DE60206923T2

DE60206923T2 - Kardiovaskulares sicherheitstestverfahren

Info

Publication number: DE60206923T2
Application number: DE60206923T
Authority: DE
Inventors: Irma Godelieve HEYLEN; Gerardus Cornelus JANSSEN; Mirek Jurzak; Petrus Van Assouw
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-02
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2022-07-03
Also published as: CA2450581A1; NZ529496A; CN1541334A; CA2450581C; DE60206923D1; ATE308046T1; IL159819A0; EP1410019B1; US7820453B2; US20080193924A1; HK1070693A1; IL159819A; WO2003006988A1; AU2002328312B2; US20110076696A1; AU2002328312B8; EP1410019A1; DK1410019T3; CN1276254C; US20040161805A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der kardiovaskulären Sicherheitstestverfahren und stellt Testverfahren und Kits zum Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum bereit. Dabei beruhen die Testverfahren und Kits auf der Erkenntnis, daß sich die Wechselwirkung von Astemizol mit dem HERG-Kaliumkanal zur Vorhersage einer potentiellen Kardiotoxizität von Verbindungen während der Entwicklung neuer Therapeutika und anderer Agentien nutzen läßt. Besonders vorteilhafte Anwendung findet die vorliegende Erfindung beim Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken chemischer Verbindungen.
TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es haben sich die Hinweise dafür gehäuft, daß mehrere Arzneistoffe die Herzrepolarisation (daher „gemessen als" das QT-Intervall des Oberflächen-Elektrokardiogramms) in einem solchen Ausmaß verlängern können, daß möglicherweise lebensbedrohliche ventrikuläre Arrhythmien, z. B. „torsades de pointes" (TdP), auftreten können, und zwar vor allem im Falle einer Überdosierung oder pharmakokinetischen Wechselwirkung.
Die Anzahl an Arzneistoffen, von denen berichtet wird, daß sie die Verlängerung des QT-Intervalls mit oder ohne TdP induzieren, steigt weiter an (W. Haverkamp et al. (2000) Cardiovascular Research 47, 219–233). Bis zu 50 klinisch verfügbaren oder sich noch in der Untersuchungsphase befindlichen nicht-kardiovaskulären Arzneistoffen sowie kardiovaskulären Nicht-Antiarrhythmika wird dabei eine Beteiligung nachgesagt. Eine Reihe von Arzneistoffen, und zwar sowohl alte als auch neue, wurden entweder vom Markt genommen oder unterliegen Verkaufsbeschränkungen. Von Interesse ist dabei der üblicherweise in Jahren gemessene Zeitraum von der Markteinführung dieser Arzneistoffe bis zum ersten Erkennen ihrer Assoziation mit der QT- Intervallverlängerung und/oder TdP. Es wäre daher vorteilhaft, jeden neuen chemischen Stoff vor seiner ersten Verwendung beim Menschen zu einem frühen Zeitpunkt in der Entwicklung neuer Therapeutika und/oder anderer Agentien auf diese potentielle Nebenwirkung hin zu untersuchen.
Eine Schlüsselkomponente bei der gegenwärtigen Entwicklung neuer Therapeutika besteht im Screening mit hohem Durchsatz (High Throughput Screening, HTS) von Bibliotheken chemischer Verbindungen. Von Pharmafirmen wurden dabei große Sammlungen strukturell unterschiedlicher Verbindungen eingerichtet, die als Ausgangspunkt für Programme zur Identifizierung von Arzneistoffzielleitsubstanzen fungieren. Eine typische firmeneigene Sammlung von Verbindungen umfaßt heute zwischen 100.000 und 1.000.000 eigenständige chemische Stoffe. Während man noch vor ein paar Jahren einen Durchsatz von einigen wenigen tausend Verbindungen pro Tag und Testverfahren als hinreichend ansah, visieren Pharmafirmen heutzutage Screening-Techniken mit ultrahohem Durchsatz an, mit denen pro Woche mehrere Hunderttausend Verbindungen getestet werden. In einem typischen Screen-Format in Verbindung mit HTS werden Tests in Mikroplatten mit mehreren Vertiefungen, wie beispielsweise 96-, 384- oder 1536-Loch-Platten, durchgeführt. Die Verwendung derartiger Platten erleichtert die Automatisierung, wie etwa die Verwendung von automatischen Reagentienspendern und Pipettierrobotern. Zur Verringerung der Zykluszeit, der Kosten und der Mittel für Biochemikalien, wie etwa rekombinante Proteine, werden Screens in Verbindung mit HTS ferner vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei alle im Test getesteten Verbindungen nur einmal gemessen werden.
Ein entscheidendes Kriterium beim Vorgang zur Beurteilung von Leitsubstanzen besteht darin, daß deren potentielle Assoziation mit QT-Verlängerung und/oder TdP früh erkannt wird. Zur Zeit stehen allerdings keine zuverlässigen, schnellen, einfachen Screening-Verfahren zur Beurteilung der Kardiotoxizität zur Verfügung, mit denen die Anzahl an mit den gegenwärtig eingesetzten HTS-Techniken identifizierten Verbindungen bewältigt werden können. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, dieses Problem im Stand der Technik durch die Bereitstellung von Testverfahren und Kits zu lösen, die auf der Erkenntnis beruhen, daß sich die Wechselwirkung von Astemizol mit dem HERG-Kaliumkanal zur Vorhersage einer Kardiotoxizität von Verbindungen während der Entwicklung neuer Therapeutika und anderer Agentien nutzen läßt.
Die gegenwärtig verfügbaren In-vitro-Modelle umfassen heterologe Expressionssysteme, disaggregierte Zellen, isolierte Gewebe und das isolierte intakte (Langendorf-perfundierte) Herz. Bei allen Modellen wird die Auswirkung der Kaliumstromblockade entweder durch die Messung von Ionenströmen unter Verwendung von „voltage-Clamp"-Aufzeichnungen mit zwei Elektroden (Dascal N. (1987) Crit. Rev. Biochem 22, 341–356) oder „Patch-Clamp"-Aufzeichnungen (Zhou Z. et al., (1998) Biophysical Journal 74, 230–241) von Membranpotentialen unter Verwendung von Mikroelektroden oder konfokaler Mikroskopie (Dall'Asta V. et al. (1997) Exp. Cell Research 231, 260–268) beurteilt. Angesichts der Komplexität der experimentellen Vorgehensweisen, den langsamen Zykluszeiten, der Beschaffenheit des Ausgangsmaterials (d.h. isolierter Gewebe und disaggregierter Zellen davon) sowie der Zuverlässigkeit der Testergebnisse läßt sich keines der oben erwähnten Verfahren in einem HTS-Screen verwenden.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß ein Bindungstest, bei dem markiertes Astemizol als spezifischer Ligand des HERG-Kanals zum Einsatz kommt, zur Vorhersage der potentiellen Assoziation von Verbindungen mit QT-Verlängerung und/oder TdP verwendet werden kann. Dieser Bindungstest löst die oben erwähnten Probleme und läßt sich damit in einem HTS-Screen-Format einsetzen.
