DE60212825T2

DE60212825T2 - Selbsterhaltender lactococcus stamm

Info

Publication number: DE60212825T2
Application number: DE60212825T
Authority: DE
Inventors: Lothar Steidler
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Intrexon Actobiotics NV
Priority date: 2001-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2022-05-04
Also published as: CA2446776A1; WO2002090551A2; JP2009060913A; DE60212825D1; ATE331789T1; WO2002090551A3; EP1383897A2; DK1383897T3; AU2002314040B2; ES2266515T3; CA2446776C; JP4347575B2; JP2004533246A; EP1383897B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen rekombinanten Lactococcus Stamm mit ökologisch begrenztem Wachstum und ökologisch begrenzter Lebensfähigkeit. Insbesondere betrifft sie einen rekombinanten Lactococcus, der nur in einem Medium überleben kann, in dem genau abgegrenzte Mediumsverbindungen vorhanden sind. Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Lactococcus, der nur in einem Wirtsorganismus überleben kann, in dem die Mediumsverbindungen vorhanden sind, aber bei fehlenden Mediumsverbindungen nicht außerhalb des Wirtsorganismus überleben kann. Darüber hinaus kann der Lactococcus mit prophylaktischen und/oder therapeutischen Molekülen transformiert werden und kann als solches zur Behandlung von Erkrankungen, wie beispielsweise entzündlichen Darmerkrankungen, verwendet werden
Hintergrund der Erfindung
Milchsäurebakterien werden seit langem bei einer großen Vielfalt von industriellen Fermentierungsverfahren verwendet. Sie werden generell als sicher angesehen, wodurch sie potentiell nützliche Organismen zur Herstellung von kommerziell wichtigen Proteinen werden. Tatsächlich werden mehrere heterologe Proteine, wie beispielsweise Interleukin-2, erfolgreich in Lactococcus spp produziert (Steidler u.a., 1995). Es ist allerdings nicht erwünscht, dass solche genetisch modifizierten Mikroorganismen in der Umwelt überleben und sich ausbreiten. Um ein unbeabsichtigtes Freisetzen von genetisch modifizierten Mikroorganismen zu vermeiden, werden bestimmte Richtlinien für eine sichere Handhabung und technische Maßgaben für eine physische Einschließung angewendet. Obwohl dies bei industriellen Fermentationen nützlich sein kann, wird die physische Einschlie ßung im Allgemeinen nicht als ausreichend angesehen und es werden zusätzliche biologische Einschließungsmaßnahmen getroffen, um die Möglichkeit eines Überlebens des genetisch modifizierten Mikroorganismus in der Umwelt zu reduzieren. Die biologische Einschließung ist in den Fällen äußerst wichtig, in denen die physische Einschließung schwierig oder sogar nicht anwendbar ist. Dies ist unter anderem bei Anwendungen der Fall, bei denen genetisch modifizierte Mikroorganismen als lebende Impfstoffe oder als Träger für die Verabreichung von therapeutischen Verbindungen verwendet werden. Solche Anwendungen sind zum Beispiel in der WO 97/14806 beschrieben worden, der die Abgabe von biologisch wirksamen Peptiden, wie beispielsweise Cytokinen, an eine Person durch rekombinante, nicht invasive oder nicht pathogene Bakterien offenbart. Die WO 96/11277 beschreibt die Abgabe von therapeutischen Verbindungen an ein Tier – einschließlich den Menschen – durch Verabreichung eines rekombinanten Bakteriums, das das therapeutische Protein kodiert. Steidler u.a. (2000) beschreiben die Behandlung einer Kolitis durch Verabreichung eines rekombinanten Lactococcus lactis unter Sekretion von Interleukin-10. Eine solche Abgabe kann tatsächlich zur Behandlung einer Erkrankung bei einem betroffenen Menschen oder Tier äußerst nützlich sein, aber das rekombinante Bakterium kann als schädlicher und pathogener Mikroorganismus auftreten, wenn er in eine nicht betroffene Person gelangt, und daher wird eine wirksame biologische Einschließung, die eine solche unbeabsichtigte Verbreitung des Mikroorganismus vermeidet, benötigt.
