DE60218678T2

DE60218678T2 - Verfahren zur herstellung von 2,4-didesoxyhexosen und 2,4,6-tridesoxyhexosen

Info

Publication number: DE60218678T2
Application number: DE60218678T
Authority: DE
Inventors: Joannes Gerardus Kierkels; Daniel Mink; Sven Panke; Franciscus Alphons Lommen; Dennis Heemskerk
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2022-07-10
Also published as: ATE356215T1; ES2282433T3; EP1404844A2; WO2003006656A2; JP2005500838A; MXPA04000310A; HUP0401577A2; CN1526019A; WO2003006656A3; HUP0401577A3; US7439046B2; US20050287650A1; DK1404844T3; EP1404844B1; US20040171125A1; US6964863B2; CA2448517A1; CN1300132C; JP4248392B2; DE60218678D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer 2,4-Didesoxyhexose oder einer 2,4,6-Tridesoxyhexose aus einer substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und einem substituierten oder unsubstituierten Aldehyd in Gegenwart einer Aldolase und Wasser.
Ein solches Verfahren ist aus US-A-5,795,749 bekannt, wo die Synthese von 2,4,6-Tridesoxyhexosen über eine 4-substituierte 3-Hydroxybutanal-Zwischenstufe beschrieben wird. Es wird von Acetaldehyd und einem 2-substituierten Aldehyd als Reaktionspartner und von einer Aldolase als Katalysator Gebrauch gemacht.
Gijsen et al. (1994) [JACS 116, 8422 bis 8423] beschreiben DERA(2-Desoxyribose-5-phosphataldolase)-katalysierte Reaktionen einer Vielfalt von C2-substituierten Aldehyden als anfängliches Akzeptorsubstrat und Acetaldehyd als Donator, um die entsprechenden 6-substituierten 2,4-Didesoxyhexosen zu bilden.
Gijsen et al. (1995) [JACS 117, 7585 bis 7591] beschreiben die stereoselektive Synthese von 6-substituierten 2,4,6-Tridesoxyhexosen über eine doppelt DEKA-katalysierte Eintopfreaktion, welche mit einem Akzeptoraldehyd und Acetaldehyd beginnt.
Ein bekannter Nachteil solcher enzymkatalysierten Aldolkondensationen ist es, dass die Produktionskapazität gering ist. Dies liegt insbesondere an der Tatsache, dass solche Aldolkondensationen im Allgemeinen bei geringen Aldehydkonzentrationen durchgeführt werden, weil allgemein angenommen wurde, dass die verwendete Aldolase bei höheren Aldehydkonzentrationen zu einem hohen Ausmaß inaktiviert würde. Unterstützung für die letztere Aussage ergibt sich auch z.B. aus Matsumura et al. (1999) [Nature Biotechnology 17, 696 bis 701], der Dissertation von W.R.K. Schoevaart (2000) [ISBN90-9013780-7], S. 117 bis 118, und Greenberg et al. (2004) [PNAS 101 (16), 5788 bis 5793].
Ein anderer Nachteil der benutzten geringen Konzentrationen ist es, dass am Ende der Reaktion die Konzentration der 2,4,6-Tridesoxyhexose in dem Reaktionsgemisch gering ist, was die Kosten zum Beispiel der Reinigung stark beeinflusst. Als Folge dessen war es nicht zu erwarten, dass es möglich wäre, ein kommerziell attraktives Verfahren zur Herstellung von 2,4-Didesoxyhexosen und 2,4,6-Tridesoxyhexosen auf der Basis einer solchen Technologie zu entwickeln.
Die Erfindung stellt ein kommerziell attraktives Verfahren zur Herstellung einer 2,4-Didesoxyhexose und einer 2,4,6-Tridesoxyhexose mittels einer enzymkatalysierten Aldolkondensation bereit.
Dies wird erfindungsgemäß durch die Durchführung der Reaktion zwischen der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und dem substituierten oder unsubstituierten Aldehyd bei einer Carbonylkonzentration von mindestens 6 Mol/l des Reaktionsgemisches erreicht, so dass die Endkonzentration der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose mindestens 2 Massen-% des Reaktionsgemisches beträgt.
