DE60211213T2

DE60211213T2 - Elektrode für aktive sauerstoffspezies und die elektrode verwendender sensor

Info

Publication number: DE60211213T2
Application number: DE60211213T
Authority: DE
Inventors: Makoto Soka-shi YUASA; Masahiko Noda-shi ABE; Aritomo Aoba-ku Yokohama-shi YAMAGUCHI; Asako Saitama-shi SHIOZAWA; Masuhide Kazo-shi ISHIKAWA; Katsuya Higashikurume-shi EGUCHI; c/o Boron Japan Co. Shigeru Shibuya-ku KIDO
Original assignee: Abe Masahiko Noda
Current assignee: Abe Masahiko Noda
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2022-12-20
Also published as: ATE325340T1; EP1457773A4; CN100357729C; HK1073888A1; EA006719B1; US20140061063A1; JPWO2003054536A1; AU2002357608A1; EA200400835A1; WO2003054536A1; EP1457773B1; JP4128530B2; US20110315551A1; US20050077192A1; CN1605026A; DE60211213D1; EP1457773A1; KR20040073500A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Elektrode für aktive Sauerstoffspezies im lebenden Körper, wie Superoxidanionradikale (O₂ ^–·), sowie auf einen Sensor zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies unter Verwendung der Elektrode. Spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Elektrode für aktive Sauerstoffspezies und einen Sensor zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies, was auf in vivo-Messungen angewandt werden kann, ohne eine große Menge an Enzymen zu verwenden und ohne ein Problem einer Enzymdeaktivierung zu verursachen.
Stand der Technik
Superoxidanionradikale (O₂ ^–·), die aktive Sauerstoffspezies darstellen, werden in vivo durch Oxidation von Xanthin, Hypoxanthin und dergleichen zu Harnsäure durch Xanthin-Xanthin-Oxidase (XOD), durch Reduktion von Sauerstoff durch Hämoglobin und dergleichen erzeugt. Die Superoxidanionradikale besitzen bei der Synthese von physiologisch aktiven Substanzen, der bakteriziden Wirkung, der Senilität und dergleichen eine wichtige Rolle. Von unterschiedlichen aktiven Sauerstoffspezies, die von Superoxidanionradikalen stammen, wird berichtet, daß sie unterschiedliche Krankheiten wie Krebs verursachen. Deshalb wird angenommen, daß das Messen der Konzentration der aktiven Sauerstoffspezies, einschließlich von Superoxidanionradikalen, im lebenden Körper wichtig ist zum Feststellen dieser unterschiedlichen Erkrankungen.
Wenn es kein Substrat gibt, werden diese Superoxidanionradikale mittels Dismutierreaktion zu Wasserstoffperoxid (H₂O₂) und Sauerstoffmolekülen (O₂), wie in der Formel (1) gezeigt. Diese Dismutierreaktion besteht aus der Bildung von HO₂· durch die Addition eines Protons zu den Superoxidanionradikalen, der Bildung von Wasserstoffperoxid und Sauerstoffmolekülen durch die Reaktion von HO₂· mit Sauerstoffmolekülen, und der Bildung von Wasserstoffperoxid und Sauerstoffmolekülen durch Kollision der HO₂·-Radikale (Formeln (1)–(4)). 2H⁺ + 2O₂· → H₂O₂ + O₂ (1) H⁺ + O₂ ^–· → HO₂· (2) HO₂· + O₂ ^–· + H⁺ → H₂O₂ + O₂ (3) HO₂· + HO₂· → H₂O₂ + O₂ (4)
In diesem Reaktionssystem wirkt das Superoxidanionradikal als ein Elektronenakzeptor (Oxidationsmittel), ein Elektronendonator (Reduktionsmittel) und ein Wasserstoffionenakzeptor (Base). Die ersten beiden Funktionen sind zum Messen der Konzentration von Superoxidanionradikalen verwendet worden. Zum Beispiel wurde die Konzentration von Superoxidanionradikalen unter Verwendung der Reaktion zum Umwandeln von Ferricytochrom c (trivalent) zu Ferrocytochtrom c (bivalent), der Reaktion zum Erzeugen von blauem Formazan aus Nitroblau-Tetrazolium (NBT) sowie der Reaktion zur Reduktion von Tetranitromethan (TNM) gemessen. Alle diese Reaktionen wurden auf einer in vitro-Basis durchgeführt. Chen et al. (Sensors and actuators B70 (2000), S. 115–120) beschreibt einen elektrochemischen Superoxidsensor auf der Basis einer Hämin-modifizierten Graphitelektrode.
Andererseits ist eine Methode zum quantitativen Messen der Konzentration von Superoxidanionradikalen in vivo untersucht worden. Zum Beispiel berichteten McNeil et al., Tariov et al. und Cooper et al., daß die Konzentration von Superoxidanionradikalen elektrochemisch bestimmt werden kann durch Herstellen einer Enzymelektrode (eine Cytochrom C-immobilisierte Elektrode), durch Modifizieren der Oberfläche einer Gold- oder Platin-Elektrode mit einem Enzym, N-Acetylcystein und dem Immobilisieren eines Proteins wie Cytochrom c, welches ein Metallprotein darstellt, mit einem als Häm bezeichneten Eisenkomplex als einem Oxidations/Reduktions-Zentrum, über eine S-Au-Bindung (C.J. McNeil et al., Free Radical Res. Commun., 7, 89 (1989); M.J. Tariov et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 1847 (1991); und J.M. Cooper, K.R.Greenough und C.J. McNeil, J. Electroanal. Chem., 347, 267 (1993)).
Die Methode basierte auf dem folgenden Meßprinzip: das heißt, Cytochrom c (trivalent) (cyt.c(Fe³⁺)) reagiert mit Superoxidanionradikalen und wird gemäß der Reaktionsformel (5) zu Cytochrom c (bivalent) (cyt.c(Fe²⁺)) reduziert. Als nächstes wird mit O₂ ^– reduziertes Cytochrom c (divalent) gemäß der Reaktionsformel (6) elektrochemisch zurückoxidiert. Der in dieser Reaktion erzeugte Oxidationsstrom wird gemessen, wodurch die Konzentration der Superoxidanionradikale auf indirekte Weise quantitativ bestimmt wird. cyt.c(Fe³⁺) + O₂ ^– → cyt.c(Fe²⁺) + O₂ (5) cyt.c(Fe²⁺) → cyt.c(Fe³⁺) + e^– (6)
Da Cytochrom c ein Elektronentransferprotein darstellt, welches in vivo auf intrazellulären mitochondrialen Membranen vorliegt, wird jedoch eine große Anzahl von Zellen (z.B. 10⁵–10⁶ Zellen) benötigt, um eine Elektrode zu bilden, auf der Cy tochrom c in einer zur Messung ausreichenden Menge immobilisiert wird. Zusätzlich wird das Enzym in mehreren Tagen deaktiviert. Deshalb gab es einen Bedarf an der Entwicklung einer Elektrode, die aktive Sauerstoffspezies wie Superoxidanionradikale detektieren kann, ohne eine große Menge an Enzymen zu erfordern, und ohne das Problem der Enzymdeaktivierung zu verursachen.
Offenbarung der Erfindung
Angesichts dieser Situation haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung umfangreiche Studien unternommen, um eine Elektrode zu erhalten, die aktive Sauerstoffspezies wie Superoxidanionradikale durch eine Oxidations/Reduktions-Reaktion detektieren kann. Als ein Ergebnis haben die Erfinder gefunden, daß eine Elektrode, die hergestellt wurde, indem eine Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes, der durch Einbringen eines Metallatoms in das Zentrum einer Porphyrin-Verbindung gebildet wurde, auf der Oberfläche einer leitenden Komponente gebildet wurde, keine große Menge an Enzymen erfordert, frei vom Problem der Deaktivierung ist, und zum Detektieren von aktiven Sauerstoffspezies und der Messung ihrer Konzentration angewandt werden kann.
Speziell stellt die vorliegende Erfindung eine Elektrode für aktive Sauerstoffspezies zur Verfügung, die eine leitende Komponente mit einer auf der Oberfläche gebildeten Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Sensor zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies zur Verfügung, der eine Elektrode für aktive Sauerstoffspezies, die eine leitende Komponente mit einer auf der Oberfläche gebil deten Polymermembran einer Metall-Porphyrin-Komplexes umfaßt, eine Gegenelektrode und eine Referenzelektrode einschließt.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von aktiven Sauerstoffspezies in einer Probe zur Verfügung, welches das Messen des Stroms, der zwischen dem Metall in der Metall-Porphyrin-Polymer-Membran und den aktiven Sauerstoffspezies erzeugt wurde, unter Verwendung des oben beschriebenen Sensors umfaßt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel der Drei-Elektroden-Zelle zeigt, die zur Herstellung der Elektrode der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
2 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel der Zwei-Kammer-Drei-Elektroden-Zelle zeigt, die zur Herstellung der Elektrode der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
3 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel der Nadel-Elektrode und der Zwei-Kammer-Drei-Elektroden-Zelle zeigt, die zur Herstellung der Elektrode der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wobei (a) die Zwei-Kammer-Drei-Elektroden-Zelle ist, (b) die gesamte Nadel-Elektrode ist, und (c) die Spitze der Nadel-Elektrode ist.