Biologische Einschließungssysteme für Wirtsorganismen können auf der Grundlage einer strikten Anforderung des Wirts für einen bestimmten Wachstumsfaktor oder einen Nährstoff, der nicht vorhanden ist oder in geringen Konzentrationen in der äußeren Umgebung vorhanden ist, passiv sein oder auf der Grundlage von so genannten suizidalen genetischen Elementen im Wirt aktiv sein, wobei der Wirt in der äußeren Umgebung durch eine Zelltötungsfunktion getötet wird, die durch ein Gen kodiert wird, das unter der Kontrolle eines nur unter bestimmten Umweltbedingungen exprimierten Promotors steht.
Passive biologische Einschließungssysteme sind in Mikroorganismen, wie beispielsweise Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae, weithin bekannt. Solche E. coli Stämme sind zum Beispiel in der US 4190495 offenbart. Die WO 95/1061 offenbart Milchsäurebakterien-Suppressormutanten und ihre Verwendung als Einschließungsmittel in Milchsäurebakterien, aber in diesem Fall erfolgt die Einschließung auf der Plasmidebene und nicht auf der Ebene des Wirtsstamms und sie stabilisiert das Plasmid im Wirtsstamm, sieht aber keine Einschließung für den genetisch modifizierten Wirtsstamm selbst vor.
Es sind aktive suizidale Systeme von mehreren Autoren beschrieben worden. Ein solches System besteht aus zwei Elementen: einem letalen Gen und einer Kontrollsequenz, die unter nicht permissiven Bedingungen auf die Expression des letalen Gens wechselt. Die WO 95/10614 offenbart die Verwendung einer zytoplasmatisch aktiven, verkürzten und/oder mutierten Staphylococcus aureus Nuklease als letales Gen. Die WO 96/40947 offenbart ein rekombinantes bakterielles System mit ökologisch begrenzter Lebensfähigkeit entweder auf der Grundlage der Expression eines essentiellen Gens, das exprimiert wird, wenn sich die Zelle in der permissiven Umgebung befindet, und nicht exprimiert wird oder zeitweise exprimiert wird, wenn sich die Zelle in der nicht permissiven Umgebung befindet, und/oder eines letalen Gens, wobei die Expression des Gens für die Zelle letal ist und das letale Gen exprimiert wird, wenn sich die Zelle in der nicht permissiven Umgebung befindet, nicht aber, wenn sich die Zelle in der permissiven Umgebung befindet. Die WO 99/58652 beschreibt ein biologisches Einschließungssystem auf der Grundlage des relE Cytotoxins. Allerdings sind die meisten Systeme für Escherichia coli (Tedkin u.a., 1995; Knudsen u.a., 1995; Schweder u.a., 1995) oder für Pseudomonas (Kaplan u.a., 1999; Molino u.a., 1998) ausgearbeitet worden. Obwohl mehrere der Einschließungssysteme theoretisch auf Milchsäurebakterien angewendet werden können, ist für Lactococcus kein bestimmtes biologisches Einschließungssystem beschrieben worden, das die Verwendung eines selbsterhaltenden und transformierten Lactococcus zur Abgabe von prophylaktischen und/oder therapeutischen Molekülen ermöglicht, um Krankheiten zu verhindern und/oder zu behandeln.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Karte des MG1363 thyA Locus
2: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Expressionsmodule, wie sie auf pOThy Plasmiden und genomischen Integranten von hIL-10 vorhanden sind. Die schwarzen Teile stellen die ursprüngliche genetische L. lactis MG1363 Information dar, die weißen Teile stellen die rekombinante genetische Information dar.
3: Die PCR-Identifikation von Thy 11 (Thy 11 1.1 und Thy 11 7.1 stellen einzeln erhaltene, identische Klone dar). Die Standard-PCR-Reaktionen wurden mittels Aliquoten von gesättigten Kulturen der angegebenen Stämme als Quelle einer DNA-Matrize durchgeführt. Die Abbildung A zeigt ein Agarosegel der Produkte der angegebenen PCR-Reaktionen. Die Abbildung B zeigt die Positionen, bei denen die Primer in der thyA (1), stromaufwärtigen (2) oder stromabwärtigen (3) PCR anlagern. Verwendete Oligonukleotidprimer (1): ATgACTTACgCAgATCAAgTTTTT und TTAAATTgCTAAATCAAATTTCAATTg (2): TCTgATTgAgTACCTTgACC und gCAATCATAATTggTTTTATTg (3): CTTACATgACTATgAAAATCCg und cTTTTTTATTATTAgggAAAgCA.