In dem bekannten Verfahren zur Synthese von 2,4-Didesoxyhexosen und 2,4,6-Tridesoxyhexosen werden Carbonylkonzentrationen von höchstens 0,4 Mol/l des Reaktionsgemisches benutzt. Es werden Endkonzentrationen der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose erhalten, welche höchstens bei ungefähr 1 Massen-% des Reaktionsgemisches liegen. Überraschenderweise hat der Anmelder herausgefunden, dass Carbonylkonzentrationen von bis zu 6 Mol/l angewendet werden können, wobei das Maß der Enzyminaktivierung trotz der hohen Carbonylkonzentration begrenzt bleibt. Als Ergebnis können höhere Endkonzentrationen der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose erreicht werden, so dass die Produktionskapazität erhöht wird und die Kosten unter anderem der Reinigung des Produkts verringert werden. Als Folge dessen zeigte es sich, dass es möglich ist, ein kommerziell attraktives Verfahren zu entwickeln.
Im Rahmen der Erfindung ist die Carbonylkonzentration zu verstehen als die Summe der Konzentrationen der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindungen mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom, des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds und des Zwischenprodukts, welches in der Reaktion der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom mit dem substituierten oder unsubstituierten Aldehyd gebildet wird.
Die Carbonylkonzentration wird während des Syntheseverfahrens im Wesentlichen auf einem Wert unter 6 Mol/l gehalten. Es ist für den Fachmann klar, dass geringfügig höhere Konzentrationen für eine (sehr) kurze Zeit nur einen geringen nachteiligen Effekt haben und deswegen im Rahmen der Erfindung noch zulässig sind. Vorzugsweise liegt die Carbonylkonzentration zwischen 0,1 und 5 Mol je Liter des Reaktionsgemisches, insbesondere zwischen 0,6 und 4 Mol je Liter des Reaktionsgemisches.
Die Endkonzentration der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose liegt in der Praxis im Allgemeinen zwischen 5 und 50 Massen-%, zum Beispiel zwischen 8 und 40 Massen-%, insbesondere zwischen 10 und 35 Massen-%, berechnet im Verhältnis zum Reaktionsgemisch am Ende der Reaktion.
Die Reihenfolge der Zugabe der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom, des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds und der Aldolase ist nicht entscheidend. Vorzugsweise wird die Aldolase vor der Zugabe der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom dem Reaktionsgemisch zugegeben. Noch bevorzugter wird die Aldolase mit einer Lösung mindestens eines Teils des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds vermischt, bevor die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom zugegeben wird, insbesondere wenn unter den gewählten Bedingungen der verwendete substituierte oder unsubstituierte Aldehyd mit sich selbst in geringerem Maße reagiert als die verwendete substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom. Vorzugsweise werden mehr als 0,1 Mol/l des Reaktionsgemisches des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds zugegeben, noch bevorzugter mehr als 0,3 Mol je Liter des Reaktionsgemisches, insbesondere mehr als 0,6 Mol je Liter des Reaktionsgemisches. Diese Wahl der Ausgangskonzentration des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds hat einen günstigen Effekt auf die Anfangs-Reaktionsgeschwindigkeit des enzymatischen Verfahrens. Die Aldolase kann während der Reaktion in mehreren Teilen zugegeben oder dosiert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden sowohl die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom als auch der substituierte oder unsubstituierte Aldehyd als auch die Aldolase dem Reaktionsgemisch jeweils in einer Charge zugegeben. Auf diese Weise können die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom, der substituierte oder unsubstituierte Aldehyd und die Aldolase sowohl gleichzeitig als auch nacheinander zugegeben werden. Gemäß dieser Ausführungsform kann die Summe der zugegebenen Mengen der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds im Allgemeinen bis zu 6 Mol je Liter des Reaktionsgemisches betragen, und in der Praxis werden gewöhnlich Endproduktkonzentrationen zwischen 7 und 15 Massen insbesondere zwischen 5 und 20 Massen des Reaktionsgemisches, erreicht.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Zugabe der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und/oder des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds in mindestens zwei Teilen durchgeführt, wobei jede Folgezugabe vorgenommen wird, nachdem zumindest ein Teil der Reaktionspartner aus der vorhergehenden Zugabe umgesetzt worden ist. Hierdurch wird ermöglicht, dass die Summe der Mengen der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds, die im Verlauf der Reaktion zugegeben werden, mehr als 6 Mol je Liter des Reaktionsgemisches betragen, während zur selben Zeit die Carbonylkonzentration in dem Reaktionsgemisch zu jedem Zeitpunkt während der Reaktion geringer als 6 Mol/l ist, um die Inaktivierung des Enzyms zu begrenzen. Die Aldolase kann, wenn erwünscht, in einer Charge oder in mindestens zwei Teilen zugegeben werden.