Ein ähnlicher Test wurde von Chadwick C. et al. (Chadwick C. et al., (1993) Circulation Research 72, 707–714), beschrieben, wobei [³H]-Dofetilid als spezifischer Radioligand für den verzögerten Gleichrichter-K⁺-Kanal des Herzens identifiziert wurde. Ferner wird in diesem Artikel eine gute Korrelation zwischen Dofetilidverdrängung und der kaliumkanalblockierenden Aktivität einer Reihe von Antiarrhythmika demonstriert. Dieser Bindungstest erleichtert die Charakterisierung von Arzneistoff-Kanal-Wechselwirkungen auf dem molekularen Niveau.
Bei diesem Test wurde markiertes Dofetilid durch ³H-Austausch aus dem Dibrom-Vorläufermolekül hergestellt, wobei sich ein Einbau von zwei ³H-Markierungen pro Molekül ergab. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl an ³H-Markierungen pro Molekül und der Empfindlichkeit des Bindungstests. Durch die vorliegende Erfindung wird ein gegenüber dem obigen Test verbesserter Bindungstest bereitgestellt, da der Einsatz eines Desmethylastemizol-Vorläufermoleküls in einer Reaktion [3³H]-Methyljodid zum Einbau von drei ³H-Markierungen pro Molekül Astemizol führte. Die spezifische Aktivität des so erhaltenen Radioliganden ist 1,5-mal bis zweimal so hoch wie die spezifische Aktivität von [³H]-Dofetilid.
Ferner ließ sich der Dofetilid-Test nicht in einem Screen in Verbindung mit HTS verwenden, da die aus erwachsenen männlichen Meerschweinchen isolierten ventrikulären Myozyten innerhalb von 6 Stunden nach der Isolierung verwendet werden mußten. Darüber hinaus waren nur 36% der isolierten Zellen lebensfähig und im Bindungstest verwendbar. Zur Verwendung in einem Screen in Verbindung mit HTS sollte das Ausgangsmaterial leicht verfügbar sein und in ausreichender Menge vorliegen. In der vorliegenden Erfindung wird dieses Problem dadurch gelöst, daß Membranpräparationen von den HERG-Kaliumkanal stabil exprimierenden HEK293-Zellen verwendet werden. Die Zellen lassen sich in ausreichender Menge in Kultur halten, wodurch die Notwendigkeit und Zulieferung von Tiermodellen vermieden wird, und da im Bindungstest Zellmembranen verwendet werden, können diese zur späteren Verwendung in bidungstestfertigen Portionen bei –80°C gelagert werden. Ein weiterer Nachteil des von Chadwick et al. beschriebenen Dofetilid-Bindungstests steht im Zusammenhang mit der Inkubationsvorschrift. Da lebensfähige Myozyten verwendet werden, muß die Inkubation bei der physiologischen Temperatur von 34°C durchgeführt werden. Dadurch werden zweifelsohne die Kosten, die mögliche Zykluszeit und die Komplexität des Tests, falls dieser in einem Screen-Format in Verbindung mit HTS durchgeführt werden soll, erhöht. In der vorliegenden Erfindung wird dieses Problem gelöst, da überraschenderweise demonstriert werden konnte, daß sich die Membranpräparationen bei Raumtemperatur inkubieren ließen. Vor allem im Licht einer Untersuchung von Zhou Z. et al. (Zhou Z. et al., (1998) Biophysical Journal 74, 230–241), worin die Schlußfolgerung gezogen wurde, daß die für HERG gemessenen kinetischen Eigenschaften deutlich temperaturabhängig sind und daß sich in mehreren Berichten beobachtete Unterschiede verringern, wenn die Untersuchungen bei physiologischen Temperaturen, d.h. 35°C, durchgeführt werden.
Dieser und weitere Aspekte der Erfindung werden nachfolgend beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Testverfahren zum Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum bereitgestellt, wobei man bei dem Verfahren eine HERG oder ein Fragment davon enthaltende Quelle mit einer Referenzverbindung und der Testverbindung über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung und der Testverbindung mit dem HERG-Polypeptidkanal zu gestatten, inkubiert und die Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an HERG gebundener Referenzverbindung mißt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das Testverfahren darin, daß man Membranpräparationen von Zellen, vorzugsweise HEK293-Zellen, die auf ihrer Oberfläche den die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfassenden HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren, mit einer markierten Referenzverbindung inkubiert, wobei es sich bei der markierten Referenzverbindung um [³H]-Astemizol der Formel (III), einem Arzneistoff, der zur Induktion von Herzrhythmusstörungen in einem Individuum fähig ist, handelt, die obigen Stoffe mit der Testverbindung inkubiert und die Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an den HERG-Polypeptidkanal gebundener Referenzverbindung mißt. In einer weiteren Ausführungsform bestehen die Mittel zur Messung aus einem Trennmittel zur Entfernung des Überschusses an nichtgebundener markierter Referenzverbindung aus dem Inkubationsgemisch sowie aus einem Mittel zum Nachweis der markierten Referenzverbindung, wobei letzteres vorzugsweise aus der Messung radioaktiver Markierung über Szintillationszählung besteht.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Testverfahren mit hohem Durchsatz zum Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum bereitgestellt, wobei man in dem Testverfahren:

a) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche HERG-Polypeptidkanäle mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder Fragmente davon exprimieren, mit einer markierten Referenzverbindung, die aus radioaktiv markiertem Astemizol der Formel (III) besteht, über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung mit dem HERG-Polypeptidkanal zu gestatten, in Kontakt bringt;
b) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche HERG-Polypeptidkanäle mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder Fragmente davon exprimieren, mit der markierten Referenzverbindung aus Schritt a) zusammen mit der Testverbindung über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung und der Testverbindung mit dem HERG-Polypeptidkanal zu gestatten, in Kontakt bringt;
c) die Menge an an den HERG-Kanal in Schritt a) gebundener markierter Referenzverbindung mißt;
d) die Menge an an den HERG-Kanal in Schritt b) gebundener markierter Referenzverbindung mißt und
e) die in Schritt a) gemessene Menge an an den HERG-Kanal gebundener markierter Referenzverbindung mit der in Schritt b) gemessenen Menge an an den HERG-Polypeptidkanal gebundener markierter Referenzverbindung vergleicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Screening-Testverfahrens mit hohem Durchsatz stammen die Membranpräparationen aus Zellen, vorzugsweise HEK293-Zellen, die auf ihrer Oberfläche von der aus der SEQ ID NO: 2 bestehenden Aminosäuresequenz codierte HERG-Polypeptidkanäle exprimieren.