4 ist eine Zeichnung, die eine verbesserte Nadel-Elektrode zeigt, die zur Herstellung der Elektrode der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Diese Elektrode ist eine Verbesserung der Nadel-Elektrode von 3, wobei (a) die gesamte verbesserte Nadel-Elektrode zeigt und (b) die Spitze der verbesserten Nadel-Elektrode darstellt.
5 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel der zur Messung aktiver Sauerstoffspezies verwendeten Meßvorrichtung zeigt.
6 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel der zur Messung aktiver Sauerstoffspezies verwendeten Meßvorrichtung zeigt.
7 zeigt Grafiken des Spektrums im UV- und sichtbaren Bereich von H₂T3ThP (7(a)) und des Spektrums im UV- und sichtbaren Bereich von FeT3ThP (7(b)).
8 zeigt Grafiken des Spektrums im UV- und sichtbaren Bereich von H₂T2AmP (8(a)) und des Spektrums im UV- und sichtbaren Bereich von FeT2AmP (8(b)).
9 ist eine Grafik, die eine Strom/Spannungs-Kurve während der elektrolytischen Polymerisation von FeT3ThP zeigt.
10 ist eine Grafik, die eine Strom/Spannungs-Kurve während der elektrolytischen Polymerisation bei der Herstellung der Elektrode von FeT2AmP zeigt.
11 ist eine Grafik, die die zeitliche Veränderung im Oxidationsstrom während der Zugabe von XOD beim Vergleichsprodukt 1 zeigt.
12 ist eine Grafik, die die zeitliche Veränderung im Oxidationsstrom während der Zugabe von XOD beim Erfindungsprodukt 1 zeigt.
13 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen (Ausmaß der XOD-Aktivität)^1/2 und der Menge des Stromanstiegs beim Erfindungsprodukt 1 und beim Vergleichsprodukt 1 zeigt.
14 ist eine Zeichnung, die die zeitliche Veränderung im Strom zeigt, wenn XOD beim Erfindungsprodukt 4 bei einer Konzentration von 100 mU/ml hinzugefügt wurde.
15 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen der Menge an Superoxidanionradikalen und der Menge der Stromveränderung zeigt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung (nachfolgend als "Elektrode" bezeichnet) umfaßt eine leitende Komponente mit einer auf der Oberfläche gebildeten Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes.
Jegliche, gewöhnlich für Elektroden verwendete Komponenten können ohne spezielle Beschränkungen als eine leitfähige Komponente für die Elektrode der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele schließen Kohlenstoff wie Glaskohlenstoff (glassy carbon, GC), Graphit, pyrolytisches Graphit (PG), hochorientiertes pyrolytisches Graphit (HOPG) und Aktivkohle, Edelmetalle wie Platin, Gold und Silber, und In₂O₃/SnO₂ (ITO) ein. Unter diesen ist Glaskohlenstoff besonders bevorzugt im Hinblick auf ökonomische Effizienz, Verarbeitbarkeit, niedrigem Gewicht und dergleichen. Bezüglich der Gestalt der leitfähigen Komponente gibt es keine speziellen Beschränkungen, soweit eine solche Gestalt für eine Elektrode verwendbar ist. Unterschiedliche Gestaltformen wie ein Zylinder, eine viereckige Stütze, eine Nadel und eine Faser können verwendet werden. Eine nadelförmige Gestalt ist zum Beispiel zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies in vivo bevorzugt.
Eine Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes ist auf der Oberfläche der leitfähigen Komponente der vorliegenden Erfindung gebildet. Als Beispiele des zum Herstellen der Polymermembran verwendeten Metall-Porphyrin-Komplexes können die Verbindungen der folgenden Formel (I) oder (II) angegeben werden.
worin M ein Metall ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Eisen, Mangan, Kobalt, Chrom und Iridium besteht, mindestens einer der vier Rs eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer Thiofurylgruppe, Pyrrolylgruppe, Furylgruppe, Mercaptophenylgruppe, Aminophenylgruppe und Hydroxyphenylgruppe besteht, und die anderen Rs irgend eines dieser Gruppen, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder Wasserstoff darstellen.
worin M und R die gleichen wie oben definiert sind, mindestens eines der beiden Ls ein Stickstoff-haltiger, axialer Ligand, wie etwa Imidazol und dessen Derivat, Pyridin und dessen Derivat, Anilin und dessen Derivat, Histidin und dessen Derivat und Trimethylamin und dessen Derivat, ein Schwefelhaltiger, axialer Ligand wie etwa Thiophenol und dessen Derivat, Cystein und dessen Derivat und Methionin und dessen Derivat, oder ein Sauerstoff-haltiger, axialer Ligand wie Benzoesäure und dessen Derivat, Essigsäure und dessen Derivat, Phenol und dessen Derivat, aliphatischer Alkohol und dessen Derivat und Wasser ist, und das andere L irgend eines dieser axialen Liganden oder eine Gruppe ohne einen Liganden ist.
Der durch die obige Formel (I) oder Formel (II) dargestellte Metall-Porphyrin-Komplex ist eine Komplexverbindung, in der ein Metallatom mit einer Porphyrinverbindung koordiniert ist. Diese Porphyrinverbindung ist eine zyklische Verbindung, die aus vier Pyrrolringen gebildet ist, von denen die vier Methingruppen bei der α-Position miteinander verbunden sind und die vier Stickstoffatome auf das Zentrum hin zeigend positioniert sind. Eine Komplexverbindung (ein Metall-Porphyrin-Komplex) kann durch Einbringen eines Metallatoms in das Zentrum gebildet werden. Zum Bilden dieser Verbindung kann ein herkömmliches Verfahren zum Herstellen eines Metallkomplexes, wie etwa beispielsweise ein Verfahren zum Einbringen eines Metallatoms in das Zentrum von Porphyrin unter Verwendung einer Metallierung, verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung können unterschiedliche Metalle, wie Eisen, Mangan, Kobalt, Chrom und Iridium, als dem in das Zentrum der Porphyrinverbindung eingebrachten Metall verwendet werden.
Ein geeignetes Metallatom kann je nach Art der zu messenden aktiven Sauerstoffspezies ausgewählt werden. Zum Beispiel werden Eisen, Mangan, Kobalt und dergleichen vorzugsweise verwendet, wenn Superoxidanionradikale gemessen werden; Eisen, Kobalt, Mangan, Chrom, Iridium und dergleichen werden vorzugsweise verwendet, wenn molekularer Sauerstoff gemessen wird; Eisen, Mangan und dergleichen werden vorzugsweise ver wendet, wenn Wasserstoffperoxid gemessen wird; und Eisen, Mangan und dergleichen werden vorzugsweise verwendet, wenn ·OH, NO, ONOO^– und dergleichen gemessen werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Porphyrinverbindung ist vorzugsweise eine Porphyrinverbindung, bei der mindestens eine der Positionen 5, 10, 15 und 20 in Übereinstimmung mit der Positionennumerierung der IOPAC-Nomenklatur substituiert ist mit einer Thiofurylgruppe, einer Pyrrolylgruppe, einer Furylgruppe, einer Mercaptophenylgruppe, einer Aminophenylgruppe, einer Hydroxyphenylgruppe oder dergleichen, und die anderen Positionen substituiert sind mit irgend einer dieser Gruppen, einer Alkylgruppe, einer Arylgruppe oder Wasserstoff. Die folgenden Verbindungen können als spezielle Beispiele angegeben werden:
5,10,15,20-tetrakis(2-Thiofuryl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Thiofuryl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(2-Pyrrolyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Pyrrolyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(2-Furyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Furyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(2-Mercaptophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Mercaptophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(4-Mercaptophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(2-Aminophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Aminophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(4-Aminophenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(2-Hydroxyphenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(3-Hydroxyphenyl)porphyrin,
5,10,15,20-tetrakis(4-Hydroxyphenyl)porphyrin,
[5,10,15-tris(2-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin,
[5,10,15-tris(3-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin,
[5,10-bis(2-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin,
[5,10-bis(3-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin,
[5,15-bis(2-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin,
[5,15-bis(3-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin,
[5-mono(2-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin und
[5-mono(3-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin.
Unter den durch L der Verbindung der Formel (II) wiedergegebenen Liganden können als Beispiele des Imidazolderivats Methylimidazol, Ethylimidazol, Propylimidazol, Dimethylimidazol und Benzimidazol angegeben werden; als Beispiele des Pyridinderivats können Methylpyridin, Methylpyridylacetat, Nicotinamid, Pyradizin, Pyrimidin, Pyrazin und Triazin angegeben werden; als Beispiele des Anilinderivats können Aminophenol und Diaminobenzol angegeben werden; als Beispiele des Histidinderivats können Histidinmethylester, Histamin und Hippuryl-histidyl-leucin angegeben werden; als Beispiele des Trimethylaminderivats können Triethylamin und Tripropylamin angegeben werden; als Beispiele des Thiophenolderivats können Thiocresol, Mercaptophenol, Mercaptobenzoesäure, Aminothiophenol, Benzoldithiol und Methylbenzoldithiol angegeben werden; als Beispiele des Cysteinderivats können Cysteinmethylester und Cysteinethylester angegeben werden; als Beispiele des Methioninderivats können Methioninmethylester und Methioninethylester angegeben werden; als Beispiele des Benzoesäurederivats können Salicylsäure, Phthalsäure, Isophthalsäure und Terephthalsäure angegeben werden; als Beispiele des Essigsäurederivats können Trifluoressigsäure, Mercaptoessigsäure, Propionsäure und Buttersäure angegeben werden; als Beispiele des Phenolderivats können Cresol und Dihydroxybenzol angegeben werden; und als Beispiele des aliphatischen Alkoholderivats können Ethylalkohol und Propylalkohol angegeben werden.