4: PCR-Identifikation von Thy11, Thy12, Thy15 und Thy16. Standard-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von drei Tage alten Kolonien der angegebenen Stämme als Quelle der DNA-Matrize durchgeführt.
Die Abbildung A zeigt die Positionen, bei denen Primer sich in der stromaufwärtigen (1), stromabwärtigen (2) oder thyA (3) PCR anlagern. Verwendete Oligonukleotidprimer: (1) ATgACTTACgCAgATCAAgTTTTT und TTAAATTgCTAAATCAAATTTCAATTg (2): TCTgATTgAgTACCTTgACC und gCAATCATAATTggTTTTATTg (3): CTTACATgACTATgAAAATCCg und cTTTTTTATTATTAgggAAAgCA
Die Abbildung B zeigt ein Agarosegel der Produkte der angegebenen PCR-Reaktionen.
5: Southern Blot Analyse der angegebenen Stämme. Chromosomale DNA wurde extrahiert und mit den angegebenen Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarosegelelektrophorese wurde die DNA auf eine Membran übertragen und der Chromosomenaufbau um den thyA Locus wurde durch Verwendung von DIG-markierten thyA oder hIL-10 DNA-Fragmenten gezeigt (Veranschaulichung A). Die Veranschaulichung B zeigt eine schematische Übersicht über den Aufbau des thyA Locus sowohl in MG1363 als auch Thy11.
6: Abbildung A zeigt eine schematische Übersicht über einen Teil des vorhergesagten Aufbaus des L. lactis Chromosoms am thyA Locus in MG1363, Thy11, Thy11, Thy15 und Thy 16. Die Zahlen geben Basenpaare an.
Abbildung B. Southern Blot Analyse der angegebenen Stämme. Chromosomale DNA wurde extrahiert und mit Ndel und Spel Restriktionsenzymen verdaut. Nach einer Agarosegelelektrophorese wurde die DNA auf eine Membran übertragen und der Chromosomenaufbau um den thyA Locus wurde mittels DIG-markierten thyA- oder hIL-10 DNA-Fragmenten offenbart.
7: Herstellung von hIL-10. Die Abbildung A zeigt einen Western Blot, der mit einem anti-hIL-10 Antiserum von Kulturüberstand und zellassoziierten Proteinen der angegebenen Stämme realisiert wurde. Die Abbildung B zeigt die Mengenbestimmung (mittels ELISA) von im Kulturüberstand vorhandenem hIL-10.
8: Herstellung von hIL-10. Die Abbildung A zeigt die Mengenbestimmung (mittels ELISA) von hIL-10, das im Kulturüberstand der angegebenen Stämme vorhanden war. Die Abbildung B zeigt einen Western Blot, der mit anti-hIL-10 Antiserum der Kulturüberstandsproteine der angegebenen Stämme realisiert wurde.
9: Herstellung von hIL-10 durch die L. lactis Stämme LL108, die entweder pOThy11, pOThy12 oder pOThy16 tragen. Die Mengenbestimmung (durch ELISA) von im Kulturüberstand der angegeben Stämme vorhandenem hIL-10. Die N-terminale Proteinsequenz des rekombinanten hIL-10 wurde durch Edman-Abbau bestimmt und war, wie gezeigt wurde, mit dem Aufbau identisch, wie er für das reife, rekombinante hIL-10 vorhergesagt wurde. Das Protein zeigt die volle biologische Wirksamkeit.
10: Wachstumsrate der angegebenen Stämme in GM17, enthaltend 100 μg/ml (T100) 50 μg/ml (T50) 25 μg/ml (T25) oder kein (T0) extra Thymidin und möglicherweise mit 5 μg/ml Erythromycin (E) ergänzt. Gesättigte Übernachtkulturen (hergestellt in T50) wurden 1:100 in den angegebenen Kulturmedien verdünnt. Abbildung A zeigt die Kinetik des Aufbaus des Absorptionsvermögens. Die Abbildung B zeigt die Kinetik der Anzahl von koloniebildenden Einheiten (cfu).
11: Wachstumsrate von MG1363 und Thy12 in thymidinfreiem Medium (TFM). TFM wurde durch Wachsenlassen von L. lactis Thy12 Bakterien in GM17, Entfernen der Bakterien durch anschließende Zentrifugation und Filtration auf einem Filter mit einer Porengröße von 0,22 um, Einstellen des pH-Werts auf 7,0 und Autoklavierung hergestellt.
