoll für die Reinigung von Plasmid-DNA mit hohem Durchsatz optimiert. Das 96-Well-Format wird dazu verwendet, für die Transfektion Plasmid-DNAs unter Verwendung des QIAwell 96 Ultra Plasmid Kits (Qiagen) aus den Mutantenklonen zu isolieren. Die Plasmid-DNAs werden durch W-Absorbierung quantifiziert und dazu verwendet, STEP-Spots auf Mikroskopie-Objektträgern zu erzeugen. Alle 1000 Mutanten-ExPressionsvektoren zusammen mit positiven und negativen Kontrollen für die STEP-Transfektion und EGFP-Fluoreszenzquantifizierung werden punktförmig aufgetragen. Auf der Grundlage der Ergebnisse der Experimente in Abschnitt A werden die Mutantenvektoren entweder vor dem Spot-Auftragen mit dem pCRE-EGFPC1-Reportervektor vermischt, oder die RRCs, die das pCRE-EGFPC1-Konstrukt stabil exprimieren, werden verwendet (RRCs werden weiter in Beispiel 11 A 4 beschrieben). Der pCMV.Neo-parentale Expressionsvektor und der Expressionsvektor, der die Kinase-defekte Mutante kodiert (mCGKIbK404R; Collins, et al., J Biol Chem 274: 8391–404 (1999)), werden als negative Kontrollen für das Screening verwendet. Der Expressionsvektor, der die konstitutiv aktive Mutante mCGKIbS79D kodiert, und der Expressionsvektor für die C-Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase dienen als positive Kontrollen.
Vorläufige Ergebnisse mit mCGKIbS79D in STEP-Transfektionen mittels pCRE-d2EGFPC1 führen zu einer 16- bis 20-fachen Induktion der EGFP-Fluoreszenz mit den konstitutiv aktiven Mutanten. Andere Mutationen können nicht solch eine hohe Aktivierung erzeugen, aber mehrere andere Mutationen erzeugen eine ähnliche Wirkung.
BEISPIEL 12
DIE VERWENDUNG VON STEP BEI DER ENTWICKLUNG VON WIRKSAMEN ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN
Die Herunterregulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Strategien weist eine große Vielzahl an Anwendungen von der Grundlagenforschung bis hin zu klinischen Behandlungen auf. Diese Methode verzeichnete mehrere bemerkenswerte Erfolge, einschließlich der Verabreichung von klinisch erprobten Arzneistoffen (Nemunaitis, et al., J Clin Oncol 17: 3586–95 (1999); Yuen, et al., Clin Cancer Res 5: 3357–63 (1999)). Sie wird jedoch nicht viel verwendet aufgrund der Schwierigkeit des Identifizierens von wirksamen Antisense-Sequenzen. Das Wirkprinzip von Antisense-Oligonukleotiden ist in den meisten Fällen unklar (Crooke, Biochim Biophys Acta 1489: 31–44 (1999)), obwohl die Wirkung von RNase H beim Abbau von RNA/DNA-Komplexen für viele wirksame Antisense-Oligonukleotide enthalten war. In einigen Fällen gibt es Beweise für zusätzliche Mechanismen, einschließlich der Hemmung der 5'-Kappenbildung an mRNAs und translationaler Hemmung (Baker, et al., Biochim Biophys Acta 1489: 3–18 (1999)).
Ein schnelles und effizientes Mittel zur Analyse von wirksamen Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen würde eine weitreichende Anwendbarkeit in der biomedizinischen Forschung haben. Solch eine Screening-Methode würde es möglich machen, Antisense-Reagenzien für jedes relevante spezifische Gen zu entwickeln, was die Herunterregulation von Proteinniveaus ermöglicht, für die keine anderen hemmenden Agentien zur Verfügung stehen. Die STEP-Transfektion ist in der Lage, das Screening von Tausenden von Antisense-Sequenzen auf ihre Wirksamkeit in der Herunterregulation von Proteinniveaus angesichts der derzeitigen Fortschritte in der Oligonukleotid-Synthese zu ermöglichen (Lipshutz, et al., Nat Genet 21: 20–4 (1999)).
Zufallssequenzen von Antisense-Oligonukleotiden werden in STEP-Format analysiert, um zu bestimmen, welche Sequenzen in der Lage sind, einen bestimmten Prozess zu stören. Antisense-Oligonukleotide gegen Adenylylcyclase, der katalytischen Untereinheit von cAMP-abhängiger Proteinkinase, und CREB haben zum Beispiel alle das Potenzial, die Erhöhung in einem CRE-EGFP-Reporter zu stören, die als Antwort auf Isoproterenol gesehen wird, das auf den β-adrenergen Rezeptor wirkt. Somit wird eine Zufallsbibliothek von Antisense-Oligonukleotiden effizient mittels STEP-Transfektion in Zellen eingeführt, und Sequenzen, die die Fluoreszenzinduktion durch Isoproterenol stören, umfassen Sequenzen, die zu Adenylylcyclase, der katalytischen Untereinheit von PKA und CREB, komplementär sind. Solange eine mikroskopisch nachweisbare Anzeige für jeden relevanten regulatorischen Signalweg verfügbar ist, kann diese Methode angewendet werden, um neuartige Komponenten einer Signaltransduktionskaskade oder eines beliebigen anderen zellulären Signalwegs zu identifizieren.
In diesem Beispiel sind die STEP-Transfektionsmethoden für den Eintritt von Oligonukleotiden in Zellen aus fixierten Komplexen unter Verwendung eines wohlcharakte risierten Kontrollproteins und eines neuartigen Assays für die Antisense-Hemmung der Expression optimiert. Nach der Optimierung der Oligonukleotidwirksamkeit mittels STEP werden Oligonukleotid-Sequenzen identifiziert, die die Produktion einer Ziel-Proteinkinase hemmen, für die Antisense-Reagenzien zuvor nicht beschrieben wurden.
A. Optimierung der STEP-Transfektion für die zelluläre Verabreichung von Antisense-Oligonukleotiden
Eine große Anzahl von erfolgreichen therapeutischen Antisense-Anwendungen wurde gemeldet, aber die am strengsten getesteten sind jene Anwendungen, die es in die Phase der klinischen Versuche geschafft haben. ISIS3521 ist ein Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid-Arzneistoff auf der Grundlage der Sequenz der Proteinkinase C, der erheblich positive Auswirkungen auf das klinische Ergebnis für Patienten mit Eierstockkrebs und anderen Krebsgeschwüren hatte (Nemunaitis, et al., J Clin Oncol 17: 3586–95 (1999); Yuen, et al., Clin Cancer Res 5: 3357–63 (1999)). In diesem Abschnitt wird ein Antisense-Oligonukleotid in Übereinstimmung mit der angestrebten Sequenz von menschlicher PKCα und ein PKCα-EGFP-Fusionsprotein verwendet, um optimale Bedingungen für die STEP-vermittelte Hemmung von PKCα-Proteinniveaus zu identifizieren.