In noch einer anderen Ausführungsform werden die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und/oder der substituierte oder unsubstituierte Aldehyd während der Reaktion nach Zeit in das Reaktionsgemisch dosiert. Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform zumindest ein Teil des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds zusammen mit der Aldolase zugegeben. Die Aldolase kann, wenn erwünscht, in einer Charge zugegeben werden, in mehreren Teilen zugegeben werden oder nach Zeit dosiert werden.
Die letzten beiden Ausführungsformen können zu Endkonzentrationen der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose führen, welche mehr als 40 Massen-% betragen. Ferner hat sich herausgestellt, dass das Dosieren der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom, des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds und/oder der Aldolase in das Reaktionsgemisch zu merklichen Einsparungen in den Enzymkosten führen kann.
Es sind auch Kombinationen der obigen Ausführungsformen möglich.
Die Reaktionstemperatur und der pH-Wert sind nicht entscheidend, und beide werden in Abhängigkeit von dem Substrat gewählt. Vorzugsweise wird die Reaktion in flüssiger Phase durchgeführt. Die Reaktion kann zum Beispiel bei einer Reaktionstemperatur zwischen –5 und 45°C, vorzugsweise zwischen 0 und 10°C, und einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8, durchgeführt werden.
Die Reaktion wird vorzugsweise bei mehr oder weniger konstantem pH-Wert durchgeführt, wobei zum Beispiel von einem Puffer oder von einer automatischen Titration Gebrauch gemacht wird. Als Puffer können zum Beispiel Natrium- und Kaliumbicarbonat, Natrium- und Kaliumphosphat, Triethanolamin/HCl, Bis-Tris-Propan/HCl und HEPES/KOH verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Kalium- oder Natriumbicarbonat-Puffer verwendet, zum Beispiel in einer Konzentration zwischen 20 und 400 mMol/l des Reaktionsgemisches.
Das molare Verhältnis zwischen der Gesamtmenge der zugegebenen substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und der Gesamtmenge des zugegebenen substituierten oder unsubstituierten Aldehyds ist nicht entscheidend und liegt vorzugsweise zwischen 1,5:1 und 4:1, insbesondere zwischen 1,8:1 und 2,2:1. Es können auch andere Verhältnisse angewendet werden, sie bieten aber keine Vorteile.
Als Katalysator wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren von einer Aldolase Gebrauch gemacht, welche die Aldolkondensation zwischen zwei Aldehyden oder zwischen einem Aldehyd und einem Keton katalysiert. Vorzugsweise handelt es sich bei der verwendeten Aldolase um 2-Desoxyribose-5-phosphataldolase (DERA, EC 4.1.2.4) oder Mutanten davon, vorzugsweise um DERA aus Escherichia coli oder Mutanten davon. Die Menge der zu verwendenden DERA ist nicht entscheidend und wird zum Beispiel in Abhängigkeit von den verwendeten Reaktionspartnern, den Konzentrationen der Reaktionspartner, der gewünschten Reaktionsgeschwindigkeit, der gewünschten Reaktionsdauer und anderen ökonomischen Faktoren gewählt. Die Menge der zu verwendenden DERA liegt zum Beispiel zwischen 50 und 5000 U/mMol des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds. 1 U (Einheit) ist ein Maß für die enzymatische Aktivität und entspricht der Umwandlung von 1 uMol des 2-Desoxyribose-5-phosphats je Minute bei 37°C.
Die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom weist vorzugsweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome auf, insbesondere 2 bis 4 Kohlenstoffatome. Gebrauch gemacht werden kann zum Beispiel von Aldehyden, zum Beispiel Acetaldehyd und Propanal, und Ketonen, zum Beispiel Aceton und Fluoraceton. Wenn ein Aldehyd als substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom verwendet wird, kann er natürlich auch in der Form seines (Halb-)Acetals verwendet werden, zum Beispiel als Acetal eines Alkohols, insbesondere Methanol, Ethanol oder Glykol.