Zum Bilden einer Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes auf der Oberfläche der leitenden Komponente können unterschiedliche Polymerisationsmethoden wie die elektrolytische Polymerisation, die Lösungspolymerisation und die heterogene Polymerisation in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Unter diesen ist die elektrolytische Polymerisation bevorzugt. Speziell kann die Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes auf der Oberfläche der leitenden Komponente mittels Polymerisation gebildet werden. Die Polymerisation wird ausgeführt durch die Zwei-Elektroden-Elektrolyse (mit Arbeitselektrode und Gegenelektrode) oder durch die Drei-Elektroden-Elektrolyse (mit Arbeitselektrode, Gegenelektrode und Bezugselektrode), einschließlich der Drei-Elektroden-Elektrolyse bei konstantem Potential, der Drei-Elektroden-Elektrolyse bei konstantem Strom, der Drei-Elektroden-Elektrolyse mit reversiblem Potentialschwenk sowie der gepulsten Drei-Elektroden-Elektrolyse, unter Verwendung eines geeigneten Trägerelektrolyten wie Tetrabutylammoniumperchlorat (TBAP: Bu₄NClO₄), Tetrapropylammoniumperchlorat (TPAP: Pr₄NClO₄), oder Tetraethylammoniumperchlorat (TEAP: Et₄NClO₄) in einem organischen Lösungsmittel wie Dichlormethan, Chloroform oder Kohlenstofftetrachlorid, unter Verwendung der leitenden Komponente als der Arbeitselektrode, einer unlöslichen Elektrode wie einer Edelmetallelektrode (z.B. Pt-Elektrode), einer Titanelektrode, einer Kohlenstoffelektrode oder einer Elektrode aus rostfreiem Stahl als der Gegenelektrode, sowie einer Elektrode aus gesättigtem Kalomel (SCE), einer Silber/Silberchlorid-Elektrode oder dergleichen als der Bezugselektrode.
Die elektrolytische Polymerisation wird vorzugsweise mittels Elektrolyse mit reversiblem Potentialschwenk oder derglei chen, zum Beispiel unter Verwendung einer in 1 gezeigten Drei-Elektroden-Zelle durchgeführt. In 1 zeigt 1 einen Zellbehälter; 2 eine leitende Komponente; 3 eine Gegenelektrode; 4 eine Bezugselektrode; 5 eine Lösung eines Metall-Porphyrin-Komplexes; 6 einen Potentiostat; und 7 einen X-Y-Recorder an.
Bei Verwendung einer Lösung mit hoher Konzentration des Metall-Porphyrin-Komplexes kann zum Beispiel eine in 2 gezeigte Zwei-Kammer/Drei-Elektroden-Zelle verwendet werden. In 2 geben die Ziffern 1–7 die gleichen Teile wie in 1 an, 8 gibt eine Elektrolytlösung an, und 9 ist ein Probengefäß.
Zum Herstellen einer vereinfachten Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (einer Nadel-Elektrode) kann eine wie in den 3(A) und 3(B) gezeigte Nadel-Elektrode 10 bzw. Drei-Elektroden-Zelle verwendet werden. In 3 gibt 1 einen Zellbehälter; 4 eine Bezugselektrode; 5 eine Lösung des Metall-Porphyrin-Komplexes; 6 einen Potentiostat; 7 einen X-Y-Recorder; 8 eine Elektrolytlösung; 9 ein Probengefäß; 10 eine Nadel-Elektrode; 11 eine Gegenelektrode; 12 die Spitze der leitenden Komponente (die Metallporphyrin-Polymermembran-Fläche); 13 ein elektrisch isolierendes Material; und 14 einen Gegenelektrodendraht an.
Wie in 3(C) gezeigt, wendet diese Elektrode eine Gegenelektrode 11 an, die durch Füllen eines kleinen Röhrchens eines elektrisch isolierenden Materials 13 mit der leitenden Komponente und Bedecken dieses kleinen Röhrchens mit dem als Gegenelektrode verwendeten Metall hergestellt wurde. Die Elektrode kann als Nadel-Elektrode verwendet werden, indem eine Membran des Metallporphyrin-Polymers auf der Oberfläche der Spitze 12 der leitenden Komponente gebildet wird.
Die Dicke der Polymermembran des Metall-Porphyrin-Komplexes wird passenderweise je nach Art der Elektrode und des Metall-Porphyrin-Komplexes sowie des Typs des zu messenden aktiven Sauerstoffs bestimmt. Eine Dicke von 1 μm oder weniger ist aus der Sicht der Elektrodenaktivität, der Stabilität gegen Veränderung und dergleichen bevorzugt.
Zum Herstellen einer vereinfachten Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (einer verbesserten Nadel-Elektrode) auf der Basis der in 3 gezeigten, vereinfachten Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (Nadel-Elektrode) mit einer Aufgabe des Entfernens von unnötigem Strom aus dem lebenden Körper, von Stromrauschen und dergleichen sowie des Verbesserns der Empfindlichkeit des Signal/Rausch-Verhältnisses (S/N-Verhältnis) und dergleichen, können zum Beispiel eine wie in 4(A) gezeigte, verbesserte Nadel-Elektrode 15 und eine in 3(A) gezeigte Drei-Elektroden-Zelle verwendet werden. In 4 gibt 11 eine Gegenelektrode; 12 eine Spitze der leitenden Komponente (Metallporphyrin-Polymermembran-Fläche); 13 ein elektrisch isolierendes Material; 14 einen Gegenelektrodendraht; 15 eine verbesserte Nadel-Elektrode; 16 eine Erdung; und 17 einen Erdungsdraht an.
Wie in 4(B) gezeigt weist diese Elektrode eine leitende Komponente auf, die in ein elektrisch isolierendes Material 13 insertiert ist (Zwei-Schicht-Struktur). Das elektrisch isolierende Material 13 wird in ein Material der Gegenelektrode 11 eingebracht (Dreischichtstruktur), das Gegenelektrodenmaterial 11 wird in einem elektrisch isolierenden Material 13 beherbergt (Vierschichtstruktur), und schließlich wird die Außenseite des resultierenden kleinen Röhrchens mit einem Material wie einem Metall, das zur Funktion als einer Erdung in der Lage ist, beschichtet (Fünfschichtstruktur). Die Beschichtung wirkt als die Erdung 16. Die Elektrode kann als eine verbesserte vereinfachte Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (verbesserte Nadel-Elektrode) verwendet werden, indem eine Metallporphyrin-Polymermembran auf der Oberfläche bei der Spitze 12 der leitenden Komponente gebildet wird.
Die Dicke der Polymermembran des Metall-Porphyrin-Komplexes wird je nach Art der Elektrode und des Metall-Porphyrin-Komplexes und der Art des zu messenden aktiven Sauerstoffs bestimmt. Eine Dicke von 1 μm oder weniger ist aus Sicht der Elektrodenwirksamkeit, der Stabilität gegenüber Veränderung und dergleichen bevorzugt. Diese verbesserte Nadel-Elektrode kann auch zum Messen von Kompositmaterialien und dergleichen verwendet werden. In einem solchen Fall ist es möglich, eine Elektrode mit einer Struktur mit bis zu 10 oder mehr Schichten herzustellen. Als Material für die Erdung können ein Edelmetall wie Platin, Gold, Titan, rostfreier Stahl und Silber, eine korrosionsbeständige Legierung wie eine Eisen-Chrom-Legierung, Kohlenstoff oder dergleichen verwendet werden. Da die Erdung häufig in vivo verwendet wird, ist ein Material mit hoher Sicherheit wie ein Edelmetall (z.B. Platin, Gold, Silber), Titan, rostfreier Stahl und Kohlenstoff bevorzugt.
Zum Verwenden der Elektrode der vorliegenden Erfindung zum Messen der aktiven Sauerstoffspezies, insbesondere zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies, ist es bevorzugt, die Elektrode mit (1) einer Gegenelektrode und einer Bezugselektrode (Drei-Elektroden-Typ) oder (2) einer Gegenelektrode (Zwei-Elektroden-Typ) zu kombinieren. Als Material für diese Gegenelektrode können ein Edelmetall wie Platin, Gold und Silber, Titan, rostfreier Stahl, eine korrosionsbeständige Legierung wie eine Eisen-Chrom-Legierung, Kohlenstoff oder dergleichen verwendet werden. Da die Gegenelektrode häufig in vivo verwendet wird, ist ein Material mit hoher Sicherheit wie ein Edelmetall (z.B. Platin, Gold, Silber), Titan und Kohlenstoff bevorzugt.
Als Bezugselektrode können unterschiedliche Bezugselektroden, wie eine Silber/Silberchlorid-Elektrode und eine Quecksilber/Quecksilberchlorid-Elektrode gewöhnlicherweise verwendet werden. Auch kann eine feste Standardelektrode verwendet werden.