Eine Indikator-Zelllinie wird als Erstes aufgebaut. Diese Zelllinie exprimiert ein PKCα-EGFP-Fusionsprotein sowie das DsRed-fluoreszierende Protein. Ein menschlicher PKCα-EGFP-Expressionsvektor steht zur Verfügung (Clontech). Die Reporter-Zelllinie wird durch das Transfizieren des pPKCα-EGFP-Plasmids in HEK-293T-Zellen und das Selektieren von stabil exprimierenden Klonen unter Verwendung der G418-Resistenz und des Neomycin-Phosphotransferase-Gens, das auf dem pPKCα-EGFP-Vektor enthalten ist, erzeugt. Mehrere stabile Zelllinien werden ausgewählt, die hohe, mittlere und niedrige Niveaus des PKCα-EGFP-Proteins exprimieren; diese werden dann sekundär mit einem Gemisch des pDsRedCl-Expressionsvektors und des pTK-Hyg-Expressionsvektors transfiziert, das die Resistenz gegenüber Hygromycin kodiert (10:1 Molverhältnis). Die pTK-Hyg-Plasmide werden gewonnen, die sich in dem Umfang der Expression sowohl von PKCα-EGFP als auch DsRed unterscheiden. Zelllinien, die sehr hohe Niveaus von PKCα-EGFP exprimieren, zeigen keine bedeutende Reduktion der Fluoreszenz, erzeugen aber die reproduzierbarsten Ergebnisse mit Antisense-Experimenten.
Diese Zelllinien werden verwendet, um die Bedingungen zu bestimmen, bei denen ein Kontroll-Antisense-PKCα-Phosphorothioat-Oligonukleotid (GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA; ISIS3521), das in STEP-Komplexen enthalten ist, zu einer Minderung der Expression des PKCα-EGFP-Fusionsproteins führt. Die Wirksamkeit des Oligonukleotids wird zuerst unter Verwendung von Standard-Antisense-Verabreichungsverfahren bestätigt (Dean, et al., J Biol Chem 269: 16416–24 (1994)), um 60 mm Schalen normaler HEK-293T-Zellen zu behandeln, mit anschließender Western Blot-Analyse der PKCα-Proteinniveaus. PKCα-Antikörper sind für diesen Zweck handelsüblich (Upstate Biotechnology, Inc.). Nach der Bestätigung der Wirksamkeit des PKCα-Antisense-Oligonukleotids wird im zweidimensionalen Array die gleiche Analyse der Faktoren angewendet, die die Transfektionseffizienz verändern, wie sie für die Plasmid-DNA-Transfektion verwendet wurde (siehe Vorläufige Ergebnisse und Spezifisches Ziel 1A). Im Wesentlichen variiert die Art des kationischen Lipids und Proteins, die in dem DNA-Komplex enthalten sind, wie das Verhältnis der verschiedenen Komponenten des DNA-Komplexes. Ein erhöhter Druck verbessert die Wirkung der Antisense-Oligonukleotide nach STEP, ähnlich den vorhergehenden Berichten, dass die Druckbehandlung die Aufnahme von Oligodeoxynukleotiden erhöht (Mann, et al, Proc Natl Acad Sci USA 96: 6411–6 (1999)). Für die Anwendung von erhöhtem Druck wird eine kleine Plexiglas-Kammer mit einem versiegelten Kolben und einem Druckmesser konstruiert. Die Kammer wird auf 37°C vorgewärmt und mit 5% CO₂ gefüllt. Jede 10 cm Gewebekulturplatte wird bei einem Druck von 1 bis 3 atm für 1 bis 10 min behandelt, und die Wirkung auf die STEP-Transfektionseffizienz wird wie oben beschrieben bestimmt.
Die Bedingungen für die optimale STEP-Komplexbildung sind im Allgemeinen ähnlich den Bedingungen für Plasmid-DNA.
B. Wirksame Antisense-Oligonukleotide für Serum- und Glucocortikoid-regulierte Kinase werden mittels STEP entwickelt
Die Prozedur zur Einführung von Antisense-Oligonukleotiden in lebende Zellen ist wie in Abschnitt A beschrieben optimiert. Die Nutzbarkeit von STEP für das eigentliche Screening von Antisense-Oligonukleotiden auf ihre Fähigkeit, die Expression herunterzuregulieren, wird durch die Verwendung eines neuartigen Ziels für die Antisense-Herunterregulation demonstriert.
Serum- und Glucocortikoid-abgeleitete Proteinkinase (SGK) wurde ursprünglich in einer anderen Analyse identifiziert, um mRNAs, die als Antwort auf Glucocortikoide induziert wurden, zu identifizieren (Webster, et al, Mol Cell Biol 13: 2031–40 (1993)). Die Glucocortikoid- oder Serumstimulation führt zu einer 10-fachen Erhöhung sowohl der SGK-mRNA als auch des Proteins. Unter den Proteinkinasen ist SGK am meisten homolog zu Akt/PKB, wobei es 54% Aminosäurehomologie gegenüber der kationischen Domäne aufzeigt. Drei verschiedene Isoformen von SGK werden weitgehend exprimiert (Kobayashi, et al., Biochem J 344 Pt 1: 189–197 (1999)), und alle werden durch die Phosphoinositid-abhängige Proteinkinase-1 (PDK-1) aktiviert, die auf eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Zellreizen reagiert. Da viele Zellreize auch die Expression von SGK induzieren, und die Induktion so schnell ist, wurde SGK als ein Immediate-Early-Gen klassifiziert. SGK ist die einzige Serin-/Threoninkinase, die in diese Klassifikation fällt (Buse, et al., J Biol Chem 274: 7253–63 (1999)). Es gibt jedoch keine bekannten physiologischen Substrate für diese Proteinkinase, und keine spezifischen Inhibitoren der SGK-Kinaseaktivität wurden gemeldet.
Die Eigenschaften von SGK machen es zu einem idealen Ziel für die Antisense-Herunterregulation. Erstens würde sich ein wirksames Antisense-Oligonukleotid als sehr nützlich bei der Charakterisierung von Downstream-Wirkungen von SGK und der Identifikation von Substratproteinen erweisen. Zweitens macht es die kurze Halbwertszeit des Proteins zu einem idealen Ziel für Antisense-Oligonukleotide, da Antisense-Oligonukleotide am wirksamsten gegenüber mRNAs sind, die Proteine mit einer kurzen proteolytischen Halbwertszeit kodieren (Baker, et al., Biochim Biophys Acta 1489: 3–18 (1999)). Schließlich kann es möglich sein, Antisense-Oligonukleotide zu entwickeln, die zwischen Isoformen von SGK unterscheiden würden, um Isoform-spezifische Funktionen zu identifizieren.