Als substituierter oder unsubstituierter Aldehyd kann zum Beispiel von Aldehyden mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen Gebrauch gemacht werden, zum Beispiel Acetaldehyd, Propanal, Butanal, einem acetalgeschützten Dialdehyd oder einem substituierten Aldehyd, insbesondere einem substituierten Acetaldehyd mit der Formel HC(O)CH₂X, wobei X für eine Gruppe steht, die mit dem im Endprodukt benötigten Substituenten identisch ist oder in diesen umgewandelt werden kann, zum Beispiel eine CN-Gruppe oder einen Substituenten, der in einer Folgereaktion als Abgangsgruppe abgespalten werden kann, zum Beispiel ein Halogen, insbesondere Cl, Br oder I; eine Tosylatgruppe; eine Mesylatgruppe; eine Acyloxygruppe, insbesondere eine Acetoxygruppe; eine Phenacetyloxygruppe; eine Alkyloxygruppe oder eine Aryloxygruppe, wobei Chloracetaldehyd besonders geeignet ist.
Der substituierte oder unsubstituierte Acetaldehyd kann als solcher oder in der Form seines (Halb-)Acetals verwendet werden, zum Beispiel als Acetal eines Alkohols wie Methanol, Ethanol oder Glykol.
Die 2,4-Didesoxyhexose oder 2,4,6-Tridesoxyhexose der Formel 1
ist zum Beispiel ein gewünschtes Zwischenprodukt bei der Herstellung verschiedener Medikamente, insbesondere für die Synthese von HMG-CoA-Reductaseinhibitoren, noch spezieller für die Synthese von Statinen, zum Beispiel Iovastatin, Cerivastatin, Rosuvastatin, Simvastatin, Pravastatin und Fluvastatin, insbesondere für ZD-4522, wie in Drugs of the future (1999), 24 (5), 511 bis 513, von M. Watanabe et al., Bioorg. & Med. Chem. (1997), 5(2), 437 bis 444, beschrieben. Die Erfindung stellt daher einen neuen, ökonomisch attraktiven, Weg zu 2,4-Didesoxyhexosen oder 2,4,6-Tridesoxyhexosen bereit, welche zum Beispiel für die Synthese von 2-(6-Hydroxymethyl-1,3-dioxan-4-yl)essigsäure verwendet werden können, welche ein gewünschtes Zwischenprodukt für die Herstellung von Medikamenten, insbesondere Statinen, ist.
Die 2,4-Didesoxyhexose oder 2,4,6-Tridesoxyhexose der Formel 1 kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens aus Acetaldehyd und HC(O)CH₂X hergestellt werden, wobei X wie oben definiert ist, und kann danach, zum Beispiel über bekannte Verfahren, in das entsprechende 4-Hydroxytetrahydropyran-2-on der Formel 2 umgewandelt werden,
wobei X wie oben definiert ist. Geeignete Reagenzien für diese Umwandlung sind zum Beispiel Br₂ mit Calciumcarbonat (Tetrahedron Lett. 30 (47), 1989, S. 6503) Pyridiniumdichromat in Dichlormethan (Carbohydrate Res. 300, 1997, S. 301) und Tetra-N-propylammoniumtetraoxoruthenat (J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, S. 1625) als Base.
Das erhaltene 4-Hydroxytetrahydropyran-2-on kann danach, wenn erwünscht, in ein 2-(1,3-Dioxan-4- yl)essigsäure-Derivat der Formel 3 umgewandelt werden,
wobei X wie oben definiert ist und R₁, R₂ und R₃ jeweils unabhängig voneinander für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen stehen. Diese Umwandlung kann zum Beispiel in Gegenwart eines geeigneten Acetalisierungsmittels und eines sauren Katalysators bewirkt werden.
Danach kann das 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure-Derivat in Gegenwart einer Base und Wasser hydrolysiert werden, um ein Salz der Formel 4 zu bilden,
wobei Y für ein Alkalimetall, ein Erdalkalimetall oder eine substituierte oder unsubstituierte Ammoniumgruppe steht, vorzugsweise Na, Ca oder eine Tetraalkylammoniumverbindung, und wobei X, R₁ und R₂ wie oben definiert sind. Auf die Hydrolyse kann die Umwandlung in die entsprechende 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure gemäß Formel 4 mit Y = H folgen.