Ein spezielles Beispiel der Meßvorrichtung, die zur Messung aktiver Sauerstoffspezies verwendet werden kann, ist in 5 gezeigt. In 5 geben die Ziffern 1, 3, 4, 6 und 7 die gleichen Bestandteile wie in 1 an, 18 gibt eine Meßelektrode (Arbeitselektrode) an, 19 gibt eine Mikrospitze an, 20 gibt eine zu messende Lösung an, 21 gibt einen Magnetrührer an, und 22 ist ein Rührer.
Ein anderes spezielles Beispiel der zur Messung aktiver Sauerstoffspezies verwendeten Meßvorrichtung ist in 6 gezeigt. In 6 geben die Ziffern 1, 6, 7 und 19–22 dieselben Gegenstände wie in 4 an, und 10 gibt eine Nadel-Elektrode an.
Obgleich die Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung als eine Elektrode zum Detektieren aktiver Sauerstoffspezies wie Superoxidanionradikalen unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung verwendet werden kann, kann die Elektrode auch als Sensor zum Messen der Kon zentration von aktiven Sauerstoffspezies durch Verwendung in Kombination mit (1) einer Gegenelektrode und einer Bezugselektrode (Drei-Elektroden-Typ) oder (2) einer Gegenelektrode (Zwei-Elektroden-Typ) verwendet werden. Wenn der Sensor zum Messen der Konzentration von aktiven Sauerstoffspezies dieses Aufbaus zum Beispiel in einem System, das Superoxidanionradikale enthält, verwendet wird, wird das Metall im die Polymermembran bildenden Metall-Porphyrin-Komplex durch die Superoxidanionradikale reduziert. Wenn zum Beispiel das Metall Eisen ist, wird durch die Superoxidanionradikale Fe³⁺ zu Fe²⁺ reduziert (Formel (7)).
Wenn das durch die Superoxidanionradikale reduzierte Fe²⁺ elektrochemisch rückoxidiert wird (Formel (8)), während die Elektrode zum Messen der Konzentration bei einem Potential (im Fall des Drei-Elektroden-Typs (1)) oder eine Spannung (im Fall des Zwei-Elektroden-Typs (2)) auf ein Maß gehalten wird, bei dem Fe²⁺ oxidiert werden kann, entspricht der in diesem Fall fließende Strom (Oxidationsstrom) der Konzentration der Superoxidanionradikale. Deshalb kann die Konzentration der in der Probenlösung aufgelösten Superoxidanionradikale quantitativ aus dem Oxidationsstrom detektiert werden. Speziell kann die Konzentration der Superoxidanionradikale bestimmt werden auf der Basis desselben Prinzips der obigen Formeln (5) und (6). Die quantitative Detektion auf der Basis dieses Prinzips ist auch möglich für aktive Sauerstoffspezies wie Wasserstoffperoxid und ·OH, andere aktive Radikalspezies wie NO und ONOO^– und dergleichen. Por(Fe³⁺) + O₂ ^–· → Por(Fe²⁺) + O₂ (7) Por(Fe²⁺) → Por(Fe³⁺) + e^– (8)worin "Por" Porphyrin angibt.
Da die Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung eine Polymermembran eines Metall-Porphyrin-Komplexes auf der Oberfläche einer leitenden Komponente aufweist, ist die Elektrode bemerkenswert stark bzw. fest und ist frei vom Problem der Deaktivierung im Vergleich zu einer herkömmlichen Cytochrom c-immobilisierten Elektrode. Da die Polymermembran des Metall-Porphyrins durch elektrolytische Polymerisation oder dergleichen gebildet ist, ist zusätzlich die Herstellung der Elektrode der vorliegenden Erfindung sehr einfach im Vergleich zu einer herkömmlichen Elektrode. Die Elektrode der vorliegenden Erfindung kann in einer Form bzw. Gestalt hergestellt werden, die zur Anwendung in vivo besonders geeignet ist, zum Beispiel einer nadelförmigen Form.
Auf diese Weise vermag die Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung aktive Sauerstoffspezies wie Superoxidanionradikale, Wasserstoffperoxid und ·OH sowie andere aktive Sauerstoffspezies (NO, ONOO^–, etc.) nicht nur zu detektieren, sondern diese aktive Sauerstoffspezies auch quantitativ zu messen durch Kombination mit einer Gegenelektrode und einer Bezugselektrode in irgendeiner Umgebung, einschließlich einer in vivo Umgebung wie auch einer in vitro Umgebung. Die Elektrode der vorliegenden Erfindung kann deshalb in unterschiedlichen Gebieten breit angewandt werden.
Da unterschiedliche Erkrankungen durch aktive Sauerstoffspezies und andere aktive Radikalspezies in vivo spezifiziert werden können, kann speziell eine Erkrankung wie Krebs bestimmt werden, indem zum Beispiel die Konzentration aktiver Sauerstoffspezies im Blut gemessen wird.
Im Hinblick auf die Anwendung in in vitro Umgebung können andererseits Zersetzungsbedingungen von Nahrungsmitteln beobachtet werden, indem aktive Sauerstoffspezies und deren Konzentration in Nahrungsmitteln gemessen werden. Wasserverschmutzungszustände können ebenfalls beobachtet werden, indem aktive Sauerstoffspezies und ihre Konzentration in Leitungswasser und Abwasser gemessen werden.
Ferner können die Konzentrationen von Superoxidanionradikalen und Superoxiddismutase (SOD), das ein Enzym mit einer Funktion der Beseitigung der Anionen darstellt, gemessen werden, indem das Tilgungsmaß der Superoxidanionradikale bestimmt wird, wenn eine die SOD enthaltene Probe hinzugefügt wird.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird im Detail näher beschrieben unter Bezugnahme auf Bezugsbeispiele, Beispiele und Testbeispiele, was jedoch nicht als die vorliegende Erfindung begrenzend gewertet werden sollte.
Bezugsbeispiel 1
Synthese von 5,10,15,20-tetrakis(3-Thiophenyl)porphyrin (H₂T3ThP)
Ein 100 ml-Bodenrundkolben wurde mit 50 ml Propionsäure, 2,0 ml 3-Thiophencarbaldehyd und 1,4 ml Pyrrol beladen. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 160°C unter Rückfluß gesetzt, während gerührt wurde. Nach dem Rückfluß wurde das Reaktionsprodukt auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, mit Eis weiter gekühlt und zu 200 ml kaltem Methanol zugegeben. Die Mischung wurde durch Absaugung filtriert. Das Filtrat wurde mit Methanol gewaschen und unter Verwendung von Siliziumdioxid-Gelchromatographie gereinigt (Entwicklungslösungsmittel: Chloroform). Das Lösungsmittel wurde zur Trockne verdampft, und der Feststoff wurde rekristallisiert und unter vermindertem Druck getrocknet, um H₂T3ThP als schwarze pulverförmige Kristalle zu erhalten (Ausbeute: 0,63 g, 19 %). Das Reaktionsprodukt wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers im UV-sichtbaren Bereich (UV-2100, hergestellt durch Shimadzu Corp.) und mittels ¹H-NMR-Messung identifiziert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Bezugsbeispiel 2
Synthese von 5,10,15,20-tetrakis(2-Aminophenyl)porphyrin (H₂T2AmP)
Ein mit einem Rückflußkondensierer ausgestatteter 2 L-Vierhalskolben wurde mit 500 ml Propionsäure beladen. Nach Zugabe von 25 g 2-Nitrobenzaldehyd wurde die Mischung unter Rückfluß bei 110°C erhitzt, während gerührt wurde. 12 ml Pyrrol wurden zugegeben, und die Mischung wurde beim Siedepunkt für 30 Minuten unter Rückfluß gehalten. Nach Zugabe von 50 ml Chloroform wurde die Mischung mit Eis gekühlt und durch Absaugung filtriert. Das Filtrat wurde mit 400 ml Chloroform gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet (100°C, sechs Stunden 0,1 kPa), um einen Vorläufer von 5,10,15,20-tetrakis(2-Nitrophenyl)porphyrin (H₂T2NO₂P) als schwarz-purpurne Kristalle zu erhalten (Ausbeute: 5,0 g, 14 %).
Ein 2 L-Vierhalskolben wurde mit 300 ml 12 N HCl beladen. Nach Zugabe von 0,5 g 5,10,15,20-tetrakis(2-Nitrophenyl)porphyrin (H₂T2NO₂P), das wie oben synthetisiert wurde, und 20,0 g Zinn(II)chlorid-Dihydrat wurde die Mischung für 30 Minuten bei 65–70°C erhitzt. Wäßriges Ammoniak wurde allmählich zugegeben, und die Mischung wurde durch Absaugung filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck getrocknet. Ein 2 L Becherglas wurde mit dem Filtrat beladen. Das Filtrat wurde mit 10 L Aceton extrahiert, und der Extrakt wurde unter Verwendung eines Verdampfers bis zur Trockne verdampft. Der trockene Feststoff wurde in 2 L Chloroform aufgelöst. Die Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak und deionisiertem Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Verdampfers bis zur Trockne verdampft, und der Feststoff wurde rekristallisiert und unter verringertem Druck getrocknet, um H₂T2AmP als purpurne Kristalle zu erhalten (Ausbeute: 4,0 g, 90 %). Das Produkt wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers im UV-sichtbaren Bereich (UV-2100, hergestellt durch Shimadzu Corp.) und durch ¹H-NMR-Messung auf die gleiche Weise wie im Bezugsbeispiel 1 identifiziert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. 7(a) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von H₂T3ThP, und 8(a) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von H₂T2AmP. (Identifikationsergebnisse) TABELLE 1
(Identifikationsergebnisse) TABELLE 2
Die Ergebnisse der Identifizierung für H₂T3ThP und H₂T2AmP in der Tabelle 1 bestätigten Protonenpeaks, die den Porphyrinring bilden, sowie spezielle Peaks der Porphyrin-Verbindungen. Der Peak von H₂T2AmP wurde bei 4,0 ppm bestätigt, was als der Peak eines Protons angenommen wurde, der eine Aminogruppe bildet. Die Ergebnisse in Tabelle 2 und den 7(a) und 8(a) bestätigten die auf H₂T3ThP und H₂T2AmP beruhenden Spektren im UV-sichtbaren Bereich. Die obigen Ergebnisse bestätigten, daß H₂T3ThP und H₂T2AmP in den Bezugsbeispielen 1 und 2 synthetisiert wurden.