Um Antisense-Oligonukleotide zu analysieren, wird ein Expressionsvektor, der ein SGK1/EGFP-Fusionsprotein kodiert, auf eine Weise erzeugt, die analog zu dem PKCa/EGFP-Expressionsvektor ist, der in dem Spezifischen Ziel 2A verwendet wird. Die Maus-SGK1-cDNA wird entweder aus dem Labor von Dr. Eiten Reuveny am Weizmann-Institut in Rehovot, Israel, erworben, oder durch PCR-Verstärkung auf der Grundlage der veröffentlichten Maus-SGK1-Sequenz gewonnen (Genbank-Zugangsnummer AF205855). Die Halbwertszeit des kodierten SGK1/EGFP-Fusionsproteins wird durch herkömmliche transiente Transfektion des Vektors in HEK-293T-Zellen bestimmt, mit anschließender Behandlung mit Serum, um SGK zu induzieren, und der Behandlung mit Cycloheximidin, um die Proteintranslation zu hemmen. Zelluläre Extrakte werden nach 0, 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der Cycloheximidin-Behandlung genommen, und die Extrakte werden durch Western Blot-Analyse mit Antikörpern gegen EGFP analysiert. Die Menge an verbleibendem Protein zu jedem Zeitpunkt wird bestimmt, und eine Halbwertszeit für das Protein wird berechnet. Die Halbwertszeit des Fusionsproteins liegt bei annähernd 20–30 Minuten, ähnlich der Halbwertszeit von SGK. Unter einigen Umständen stabilisiert die EGFP-Fusion das Protein. Für diese Umstände wird ein zweiter Expressionsvektor erzeugt, bei dem SGK mit dem destabilisierten d2EGFP-kodierenden Bereich verschmolzen ist (Li, et al., J Biol Chem 273: 34970–5 (1998)), und die Halbwertszeit des destabilisierten Konstrukts wird bestimmt. Wie oben für die PKCα-EGFP-Reporter-Zelllinie beschrieben, werden stabile Zelllinien erzeugt, die das SGK1-EGFP-Fusionsprotein sowie das interne Standard-DsRed-fluoreszierende Protein derart exprimieren, dass die ratiometrische Bildverarbeitung verwendet werden kann, um die Sensitivität des Fluoreszenz-Scannens zu erhöhen.
Ursprünglich werden 10 verschiedene Oligonukleotid-Sequenzen für die SGK1-mRNA auf der Grundlage ihres Mangels der Neigung, Haarnadelstrukturen zu bilden, und der vorhergesagten Stabilität des Hybrids mit der SGK1-mRNA ausgewählt. Die Länge der Oligonukleotide variiert von 18 bis 24 Nukleotiden in Abhängigkeit von der Basenzusammensetzung. Auf der Grundlage unserer aktuellen Analyse der Maus-SGK-mRNA-Sequenz werden die folgenden Nukleotidsequenzen für die Synthese der ersten zehn Oligonukleotide angestrebt: 23–43 (21-mer); 38–60 (23-mer); 275–298 (24-mer); 366–389 (24-mer); 826–849 (24-mer); 1252–1270 (19-mer); 1626–1647 (22-mer); 1690–1709 (20-mer); 1859–1880 (22-mer) und 2243–2266 (24-mer). Die ersten beiden Oligonukleotide und die letzten vier Oligonukleotide werden zu den 5'-nicht translatierten und den 3'-nicht translatierten Bereichen geleitet, die zwischen den SGK1-, SGK2- und SGK3-mRNAs schwach konserviert sind (Kobayashi, et al., Biochem J 344 Pt 1: 189–97 (1999)). Die Antisense-Oligonukleotide besitzen einfache Phosphorothioat-Verknüpfungen, die sich in vielen Fällen als wirksam erwiesen haben.
Wie oben beschrieben, bilden die Oligonukleotide Komplexe mit den optimalen Konzentrationen von kationischem Lipid, kationischem Protein und Transferrin, die erwiesenermaßen das PKCα-EGFP-Fusionsprotein wie in Abschnitt A beschrieben herunterregulieren. Geringe Variationen dieser Parameter sind optimal für ein unterschiedliches Oligonukleotid gegenüber einer unterschiedlichen mRNA; daher ist die STEP-Transfektion für die SGK1-mRNA optimiert. Bestimmte Bedingungen werden derart bestimmt, dass eines der obigen Oligonukleotide erwiesenermaßen das Fluoreszenzsignal des SGK1-EGFP erheblich vermindert (mehr als 90%ige Reduktion); diese Bedingungen werden dann in den im Folgenden beschriebenen Experimenten verwendet, um die Wirksamkeit des Oligonukleotids bei der Herunterregulation der ursprünglichen SGK1-mRNA festzustellen. Falls die Bedingungen, die den SGK1-EGFP-Reporter mit einzelnen Nukleotiden herunterregulieren, nicht leicht zu bestimmen sind, werden Oligonukleotidpools auf ihre Effizienz im Verhältnis zu der Effizienz von individuellen Nukleotiden untersucht. Ein zweites Set von zehn zusätzlichen Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen wird angestrebt, falls sich keine Kombination der ersten zehn leicht als wirksam nachweisen lässt. Das zweite Set von Oligonukleotiden wird andere Bereiche der mRNA anstreben und wahrscheinlich zusätzliche Modifikationen der Oligonukleotide wie Selbst-Stabilisierung umfassen (Agrawal, S., Biochim Biophys Acta 1489: 53–68 (1999)).