Das Salz der 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure gemäß Formel 4 kann in einen entsprechenden Ester der 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure gemäß Formel 3, wobei X, R₁ und R₂ wie oben definiert sind und R₃ für eine Alkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen steht, auf eine bekannte Weise umgewandelt werden. Vorzugsweise wird das Salz der 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure in den entsprechenden t-Butylester der 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure umgewandelt.
Das 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure-Derivat der Formel 3, in welcher R₃ für eine Alkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen steht, kann in das Essigsäurederivat der entsprechenden 2-(6-Hydroxymethyl-1,3-dioxan-4-yl)essigsäure der Formel 5 umgewandelt werden,
in welcher R₁, R₂ und R₃ wie oben definiert sind, zum Beispiel wie in US-A-5594153 oder in WO-A-200008011 beschrieben, über die Umwandlung in eine Verbindung gemäß der Formel 3, in welcher X für eine Acyloxy-, zum Beispiel eine Acetoxygruppe, steht und R₁, R₂ und R₃ wie oben definiert sind, gefolgt vom Ersetzen der Acyloxygruppe auf eine allgemein bekannte Weise durch eine Hydroxylgruppe.
Das 4-Hydroxytetrahydropyran-2-on der Formel 2
wobei X wie oben definiert ist, kann mit Hilfe einer Säure oder einer Base ebenfalls in die entsprechende Dihydroxyhexansäure der Formel 6 umgewandelt werden.
Die Dihydroxyhexansäure der Formel 6 kann danach in ein 2-(1,3-Dioxan-4-yl)essigsäure-Derivat der Formel 3 umgewandelt werden, in welcher X, R₁ und R₂ wie oben definiert sind und R₃ für eine Alkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen steht, zum Beispiel in Gegenwart eines geeigneten Acetalisierungsmittels und eines sauren Katalysators.
Die Erfindung wird mit Hilfe der Beispiele erläutert, ohne jedoch hierdurch beschränkt zu werden.
Beispiele
Herstellungs- und Messverfahren
1. Herstellung einer Menge einer 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose als Bezugsmaterial für die GC-Analyse
76 ml (0,60 Mol) einer 50%igen Chloracetaldehyd-Lösung und 84 ml (1,47 Mol) Acetaldehyd wurden bei 10°C zu 0,62 l 100 mM-NaHCO₃-Lösung hinzugegeben, wonach der pH-Wert mit Hifle von 4N NaOH auf 7,0 eingestellt wurde. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 220 g Enzymlösung (2050 U/g) begonnen. Nach etwa 18-stündigem Rühren wurde über GC eine maximale Umwandlung zu 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose gemessen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1,7 l Aceton beendet. Diesem Gemisch wurden 4 g Dicalite zugegeben, und nach ungefähr 30-minütigem Rühren wurde das Gemisch filtriert. Das Filtrat wurde 5 Stunden lang bei 40°C unter Vakuum eingedampft. Das entstehende Öl wurde mittels Säulenchromatographie auf einer Kieselgelsäule (400 ml) gereinigt und mit einem Elutionsmittel, welches aus einem Gemisch aus Petrolether (Siedepunkt 40 bis 70°C) und Ethylacetat in einem Volumenverhältnis von 1:2 bestand, ausgewaschen. Nach dem Eindampfen der Fraktion mit einem Rf-Wert von 0,33 wurden insgesamt 26 g der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose isoliert. Der Begriff des Rf-Wertes einer Fraktion ist dem Fachmann bekannt und ist als der Weg definiert, den eine Fraktion in der Säule zurücklegt, geteilt durch den Weg, der durch das mobile Lösungsmittel in der Säule zurückgelegt wird, oder als die Zeit, welche eine Fraktion benötigt, um einen bestimmten Weg in der Säule zurückzulegen, geteilt durch die Zeit, welche das mobile Lösungsmittel benötigt, um denselben Weg in der Säule zurückzulegen.
Die Reinheit der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose wurde mittels ¹H-NMR gemäß einem Verfahren bestimmt, welches von P.P. Lankhorst in Pharmacopeial Forum, 22 (3), 2414 bis 2422, beschrieben wurde.