Außerdem umfaßt die vorliegende Erfindung Kits zum Screening von Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum ebenso wie die Verwendung von Reagentien, einschließlich Polynukleotiden, Polypeptiden und geeigneten Referenzverbindungen, in den Testverfahren der vorliegenden Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
In 1A ist die Sättigungsbindung von [³H]-Astemizol an Zellmembranpräparationen von mit der HERG-Kanal-cDNA stabil transfizierten HEK293-Zellen dargestellt. Dabei steht TB (Total Binding) für die gemessene Gesamtbindung, NSB (Non Specific Binding) für die gemessene nichtspezifische Bindung und SB (Specific Binding) für die gemessene spezifische Bindung.
In 1B ist der Scatchard-Plot für die Sättigungsbindungsexperimente dargestellt. Aus der Kurvenanpassung konnte ein K_D-Wert von 3,07 ± 2,26 nM (n = 11) ermittelt werden, wobei der Wert für B_max (Maximale Bindung) 3260 ± 900 fmol/mg Protein (n = 11) betrug.
In 2 sind die Bindungsaffinitäten von 42 Referenzverbindungen im Vergleich mit den elektrophysiologischen Patch-Clamp-Daten dargestellt. Dabei ergab sich ein Spearman-Rangkorrelationskoeffizient von 0,87.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der kardiovaskulären Sicherheitstestverfahren und stellt Testverfahren und Kits zum Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum bereit. Dabei beruhen die Testverfahren und Kits auf der Erkenntnis, daß sich die Wechselwirkung von Astemizol mit dem HERG-Kaliumkanal zur Vorhersage der Kardiotoxizität von Verbindungen während der Entwicklung neuer Therapeutika und anderer Agentien nutzen läßt. Besonders vorteilhafte Anwendung findet die vorliegende Erfindung beim Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken chemischer Verbindungen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Testverfahren zum Screening von Testverbindungen die folgenden Schritte: a) Inkubieren einer HERG oder ein Fragment davon enthaltenden Quelle mit i) einer Referenzverbindung, ii) der Testverbindung; und b) Messen der Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an HERG gebundener Referenzverbindung.
In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Testverfahren zur Beurteilung der Fähigkeit der Testverbindungen, in einem Individuum Herzrhythmusstörungen zu induzieren, verwendet.
Der Begriff „Testverbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein chemisch definiertes Molekül, dessen Fähigkeit zur Induktion von Herzrhythmusstörungen in einem erfindungsgemäßen Testverfahren beurteilt wird. Zu Testverbindungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Arzneistoffe, (natürliche oder synthetische) Liganden, Polypeptide, Peptide, Peptidmimetika, Polysaccharide, Saccharide, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Polynukleotide und kleine organische Moleküle. In einer Ausführungsform umfassen Testverbindungen eine existierende Bibliothek von Verbindungen. In einer weiteren Ausführungsform umfassen Testverbindungen eine neue Bibliothek von Verbindungen.
Der Begriff „Referenzverbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Arzneistoff, der dazu in der Lage ist, in einem Individuum Kardiotoxizität zu induzieren. Zu Referenzverbindungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Astemizol, Terfenadin, Erythromycin, Sparfloxain, Probucol, Terodilin und Sertindol.
Der Begriff „HERG", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den „Human Ether-a-go-go-Related Gene"-Kanal. Dabei handelt es sich um einen verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanal, der in vielen Zelltypen eine Rolle bei der Steuerung der Aktionspotentialrepolarisation spielt. HERG wurde ursprünglich aus dem menschlichen Hippocampus kloniert und wird im Herz stark exprimiert. Zu den erfindungsgemäßen HERG-Polypeptiden gehören isolierte und gereinigte Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder einem Fragment davon. In einer weiteren Ausführungsform weist der erfindungsgemäße HERG-Polypeptidkanal eine Aminosäuresequenz auf, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße HERG-Polypeptid aus der SEQ ID NO: 2.
Varianten der definierten Sequenz und Fragmente sind ebenso Teil der Erfindung. Unter Varianten fallen solche, die sich von der Ausgangssequenz durch konservative Aminosäureänderungen unterscheiden, wobei sich „konservative Aminosäureänderungen" auf den Austausch eines Aminosäurerests oder mehrerer Aminosäurereste in der Ausgangssequenz bezieht, der sich auf die biologische Aktivität des Ausgangsmoleküls nicht auswirkt und auf der im Fachgebiet bekannten Austauschbarkeit bestimmter Aminosäuren (siehe z.B. M. Dayhoff, In Atlas of Protein Sequence and Structure, Bd. 5, Supp. 3, S. 345–352, 1987) basiert. Zu den Varianten zählen weiterhin solche, in denen mehrere, 5–10, 1–5 oder 1–2 Aminosäuren in beliebiger Kombination substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind.
Verfahren zum Vergleichen der Identität und Ähnlichkeit zweier oder mehrerer Sequenzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. So können beispielsweise im Winconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devreux J. et al., Nucleic Acid Res., 12, 387–395, 1984), verfügbare Programme, beispielsweise die Programme BESTFIT und GAP, zur Bestimmung der % Identität zwischen zwei Polynukleotiden sowie der % Identität und % Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen verwendet werden. BESTFIT benutzt dabei den "Lokale Homologie"-Algorithmus von Smith und Waterman (J. Mol. Biol., 147, 195–197, 1981) und findet den einen besten Ähnlichkeitsbereich zwischen zwei Sequenzen. BESTFIT eignet sich eher zum Vergleich von zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidsequenzen, die sich in ihrer Länge unterscheiden, wobei das Programm davon ausgeht, daß es sich bei der kürzeren Sequenz um einen Teil der längeren handelt. Demgegenüber stellt GAP zwei Sequenzen vergleichend gegenüber und findet dabei eine „maximale Ähnlichkeit" nach dem Algorithmus von Neddleman und Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 443–453, 1970). GAP eignet sich eher für den Vergleich von Sequenzen, die etwa die gleiche Länge aufweisen, wobei eine vergleichende Gegenüberstellung über die gesamte Länge erwartet wird. Vorzugsweise betragen die in beiden Programmen jeweils verwendeten Parameter "Gap Weight" und "Length Weight" 50 bzw. 3 für Polynukleotidsequenzen sowie 12 bzw. 4 für Polypeptidsequenzen. Vorzugsweise werden % Identitäten und Ähnlichkeiten bestimmt, wenn die beiden zu vergleichenden Sequenzen optimal zueinander ausgerichtet sind. Andere Programme zur Bestimmung der Identität und/oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind ebenso im Fachgebiet bekannt, beispielsweise die Programme der BLAST-Familie (Altschul S F et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402, 1997).
Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide, d.h. der HERG-Polypeptidkanal, mit mehreren rekombinanten DNA-Techniken, einschließlich beispielsweise Hybridisierung, Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), oder De-novo-DNA-Synthese erhalten werden könnten (siehe z.B. T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Kap. 14 (1989)). Somit wird in einer weiteren Ausführungsform durch die vorliegende Erfindung die Verwendung der isolierten und gereinigten, für das HERG-Polypeptid oder ein Fragment davon codierenden Polynukleotide in einem erfindungsgemäßen Testverfahren oder Kit bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform wird durch die vorliegende Erfindung die Verwendung des isolierten und gereinigten, für den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon codierenden Polynukleotids, umfassend die Polynukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird durch die vorliegende Erfindung die Verwendung des isolierten und gereinigten, für den HERG-Polypeptidkanal codierenden Polynukleotids, bestehend aus der Polynukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, bereitgestellt.
Der Begriff „Fragmente davon" beschreibt ein Stück oder einen Teilbereich eines Protein- oder Polynukleotidmoleküls, dessen Sequenz hier offenbart ist, so daß das Fragment mindestens 5 im Ausgangsprotein zusammenhängende Aminosäuren umfaßt oder so daß das Fragment mindestens 15 im Ausgangspolynukleotid zusammenhängende Nukleinsäuren umfaßt. Dabei sollen vom Begriff „Fragmente davon" „funktionelle Fragmente" umfaßt sein, wobei das isolierte Fragment, Stück oder der isolierte Teilbereich einen funktionell unterschiedenen Bereich, wie etwa ein aktives Zentrum, eine Bindungsstelle oder eine Phosphorylierungsstelle des Rezeptorproteins, umfaßt. Funktionelle Fragmente können klonierungstechnisch oder als natürliche Produkte alternativer Spleißtechniken produziert werden.
„Isoliert", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Tatsache, daß die betreffenden Polynukleotide, Proteine und Polypeptide oder entsprechenden Fragmente davon aus ihrer In-vivo-Umgebung entfernt wurden, so daß sie sich vom Fachmann manipulieren lassen, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, Sequenzieren, Restriktionsverdauung, stellengerichtete Mutagenese sowie Subklonieren in Expressionsvektoren für ein Nukleinsäurefragment ebenso wie Gewinnen des Proteins oder der Proteinfragmente in einer Menge, die die Erzeugung polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper, Aminosäuresequenzierung und Peptidverdauung ermöglichen. Daher können die Nukleinsäuren, wie sie hier beschrieben sind, in ganzen Zellen oder in Zelllysaten oder in einer teilweise, weitgehend oder vollständig gereinigten Form vorliegen.
Ein Polypeptid wird als „gereinigt" betrachtet, wenn es bei der Reinigung von Verunreinigungen in der Umgebung abgetrennt wird. Somit wird ein aus Zellen isoliertes Polypeptid als weitgehend gereinigt angesehen, wenn es mit Standardverfahren von Zellbestandteilen gereinigt wurde, während eine chemisch synthetisierte Polypeptidsequenz als weitgehend gereinigt angesehen wird, wenn sie von ihren chemischen Vorläufermolekülen gereinigt ist. Dabei umfaßt ein „weitgehend reines" Protein bzw. eine „weitgehend reine" Nukleinsäure typischerweise wenigstens 85% einer Probe, wobei höhere Prozentsätze bevorzugt sind. Ein Verfahren zur Bestimmung der Reinheit eines Protein- oder Nukleinsäuremoleküls besteht in der Elektrophorese einer Präparation in einer Matrix, wie etwa Polyacrylamid oder Agarose. Die Reinheit zeigt sich am Auftreten einer einzigen Bande nach dem Anfärben. Zu weiteren Verfahren zur Reinheitsbestimmung gehören die Chromatographie und die analytische Zentrifugation.
Der Begriff „Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung zu gestatten", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die zur Erzeugung einer nachweisbaren Menge an an den HERG-Polypeptidkanal gebundener markierter Referenzverbindung benötigte Zeit. Die zur Erzeugung dieser nachweisbaren Menge benötigte Zeit variiert je nach dem Testsystem. Dem Fachmann ist die zur Erzeugung einer nachweisbaren Menge an an den HERG-Polypeptidkanal gebundener markierter Referenzverbindung auf der Grundlage des Testsystems ausreichende Zeit bekannt.
Testverfahren
Testverfahren der vorliegenden Erfindung lassen sich in vielen Formaten gestalten, die im Fachgebiet des Screening von Verbindungen auf die Bindung von Polypeptidkanälen allgemein bekannt sind.
Die Testverfahren der vorliegenden Erfindung machen sich vorteilhafterweise die Tatsache zunutze, daß die Wechselwirkung von Astemizol mit dem HERG-Kaliumkanal zur Vorhersage der Kardiotoxizität von Verbindungen während der Entwicklung neuer Therapeutika und anderer Agentien genutzt werden kann.
Daher wird durch die vorliegende Erfindung ein Test zum Screening von Testverbindungen bereitgestellt, bei dem man a) eine HERG oder ein Fragment davon enthaltende Quelle mit i) radioaktiv markiertem Astimezol der Formel (III), ii) der Testverbinding inkubiert und b) die Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an HERG gebundener Referenzverbindung mißt.
In einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um ein isoliertes und gereinigtes Protein, das HERG mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder ein Fragment davon codiert.
In einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um ein isoliertes und gereinigtes Protein, das HERG, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon codiert.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Testverfahren zum Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Kardiotoxizität in einem Individuum darin, daß man a) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche von der aus SEQ ID NO: 2 bestehenden Aminosäuresequenz codierte HERG-Polypeptidkanäle exprimieren, mit i) radioaktiv markiertem Astemizol der Formel (III), ii) der zu testenden Verbindung inkubiert; und die Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an HERG gebundener Referenzverbindung mißt.
Eine spezifische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testverfahren besteht aus einem Testverfahren mit hohem Durchsatz zum Screening von Testverbindungen, wobei man in dem Testverfahren: a) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche HERG-Polypeptidkanäle mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder Fragmente davon exprimieren, mit einem radioaktiv markierten Astemizol der Formel (III) über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung mit dem HERG-Polypeptidkanal zu gestatten, in Kontakt bringt; b) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche HERG-Polypeptidkanäle mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder Fragmente davon exprimieren, mit der markierten Referenzverbindung aus Schritt a) zusammen mit der Testverbindung über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung und der Testverbindung mit dem HERG-Polypeptidkanal zu gestatten, in Kontakt bringt; c) die Menge an an den HERG-Polypeptidkanal in Schritt a) gebundenem radioaktiv markiertem Astemizol mißt; d) die Menge an an den HERG-Kanal in Schritt b) gebundenem radioaktiv markiertem Astemizol mißt und e) die in Schritt a) gemessene Menge an an den HERG-Kanal gebundenem radioaktiv markiertem Astemizol mit der in Schritt b) gemessenen Menge an an den HERG-Polypeptidkanal gebundenem radioaktiv markiertem Astemizol vergleicht.
In einer weiteren Ausführungsform bestehen die Membranpräparationen des Screening-Testverfahrens mit hohem Durchsatz aus Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfassenden HERG-Polypeptidkanal oder Fragmente davon exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen die Membranpräparationen des Screening- Testverfahrens mit hohem Durchsatz aus Membranpräparationen von Zellen, vorzugsweise HEK-293-Zellen, die auf ihrer Oberfläche aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 bestehende HERG-Polypeptidkanäle exprimieren.
Das mit [³H] markierte Astemizol läßt sich unter anderem mittels Szintillationszählung messen.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform wird durch die vorliegende Erfindung ein „Proximity Detection Assay" [Nachweistest zur Bestimmung der Nähe von Verbindungen zueinander] mit hohem Durchsatz zum Screening von Testverbindungen bereitgestellt, wobei das Testverfahren folgendes umfaßt:

i) mit einer ersten, zur Teilnahme an einem Proximity Detection Assay fähigen Markierung markierter HERG;
ii) zur Teilnahme an einem Proximity Detection Assay fähiges radioaktiv markiertes Astemizol der Formel (III);
iii) Inkontaktbringen von HERG aus Schritt i) und radioaktiv markiertem Astemizol aus Schritt ii) mit einer Testverbindung über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Bindung der Referenzverbindung und der Testverbindung an HERG zu gestatten; und
iv) Nachweisen einer Wechselwirkung zwischen HERG aus Schritt i) und radioaktiv markiertem Astemizol aus Schritt ii) über die Nähe der ersten Markierung zur zweiten Markierung, wenn eine Wechselwirkung zwischen HERG und der Referenzverbindung stattfindet.

Die durch die Wechselwirkung von HERG und der Referenzverbindung herbeigeführte Nähe der ersten Markierung zur zweiten Markierung führt zur Produktion eines nachweisbaren Signals. Dies kann beispielsweise mit einem Scintillation Proximity Assay(SPA)-System ereicht werden, bei dem es sich bei einer der Markierungen um eine zur Verwendung im SPA geeignete radioaktive Markierung und bei der anderen Markierung um einen in einer Festphase enthaltenen Fluoreszierer handelt. Bei dem nachweisbaren Signal handelt es sich um bei der Wechselwirkung des markierten HERG-Proteins mit der markierten Referenzverbindung, wodurch die radioaktive Markierung in ausreichende Nähe zum Fluoreszierer gebracht wird, abgestrahlte Lichtenergie. Die Technik des Scintillation Proximity Assay ist in der US 4,568,649 beschrieben.
Andererseits kann es sich bei dem nachweisbaren Signal um eine Änderung einer bestehenden Signalabgabe, z. B. Fluoreszenz, handeln. Beim Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) handelt es sich um ein Verfahren, das nach diesem Prinzip arbeitet und bei Tsien R. et al. (Tsien R. et al. (1993) Trends Cell Biol. 3: 242–245) beschrieben ist. Dabei werden zwei unterschiedliche Fluoreszenzmoleküle eingesetzt, und zwar ein Donor und ein Akzeptor, so daß bei hinreichender Nähe dieser Moleküle zueinander die Fluoreszenz des Donormoleküls vom Akzeptormolekül absorbiert und Licht einer anderen Wellenlänge emittiert wird. Somit wird ein nachweisbares Signal produziert, wenn eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, wie etwa HERG und einer Referenzverbindung, die jeweils mit einem dieser Fluoreszenzmoleküle markiert sind, stattfindet.
Mittels derartiger Proximity Assays, wie sie oben beschrieben sind, kann das erfindungsgemäße Screening-Testverfahren in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, d.h. ohne daß ein Trennschritt zur Entfernung des Überschusses an markierter Referenzverbindung aus dem Inkubationsansatz unter Verwendung von Trennmitteln, wie z. B. Filtration, notwendig ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Proximity Detection Assay mit hohem Durchsatz wird HERG mit dem in einer Festphase, wie etwa beschichteten Scintillation Proximity Assay-Perlen, enthaltenen Fluoreszierer und die Referenzverbindung mit der radioaktiven Markierung markiert; vorzugsweise handelt es sich bei der Referenzverbindung um radioaktiv markiertes Astemizol der Formel (III).
Es ist der Fachkraft leicht ersichtlich, daß die Bindung von Astemizol mit HERG auch in einem Verfahren für den strukturbasierten oder rationalen Entwurf einer Verbindung, die sich auf die oben erwähnte Bindung auswirkt, verwendet werden kann, indem man:

a) die Struktur der Bindungsstelle des HERG-Polypeptidkanals mit Astemizol sondiert;
b) Kontakt machende Atome in der Bindungsstelle des HERG-Polypeptidkanals, die während der Bindung mit Astemizol wechselwirken, identifiziert;
c) Testverbindungen entwirft, die mit den in (b) identifizierten Atomen wechselwirken, um die HERG-Astemizol-Wechselwirkung zu beeinflussen; und
d) die entworfene Testverbindung mit einer HERG oder ein Fragment davon enthaltenden Quelle in Kontakt bringt, um die Fähigkeit der Verbindung zur Beeinflussung der Menge an an HERG gebundenem markiertem Astemizol zu messen.