Sobald eine wirksame Antisense-Oligonukleotid-Sequenz definiert ist, wird die Wirksamkeit des Oligonukleotids bei der Herunterregulation der endogenen SGK1-mRNA bestimmt. Zu diesem Zweck werden NMuMg-nichttransformierte Brustepithelzellen von Mäusen verwendet, die vor kurzem als ein Modellsystem für das Studium der SGK1-Antwort entwickelt wurden (Bell, et al., J Biol Chem 275: 25262–72 (2000)). NMuMg-Zellen werden auf Kontrollplatten oder auf Platten, die behandelt wurden, um STEP-Komplexe mit den SGK1-Antisense-Oligonukleotiden zu bilden, ausplattiert. Nach dem Ausplattieren werden die Zellen für 3 Minuten mit 0,3 M Sorbitol schockbehandelt, um SGK1-mRNA- und -Proteinniveaus zu induzieren (Bell, et al., J Biol Chem 275: 25262–72 (2000)). Die Induktion von SGK-Niveaus und der Zeitverlauf des Abbaus des SGK1-Proteins in Gegenwart von Cycloheximidin werden durch Western Blotting unter Verwendung eines Antikörpers gegen das SGK1-Protein bestimmt (Upstate Biotechnology). Das Antisense-Nukleotid, das gegen PKCα gerichtet ist, dient als eine negative Kontrolle für dieses Experiment. Die Zellen, die auf den STEP-Präzipitaten ausplattiert sind, zeigen eine Verminderung der Induktion des SGK1-Proteins und eine Verminderung der Halbwertszeit des Proteins nach der Behandlung mit Cycloheximidin.
Falls es schwer ist, Nachweise dafür zu bekommen, dass das Antisense-Oligonukleotid für SGK1 das SGK1-Protein in NMuMg-Zellen herunterreguliert, werden die NMuMg-Zellen transfiziert und stabile Zelllinien, die das SGK1-EGFP-Fusionsprotein exprimieren, werden isoliert, um die optimalen Bedingungen für die Antisense-Behandlung mit dem SGK1-Antisense-Oligonukleotid zu identifizieren. NMuMg-Zellen werden mit mäßiger Effizienz transfiziert (Bell, et al., J Biol Chem 275: 25262–72 (2000)). Die Identifikation von wirksamen SGK1-Antisense-Oligonukleotiden ermöglicht ihre Verwendung in weiteren Studien, die die Funktion von SGK1 in NMuMg-Zellen sowie in anderen Zelllinien charakterisieren.
BEISPIEL 13
Bedingungen für das funktionelle Screening von cDNA-Expressionssammlungen mittels STEP
In diesem Beispiel wird die STEP-Transfektion auf das funktionelle Hochdurchsatz-Screening von Proteinen angewendet. Die beispielhaften Ergebnisse aus Proteinkinasen und die Regulation der Transkription zeigen, dass das funktionelle Hochdurchsatz-Screening von Proteinen mittels STEP an viele verschiedene Forschungsbereiche angepasst werden kann. Als ein weiteres Beispiel wird STEP in einem umfangreichen Screening von Signalwegkomponenten der Signaltransduktion effektiv angewendet, um funktionelle „Module", die für mehrere Aspekte des Zellmetabolismus von Bedeutung sind, auf eine Weise zu bestimmen, die analog zu der von Hartwell vorgeschlagenen Weise ist (Hartwell, et al., Nature 402: C47–C52 (1999).
A. Eine kleine Bibliothek von konstitutiv aktiven Proteinkinasen wird auf ihre Regulation von cAMP-Antwortelement(CRE)-abhängiger Transkription untersucht
Der klassische PKA/CREB/CRE-Mechanismus für die cAMP-Regulation der Genexpression wurde vor mehr als einem Jahrzehnt entwickelt (Gonzalez, et al., Nature 337: 749–52 (1989)). Seit dieser Zeit wurde bewiesen, dass eine Reihe von Proteinkinasen in der Lage sind, die Genexpression durch Phosphorylierung von CREB oder anderen Faktoren zu regulieren, die sich an das CRE binden können. Die Experimente in diesem Beispiel bestimmen die Fähigkeit einer Gruppe von 25 verschiedenen Proteinkinasen, die transkriptionelle Aktivität durch das CRE zu regulieren. Konstitutiv aktive Mutationen aller Proteinkinasen, die in diesen Experimenten verwendet werden, sind identifiziert und in Tabelle 1 aufgelistet. Diese Proteinkinasen wurden ausgewählt aufgrund der Verschiedenheit der Signaltransduktionswege, die sie repräsentieren, sowie aufgrund des Ausmaßes, in dem die konstitutiv aktiven Mutationen in vitro und in vivo charakterisiert wurden. Tabelle 1. Konstitutiv aktive Kinasen und ihre passenden Transkriptionsfaktoren
In diesen Experimenten wird jede der konstitutiv aktiven Formen der Kinasen in einen Expressionsvektor subkloniert, der ein Amino-terminales oder C-terminales FLAG-Epitop-Tag bereitstellt. Dieses Epitop wird verwendet, um die Menge der produzierten Proteinkinase nach der STEP-Transfektion zu quantifizieren. Der Expressionsvek tor enthält den menschlichen CMV-Promotor, der die Expression der Kinasen steuert, und jeder der Vektoren wird in normalen Transfektionsassays getestet, um zu demonstrieren, dass das Protein mit geeigneter Größe in vivo synthetisiert wird. Die konstitutiv aktiven Expressionsvektoren werden gemäß der in Tabelle 1 zitierten Verweise präpariert.
Sobald sie in herkömmlichen transienten Expressionsexperimenten bestätigt wurden, werden die Expressionsvektoren für die konstitutiv aktiven Kinasen in der STEP-Transfektion verwendet, um die Wirksamkeit zu bestimmen, mit der sie die CRE-abhängige Genexpression regulieren. Zwei verschiedene Formen der Transfektion werden angewendet. Zuerst werden STEP-Komplexe mit einem Gemisch eines individuellen Kinasevektors mit variierenden Mengen des pCRE-d2EGFP-Reporterplasmids gebildet. Diese Komplexe werden dann punktförmig aufgetragen, und HEK-293T- oder NIH-3T3-Zellen werden ausplattiert, um zu bestimmen, ob die Co-Expression der Kinase zu einer transkriptionellen Aktivierung des pCRE-d2EGFP-Reporterplasmids führt. Zusätzliche Zelllinien, die, wie in Beispiel 11, Abschnitt A, beschrieben, entwickelt wurden, werden dazu verwendet, die Funktion der zellspezifischen Transkriptionsfaktoren bei der Induktion der CRE-abhängigen Transkription zu untersuchen. Die STEP-transfizierten Zellen werden nach dem Ausplattieren zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert (6, 12, 24, 48 und 72 Stunden). Ein Set von Dreifach-Objektträgern wird zu jedem Zeitpunkt zur Bestimmung der GFP-Fluoreszenz verwendet (wie in Beispiel 8 beschrieben), und ein zweites Set von Dreifach-Objektträgern wird für das immunozytochemische Anfärben mit dem M2-monoklonalen Antikörper benutzt, um die Häufigkeit der FLAG-gekennzeichneten Proteinkinase einzuschätzen (wie in Beispiel 6 beschrieben). Aus diesen beiden Bestimmungen wird die relative Effizienz jeder Kinase für die Stimulation des CRE-EGFP-Reporters zu jedem Zeitpunkt ermittelt. Das resultierende kinetische Profil der transkriptionellen Regulation für jede Kinase wird für die 25 verschiedenen Kinasen verglichen, die in Tabelle 1 aufgelistet sind. Konstitutiv aktive Formen von PKA, PKG und CaMKII liefern die stärkste Induktion; etwas Induktion wird auch mit vielen der anderen Kinasen beobachtet (siehe Tabelle 1), in Übereinstimmung mit veröffentlichten Berichten.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wird das gleiche Set von 25 konstitutiv aktiven Kinasen in der STEP-Transfektion mit den RRC-Linien verwendet, die wie in Beispiel 11, Abschnitt A, beschrieben entwickelt wurden. Die intrazelluläre Konzentration von CRE-Stellen ist viel niedriger in STEP-Transfektionen mit den RRC-Linien, da das Reporter-Plasmid nicht mit der Kinase co-transfiziert wird, sondern schon in der Reporterzelllinie stabil exprimiert wird. Das Ergebnis ist ein viel sensitiverer Assay zur Aktivierung der Transkription durch konstitutiv aktive Kinasen. In dem Fall von RRC-Zelllinien sind variierende Mengen des Expressionsvektors für die konstitutiv aktiven Kinasen in den STEP-Komplexen derart enthalten, dass ansteigende Mengen von Proteinkinase produziert werden. Auf diese Art wird die Minimalmenge von Kinase, die für eine transkriptionelle Antwort erforderlich ist, durch den Vergleich der ratiometrischen Bildverarbeitung von GFP mit der Anfärbung des M2-monoklonalen Antikörpers bestimmt.