2. GC-Analyse
Die Konzentration der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose während der enzymatischen Reaktion wurde mittels gaschromatographischer Analyse bestimmt. Es wurde ein Hewlett Packard GC mit Flammenionisationsdetektor des Typs HP5890 Serie II, ausgestattet mit einer Chrompack-CP-Sil-5-CB-Säule (25 m·0,25 mm, dr 1,2 μm), benutzt. Die Konzentrationen wurden auf der Basis einer Eichkurve der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose mit bekannter chemischer Reinheit (1) in Aceton bestimmt.
3. Herstellung der DERA-Lösung
Es wurden Standardtechniken angewandt, um das DERA-Enzym in rekombinanten Escherichia-coli-Zellen zu überexprimieren. Solche Techniken sind bei Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, beschrieben. In diesem Fall wurde das deoC-Gen von Escherichia-coli W3110 in dem kommerziell erhältlichen Expressionsvektor pBADMyc-HisB (Invitrogen, Groningen, NL) kloniert. Das Gen (einschließlich des Stoppcodons) wurde mittels einer Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt und in solcher Weise in die NcoI- und EcoRI-Stellen des Vektors eingeführt, dass das ATG-Startcodon des deoC das gleiche war wie das ATG-Codon auf der NcoI-Stelle des Vektors (Translationsfusion). Weil das deoC-Stoppcodon ebenfalls kloniert wurde, wurde die Bildung eines Fusionsproteins mit dem His-Tag, welches ebenfalls auf dem Vektor codiert ist, verhindert. Escherichia-coli-DH10B-Zellen (Life Technologies, Breda, NL) mit dem resultierenden Plasmid pBAD DERA2.2 wurden in einem belüfteten und gerührten 10-l-Kesselreaktor auf einem komplexen Luria-Bertani-Medium mit 100 μg/ml Carbenicillin kultiviert und durch Zugabe von Arabinose zu 0,01% induziert. Um die Zelldichte zu erhöhen, wurden zwei zusätzliche wässrige Lösungen, welche reines Glycerin (Nährlösung 1) und 13% Hefeextrakt und 1,3% Trypton (Difco, Michigan, US) (Nährlösung 2) enthielten, zugegeben, nachdem die Zellen das LB-Medium verbraucht hatten. Auf diese Weise wurden ungefähr 350 g Nasszellen aus einer 10-l-Kultur erhalten, welche mittels Zentrifugieren aufbereitet wurden, wonach sie in einem Kaliumphosphatpuffer des pH-Werts 7,2 neu suspendiert und wiederum zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet bei –20°C gelagert.
In der Literatur werden verschiedene Verfahren zur Reinigung von DERA aus rekombinanten E.Coli-Zellen beschrieben, zum Beispiel bei Chen et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 114, 1992, 741 bis 748 und bei Wong et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 117, 1995, 3333 bis 3339. Reinigung ist aber keine Bedingung für den effizienten Einsatz von DERA bei Aldolreaktionen, siehe, z.B., Wong et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 117, 1995, 3333-3339.
Für die Teilreinigung von DERA wurden Standardtechniken angewendet. Gefrorene Pellets wurden in einem 100-mM-Kaliumphosphatpuffer beim pH-Wert 7,2 suspendiert (1 Gewichtsteil Nasszellen und 2 Gewichtsteile Puffer), wonach die Zellwände mittels kontinuierlicher Ultraschalleinwirkung zerstört wurden. Der klare Rohextrakt wurde mittels Zentrifugieren erhalten und direkt verwendet oder bei –20°C gelagert. Die Lösung kann, wenn erwünscht, mittels Ultrafiltration weiter aufkonzentriert werden, zum Beispiel mit Hilfe von Millipore-Ultrafiltrationsmembranen mit einer Ausschlussgrenze von 10.000 Dalton (Millipore, Redford, USA). Typische spezifische Aktivitäten, welche mittels dieses Verfahrens erhalten wurden, liegen zwischen 1400 und 5300 Einheiten je g der Lösung.