Ferner ist ersichtlich, daß es sich hierbei in der Regel um ein iteratives Verfahren handelt.
Kits
Mit der vorliegenden Erfindung werden auch Kits bereitgestellt, die sich in den obigen Testverfahren einsetzen lassen. Dabei umfaßt in einer Ausführungsform der Kit a) eine HERG enthaltende Quelle; b) eine Referenzverbindung.
In einer ersten Ausführungsform umfaßt der Kit eine HERG enthaltende Quelle, ausgewählt aus: i) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder ein Fragment davon codiert; ii) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon codiert; iii) Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren; oder iv) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt der Kit eine Referenzverbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Astemizol, Terfenadin, Erythromycin, Sparfloxain, Probucol, Terodilin und Sertindol. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Referenzverbindung um Astemizol. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Kits, wobei die Referenzverbindung markiert, vorzugsweise radioaktiv markiert ist.
In einer spezifischen Ausführungsform ist der isolierte und gereinigte HERG-Polypeptidkanal an einen festen Träger, vorzugsweise an einen einen Fluoreszierer umfassenden festen Träger, wie beispielsweise beschichtete Scintillation Proximity-Perlen, gebunden.
Somit umfaßt der Kit in einer spezifischen Ausführungsform a) einen isolierten und gereinigten HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon, gebunden an einen festen Träger; und b) eine markierte Referenzverbindung. Vorzugsweise besteht diese spezifische Ausführungsform aus einem Kit, umfassend a) einen aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 bestehenden isolierten und gereinigten HERG-Polypeptidkanal, gebunden an einen einen Fluoreszierer umfassenden festen Träger; und b) eine radioaktiv markierte Referenzverbindung, vorzugsweise mit [³H] markiertes Astemizol.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform umfaßt der Kit a) Membranpräparationen von Zellen, vorzugsweise HEK293-Zellen, die auf ihrer Oberfläche den aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 bestehenden HERG-Polypeptidkanal exprimieren; b) mit [³H] markiertes Astemizol und c) Mittel zur Messung der Menge an an HERG gebundener markierter Referenzverbindung.
Die Mittel zur Messung bestehen aus Trennmitteln zur Entfernung des Überschusses an nichtgebundener markierter Referenzverbindung aus dem Inkubationsansatz sowie aus Mitteln zum Nachweis der markierten Referenzverbindung. Dem Fachmann sind die verfügbaren Trennmittel zur Entfernung des Überschusses an nichtgebundener markierter Referenzverbindung aus dem Inkubationsansatz bekannt. Zu den Trennmitteln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Magnetperlen, Zentrifugationstechniken und Filtrationstechniken. Die Mittel zum Nachweis der markierten Referenzverbindung hängen von der verwendeten Markierung ab. Bei diesen Markierungen kann es sich um Fluoreszenzmoleküle oder radioaktive Markierungen handeln.
Dem Fachmann sind die je nach verwendeter Markierung zur Verfügung stehenden Nachweismittel bekannt.
In einer spezifischen Ausführungsform besteht das Trennmittel aus GF/B-Filtration (Whatman Inc, Clifton, N. J.). In einer weiteren spezifischen Ausführungsform besteht das Nachweismittel aus Szintillationszählung in einem Topcount-Gerät (Packard, Meriden, CT).
In einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Kits ferner Anweisungen und/oder Platten mit mehreren Vertiefungen zur Durchführung des Testverfahrens.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die nachfolgenden experimentellen Details verwiesen, doch ist dem Fachmann leicht ersichtlich, daß es sich dabei lediglich um Veranschaulichungen der Erfindung, wie sie ausführlicher in den darauf folgenden Ansprüchen beschrieben ist, handelt. Darüber hinaus sind in der gesamten Anmeldung verschiedene Veröffentlichungen zitiert. Die Offenbarung dieser Veröffentlichungen wird hiermit zur ausführlicheren Beschreibung des Standes der Technik, mit dem die vorliegende Erfindung in Zusammenhang steht, durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung auf genommen.
BEISPIEL 1: DNA-Konstrukte und stabile Transfektion von HEK293-Zellen
HERG-cDNA (Genbank-Zugangsnummer: U04270 (SEQ ID NO: 1)) wurde in bamHI/EcoRI-Stellen des Vektors pcDNA3 (Invitrogen) subkloniert. Dieser Vektor enthält einen CMV-Promotor und einen SV40-Promotor, die die Expression der inserierten cDNA (HERG) bzw. des Neomycinresistenz-Gens antreiben. Die HEK293-Zellen wurden mit diesem Konstrukt mit einem Calciumphosphatpräzipitationsverfahren (Gibco) oder einem Lipofectamine-Verfahren (Gibco) transfiziert. Nach Selektion in 800 μg/ml Geneticin (G418; Gibco) über 15–20 Tage wurden Einzelkolonien mit Klonierungszylindern gepickt und auf HERG-Strom getestet. Die stabil transfizierten Zellen wurden in MEM (Minimum Essential Medium), dem 10% fötales Rinderserum sowie 400 μg/ml Geneticin zugesetzt waren, kultiviert.
Zur elektrophysiologischen Untersuchung wurden die Zellen durch Trypsinisierung aus der Kulturschale geerntet, zweimal mit MEM-Standardmedium gewaschen und auf mit Poly-L-Lysin beschichteten kleinen Petrischalen ausgesät. 1–2 Tage nach dem Ausplattieren wurden an den Zellen Experimente durchgeführt.
BEISPIEL 2: Membranpräparationen von mit dem HERG-Kaliumkanal stabil transfizierten HEK293-Zellen
Mit der HERG-Kanal-cDNA stabil transfizierte HEK293-Zellen wurden in mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika angereichertem DMEM-Kulturmedium angezogen. Die Zellen wurden gesammelt und dann in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 unter Verwendung eines Ultraturrax-Homogenisators homogenisiert, und das Homogenisat wurde 10 min bei 23.500 × g in einer Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellmembranen wurden einmal durch erneutes Homogenisieren und Zentrifugieren gewaschen. Die Membranen wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, suspendiert, in Portionen aufgeteilt und bei –80°C gelagert.