Die gewonnenen Daten werden dazu verwendet, um ein Induktionsprofil für jede Kinase über den Zeitverlauf von 72 Stunden zu erstellen. Diese Profile werden sowohl auf quantitativer als auch auf qualitativer Basis verglichen. Das Ergebnis ist die Identifikation von neuartigen Kinasen, die die CRE-abhängige Transkription regulieren können, sowie das Gruppieren der Kinasen in Clustern, die durch die Kinetik der CRE-Antwort definiert sind. Jegliche Unterschiede in solchen kinetischen Profilen, die in der Literatur nicht mechanistisch erklärt werden, dienen dann als Motivation, diesen bestimmten Kinase-Signalweg genauer zu untersuchen.
B. Die funktionelle Analyse der konstitutiv aktiven Proteinkinasen, erweitert auf ein größeres Set von 21 verschiedenen transkriptionellen Antwortelementen
Sobald die Antwort des CRE auf die konstitutiv aktiven Kinasen bestimmt wurde, wird ein Mikroarray-Format der STEP-Transfektion verwendet, um die Antwort eines Sets von 21 verschiedenen charakterisierten transkriptionellen Antwortelementen auf das Set von 25 konstitutiv aktiven Proteinkinasen zu bestimmen. Die Antwortelemente, die in diesen Experimenten verwendet werden, sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2. Ausgewählte Reportersequenzen für das funktionelle Screening von konstitutiv aktiven Proteinkinasen
All diese Antwortelemente wurden zuvor gänzlich charakterisiert, und die entsprechenden Reportervektoren wurden beschrieben. Außerdem sind Reportervektoren für die Mehrzahl dieser Antwortelemente im Handel erhältlich (Stratagene und Clontech). Die meisten der Reportervektoren wurden entworfen, um Luciferase als das Reportergen derart zu verwenden, dass der Luciferase-kodierende Bereich zuerst durch den d2-EGFP-kodierenden Bereich ersetzt wird, bevor sie verwendet werden. Alternativ dazu wird der Luciferase-kodierende Bereich zuerst durch das b-Lactamase-Reportersystem zur Verwendung unter jenen Bedingungen ersetzt, unter denen die b-Lactamase einen wesentlichen Vorteil gegenüber EGFP in Bezug auf die Sensitivität oder Quantifizierung hat (wie in Bei spiel 11, Abschnitt A, beschrieben). Alle Transfektionen in diesen Experimenten beinhalten die Co-Transfektion der Reportervektoren und konstitutiv aktive Kinasen. Alternativ dazu werden RRC-Zelllinien für jedes der Antwortelemente entwickelt. wie oben in Abschnitt A beschrieben, wird ein Zeitprofil für jeden der Kinase/Antwortelement-Partner entwickelt, um die kinetische Antwort des spezifischen Reportervektors zu charakterisieren.
Mehr als 500 verschiedene Kinase/Antwortelement-Wechselwirkungen werden auf systematische Weise getestet. Nur 20% dieser Wechselwirkungen wurden zuvor untersucht, sodass die Mehrzahl dieser Ergebnisse neuartige Informationen über die Kinaseregulation der Gentranskription darstellt. Der Nachweis der neuartigen positiven Regulation der Transkription für ein Proteinkinase/Antwortelement-Paar wird unter Verwendung von Standard-Transfektionsmethoden und einem Luciferaseassay-Reporter bestätigt, um das Ausmaß der Induktion zu bestimmen.
Mehrere technische Fragen werden von diesen Experimenten behandelt. Erstens haben die verschiedenen Reporter deutlich unterschiedliche grundlegende und stimulierte Transkriptionsniveaus. In dieser Hinsicht ist das beta-Lactamase-Expressionssystem eine bedeutende Alternative zum Nachweis aufgrund der größeren dynamischen Reichweite dieses Reportersystems (Zlokarnik, et al, Science 279: 84–88 (1998)). Des Weiteren wird die grundlegende Expression des Reporters gewissermaßen durch das Verändern der Menge des Reporter-Plasmids kontrolliert, das in den punktförmig aufgetragenen STEP-Komplexen vorhanden ist. Jene Zelllinien, die die höchsten Transfektionseffizienzen in dem STEP-System aufweisen, werden vorzugsweise in diesen Experimenten verwendet. Alternativ dazu werden Expressionsvektoren für bestimmte Transkriptionsfaktoren in den STEP-Komplex selbst eingeschlossen; solche Transkriptionsfaktoren sind, aber nicht darauf beschränkt, CREB, c-jun und fos. Diese Expressionsvektoren sind handelsüblich oder werden hergestellt, wie es in den Verweisen beschrieben wird, die für die Antwortelemente in Tabelle 2 aufgelistet sind.