Bezugsbeispiel 3
Synthese des Metallporphyrinkomplexes (1) (Einführen des zentralen Metalls (Fe) in H₂T3ThP mittels Metallierung)
Ein 50 ml Dreihalskolben wurde mit 10 ml 48%iger Bromwasserstoffsäure beladen. Nach Einströmen von Stickstoffgas für 30 Minuten wurden 100 mg reduziertes Eisen zugegeben. Die Mischung wurde bei 100°C gerührt, bis das reduzierte Eisen aufgelöst war. Nach dem Rühren wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft, um Eisenbromanhydrid als weißes Pulver zu erhalten.
250 mg Porphyrin (H₂T3ThP), welches im Bezugsbeispiel 1 hergestellt wurde, und 200 ml Dimethylformamid (DMF), zu welchem Stickstoffgas zuvor für 30 Minuten eingeströmt wurde, wurden zum Produkt zugegeben. Die Mischung wurde für vier Stunden in einer Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Nach der Reaktion wurden 200 ml Chloroform zum Reaktionsprodukt zugegeben. Die Mischung wurde mit deionisiertem Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und filtriert. Das Lö sungsmittel wurde unter Verwendung eines Verdampfers verdampft, und der erhaltene Feststoff wurde unter Verwendung von Aluminiumoxid-Säulenchromatographie gereinigt (Entwicklungslösungsmittel: Chloroform/Methanol = 20/1). Nach der Zugabe von 48%iger Bromwasserstoffsäure zu dem Eluat wurde die Mischung mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert und filtriert. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Feststoff wurde rekristallisiert und unter verringertem Druck getrocknet, um Metallporphyrin (Fe im Zentrum enthaltendes H₂T3ThP; nachfolgend als "FeT3ThP" bezeichnet) als schwarze Kristalle zu erhalten (Ausbeute: 230 mg, 84 %).
Bezugsbeispiel 4
Synthese des Metallporphyrinkomplexes (2) (Einführen des zentralen Metalls (Fe) in den H₂T2AmP mittels Metallierung)
Schwarze Kristalle eines Metallporphyrinkomplexes, welches im Zentrum von H₂T2AmP Fe enthält (nachfolgend als "FeT2AmP" bezeichnet), wurde auf die gleiche Weise wie im Bezugsbeispiel 3 erhalten, außer daß 250 mg H₂T2AmP (im Bezugsbeispiel 2 erhalten) als eine Porphyrin-Verbindung verwende wurde (Ausbeute: 224 mg, 83 %). Die Produkte der Bezugsbeispiele 3 und 4 wurden unter Verwendung eines Spektralphotometers im UV-sichtbaren Bereich identifiziert. Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 und Tabelle 2 gezeigt.
7(a) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von H₂T3ThP, und 7(b) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von FeT3ThP. 8(a) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von H₂T2AmP, und 8(b) zeigt das Spektrum im UV-sichtbaren Bereich von FeT2AmP. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Messung der Spektren im UV-sichtbaren Bereich.
Die Porphyrinverbindungen, in denen ein Metall im Zentrum nicht koordiniert ist (H₂T3ThP und H₂T2AmP), besitzen auf der Grundlage des konjugierten Rings in der Nähe von 400 nm einen Peak. Der molekulare Extinktionskoeffizient im Peak beträgt 3,6–6,0 × 10⁵ M^–1 cm^–1. Der Peak wird Soret-Bande genannt.
Ferner besitzen die Porphyrin-Verbindungen vier Q-Banden genannte Peaks, von denen der molekulare Extinktionskoeffizient im sichtbaren Bereich 10⁴ M^–1 cm^–1 beträgt. Das Einführen eines Metalls wird im allgemeinen durch Verwendung spektraler Veränderungen der Q-Banden bestätigt. Der Vergleich von (a) mit (b) in 7 und Tabelle 2 zeigt an, daß es vier Peaks von Q-Banden in (a) gibt, während die Zahl der Peaks in (b) auf eins verringert ist. Dies ist in Übereinstimmung mit einem typischen Verhalten, wenn Porphyrin einen Metallkomplex bildet. Folglich wurde bestätigt, daß Porphyrin einen Komplex mit Eisen gebildet hatte, wodurch ein Metallporphyrinkomplex synthetisiert wurde.
Bezugsbeispiel 5
Synthese des Metallporphyrinkomplexes (3) (Einführen eines zentralen Metalls (Mn) in H₂T3ThP mittels Metallierung) Ein mit einem Rückflußkondensierer ausgestatteter 300 ml-Vierhalskolben mit einem am oberen Teil befestigten Argonballon, der über einem Ölbad erhitzt und unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt werden kann, wurde mit 100 ml DMF beladen, das 0,5 g Manganacetat und 0,5 mg im Bezugsbeispiel 1 erhaltenes H₂T3ThP enthielt. Nach Sättigung mit Argon wurde die Mischung für eine Stunde bei 140°C unter Rückfluß gehalten.
Die resultierende Lösung wurde in einen Trenntrichter gegossen und mit Chloroform und deionisiertem Wasser gewaschen. Nach Zugabe von wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde die Mischung für eine Stunde dehydratisiert und filtriert. Das Filtrat wurde unter Verwendung eines Verdampfers bis zur Trockne verdampft.
Der trockene Feststoff wurde getrennt und gereinigt unter Verwendung einer Säulenchromatographie (Füllmittel: basisches Aluminiumoxid, Eluat: Chloroform/Methanol = 20/1). Nach der Filtrierung wurde das Filtrat bis zur Trockne verdampft. Der Feststoff wurde unter verringertem Druck (0,1 kPa, 100°C) getrocknet, um MnT3ThP als schwarz-purpurne Kristalle zu erhalten (Ausbeute: 0,36 g).
Das Absorptionsspektrum im UV-sichtbaren Bereich wurde gemessen, um das Einbringen eines Metalls zu bestätigen. Die Absorptionspeaks von MnT3ThP wurden bei 380 nm, 405 nm, 480 nm, 533 nm, 583 nm und 623 nm bestätigt, was sich vom oben beschriebenen Fall von H₂T3ThP unterschied. Die Einführung eines Metalls wurde somit bestätigt.
Bezugsbeispiel 6
Synthese des Metallporphyrinkomplexes mit einem axialen Liganden (1) (Synthese von FeT3ThP, an welches 1-Methylimidazol koordiniert ist)
Im Bezugsbeispiel 3 erhaltenes FeT3ThP (0,018 g) und 1-Methylimidazol (2–100 μl) (FeT3ThP: 1-Methylimidazol = 1–50 (molares Verhältnis)) wurden zu 0,5 ml Dichlormethan zugegeben. Die Mischung wurde gerührt, während für fünf Minuten Ul traschall (15W) eingestrahlt wurde, oder ohne Einstrahlung von Ultraschall für sechs Stunden oder mehr.
Das Absorptionsspektrum im UV-sichtbaren Bereich wurde gemessen, um die Koordinierung eines Liganden zu bestätigen. Ein Absorptionspeak des durch Koordinierung von 1-Methylimidazol an FeT3ThP erhaltenen Komplexes wurde bei 421 nm erzeugt, was sich vom oben beschriebenen Fall von FeT3ThP unterschied. Die Koordinierung eines Liganden wurde somit bestätigt.
Der Komplex wurde unter Verwendung eines Verdampfers zur Trockne eingedampft und gelagert, oder zur Herstellung einer Elektrode für aktive Sauerstoffspezies verwendet.
Beispiel 1
Herstellung der Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (1)
Eine Glaskohlenstoff (GC)-Elektrode (Durchmesser: 1,0 mm, hergestellt durch BAS Inc.) wurde unter Verwendung eines Aluminiumoxid-Poliermittels (0,05 μm) poliert. Nach Waschen mit Wasser wurde die Elektrode mit Methanol weiter gewaschen. Eine Polymermembran wurde auf der Oberfläche dieser Elektrode mittels elektrolytischer Polymerisation unter Verwendung der folgenden Elektrolytlösung und des folgenden Verfahrens gebildet, um eine Glaskohlenstoff-Elektrode mit einer Polymermembran aus FeT3ThP, welches auf der Oberfläche gebildet wurde (Erfindungsprodukt 1), und eine Glaskohlenstoff-Elektrode mit einer Polymermembran aus auf der Oberfläche gebildetem FeT2AmP (Erfindungsprodukt 2) herzustellen.