MG1363 und Ty12 Bakterien wurden von einer Übernachtkultur in GM17 bzw. GM17 + 50 μg/ml Thymidin gesammelt und in M9 Puffer (6 g/l Na₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,5 g/l NaCl in Wasser) gewaschen. Die Suspensionen von beiden wurden entweder in TFM oder mit 50 μg/ml Thymidin (T50) ergänztem TFM verdünnt. Die CFU-Zahlen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt: t = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 und 20 Stunden.
Dies zeigt, dass die Lebensfähigkeit von Thy12 bei einem Fehlen von Thymidin stark eingeschränkt ist.
12: Darm-Passage und Lebensfähigkeit: L. lactis MG1363 wurde mit dem Plasmid pLET2N transformiert, das einen Chloramphenicol (Cm) Resistenzmarker trägt. L. lactis Thy12 wurde mit dem Plasmid pT1NX transformiert, das einen Erythromcyin (Em) Resistenzmarker trägt. Von beiden Stämmen wurden 10⁹ Bakterien erneut in BM9 (6 g/l Na₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 1 g/l NH₄Cl, 0,5 g/l NaCl in 25 mM NaHCO₃ + 25 mM Na₂CO₃) suspendiert, gemischt und in drei Mäuse bei t = 0h inokuliert. Der Kot wurde in den Zeiträumen –1 bis 0, 0 bis 1, 1 bis 2, 2 bis 3, 3 bis 4, 4 bis 5, 5 bis 6, 6 bis 7, 7 bis 8, 8 bis 9, 9 bis 10 und 10 bis übernacht gesammelt. Alle Proben wurden in isotonischem Puffer erneut suspendiert und geeignete Verdünnungen wurden auf GM17 (M17 Medium, Difco, St. Louis, ergänzt mit 0,5 % Glucose) Platten geschichtet, die entweder Cm, Em oder Em + 50 μg/ml Thymidin enthielten. Koloniebildende Einheiten für die unterschiedlichen Platten sind in dem Schaubild dargestellt.
Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein geeignetes biologisches Einschließungssystem für Lactococcus zur Verfügung zu stellen.
Ein erster Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Stamms von Lactococcus sp., der ein Thymidylat-Synthase-Gen umfasst, das durch Gendisruption inaktiviert ist. Lactococcus sp. ist bevorzugt Lactococcus lactis. Eine besondere Ausführungsform ist ein Lactococcus sp. Stamm, vorzugsweise Lactococcus lactis, besonders bevorzugt ein Lactococcus lactis MG1363 Derivat, wo bei das Thymidiylatsynthasegen disrumpiert wird und durch eine Interleukin-10 Expressionseinheit ersetzt wird. Die Interleukin-10 Expressionseinheit ist vorzugsweise eine humane Interleukin-10 Expressionseinheit oder ein Gen, das für humanes Interleukin-10 kodiert, aber es ist nicht darauf beschränkt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Stammes gemäß der Erfindung als Wirtsstamm zur Transformation, wobei das transformierende Plasmid kein Thymidiylat-Synthase-Gen umfasst, das durch Gendisruption inaktiviert wurde. Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen transformierten Stamm von Lactococcus sp. gemäß der Erfindung, der ein Plasmid umfasst, das ein durch Gendisruption inaktiviertes Thymidylat-Synthase-Gen aufweist. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen transformierten Stamm von Lactococcus sp., der ein Gen oder eine Expressionseinheit umfasst, die für ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Molekül, wie beispielsweise Interleukin-10, kodiert. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines transformierten Stamms von Lactococcus sp., um prophylaktische und/oder therapeutische Moleküle abzugeben, und als solchen um Krankheiten zu behandeln. Verfahren zur Abgabe der Moleküle und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, wie beispielsweise entzündliche Darmerkrankungen, werden ausführlich in der WO 97/14806 und der WO 00/23471 von Steidler u.a und in Steidler u.a. (Science 200, 289:1352) erläutert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine medizinische Herstellung, die einen transformierten Stamm von Lactococcus sp. gemäß der Erfindung umfasst.