BEISPIEL 14
Die Verwendung von PCR-Produkten in der STEP-Transfektion
Typischerweise ist die transiente Transfektion mit superhelikaler DNA wirksamer als mit linearer DNA. Das Bakterienwachstum und die Plasmidisolation erfordern jedoch einen erheblichen Zeitaufwand, wenn eine große Anzahl von Expressionsvektor-Konstrukten auf die Proteinfunktion getestet werden soll. Es ist ein unerwarteter Vorteil von STEP, dass es auch mit DNA-Fragmenten durchgeführt werden kann, die durch PCR erzeugt wurden und vor der Verwendung in STEP nicht gereinigt werden müssen. Dies führt zu einer erheblichen Einsparung an Zeit, Materialien und Aufwand.
In diesem Beispiel wurden Primer verwendet, die den CMV-Promotor und die SV40-Poly(A)-Zusatzsequenz von pEGFP-Cl flankieren, um ein 1,8 kb Fragment zu verstärken, das der Expressionskassette für EGFP entspricht. Nach der Isolation mit einem QIAquick Kit (Qiagen) wurde dieses PCR-Fragment in der STEP-Transfektion verwendet, was zu Transfektionseffizienzen von 50% führte. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der Expression des pDsRed-Cl-Plasmids erzielt. Anschließend wurde bestimmt, dass es nicht notwendig war, das PCR-Fragment vor seiner Verwendung zu reinigen, um Transfektionskomplexe zu bilden, sodass PCR-Reaktionsgemische direkt zu den Komplexbildnern hinzugefügt werden können, um Transfektionskomplexe zu bilden, die dann zur Bildung von Arrays verwendet werden.
Verfahren:
Oligonukleotide in Übereinstimmung mit den Sequenzen 5' des CMV-Promotors (ATTACGGGGTCATTAGTTCATA) und 3' der SV40-Poly(A)-Zusatzsequenz (TCTCGGTCTATTCTTTTGATTT) wurden dazu verwendet, ein 1,8 kb Fragment in Übereinstimmung mit den Nukleotiden 4721–1770 von pEGFP-Cl unter Verwendung von Vent-Polymerase (New England Biolabs) zu verstärken. Nach der Agarose-Gel-Elektrophorese wurde das PCR-Fragment durch QIAquick-Reinigung (Qiagen) isoliert.
PCR-Fragmente (gereinigt oder im Rohzustand) wurden auf 0,12 mg/ml in Wasser verdünnt. Zehn Mikroliter Plasmid-DNA wurden zu einer Vertiefung einer Mikrotiter-Platte hinzugefügt. Zehn Mikroliter eines Transferrin-Poly-L-Lysin-Komplexes (1 mg/ml, Sigma) wurden dann hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zehn Mikroliter von 2 mg/ml Lipofectamin (Life Technologies, Inc.) wurden zu diesem Gemisch hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transfektionskomplex-Lösung wurde dann von Hand punktförmig mit einem Mikropipettierer zur Auftragung von 100 Nanolitern aufgetragen. Nach dem Spot-Auftragen konnten die Objektträger für 30 min in einem Gewebekulturabzug trocknen. Die Mikroskopie-Objektträger wurden dann in einer Gewebekulturplatte (10 cm Durchmesser) platziert, und 106 exponentiell wachsende Zellen in 20 ml DMEM mit 10% FCS wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37°C in 5% CO₂ nach dem Ausplattieren inkubiert.
Ergebnisse:
Unter Verwendung der STEP-Transfektion und -Expression von Proteinen, die auf linearen PCR-Fragmenten wie oben beschrieben kodiert wurden, zeigten annähernd 50% der Zellen die EGFP-Expression.
BEISPIEL 15
Anwendung von STEP auf Assays der Transmembranrezeptor-Funktion
Um die Anwendung von STEP auf die Untersuchung der Membranrezeptorfunktion zu demonstrieren, wurde das STEP-Transfektionsprotokoll verwendet, um HEK-293T-Zellen mit einem Expressionsvektor für den menschlichen D1-Dopamin-Rezeptor (pCMV.D1) und einem zyklischen AMP-gesteuerten Promotor zu transfizieren, der die Expression eines destabilisierten grün fluoreszierenden Proteins (pCRE-d2EGFP) steuert. Der Zweck des Experiments war die Messung der Aktivierung des D1-Dopamin-Rezeptors durch einen D1-Rezeptor-Agonisten, Chloro-APB (Cl-APB). Die Aktivierung des D1-Rezeptors durch Cl-APB konnte aufgrund seiner Kopplung an Adenylylcyclase und der nachfolgenden Erzeugung von zyklischem AMP gemessen werden, was durch den in 3 gezeigten Signalweg dargestellt wird.
Dreihundert Nanogramm pCMV.D1 (oder Kontrollvektor pCMV.Neo) und 300 ng pCRE-d2EGFP in 10 Mikrolitern wurden mit 10 Mikrolitern eines Transferrin-Polylysin-Komplexes (1 mg/ml) vermischt. Nach 10 Minuten wurden 10 Mikroliter Lipofectamin (1 mg/ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde weitere 10 Minuten inkubiert. Spots von annähernd 100 Nanolitern wurden auf vier verschiedenen Polylysin-beschichteten Mikroskop-Objektträgern platziert, und die Spots konnten unter Umgebungsraumbedingungen trocknen. HEK-293T-Zellen wurden dann auf drei Objektträger ausplattiert, während ein Objektträger nur in Serum-enthaltenden Medien gezogen wurde. Die drei Objektträger, die mit Zellen ausplattiert wurden, wurden in Gegenwart entweder von Cl-APB oder dem Phosphodiesterase-Inhibitor IBMX oder beiden, Cl-APB und IMBX, gezogen.
Nach 48 Stunden wurden die Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Die Zellen, die den D1-Rezeptor exprimieren und mit Cl-APB (1 mikromolar) behandelt wurden, zeigten eine erheblich größere Expression des grün-fluoreszierenden Protein-Reporters. Die Quantifizierung dieser Ergebnisse mit der MCID-Bildanalyse-Software erbrachte die Ergebnisse, die in der folgenden Tabelle 3 dargestellt sind. Tabelle 3. Pixel pro Spot im STEP-D1-Aktivierungsexperiment
Die Zellen, die mit dem Expressionsvektor des D1-Rezeptors transfiziert und mit Cl-APB behandelt wurden, zeigten ein zehnfach höheres Niveau der GFP-Expression als die Zellen, die mit dem leeren parentalen Vektor pCMV.Neo transfiziert wurden. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass STEP dazu verwendet werden kann, die Aktivierung eines Membranrezeptors durch einen spezifischen Liganden zu messen, und dass die Aktivierung durch die Bestimmung der GFP-Fluoreszenz quantifiziert werden kann. Das STEP-Verfahren kann auf ähnliche Weise angewendet werden, um Liganden und Arzneistoffe zu identifizieren, die als Agonisten oder Antagonisten bei anderen bekannten Rezeptoren oder Orphan-Rezeptoren wirken.