BEISPIEL 3: Radioaktive Markierung von Astemizol
Eine Lösung von 4,6 g Astemizol (I) (10 mmol) in einer wäßrigen Lösung von 48% Bromwasserstoffsäure (80 ml) wurde 2 Stunden am Rückfluß gerührt. Man ließ den Reaktionsansatz auf Raumtemperatur abkühlen und der gebildete Niederschlag wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die Feststoffe wurden in einem Gemisch aus N,N-Dimethylformamid (20 ml) und Wasser (20 ml) gelöst und das Gemisch durch langsames Eintragen einer konzentrierten wäßrigen Ammoniumhydroxidlösung unter Rühren alkalisch gemacht. Anschließend wurde mit Wasser (100 ml) versetzt und der Ansatz 1 h gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und 18 h an der Luft unter Erhalt von Desmethylastemizol (II) getrocknet.
Dieser Menge wurde eine Fraktion entnommen und portionsweise über eine präparative HPLC an einer Hypersyl ODS (5 μm)-gebundene-Phase-Säule aus rostfreiem Stahl (7,1 mm ID × 300 mm) gründlich gereinigt, so daß astemizolfreies Desmethylastemizol erhalten wurde. Der Nachweis erfolgte bei 282 nm, und die Elution wurde isokratisch mit Acetonitril-Wasser-Diisopropylamin (56:44:0,2, v/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 4,0 ml/min durchgeführt.
Eine Fraktion des HPLC-gereinigten Desmethylastemizol (II) (26,7 mg, 60 μmol) wurde in N,N-Dimethylformamid (1,0 ml) gelöst. Diese Lösung wurde mit 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung (60 μl, 60 μmol) versetzt. Der Ansatz wurde 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann zu einer vorgekühlten Lösung (–78°C) von [3³H]-Methyljodid (370 MBq) in Toluol zugetropft. Der Reaktionsansatz wurde am Vortex-Rührer gemischt und danach ohne Kühlen 3 Stunden stehengelassen. Das Toluol wurde auf dem Wasserbad bei 40°C aus dem Reaktionsansatz unter Wasserpumpendruck abgezogen und der Rückstand portionsweise über präparative HPLC wie oben beschrieben gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt und mit Methanol auf 70 ml abgereichert, so daß [³H]-Astemizol (III) mit einer Gesamtradioaktivität von 198 MBq und einer spezifischen Aktivität von 3,14 TBq/mmol (85 Ci/mmol) erhalten wurde.
BEISPIEL 4: Radioligandenbindungstest
Membranen wurden aufgetaut und in Inkubationspuffer (10 nM Hepes, pH 7,4, 40 mM KCl, 20 mM KH₂PO₄, 5 mM MgCl₂, 0,5 mM KHCO₃, 10 mM Glucose, 50 mM Glutamat, 20 mM Aspartat, 14 mM Heptansäure, 1 mM EGTA, 0,1% BSA) rehomogenisiert, und 20–100 μg Protein wurden 60 min bei 25°C mit oder ohne Kompetitor mit [³H]-Astemizol inkubiert, wonach eine Schnellfiltration über ein GF/B-Filter unter Verwendung eines Filtermatel96-Erntegeräts (Packard, Meriden, CT) erfolgte. Die Filter wurden ausgiebig mit eiskaltem Spülpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 130 mM NaCl, 5,5 mM KCl, 5 mM Glucose, 0,8 mM MgCl₂, 50 μM CaCl₂, 0,1% BSA) gespült. Filtergebundene Radioaktivität wurde mittels Szintillationszählung im Topcount (Packard, Meriden, CT) bestimmt, und die Ergebnisse wurden in Anzahl pro Minute [counts per minute] (cpm) ausgedrückt.
Zunächst wurden verschiedene Parameter, einschließlich Puffer, Radioligand und Verbindung zur Bestimmung nichtspezifischer Bindung, untersucht, um die optimalen Bedingungen auszuwählen.
In einem Sättigungsbindungsexperiment wurden steigende [³H]-Astemizol-Konzentrationen mit in Puffer resuspendierten Membranen inkubiert. Nichtspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μM R66204 gemessen (1).
Die Wirkung von im Inkubationspuffer vorhandenem BSA und/oder Cyclodextrin sowie von verschiedenen Arten der Zugabe von Verbindungen vor dem Experiment wurde untersucht, indem die Bindungsaffinitäten von 22 Referenzverbindungen mit den Elektrophysiologiedaten verglichen wurden. Dabei wurden die Verbindungen in DMSO gelöst und im gleichen Lösungsmittel unter Verwendung einer MultiprobeII-Pipettierstation (Packard, Meriden, CT) weiter verdünnt. Die Endkonzentration an DMSO betrug in allen Experimenten 1%. Nach dieser Analyse scheint es so zu sein, daß Verbindungen direkt aus der DMSO-Stammlösung zugegeben werden können. Versuche, die Löslichkeit der Verbindungen durch Zugabe von BSA und/oder Cyclodextrin zu erhöhen, führten zu keiner signifikanten Verbesserung der Korrelation.
BEISPIEL 5: Voltage-Clamp-Technik an ganzen Zellen (Patch Clamp)
Lösungen: Die Badlösung enthielt (in mM) 150 NaCl, 4 KCl, 5 Glucose, 10 HEPES, 1,8 CaCl₂ und 1 MgCl₂ (pH 7,4 mit NaOH). Die Pipettenlösung enthielt (in mM) 120 KCl, 5 EGTA, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 CaCl₂ und 2 MgCl₂ (pH 7,2 mit KOH). Die Verbindungen wurden in DMSO gelöst, so daß jeweils eine Stammlösung von 10^–2 M oder 10^–1 M erhalten wurde. Kontroll-(= Badlösung + DMSO) und Testlösungen (= Badlösung + DMSO + zu testende Verbindung) enthielten 0,3%, 0,1% oder 0,03 DMSO. Test- und Kontrollösungen wurden der zu untersuchenden Zelle unter Verwendung eines Y-Röhrensystems zugeführt, was den schnellen Wechsel von Lösungen (weniger als 0,5 s) in der Umgebung der zu untersuchenden Zelle gestattete.
Elektrophysiologische Messungen: Eine Petrischale mit daran gebundenen, HERG exprimierenden HEK293-Zellen wurde auf der Bühne eines Patch Clamp Tower befestigt. Zur Beobachtung der Zellen wurde ein Umkehrmikroskop verwendet. Die Petrischale wurde ständig mit der Badlösung bei Raumtemperatur perfundiert.