Das Lactococcus lactis subsp. lactis Thymidylat-Synthase-Gen (thyA) wurde von Ross u.a. (1990a) kloniert; seine Sequenz ist in SED ID N° 3 und SED ID N° 5 beinhaltet. Die EP 0406003 offenbart einen Vektor, dem eine antibiotische Resistenz fehlt und der ein Thymidylat-Synthase-Gen als Selektionsmarker trägt; derselbe Vektor ist von Ross u.a. (1990b) beschrieben worden. Allerdings konnte dieser Vektor aufgrund des Fehlens einer geeigneten thyA-Mutante, die nie beschrieben wurde, nicht in einem Lactococcus lactis Stamm verwendet werden. Die vorliegende Erfindung offenbart, wie eine solche Mutante durch Genruption mittels einer homologen Rekombination in Lactococcus konstruiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das thyA Gen durch eine funktionelle humane Interleukin-1 Expressionskassette disrumpiert. Allerdings ist es klar, dass für die Genruption jedes Konstrukt verwendet werden kann, solange dies zu einer Inaktivierung des thyA Gens oder einer inaktiven Thymidylat-Synthase führt. Als nicht einschränkendes Beispiel kann die homologe Rekombination zu einer Deletion des Gens in einer oder mehr Aminosäuresubstitutionen führen, die eine inaktive Form der Thymidylat-Synthase ergibt, oder auch zu einer Rasterverschiebungsmutation, was zu einer verkürzten Proteinform führt.
Eine solche Lactococcus sp. thyA Mutante ist als Wirtsstamm für eine Transformation in den Situationen sehr nützlich, in denen eine stärkere Einschließung als die rein physische Einschließung notwendig ist. Tatsächlich können thyA Mutanten nicht in einer Umgebung ohne oder nur mit einer beschränkten Konzentration an Thymidin und/oder Thymin überleben. Wenn ein solcher Stamm mit einem Plasmid transformiert wird, das kein intaktes thyA Gen umfasst und die Mutation nicht komplementieren kann, wird der transformierte Stamm in einer Thymidin/Thymin-armen Umgebung suizidal. Ein solcher Stamm kann in einem Fermenter verwendet werden, und zwar als zusätzlicher Schutz für die physische Einschließung. Darüber hinaus offenbart die vorliegende Erfindung, dass ein solcher Stamm in den Fällen besonders nützlich ist, in denen der Stamm als Abgabevehikel in einen Tierkörper verwendet wird. In der Tat überlebt ein solcher transformierter Stamm, wenn er einem Tier – einschließlich einem Menschen – zum Beispiel oral verabreicht wird, im Darm, vorausgesetzt eine ausreichend hohe Konzentration an Thymidin/Thymin ist vorhanden, und erzeugt homologe und/oder heterologe Proteine, wie beispielsweise humanes Interleukin-10, das für das Tier nützlich sein kann. Die vorliegende Erfindung zeigt weiter, dass die transformierten Stämme überraschenderweise den Darm mit derselben Geschwindigkeit wie die Kontrollstämme passieren, und zeigt, dass ihr Verlust an Lebensfähigkeit tatsächlich nicht von der der Kontrollstämme unterschiedlich ist. Allerdings ist der Stamm, sobald er in die Umgebung abgegeben wird, z.B. im Kot, nicht in der Lage, weiterzuleben.
Das transformierende Plasmid kann jedes Plasmid sein, solange es nicht die thyA Mutation komplementieren kann. Es kann sich hierbei um ein selbstreplizierendes Plasmid handeln, das vorzugsweise ein oder mehr interessante Gene und ein oder mehr Resistenzmarker trägt, oder es kann ein integratives Plasmid sein. Im letzteren Fall kann das integrative Plasmid selbst dazu verwendet werden, die Mutation zu erzeugen, indem die Integration an der thyA Stelle bewirkt wird, wodurch das thyA Gen inaktiviert wird. Vorzugsweise wird das aktive thyA Gene durch doppelte homologe Rekombination mittels einer Kassette ersetzt, die das interessante Gen oder die interessanten Gene umfasst, welche durch Zielsequenzen flankiert sind, die die Insertion auf die thyA Zielstelle richten. Es ist von äußerster Wichtigkeit, dass diese Sequenzen ausreichend lang und ausreichend homolog sind, um eine Integration der Sequenz in die Zielstelle zu erreichen. Vorzugsweise bestehen diese Zielsequenzen aus mindestens 100 benachbarten Nukleotiden an einer Seite des interessanten Gens und mindestens 100 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID N° 2 an der anderen Seiten; besonders bevorzugt bestehen die Zielsequenzen aus mindestens 500 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID N° 1 an einer Seite des interessanten Gens und mindestens 500 benachbarten Nukleotiden von SEQ ID N° 2 an der anderen Seite; am meisten bevorzugt bestehen die Zielsequenzen aus SEQ ID N° 1 an einer Seite des interessanten Gens und aus SEQ ID N° 2 an der anderen Seite, oder die Zielsequenzen bestehen aus mindestens 100 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise zu 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 1 an einer Seite des interessanten Gens identisch sind, und aus mindestens 100 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 2 an der anderen Seite des interessanten Gens identisch sind, vorzugsweise bestehen die Zielsequenzen aus mindestens 500 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 1 an einer Seite des interessanten Gens identisch sind, und aus mindestens 500 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 2 an der anderen Seite des interessanten Gens identisch sind, am meisten bevorzugt bestehen die Zielsequenzen aus mindestens 1000 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 1 an einer Seite des interessanten Gens identisch sind, und aus mindestens 1000 Nukleotiden, die zu mindestens 80 % identisch, vorzugsweise zu 90 % mit einer Region von SEQ ID N° 2 an der anderen Seite des interessanten Gens identisch sind. Die prozentuale Identität wird mit BLAST gemäß Altschul u.a. (1997) gemessen. Ein bevorzugtes Beispiel einer Sequenz, die zu SEQ ID N° 1 homolog ist, wird in SEQ ID N° 7 gegeben. Für den Zweck der Erfindung sind SEQ ID N° 1 und SEQ ID N° 7 austauschbar.
Transformationsverfahren von Lactococcus sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Protoplasttransformation und Elektroporation, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein transformierter Lactococcus sp. Stamm gemäß der Erfindung ist zur Abgabe von prophylaktischen und/oder therapeutischen Molekülen nützlich und kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Die Abgabe von solchen Molekülen ist als nicht einschränkendes Beispiel in der WO 97/14806 und in der WO 98/31786 offenbart worden. Die prophylaktischen und/oder therapeutischen Moleküle umfassen Polypeptide, wie beispielsweise Insulin, Wachstumshormon, Prolactin, Calcitonin, Zytokine der Gruppe 1, Zytokine der Gruppe 2 und Zytokine der Gruppe 3, und Polysaccharide, wie beispielsweise Polysaccharidantigene von pathogenen Bakterien, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines Lactococcus sp. Stamms gemäß der Erfindung zur Abgabe von humanem Interleukin-10. Dieser Stamm kann zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Crohn-Krankheit wie oben angegeben verwendet werden.
Beispiele
Von L. lactis MG1363 (Gasson, 1983) haben wir die Regionen auskloniert, die die Sequenz gemäß Roos u.a. (1990a) flankieren.
Die Kenntnis von diesen Sequenzen ist von kritischer Bedeutung für die Gentechnik jedes Lactococcus-Stamms, wie unten beschrieben, da die Strategie eine doppelte homologe Rekombination in den Gebieten 1000 bp am 5'-Ende (SEQ ID N° 1) und 1000 bp am 3'-Ende (SEQ ID N° 2) von thyA, dem „thyA Ziel", anwendet. Diese Sequenzen sind bis jetzt nicht aus einer öffentlichen Quelle er hältlich. Wir haben diese flankierenden DNA-Fragmente kloniert und ihre Sequenz identifiziert. Die Sequenz des gesamten Locus ist in der SEQ ID N° 3 gezeigt; eine Mutantenversion dieser Sequenz ist in SEQ ID N° 5 gezeigt. Sowohl die 5'- als auch die 3'-Sequenz unterscheiden sich von der Genbank-Sequenz AE 006385 , die die L. lactis IL1403 Sequenz beschreibt (Bolotin, in der Presse) oder AF 336368 , die die L. lactis subsp. Lactis CHCC373 Sequenz beschreibt. Aus der Literatur ist ersichtlich, dass die homologe Rekombination durch Verwendung der veröffentlichten Sequenzen benachbart zu thyA (Ross u.a., 1990a) (86 bp am 5'-Ende und 31 bp am 3'-Ende) aufgrund der Kürze der Sequenzen praktisch unmöglich ist. Tatsächlich beschreiben Biswas u.a. (1993) eine logarithmisch abnehmende Korrelation zwischen der Länge der homologen Sequenzen und der Häufigkeit der Integration. Die Sequenzen von L. lactis Thy11, Thy12, Thy15 und Thy16 am thyA Locus, wie in der vorliegenden Erfindung bestimmt, werden durch SEQ ID N° 19, 20, 21 bzw. 22 angegeben.