(Probenlösung)
Als Metallporphyrinkomplex wurden FeT3ThP oder FeT2AmP, die im Bezugsbeispiel 3 oder 4 synthetisiert wurden, in einer Lösung mit einer Konzentration von 0,05 M verwendet. Als Lösungsmittel wurde (wasserfreies) Dichlormethan, welches 0,1 M Tetrabutylammoniumperchlorat (Bu₄NClO₄/TBAP) enthielt, als Trägerelektrolyt verwendet. Im Lösungsmittel gelöster Sauerstoff wurde unter Verwendung von Argongas entfernt.
(Prozedur)
Eine elektrolytische Polymerisation wurde durch reversible Potentialschwenkelektrolyse unter Verwendung einer Drei-Elektrodenzelle mit einem in 1 gezeigten Aufbau (Arbeitselektrode: GC, Gegenelektrode: Pt-Leitung, Bezugselektrode: SCE) durchgeführt. Der Schwenkbereich betrug bei der SCE im Fall der Herstellung einer Elektrode für aktive Sauerstoffspezies unter Verwendung von FeT3ThP 0 bis 2,0 V; der Bereich betrug bei der SCE im Fall der Herstellung einer Elektrode für aktive Sauerstoffspezies unter Verwendung von FeT2AmP –0,2 bis 1,4 V. Die Schwenkrate betrug in beiden Fällen 0,05 V/s. Die Zahl der Schwenks war einmal im Fall von FeT3ThP und dreimal im Fall von FeT2AmP. Das bei dieser Elektrolytprozedur erhaltene zyklische Voltammogramm (Kurve) wurde in einem X-Y-Rekorder (hergestellt durch Riken Denshi Co., Ltd.) aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in den 9 und 10 gezeigt.
9 zeigt eine CV-Kurve während der elektrolytischen Polymerisation beim Herstellen einer Elektrode unter Verwendung von FeT3ThP als einem Metallporphyrinkomplex. Auf der Basis dieser Kurve wird angenommen, daß kationische Radikale von Thiophen bei +1,74 V (bei der SCE) erzeugt werden. Da beim Umkehren des Potentialschwenks praktisch kein Kathodenstrom aufgrund der Reduktion von kationischen Radikalen strömt, wird angenommen, daß die erzeugten kationischen Radikale sofort in der Lösung polymerisiert werden. Es wird angenommen, daß deren Reduktionspeak in der Nähe von 0,6 V (bei der SCE) eine Redoxantwort des Polymers ist. Die Ergebnisse bestätigten, daß auf der Oberfläche der GC-Elektrode eine Polymermembran des Metallporphyrinkomplexes (FeT3ThP) gebildet wurde.
10 zeigt eine CV-Kurve während der elektrolytischen Polymerisation, als eine Elektrode unter Verwendung von FeT2AmP als einem Metallporphyrinkomplex hergestellt wurde. Auf der Basis dieser Kurve wird angenommen, daß kationische Radikale von Anilin (Aminobenzol) bei +1,02 V (bei der SCE) erzeugt werden. Da beim Umkehren des Potentialschwenks praktisch kein Kathodenstrom aufgrund der Reduktion der kationischen Radikale strömt, wird angenommen, daß die erzeugten kationischen Radikale sofort in der Lösung polymerisiert werden. Es wird angenommen, daß der Reduktionspeak in der Nähe von 0,1 V (bei der SCE) eine Redoxantwort des Polymers ist. Derselbe Peak wurde im zweiten Schwenk gefunden. Ein weiterer Fortgang der Polymerisationsreaktion wurde somit bestätigt. Es wird angenommen, daß der Reduktionspeak in der Nähe von 0,23 V (bei der SCE) eine Redoxantwort des Polymers ist. Die Ergebnisse bestätigten, daß eine Polymermembran des Metallporphyrinkomplexes (FeT2AmP) auf der Oberfläche der GC-Elektrode gebildet wurde.
Beispiel 2
Herstellung der Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (2)
Eine von Polyetheretherketon (PEEK) umgebene Glaskohlenstoff (GC)-Elektrode mit nur einem exponierten Ende (PEEK-Durchmesser: 3 mm, GC-Durchmesser: 1 mm, Endfläche: 0,0079 cm²; wobei das andere Ende aus Messing gefertigt war) wurde bereitgestellt. Das GC-Ende der Elektrode wurde aufeinanderfolgend mittels 6 μm-Polierdiamant und 1 μm-Polierdiamant poliert. Nach abschließendem Polieren auf einem Aluminiumoxid-Polierkissen unter Verwendung eines Aluminiumoxidpoliermittels (0,05 μm) wurde die Elektrode mit deionisiertem Wasser und Aceton gewaschen.
0,0037 g von im Bezugsbeispiel 4 erhaltenem FeT2AmP und 0,171 g von TBAP wurden in einen 5 ml-Meßkolben eingebracht. Acetonitril wurde zur Mischung hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu bilden, wodurch eine Probenlösung erhalten wurde.
Die Probenlösung wurde in ein Zellgefäß eingebracht. Es wurde eine elektrochemische Drei-Elektroden-Zelle mit einer GC-Elektrode als einer Arbeitselektrode wie in 1 gezeigt hergestellt. Die Atmosphäre wurde mit Argon ausgetauscht.
Der Potentialschwenk wurde dreimal im Bereich des Potentialschwenks von –0,3 bis 1,0 V für Ag/Ag⁺ bei einer Potentialschwenkrate von 200 mV/s durchgeführt. Das Schwenk-Anfangspotential und das Schwenk-Endpotential betrug für Ag/Ag⁺ 0 V. Der Schwenk wurde zuerst in der negativen Richtung ausgeführt. Nach dem Schwenk wurde die Zelle aufeinanderfolgend mit Acetonitril und deionisiertem Wasser gewaschen, um eine Glaskohlenstoff-Elektrode mit einer Polymermembran aus FeT2AmP, das auf der Oberfläche gebildet wurde, herzustellen (Erfindungsprodukt 3).
Beispiel 3
Herstellung der Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (3)
0,171 g von TBAP wurden in einen 5 ml-Meßkolben eingebracht. Dichlormethan wurde hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu bilden, wodurch eine elektrolytische Lösung erhalten wurde.
0,0182 g des im Bezugsbeispiel 4 erhaltenen FeT2AmP, 0,0171 g TBAP und 0,5 ml Dichlormethan wurden zu einem Probengefäß hinzugefügt, während die Spitze des mit Vycorglas verschlossenen Probengefäßes in die Elektrolytlösung eingetaucht wurde.
Eine Pt-Gegenelektrode und die im Beispiel 2 verwendete GC-Elektrode wurden in das Probengefäß eingebracht, und eine Ag/Ag⁺-Elektrode wurde auf der Außenseite des Probengefäßes angeordnet, wie in 2 gezeigt, um eine elektrochemische Zweikammer-Dreielektroden-Zelle herzustellen. Die Atmosphäre in den beiden Kammern wurde mit Argon ausgetauscht.
Der Potentialschwenk wurde dreimal im Potentialschwenkbereich von –0,3 bis 2,5 V für Ag/Ag⁺ bei einer Potentialschwenkrate von 50 mV/s ausgeführt. Das Schwenkanfangspotential betrug 0 V für Ag/Ag⁺, und das Schwenkendpotential betrug –0,3 V für Ag/Ag⁺. Der Schwenk wurde zuerst in der negativen Richtung ausgeführt. Nach dem Schwenk wurde die Zelle aufeinanderfolgend mit Dichlormethan und deionisiertem Wasser gewaschen, um eine Glaskohlenstoff-Elektrode mit einer auf der Oberfläche gebildeten Polymermembran aus FeT2AmP herzustellen (Erfindungsprodukt 4).
Beispiel 4
Herstellung einer Elektrode für aktive Sauerstoffspezies (4)
Ein Elektrodenstab aus Glaskohlenstoff (Durchmesser: 0,28–0,30 mm) wurde in eine Glaskapillare eingeführt (Innendurchmesser: 0,3 mm). Diese Produkte wurden in eine Nadel eingebracht (gefertigt aus Platin, rostfreiem Stahl oder dergleichen, in Übereinstimmung mit einer etwa 18G-Injektionsnadel). Diese Produkte wurden verbunden und unter Verwendung von Epoxykleber, Acrylkleber, Maniküre oder dergleichen befestigt. Als nächstes wurden der Glaskohlenstoff und die äußere Nadel jeweils mit einer Platinelektrode, einer Elektrode aus rostfreiem Stahl, einer Kupferelektrode oder dergleichen über einen leitenden Kleber wie einer Silberpaste oder einer Kohlenstoffpaste verbunden. Die Spitze wurde unter Verwendung eines Schleifers poliert, um eine Nadel-Elektrode mit einer Dreischichtstruktur wie in 3 gezeigt herzustellen (Glaskohlenstoff: Arbeitselektrode, innere Glaskapillare: isolierendes Teil zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode, äußere Nadel: Gegenelektrode).