4. Bestimmung der DERA-Aktivität
Rekombinante E.coli-Zellen, welche DERA synthetisieren, wurden einer Ultraschalleinwirkung in einem 50-mM-Kaliumphosphatpuffer unterzogen und zentrifugiert (18.500 U/min, 30 min.), um das Zellmaterial zu entfernen. Der resultierende freie Zellextrakt wurde verdünnt und in einem angeschlossenen spektrophotometrischen Test verwendet. In diesem Test wurde 2-Desoxyribose-5-phosphat zu D-Glyceraldehyd-3-phosphat und Acetaldehyd umgewandelt, wonach das D-Glyceraldehyd-3-phosphat in Gegenwart von Triosephosphatisomerase (TIM, EC 5.3.1.1) zu Dihydroxyacetonphosphat umgewandelt wurde. Das Dihydroxyacetonphosphat wurde dann in Gegenwart von Glycerinphosphatdehydrogenase (GDH, EC 1.1.1.8) zu Glycerin-3-phosphat umgewandelt. Im letzten Schritt wurde Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid in reduzierter Form (NADH) verbraucht, was spektrophotometrisch über die Bestimmung des Rückgangs der Absorption bei 340 nm überwacht wurde. Typischerweise wurde ein Gesamtvolumen von 3 ml verwendet, welches 2878,5 μM eines 50-mM-Triethanolaminpuffers mit dem pH-Wert 7,2, 30 μl einer 12-mM-Lösung von NADH in Wasser, 11,5 μl einer Enzymsuspension, welche 30 Einheiten GDH und 500 Einheiten TIM in 3,2 M wässrigem Ammoniumphosphat enthielt, und 30 μl einer 50-mM-Lösung von 2-Desoxyribose-5-phosphat in Wasser enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl freiem Zellextrakt begonnen. Die Temperatur betrug 37°C. Die Aktivität, ausgedrückt in U (Einheiten), wobei 1 Einheit der enzymatischen Aktivität entspricht, welche der Umwandlung von 1 μMol 2-Desoxyribose-5-phosphat je Minute bei 37°C entspricht, wurde aus der linearen Abnahme der Absorption bei 340 nm errechnet.
Beispiel I
Herstellung von 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose in einem Batch-Experiment
4,3 ml (0,03 Mol) einer 45%igen Lösung von Chloracetaldehyd und 3,4 ml (0,06 Mol) Acetaldehyd wurden bei einer Temperatur von 4°C zu 37 ml einer 10-mM-NaHCO₃-Pufferlösung gegeben. Der pH-Wert dieses Gemisches betrug 7,3. Die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 6,3 ml (5270 U/g) Enzymlösung begonnen. Die Reaktion wurde bei einem konstanten pH-Wert von 7,5 durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurde das Gemisch mittels GC analysiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 100 ml Aceton beendet, nachdem eine Konzentration der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose von ungefähr 80 g/l (8 Massen-%) erreicht worden war.
Beispiel II
Herstellung von 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose in einem Serien-Batch-Experiment
Das Experiment aus Beispiel I wurde wiederholt. Nachdem die Konzentration der 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose jedoch ungefähr 80 g/l erreichte, wurden weitere 4,3 ml (0,03 Mol) einer 45%igen Lösung von Chloracetaldehyd, 3,4 ml (0,06 Mol) Acetaldehyd und 6,3 ml (5270 U/g) Enzymlösung zugegeben. Dies wurde drei weitere Male wiederholt, jedes Mal, nachdem die Umwandlung einen konstanten Wert erreicht hatte und nicht weiter fortschritt. Auf diese Weise wurden insgesamt 0,15 Mol einer 45%igen Lösung von Chloracetaldehyd und 0,30 Mol Acetaldehyd zugegeben. Die Reaktion wurde bei einem konstanten pH-Wert von 7,5 durchgeführt. Proben aus dem Reaktionsgemisch wurden mit Hilfe von GC analysiert. Die abschließende 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose-Konzentration betrug ungefähr 240 g/l (24 Massen-%).