Der thyA Austausch wird durch Herstellung von geeigneten Austauschen in einer Plasmid getragenen Version des thyA Ziels durchgeführt, wie nachfolgend beschrieben. Das Trägerplasmid ist von pORI19 abgeleitet (Law u.a., 1995), einem replikationsdefekten Plasmid, das die Erythromycinresistenz nur einem bestimmten Stamm überträgt, wenn eine erste homologe Rekombination entweder an 5' 1000 bp oder am 3' 1000 pg des thyA Ziels erfolgt. Eine zweite homologe Rekombination an 3' 1000 bp oder an 5' 1000 bp des thyA-Ziels ergibt den gewünschten Stamm.
Das thyA-Gen wird durch ein synthetisches Gen ersetzt, das ein Protein kodiert, das den L. lactis Usp45 Sekretionsleader (van Asseldonk u.a., 1990) an ein Protein mit identischer Aminosäuresequenz fusioniert hat, und zwar als: (a) den reifen Teil von humanem Interleukin 10 (hIL-10) oder (b) den reifen Teil von hIL-10, bei dem Prolin in der Position 2 durch Alanin ersetzt wurde, oder (c) den reifen Teil von hIL-10, bei dem die ersten zwei Aminosäuren deletiert wurden; (a), (b) und (c) werden hIL-10 Analoge genannt, die Fusionsprodukte werden als Usp45-hIL-10 bezeichnet.
Das thyA Gen wird durch eine Expressionseinheit ersetzt, umfassend den Lactococcus-P1 Promotor (Waterfield u.a., 1995), die E. coli Bakteriophagen T7 Expressionssignale: vemeintliche RNA-Stabilisierungssequenz und modifizierte Gen 10 ribosomale Bindungsstelle (Wells und Schofield, 1996):
Am 5'-Ende wird die Insertion derart durchgeführt, dass das ATG von thyA an die P1-T7Usp45-hIL-10 Expressionseinheit fusioniert wird.
Alternativ wird am 5'-Ende die Insertion derart durchgeführt, dass das thyA ATG nicht eingeschlossen ist:
Alternativ wird am 5'-Ende die Insertion derart durchgeführt, dass der thyA Promoter [Ross, 1990 a] nicht eingeschlossen ist:
Am 3'-Ende wurde eine ACTAGT Spel Restriktionsstelle direkt benachbart zum TAA Stoppkodon der usp45-hIL-10 Sequenz konstruiert. Diese wurde in eine
TCTAGA XbaI Restriktionsstelle ligiert, die direkt im Anschluss an das thyA Stoppkodon synthetisiert wurde.
Diese Konstrukte sind in der 2 gezeigt. Die Sequenzen von pOThy11, pOThy12, pOThy15 und pOThy16 sind durch SEQ ID N° 23, 24, 25 bzw. 26 gegeben.
Die sich ergebenden Stämme sind thyA-defizient, eine Mutante, die noch nicht für L. lactis beschrieben wurde. Sie hängt streng von der Zugabe von Thymin oder Thymidin für das Wachstum ab.
Die Deletionskarte sowie die PCR-Analyse aller Isolate/Mutanten der vorliegenden Erfindung sind in den 3 und 4 gezeigt. Das Vorhandensein der Thymidylat-Synthase und des Interleukin-10 Gens im Wildtyp-Stamm und in den unabhängigen Isolaten/Mutanten wurde mittels Southern Analyse analysiert, wie in den 5 und 6 gezeigt. Die Region um das insertierte hIL-10 Gen wurde mittels PCR isoliert und die DNA-Sequenz wurde verifiziert. Der Aufbau ist mit der vorhergesagten Sequenz identisch.
Die humane Interleukin-10 Produktion in die Mutanten wurde mittels Western Blot Analyse geprüft und mit dem parentalen Stamm, der mit pTREX1 als negative Kontrolle transformiert war, und dem parentalen Stamm, der mit dem IL 10 erzeugendens Plasmid pT1HIL10apxa als positive Kontrolle transformiert war, verglichen (7A). Die Konzentration im Kulturüberstand wurde mittels ELISA quantitativ bestimmt. Wie in der 7B gezeigt ist, erzeugen beide Isolate der Mutante eine vergleichbare, signifikante Menge an hIL-10, auch wenn viel weniger als der Stamm, der mit dem nicht integrativen Plasmid pT1HIL10apxa transformiert ist. Die 8 (Veranschaulichung A und B) zeigen weiter, dass alle Mutanten eine signifikante Menge an h-IL 10 erzeugen.