Eine auf die gleiche Weise wie im Beispiel 3 hergestellte Elektrolytlösung (5 ml) wurde in einen Zellbehälter eingebracht. Eine Dichlormethanlösung von im Bezugsbeispiel 6 erhaltenem FeT3ThP, an das 1-Methylimidazol koordiniert wurde, die 0,0171 g TBAP enthielt, wurde zu einem Probengefäß hinzugegeben, während die Spitze des mit Vycor-Glas versiegelten Probengefäßes in die Elektrolytlösung eingetaucht wurde.
Die wie oben beschrieben hergestellten Nadel-Elektroden (Arbeitselektrode und Gegenelektrode) wurden in das Probengefäß eingebracht, und eine Ag/Ag⁺-Elektrode wurde auf der Außenseite des Probengefäßes angeordnet, wie in 3 gezeigt, um eine elektrochemische Zweikammer-Dreielektroden-Zelle herzustellen.
Die Zelle wurde unter Verwendung einer reversiblen Potentialschwenkmethode (Potentialschwenkbereich: –0,1 bis +2,0 V für Ag/Ag⁺, Potentialschwenkrate: 10 bis 500 mV/s) und einer mit konstanten Potentialmethode (Potential: +2,0 V für Ag/Ag⁺) für 5–120 Minuten elektrolytisch polymerisiert. Nach der elektrolytischen Polymerisation wurde die Zelle aufeinanderfolgend mit Dichlormethan und deionisiertem Wasser gewaschen, um eine Nadel-Elektrode mit einer Dreischichtstruktur, einschließlich einer Glaskohlenstoff-Elektrode mit einer Polymermembran aus FeT3ThP, an das 1-Methylimidazol koordiniert war, herzustellen (mittels Polymermembran oberflächenmodifizierter Glaskohlenstoff: Arbeitselektrode, innere Glaskapillare: isolierendes Teil zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode, äußere Nadel: Gegenelektrode; Erfindungsprodukt 5).
Vergleichsbeispiel 1
Herstellung von Cytochrom c-immobilierter Goldelektrode
Als Vergleichsprodukt für die Elektroden der Erfindungsprodukte wurde eine Cytochrom c-immobilierte Goldelektrode als eine Elektrode zum Bestimmen der Konzentration von Superoxidanionradikalen auf die folgende Weise hergestellt.
Eine Goldelektrode (Durchmesser: 1,6 mm, hergestellt durch BAS Inc.) wurde unter Verwendung von Aluminiumoxid-Poliermittel (0,05 μm) poliert und mit Wasser gewaschen. Die Elektrode wurde in l M H²SO₄ elektrochemisch behandelt und mit Wasser gewaschen. Als nächstes wurde die Elektrode in 10 mM 3-Mercaptopropionsäure (nachfolgend mit MPA abgekürzt, hergestellt durch Aldrich Co.) (Lösungsmittel: 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 7,0)) für 24 stunden eingetaucht, um eine MPA-modifizierte Goldelektrode herzustellen. Nach Waschen der Elektrode mit Wasser wurde ein Potentialschwenk in 0,48 mM Cytochrom c (Typ IV aus Pferdeherz, hergestellt durch Sigma Co.) (Lösungsmittel: 10 mM Phosphorsäurepufferlösung (pH 7,0)) für 30 Minuten ausgeführt (Schwenkbereich: –0,4 bis 0,4 V (für Ag/AgCl), Schwenkrage: 0,05 V/s).
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, hergestellt durch Pierce Chemical Co.) wurde hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu bilden, und die Elektrode wurde für zwei Stunden in die Mischung eingetaucht. Die Elektrode wurde schließlich mit einer Phosphorsäurepufferlösung gewaschen, um eine Cytochrom c-immobilisierte Goldelektrode (Vergleichsprodukt 1) zu erhalten. Die obige Phosphorsäurepufferlösung war eine Mischlösung aus Dinatrium-Hydrogenphosphat und Natrium-Dihydrogenphosphat. Einmal destilliertes Wasser wurde zum Einstellen der Probenlösung verwendet.
Testbeispiel 1
Messung der Menge von Superoxidanionradikalen (1)
Die Menge von Superoxidanionradikalen wurde unter Verwendung des Erfindungsprodukts 1 und des Vergleichsprodukts 1 gemessen.
Zuerst wurden die Elektrode des Erfindungsprodukts 1 oder des Vergleichsprodukts 1 als eine Arbeitselektrode und eine Pt-Elektrode als eine Gegenelektrode in einen Zellbehälter ein gebracht, und eine Silber/Silberchlorid-Elektrode (Ag/AgCl) wurde als eine Bezugselektrode verwendet, um für den Test eine Dreielektroden-Zelle zu bilden. Ein in 5 gezeigtes Gerät wurde unter Verwendung der Dreielektroden-Zelle für den Test im Zentrum präpariert. In diesem Test wurde der Potentialschwenkbereich für die Elektrode des Vergleichsprodukts 1 auf –0,2 bis 0,25 V (für Ag/AgCl) und für die Elektrode des Erfindungsprodukts 1 bei –0,5 bis 0,5 V (für Ag/AgCl) festgelegt. Messungen wurden unter Verwendung von mehreren Schwenkraten durchgeführt.
Es wurden eine 14,4 mM Xanthin (hergestellt durch Sigma Co.) enthaltende, 2 mM wäßrige Kaliumhydroxid-Lösung und eine 10 mM Kaliumchlorid enthaltende 10 mM Tris-Pufferlösung (pH 7,5) hergestellt. 0,365 ml der ersteren und 14,635 ml der letzteren wurden zur Herstellung einer 0,35 mM-Xanthin-Lösung vermischt, die als eine Testlösung verwendet wurde. In der Testlösung gelöster Sauerstoff wurde unter Verwendung von hochreinem Argongas entfernt.
Als zweites wurde die Testlösung zum Test zu der Dreielektroden-Zelle hinzugefügt. Ein Potential von 0,2 V (für Ag(AgCl), das ausreichend größer ist als das Oxidations-Reduktions-Potential von jeder Elektrode, wurde angelegt. Xanthin-Oxidase (XOD, Qualitätsstufe III aus Buttermilch, hergestellt durch Sigma Co.) wurde zur Testlösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0–100 mU/ml zu bilden. Die zeitliche Veränderung des Oxidationsstroms wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse für das Erfindungsprodukt 1 sind in 12 und für das Vergleichsprodukt 1 in 11 gezeigt. XOD wurde vor dem Gebraucht mit einer 10 ml-Phosphorsäurepufferlösung (pH 7,0) dialysiert. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
XOD wurde zu Xanthin hinzugegeben, um dosisabhängig Superoxidanionradikale zu erzeugen. 11 zeigt die zeitliche Veränderung im Oxidationsstrom während der Zugabe von XOD im Vergleichsprodukt 1, da die Kontrolle anzeigt, daß der Oxidationsstrom unmittelbar nach Zugabe von XOD schnell ansteigt und nahezu bei einem konstanten Wert bleibt. 12, die die zeitliche Veränderung des Oxidationsstroms während der Zugabe von XOD beim Erfindungsprodukt 1 zeigt, gibt an, daß der Oxidationsstrom unmittelbar nach der Zugabe von XOD wie in 11 schnell ansteigt und der Strom einmal abfällt und nahezu bei einem konstanten Wert bleibt, und daß der Stromwert von der Konzentration des XOD, speziell der Menge an Superoxidanionradikalen, abhängt.
13 ist eine Grafik, die die Beziehung zwischen (Ausmaß der XOD-Aktivität)^1/2 und dem Betrag des Stromanstiegs zeigt, wenn XOD beim Erfindungsprodukt 1 und beim Vergleichsprodukt 1 zugegeben wird. Die XOD-Aktivität wurde bestimmt, wobei die Werte in den Dokumenten Fridovich et al. und Cooper et al. (J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem., 243, 5753 (1968), J.M. McCord und I. Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969), I. Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 4053 (1970), und J.M. Cooper, K.R. Greenough und C.J. McNeil, J. Electroanal. Chem., 347, 267 (1993)) in Betracht gezogen wurden.
Die Ergebnisse zeigen, daß der Betrag des Stromanstiegs beim Erfindungsprodukt 1 proportional ist zu (Ausmaß der XOD-Aktivität)^1/2, und daß es eine lineare Beziehung dazwischen gibt, auf die gleiche Weise wie beim als Kontrolle verwendeten Vergleichsprodukt 1. Diese Tatsachen bestätigten, daß die Konzentration an Superoxidanionradikalen gemessen werden kann unter Verwendung der Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung.
Testbeispiel 2
Messung der Menge an Superoxidanionradikalen (2)
Die Menge an Superoxidanionradikalen wurde unter Verwendung der Elektrode des Erfindungsprodukts 5 gemessen.
Die Elektrode des Erfindungsprodukts 5, speziell einer Nadel-Elektrode mit einer Dreischichtstruktur (mit Polymermembran Oberflächen-modifizierter Glaskohlenstoff: Arbeitselektrode, innere Glaskapillare: isolierender Teil zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode, äußere Nadel: Gegenelektrode; Erfindungsprodukt 5) wurde unter Verwendung einer Zweielektroden-Methode gemessen. Als eine Lösung zur Messung wurde eine 0,15 mM Xanthin enthaltende Tris-Pufferlösung (pH 7,5) verwendet. Zu der Lösung wurden 0–100 mU/ml XOD hinzugefügt. Die angelegte Spannung betrug 0–1,0 V.