BEISPIEL 16
Die Verwendung von zusätzlichen Zelloberflächen-Liganden zur Erhöhung der STEP-Transfektionseffizienz
Andere Zelloberflächen-Liganden können verwendet werden, um Zellen zu transfizieren, die geringere Transferrin-Rezeptor-Niveaus aufweisen, oder wenn Transferrinniveaus in den Kulturmedien mit den STEP-Transfektionskomplexen konkurrieren. Ein nicht-einschränkendes Beispiel ist ein Protein wie das Adenovirus-Pentonprotein, das sich an Zelloberflächen-Integrine bindet und anstelle von Transferrin verwendet werden kann, um viele Zelltypen zu transfizieren, die weniger als optimale Transfektionseffizienzen unter Verwendung von Transferrin in dem Transfektionskomplex aufweisen.
Zu diesem Zweck wird das Adenovirus-Pentonprotein entweder in Bakterien oder in Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen exprimiert und mit den oben beschriebenen Verfahren und Methoden gereinigt. Das Pentonprotein kann in Konzentrationen von etwa 0,02 mg/ml bis 1,0 mg/ml verwendet werden. Das gereinigte Protein wird mit der zu transfizierenden Nukleinsäure vermischt, zusammen mit Polylysin oder Histonen und einem kationischen Lipid wie Lipofectamin oder Lipofectamin 2000. Nach dem punktförmigen Auftragen des Komplexes werden die Zelllinien (wie Ratten-PC-12-Phäochromozytom-, NG-108-Neuroblastom-Gliom-Hybridzellen und SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellen), die normalerweise niedrige Transfektionseffizienzen (weniger als 10%) mit Transferrin aufweisen, mit Effizienzen von 50 bis 80% transfiziert, falls das Adenovirus-Pentonprotein verwendet wird. Die Transfektionseffizienzen können sogar noch weiter erhöht werden durch das Herstellen von Fusionsproteinen, die das Pentonprotein am Amino-Ende und DNA-bindende Proteine wie Histone am C-terminalen Ende enthalten.
In den folgenden Experimenten wurden Transfektionskomplexe wie in Beispiel 1 beschrieben gebildet, mit der Ausnahme, dass bei der Präparation einiger Transfektionskomplexe gereinigtes Pentonprotein anstelle von Transferrin verwendet wurde; das Pentonprotein wurde in einer Konzentration von 0,64 mg/ml verwendet. Transfektionskomplexe wurden somit entweder mit Transferrin oder mit Pentonprotein präpariert. Nach dem Immobilisieren der Komplexe, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden die Zelllinien Ratten-PC-12-Phäochromozytom und HEK-293T wie in Beispiel 1 beschrieben transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden dann durch Hellfeldmikroskopie, die alle Zellen zeigt, und mit Fluoreszenz, die bloß jene Zellen zeigt, die GFP exprimieren, untersucht.
Die Ergebnisse werden in 4 als Abbildungsset dargestellt; die Zelllinie wird oben an den Bildern angegeben, und der Ligand, der in dem Transfektionskomplex verwendet wurde, wird links von den Abbildungen angegeben. Die Abbildungen unter jeder angegebenen Zelllinie sind entweder Hellfeld-Abbildungen (auf der linken Seite) oder Fluoreszenz-Abbildungen (auf der rechten Seite). Diese Ergebnisse zeigen, dass PC-12 mit geringen Effizienzen mit Transferrin (weniger als 10%) transfiziert wurde, und dass eine Erhöhung der Transfektionseffizienz (von 50% bis 80%) beobachtet wurde, wenn der Ligand Adenovirus-Pentonprotein war.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit spezifischen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte es so verstanden werden, dass die Erfindung gemäß den Ansprüchen nicht auf solche spezifischen Ausführungsformen unberechtigt eingeschränkt werden sollte. Allerdings sollen verschiedene Modifikationen der beschriebenen Art der Ausführung der Erfindung, die für den Fachmann in den relevanten Bereichen klar sind, im Rahmen der folgenden Ansprüche liegen.

Claims

Verfahren zur Transfektion einer Zelle, umfassend: a) das Bereitstellen: i) eines auf einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei dieser Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt, wobei der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, und ii) einer Zelle; sowie b) das Inkontaktbringen der Zelle mit der Nukleinsäure im Transfektionskomplex unter solchen Bedingungen, daß die Zelle transfiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Transfektionskomplex ferner einen dritten Komplexbildner umfaßt, welcher ein membranpermeables Molekül umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem DNA bindenden Molekül um ein kationisches Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem membranpermeablen Molekül um ein kationisches Lipid handelt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Ligand kovalent mit dem kationischen Protein verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Transfektionskomplex ferner ein oder mehrere kationische Lipide umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Liganden um Transferrin und bei dem kationischen Protein um Polylysin handelt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Transfektionskomplex ferner einen oder mehrere zusätzliche Komplexbildner, ausgewählt aus der Gruppe: Targeting-Moleküle, Transkriptionsmoleküle, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus, Modulatoren von Zellwachstum und -integrität sowie Gemische daraus, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt der Expression der Nukleinsäure in der transfizierten Zelle.
Verfahren nach Anspruch 9, ferner umfassend den Schritt des Nachweisens der Expression der Nukleinsäure in der transfizierten Zelle.
Verfahren zur Transfektion einer Zelle, bei dem man a) einen Transfektionskomplex auf einer Oberfläche immobilisiert, wobei der Komplex Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt, wobei der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, und b) die Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure im Transfektionskomplex unter Bedingungen, die der Transfektion der Zelle genügen, in Kontakt bringt.
Verfahren zur Transfektion einer Zelle, bei dem man a) Nukleinsäure mit einem ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt und der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, kombiniert, so daß wenigstens ein Transfektionskomplex, der Nukleinsäure sowie den ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, gebildet wird, b) den Transfektionskomplex auf einer Oberfläche immobilisiert, so daß immobilisierte Nukleinsäure gebildet wird, und c) die Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure im Transfektionskomplex unter solchen Bedingungen, daß die Zelle transfiziert wird, in Kontakt bringt.
Verfahren zur Transfektion einer Zelle, bei dem man a) Transferrin kovalent mit Polylysin unter Bildung eines Transferrin-Polylysin-Komplexes verknüpft, b) Nukleinsäure sowie ein kationisches Lipid mit dem kovalent verknüpften Transferrin-Polylysin-Komplex unter Bildung wenigstens eines Transfektionskomplexes kombiniert, c) den Transfektionskomplex auf einer Oberfläche immobilisiert, so daß immobilisierte Nukleinsäure gebildet wird, d) die Zelle mit der immobilisierten Nukleinsäure im Transfektionskomplex unter solchen Bedingungen, daß die Zelle transfiziert wird, in Kontakt bringt.
Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäure an eine Oberfläche, bei dem man: a) die Nukleinsäure mit einem ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt und der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, kombiniert, so daß wenigstens ein Transfektionskomplex, der die Nukleinsäure sowie den ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, gebildet wird, und b) den wenigstens einen Transfektionskomplex mit einer Oberfläche unter Bedingungen, die der Immobilisierung der Nukleinsäure im Transfektionskomplex genügen, in Kontakt bringt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Transfektionskomplex ferner einen dritten Komplexbildner umfaßt, welcher ein membranpermeables Molekül umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das DNA bindende Molekül ein kationisches Protein umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das membranpermeable Molekül ein kationisches Lipid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Ligand kovalent mit dem kationischen Protein verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Liganden um Transferrin und bei dem kationischen Protein um Polylysin handelt.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Transfektionskomplex ferner ein kationisches Lipid umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Transfektionskomplex ferner wenigstens einen zusätzlichen Komplexbildner, ausgewählt aus der Gruppe: Targeting-Moleküle, Transkriptionsmoleküle, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus, Modulatoren von Zellwachstum und -integrität sowie Gemische daraus, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei mehr als ein Transfektionskomplex gebildet wird und die immobilisierten Transfektionskomplexe ein Array bilden.
Array, umfassend auf einer Oberfläche immobilisierte Transfektionskomplexe, wobei diese Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner umfassen, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt und der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt.
Array nach Anspruch 23, wobei wenigstens einer der Transfektionskomplexe ferner einen dritten Komplexbildner umfaßt, welcher ein membranpermeables Molekül umfaßt.
Transfektionskomplex, der an eine Oberfläche immobilisiert ist, umfassend Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt und der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 25, ferner umfassend einen dritten Komplexbildner, welcher ein membranpermeables Molekül umfaßt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem DNA bindenden Molekül um ein kationisches Protein handelt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 27, wobei es sich bei dem membranpermeablen Molekül um ein kationisches Lipid handelt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 27, wobei der Ligand kovalent mit dem kationischen Protein verknüpft ist.
Transfektionskomplex nach Anspruch 29, wobei es sich bei dem Liganden um Transferrin und bei dem kationischen Protein um Polylysin handelt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 29, ferner umfassend ein oder mehrere kationische Lipide.
Transfektionskomplex nach Anspruch 26, ferner umfassend wenigstens einen zusätzlichen Komplexbildner, ausgewählt aus der Gruppe: Targeting-Moleküle, Transkriptionsmoleküle, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus, Modulatoren von Zellwachstum und -integrität sowie Gemische daraus.
Verfahren zur Identifizierung eines Liganden eines Rezeptorproteins, umfassend: a) das Bereitstellen: i) einer Zelle und ii) wenigstens eines auf einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei dieser eine erste und zweite Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, wobei die erste Nukleinsäure für ein Rezeptorprotein und die zweite Nukleinsäure für ein Testprotein codiert, wobei die erste und zweite Nukleinsäure in wenigstens einem Expressionsvektor vorliegen, und der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Zelloberflächenrezeptor, der sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, umfaßt und der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, und b) das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Komplex unter solchen Bedingungen, daß die Zelle mit der ersten und zweiten Nukleinsäure cotransfiziert wird und die erste und zweite Nukleinsäure exprimiert werden; sowie c) das Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Bindung zwischen dem von der ersten Nukleinsäure exprimierten Rezeptorprotein und dem von der zweiten Nukleinsäure exprimierten Testprotein.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Rezeptorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Rezeptorkinasen.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei es sich bei dem Testprotein um einen Transkriptionsfaktor handelt und das Nachweisen einen Reportergen-Test umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das Reportergen ein mit einem selektionierbaren Marker operativ verknüpftes zyklisches-AMP-Antwortelement umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei ein Transfektionskomplex auf einer Oberfläche immobilisiert wird, so daß ein Array gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Bindung zwischen dem Rezeptorprotein und dem Testprotein das Reinigen des Rezeptorproteins und das Bestimmmen seiner Masse umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Transfektionskomplex ferner einen dritten Komplexbildner umfaßt, welcher ein membranpermeables Molekül umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei es sich bei dem DNA bindenden Molekül um ein kationisches Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei es sich bei dem membranpermeablen Molekül um ein kationisches Lipid handelt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Ligand kovalent mit dem kationischen Protein verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei es sich bei dem Liganden um Transferrin und bei dem kationischen Protein um Polylysin handelt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Transfektionskomplex ferner einen oder mehrere zusätzliche Komplexbildner, ausgewählt aus der Gruppe: Targeting-Moleküle, Transkriptionsmoleküle, Inhibitoren des Nukleinsäureabbaus, Modulatoren von Zellwachstum und -integrität sowie Gemische daraus, umfaßt.
Verfahren zur Transfektion einer Zelle, umfassend: a) das Bereitstellen: i) eines auf einer Oberfläche immobilisierten Transfektionskomplexes, wobei dieser Nukleinsäure sowie einen ersten und zweiten Komplexbildner umfaßt, wobei der erste Komplexbildner einen Liganden für einen Rezeptor umfaßt, wobei der zweite Komplexbildner ein DNA bindendes Molekül umfaßt, und ii) einer Zelle; sowie b) das Inkontaktbringen der Zelle mit dem immobilisierten Transfektionskomplex auf der Oberfläche unter solchen Bedingungen, daß Zellen unter Verwendung eines aktiven Transportprozesses transfiziert werden.
Transfektionskomplex, der an eine Oberfläche immobilisiert ist, umfassend eine Nukleinsäure, ein kationisches Lipid, einen Liganden für einen Rezeptor sowie ein DNA bindendes Protein, wobei es sich bei dem Liganden um ein Virusprotein handelt und wobei das Virusprotein kovalent an das DNA bindende Protein gebunden ist.
Transfektionskomplex nach Anspruch 46, wobei das Virusprotein ausgewählt ist aus der Gruppe: Pentonprotein, HIV-Protein GP120, Protein VP1 des equinen Rhinitis-A-Virus, menschliches Adenovirus-Protein E3 und Epstein-Barr-Virus-Protein GP350.
Transfektionskomplex nach Anspruch 46, wobei es sich bei dem Virusprotein um Pentonprotein handelt.
Transfektionskomplex nach Anspruch 46, wobei das DNA bindende Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polylysin und einem Histon.
Transfektionskomplex nach Anspruch 46, wobei es sich bei dem kationischen Lipid um Lipofectamine handelt.