Die 9 zeigt die Herstellung von hIL-10 durch die L. lactis Stämme LL108, die entweder pOThy11, pOThy12 oder pOThy16 tragen. Die Menge von hIL-10 wird (mittels ELISA) bestimmt, das im Kulturüberstand der angegebenen Stämme vorhanden ist. Die N-terminale Proteinsequenz des rekombinanten hIL-10 wurde durch Edman-Abbau bestimmt und war, wie sich zeigte, identisch mit dem Aufbau, wie er für das reife, rekombinante hIL-10 vorhergesagt war. Das Protein zeigte die volle biologische Wirksamkeit. LL108 ist ein L. lactis Stamm, der eine genomische Integration des repA Gens trägt, das für die Replikation von pORI19 abgeleiteten Plasmiden, wie beispielsweise pOThy11, pOThy12, pOThy15 oder pOThy16 erforderlich ist. Dieser Stamm wurde freundlicherweise von Dr. Jan Kok von der Universität Groningen zur Verfügung gestellt. Die Plasmide pOThy11, pOThy12, pOThy15 und pOThy16 tragen das synthetische humane IL-10 Gen in unterschiedlichen Promotorkonfigurationen (siehe 2), flankiert von ungefähr 1 kB genomischer DNA, die vom thyA Locus stammt, und zwar stromaufwärts und stromabwärts von thyA. Diese Plasmide wurden zur Konstruktion der genomischen Integration verwendet, wie beschrieben.
Die Wirkung der Thymidilatsynthasedeletion auf das Wachstum in Medien mit weniger Thymidin und in mit Thymidin ergänzten Medien wurde getestet; die Ergebnisse sind in den 10 und 11 zusammengefasst. Das Fehlen von Thymidin im Medium schränkt das Wachstum der Mutante stark ein und führt sogar nach vier Stunden Kultivierung zu einer Abnahme der koloniebildenden Einheiten. Die Zugabe von Thymidin zum Medium führt im Vergleich zum Wildtyp-Stamm zu einer identischen Wachstumskurve und Menge von koloniebildenden Einheiten, was zeigt, dass die Mutante das Wachstum oder die Lebensfähigkeit in einem mit Thymidin ergänzten Medium nicht beeinflusst. Die 11 zeigt klar, dass die Thy12 Lebensfähigkeit bei einem Fehlen von Thymidin stark beeinträchtigt ist.
Die 12 zeigt schließlich, dass L. lactis Thy12 den Darm von Mäusen mit der gleichen Geschwindigkeit wie MG1363 passiert. Ein Verlust der Lebensfähigkeit scheint zwischen Thy12 und MG1363 nicht unterschiedlich zu sein. Thy12 scheint von Thymidin im Hinblick auf das Wachstum vollständig abzuhän gen, was zeigt, dass keine Thy12 Bakterien ein fremdes thyA Gen aufgenommen hatten.
Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines isolierten Lactococcus sp. Stamms, umfassend ein Thymidylat-Synthase-Gen, das mittels Gendisruption inaktiviert wurde für die Zubereitung eines Medikaments für die Zufuhr eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Moleküls.
Die Verwendung eines isolierten Lactococcus sp. Stamms nach Anspruch 1, wobei das Thymidylat-Synthase-Gen durch das Gen, das für das prophylaktische und/oder therapeutische Molekül kodiert disrumpiert wird.
Die Verwendung eines isolierten Lactococcus sp. Stamms nach Anspruch 1 oder 2, wobei das prophylaktische und/oder therapeutische Molekül Interleukin 10 ist.
Die Verwendung eines isolierten Lactococcus sp. Stamms nach Anspruch 3 für die Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung entzündlicher Darmerkrankung.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen isolierten Lactococcus sp. Stamm, der ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Molekül herstellt, wobei der Stamm ein Thymidylat-Synthase-Gen umfasst, das mittels Gendisruption inaktiviert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Thymidylat-Synthase-Gen durch das Gen, das für das prophylaktische und/oder therapeutische Molekül kodiert, disrumpiert wird.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, wobei das prophylaktische und/oder therapeutische Molekül Interleukin 10 ist.