Beispiel III
Herstellung von 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose mittels Zudosierens der Reaktionskomponenten
84 g (1,0 Mol) NaHCO₃ wurden in 6,2 l entmineralisiertes Wasser gegeben, wonach die Lösung auf ungefähr 2°C abgekühlt wurde. Danach wurden diesem 72,3 ml (0,4 Mol) einer 45%igen Lösung Chloracetaldehyd zugegeben, wonach der pH-Wert der Lösung mit Hilfe von 32%iger HCl auf 7,3 eingestellt wurde. Diesem Gemisch wurde eine Enzymlösung (6,8 × 10⁶ U) zugegeben, wonach das Volumen auf 7,5 l gebracht wurde. In 2 Stunden wurden diesem Gemisch insgesamt 1,3 l (9,5 Mol) einer 45%igen Chloracetaldehydlösung und 0,9 l (9,9 Mol) einer 50%igen Acetaldehydlösung zudosiert. Hiernach wurden in 5 Stunden 0,86 l (9,5 Mol) einer 50%igen Acetaldehydlösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 2°C und einem konstanten pH-Wert von 7,5 gerührt. Das Gesamtgewicht des Reaktionsgemisches betrug 10,9 kg. Der Gehalt an 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose wurde mittels Gaschromatographie bestimmt, und es stellte sich heraus, dass er 126 g/l (12,6 Massen-%) betrug.
Beispiel IV
Herstellung von 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose mittels Zudosierens der Reaktionskomponenten
11,8 g (0,14 Mol) NaHCO₃ wurden in 0,44 l entmineralisiertes Wasser gegeben, wonach die Lösung auf ungefähr 2°C abgekühlt wurde. Danach wurden diesem 10,0 ml (0,07 Mol) einer 45%igen Lösung Chloracetaldehyd zugegeben, wonach der pH-Wert der Lösung mit Hilfe von 32%iger HCl auf 7,3 eingestellt wurde. Diesem Gemisch wurde eine Enzymlösung (1,03 × 10⁶ U) zugegeben. In 2 Stunden wurden diesem Gemisch 0,193 l (1,35 Mol) einer 45%igen Chloracetaldehydlösung und 0,127 l (1,40 Mol) einer 50%igen Acetaldehydlösung zudosiert. Hiernach wurden in 5 Stunden 0,134 l (1,46 Mol) einer 50%igen Acetaldehydlösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 2°C und einem konstanten pH-Wert von 7,5 gerührt. Der Gehalt an 6-Chlor-2,4,6-tridesoxyhexose wurde mittels Gaschromatographie bestimmt, und es stellte sich heraus, dass er 180 g/l (18,0 Massen-%) betrug.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer 2,4-Didesoxyhexose oder einer 2,4,6-Tridesoxyhexose aus einer substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und einem substituierten oder unsubstituierten Aldehyd in Gegenwart einer Aldolase und Wasser, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion zwischen der substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und dem substituierten oder unsubstituierten Aldehyd bei einer Carbonylkonzentration von zwischen 0,6 und 6 Mol/l Reaktionsgemisch durchgeführt wird und die Endkonzentration der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose mindestens 2 Massen-% des Reaktionsgemisches beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Endkonzentration der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose zwischen 5 und 50 Massen-% des Reaktionsgemisches liegt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Endkonzentration der 2,4-Didesoxyhexose oder der 2,4,6-Tridesoxyhexose zwischen 10 und 35 Massen-% des Reaktionsgemisches liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Carbonylkonzentration im Reaktionsgemisch während des Syntheseverfahrens zwischen 0,6 und 4 Mol/l des Reaktionsgemisches liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 0,1 Mol/l des substituierten oder unsubstituierten Aldehyds zugeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und/oder der substituierte oder unsubstituierte Aldehyd dem Reaktionsgemisch in mindestens zwei Teilen zugegeben werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis zwischen der Gesamtmenge der zugegebenen substituierten oder unsubstituierten Carbonylverbindung mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und mindestens einem α-Wasserstoffatom und der Gesamtmenge des zugegebenen substituierten oder unsubstituierten Aldehyds zwischen 1,5:1 und 4:1 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Aldolase eine 2-Desoxyribose-5-phosphataldolase verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die 2-Desoxyribose-5-phosphataldolase von Escherichia coli stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als substituierter oder unsubstituierter Aldehyd ein substituierter Acetaldehyd der Formel HC(O)CH₂X verwendet wird, wobei X für CN, ein Halogen, eine Tosylatgruppe, eine Mesylatgruppe, eine Acyloxygruppe, eine Phenacetyloxygruppe, eine Alkyloxygruppe oder eine Aryloxygruppe steht.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass X eine Abgangsgruppe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als substituierte oder unsubstituierte Carbonylverbindung Acetaldehyd verwendet wird.