Die zeitliche Veränderung des Stroms bei Zugabe von XOD bis zu einer Konzentration von 100 mU/ml bei einer angewandten Spannung von +0,5 V ist in 14 gezeigt. Eine Grafik der Beziehung zwischen der Menge an Superoxidanionradikalen und dem Betrag an Stromveränderung, ermittelt durch den Strompeakwert, ist in 15 gezeigt.
Der aus 15 bestimmte Korrelationskoeffizient zwischen der Menge an Superoxidanionradikalen und dem Betrag an Stromveränderung betrug 0,995. Dies gibt an, daß die Elektrode der vorliegenden Erfindung zur Messung der Menge an Superoxidanionradikalen wirksam verwendet werden kann.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die Elektrode für aktive Sauerstoffspezies der vorliegenden Erfindung kann aktive Sauerstoffspezies wie Superoxidanionradikale, Wasserstoffperoxid und ·OH sowie andere Radikalspezies (NO, ONOO-, usw.) in irgendeiner Umgebung detektieren, einschließlich einer in vivo-Umgebung wie auch einer in vitro-Umgebung. Zusätzlich ist es möglich, diese aktiven Sauerstoffspezies und andere aktive Radikalspezies quantitativ zu bestimmen, indem die Elektrode mit einer Gegenelektrode oder einer Bezugselektrode kombiniert wird. Die Elektrode kann somit in unterschiedlichen Gebieten breit angewandt werden.
Zum Beispiel können bei Verwendung in vivo verschiedene Erkrankungen aus aktiven Sauerstoffspezies und anderen aktiven Radikalspezies des lebenden Körpers spezifiziert werden.
Andererseits können bei Verwendung in vitro aktive Sauerstoffspezies und ihre Konzentration in Nahrungsmitteln gemessen werden, auf dessen Basis Zersetzungsbedingungen des Nahrungsmittels bewertet werden können. Auch können Wasserverunreinigungsbedingungen untersucht werden, indem aktive Sauerstoffspezies und ihre Konzentration im Leitungswasser und im Abwasser gemessen werden.

Claims

Elektrode für aktive Sauerstoffspezies, umfassend eine leitende Komponente mit einer auf der Oberfläche gebildeten Polymermembran eines durch die folgende Formel (I) oder (II) gezeigten Metall-Porphyrin-Komplexes,
worin M ein Metall ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Eisen, Mangan, Kobalt, Chrom und Iridium besteht, mindestens einer der vier Rs eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer Thiofurylgruppe, einer Pyrrolylgruppe, einer Furylgruppe, einer Mercaptophenylgruppe und einer Aminophenylgruppe besteht, und die anderen Rs irgendeine dieser Gruppen, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder Wasserstoff darstellen,
worin M und R gleich wie oben definiert sind, mindestens eines der beiden Ls ein Stickstoff-haltiger, axialer Ligand wie etwa Imidazol und dessen Derivat, Pyridin und dessen Derivat, Anilin und dessen Derivat, Histidin und dessen Derivat und Trimethylamin und dessen Derivat, ein Schwefel-haltiger, axialer Ligand wie etwa Thiophenol und dessen Derivat, Cystein und dessen Derivat und Methionin und dessen Derivat, oder ein Sauerstoff-haltiger, axialer Ligand wie Benzoesäure und dessen Derivat, Essigsäure und dessen Derivat, Phenol und dessen Derivat, aliphatischer Alkohol und dessen Derivat und Wasser ist, und das andere L irgendeines dieser axialen Liganden oder eine Gruppe ohne einen Liganden ist.
Elektrode gemäß Anspruch 1, wobei die den Metall-Porphyrin-Komplex bildende Porphyrinverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 5,10,15,20-tetrakis(2-Thiofuryl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Thiofuryl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Pyrrolyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Pyrrolyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Furyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Furyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(4-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Aminophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Aminophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(4-Aminophenyl)porphyrin, [5,10,15-tris(2-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin, [5,10,15-tris(3-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin, [5,10-bis(2-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,10-bis(3-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,15-bis(2-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,15-bis(3-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin, [5-mono(2-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin und [5-mono(3-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin.
Elektrode gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die leitende Komponente in ein aus einem elektrisch isolierenden Material gefertigten kleinen Röhrchen eingeführt ist, die Außenseite dieses kleinen Röhrchens mit einem Material bedeckt ist, das als eine Gegenelektrode wirkt, wie einem Metall zum Bilden einer Gegenelektrode, eine Metall-Porphyrinpolymer-Membran auf der Spitze der leitenden Komponente gebildet ist, und die Elektrode eine nadel-förmige Gestalt aufweist.
Elektrode gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die leitende Komponente in ein elektrisch isolierendes Material eingeführt ist, das elektrisch isolierende Material in ein Material für eine Gegenelektrode eingebracht ist, das resultierende Material der Gegenelektrode in einem elektrisch isolierenden Material beherbergt wird, dessen Außenseite mit einem als Erdung wirkenden Material bedeckt ist, eine Metall-Porphyrinpolymer-Membran auf der Spitze der leitenden Komponente gebildet ist, und die Elektrode eine nadelförmige Gestalt aufweist.
Elektrode gemäß irgendeinem vorangehenden Anspruch, verwendet zum Messen von Superoxidanionradikalen.
Sensor zum Messen der Konzentration aktiver Sauerstoffspezies, der eine Elektrode für aktive Sauerstoffspezies mit einer leitenden Komponente mit einer auf der Oberfläche gebildeten Polymermembran eines durch die folgende Formel (I) oder (II) gezeigten Metall-Porphyrin-Komplexes, eine Gegenelektrode und eine Bezugselektrode aufweist,
worin M ein Metall ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Eisen, Mangan, Kobalt, Chrom und Iridium besteht, mindestens einer der vier Rs eine Gruppe ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer Thiofurylgruppe, Pyrrolylgruppe, Furylgruppe, Mercaptophenylgruppe und Aminophenylgruppe besteht, und die anderen Rs irgendeine dieser Gruppen, eine Alkylgruppe, eine Arylgruppe oder Wasserstoff darstellen,
worin M und R gleich wie oben definiert sind, mindestens eines der beiden Ls ein Stickstoff-haltiger, axialer Ligand wie etwa Imidazol und dessen Derivat, Pyridin und dessen Derivat, Anilin und dessen Derivat, Histidin und dessen Derivat und Trimethylamin und dessen Derivat, ein Schwefel-haltiger, axialer Ligand wie etwa Thiophenol und dessen Derivat, Cystein und dessen Derivat und Methionin und dessen Derivat, oder ein Sauerstoff-haltiger, axialer Ligand wie Benzoesäure und dessen Derivat, Essigsäure und dessen Derivat, Phenol und dessen Derivat, aliphatischer Alkohol und dessen Derivat und Wasser ist, und das andere L irgendeines dieser axialen Liganden oder eine Gruppe ohne einen Liganden ist.
Sensor gemäß Anspruch 6, wobei die den Metall-Porphyrin-Komplex bildende Porphyrinverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 5,10,15,20-tetrakis(2-Thiofuryl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Thiofuryl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Pyrrolyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Pyrrolyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Furyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Furyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(4-Mercaptophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(2-Aminophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(3-Aminophenyl)porphyrin, 5,10,15,20-tetrakis(4-Aminophenyl)porphyrin, [5,10,15-tris(2-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin, [5,10,15-tris(3-Thiofuryl)-20-mono(phenyl)]porphyrin, [5,10-bis(2-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,10-bis(3-Thiofuryl)-15,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,15-bis(2-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin, [5,15-bis(3-Thiofuryl)-10,20-di(phenyl)]porphyrin, [5-mono(2-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin und [5-mono(3-Thiofuryl)-10,15,20-tri(phenyl)]porphyrin.
Sensor gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei eine Elektrode verwendet wird, die Elektrode leitende Komponenten einschließt, die in ein aus einem elektrisch isolierenden Material gefertigten kleinen Röhrchen eingeführt ist, die Außenseite dieses kleinen Röhrchens mit einem Material bedeckt ist, das als eine Gegenelektrode wirkt, wie einem Metall zum Bilden einer Gegenelektrode, eine Metall-Porphyrinpolymer-Membran auf der Spitze der leitenden Komponente gebildet ist, und die Elektrode eine nadel-förmige Gestalt aufweist.
Sensor gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei eine Elektrode verwendet wird, die Elektrode eine leitende Komponente einschließt, die in ein elektrisch isolierendes Material eingeführt ist, das elektrisch isolierende Material in ein Material für eine Gegenelektrode eingebracht ist, das resultierende Material der Gegenelektrode in einem elektrisch isolierenden Material beherbergt wird, dessen Außenseite mit einem als Erdung wirkenden Material bedeckt ist, eine Metall-Porphyrinpolymer-Membran auf der Spitze der leitenden Komponente gebildet ist, und die Elektrode eine nadelförmige Gestalt aufweist.
Sensor gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9, verwendet zur Messung von Superoxidanionradikalen.
Verfahren zum Detektieren aktiver Sauerstoffspezies in einer Probe, umfassend das Messen eines Stroms, der durch eine Oxidations/Reduktions-Reaktion zwischen einem Metall in einer Metall-Porphyrin-Polymermembran und aktiven Sauerstoffspezies erzeugt wird, unter Verwendung des Sensors gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die zu detektierenden aktiven Sauerstoffspezies Superoxidanionradikale sind.