Patch-Pipetten wurden aus Borsilikat-Glaskapillaren unter Verwendung eines horizontalen Flaming/Brown-Mikropipettenziehers ohne weitere Feuerpolitur gezogen. Die verwendeten Mikroelektroden wiesen einen Eingangswiderstand zwischen 1,5 und 3 MΩ auf, wenn sie mit der Pipettenlösung gefüllt waren.
Der Membranstrom der Zellen wurde bei verschiedenen Membranpotentialen mit der Patch-Clamp-Technik mittels eines EPC-9-Patch-Clamp-Verstärkers gemessen. Die Daten wurden mit den Programmen Pulse und Pulsefit (HEKA), DataAccess (Bruxton) sowie Igor (Wavemetrics) gesammelt und analysiert. Die Stromsignale wurden tiefpaßfiltriert und anschließend digitalisiert. Das Diffusionspotential (Liquid Junction Potential, LJP) wurde vor dem Einrichten der Abdichtung elektronisch korrigiert. Nach Aufbrechen der Membran wurden die Kapazität der Zellen und der Reihenwiderstand mit dem Stromkreis des EPC-9-Patch-Clamp-Verstärkers ausgeglichen.
Das Haltepotential betrug –80 mV. Der HERG-Strom (K⁺-selektiver Auswärtsstrom) wurde als maximaler Tail-Strom bei –40 mV nach 2 Sekunden Depolarisation auf +60 mV bestimmt. Die Impulskreislauf-Geschwindigkeit betrug 15 s. Vor jedem Testimpuls wurde ein kurzer Impuls (0,5 s) vom Haltepotential auf –60 mV gegeben, um den Leckstrom zu bestimmen. Nach Aufbau der Ganzzellenkonfiguration wurde zur internen Perfusion der Zelle mit der Pipettenlösung 5 Minuten äquilibriert. Danach wurden zur Quantifizierung des HERG-Stroms unter Kontrollbedingungen 5 Minuten lang Testimpulse gegeben. Während das Impulsprotokoll weiterlief, wurde die Perfusion von der Kontrollösung auf die arzneistoffhaltige Lösung umgeschaltet. Die Wirkung des Arzneistoffs wurde nach 5 Minuten Arzneistoffapplikation gemessen. Pro Zelle wurden eine bis drei (kumulativ applizierte) Arzneistoffkonzentrationen getestet.
Parameteranalyse der Messungen: Ausgehend von einem Haltepotential von –80 mV wurde der HERG-Strom als maximaler Tail-Strom bei –40 mV nach 2 Sekunden Depolarisation auf +60 mV bestimmt.
Während der ersten 5 Minuten Messung in Gegenwart der Kontrollösung nahm die Amplitude des HERG-vermittelten K⁺-Membranstroms mit der Zeit nach und nach ab (Abbau [rundown]). Um das Ausmaß der Blockierung durch die Verbindungen korrekt quantifizieren zu können, muß dieser kontinuierliche Abbau des K⁺-Stroms berücksichtigt werden. Daher wurde der zeitliche Verlauf des (bei –40 mV gemessenen) K⁺-Stroms exponentiell an die Anfangszeit von 5 Minuten in der Kontrollösung angepasst und für den Rest des Experiments extrapoliert. Diese Extrapolierungen ergeben die geschätzte Amplitude des Stroms, wenn kein Arzneistoff appliziert worden wäre. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Blockierng durch die Verbindungen wurde das Verhältnis des gemessenen Stroms berechnet, indem die gemessene Stromamplitude jeweils durch den Wert des angepassten Stroms beim gleichen Zeitpunkt geteilt wurde.
BEISPIEL 6: Pharmakologische Bewertung des Bindungstests
Zur pharmakologischen Bewertung des Bindungstests wurden 322 Verbindungen bei 8 Konzentrationen auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von [³H]-Astemizol an den HERG-Kanal getestet und pIC₅₀-Werte mittels nichtlinearer Regressionsanalyse berechnet. Falls pIC₅₀-Werte verfügbar waren, wurde die Rangordnung (Spearman) der Potencies für Bindung und Patch Clamp verglichen.

Wurden im Patch-Clamp-Testverfahren Verbindungen nur bei < 4 Konzentrationen getestet, wurde sowohl den Bindungs- als auch den Patch-Clamp-Daten jeweils ein Punktwert („Score") gemäß den folgenden Kriterien zugeordnet:

Score 1:	pIC50 < 6 oder %Blockade < 50% bei 10^–6 M oder höher
Score 2:	pIC50 zwischen 6–8 oder Blockade < 50% zwischen 10^–6 und 10^–8 M
Score 3:	pIC50 > 8 oder %Blockade > 50% bei 10^–8 M oder niedriger

Die Rangordnung der Potencies von 42 Referenzverbindungen für die Verdrängung der [³H]-Astemizolbindung vom HERG-Kanal, korreliert gut mit den elektrophysiologischen Daten für die funktionelle Blockade des schnellen aktivierenden verzögerten Gleichrichter-K⁺-Stroms (r_SP = 0,87) (2).
Bei 94% der getesteten Verbindungen korrelieren die Bindungsdaten mit den Patch-Clamp-Daten. In 2% der Fälle erzielte der Bindungstest einen höheren Score als der Patch-Clamp-Test, wobei es bei den restlichen 4% umgekehrt ist, d.h. der Patch-Clamp-Test erzielt einen höheren Score als der Bindungstest.
Angesichts dieser guten Korrelation zwischen Bindungsdaten und elektrophysiologischen Daten kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß sich der Radioligandenbindungstest als ein primäres Screening-Werkzeug zur Vorhersage potentieller kardiovaskulärer Nebenwirkungen verwenden läßt.
Sequenzprotokoll

Claims

Testverfahren zum Screening von Testverbindungen, bei dem man: a) eine HERG oder ein Fragment davon enthaltende Quelle mit i) radioaktiv markiertem Astemizol der Formel (III)
ii) der Testverbindung inkubiert; und b) die Wirkung der Testverbindung auf die Menge an an HERG gebundener Referenzverbindung mißt.
Testverfahren nach Anspruch 1, wobei die HERG enthaltende Quelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder ein Fragment davon codiert; ii) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon codiert; iii) Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren; oder iv) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren.
Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal, bestehend aus SEQ ID NO: 2, exprimieren, handelt.
Verwendung eines Testverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für das Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induzierung von Kardiotoxizität in einem Individuum.
Verwendung eines Testverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für das Screening von Testverbindungen auf ihre Fähigkeit zur Induzierung von Herzrhythmusstörungen in einem Individuum.
Radioaktiv markiertes Astemizol der Formel (III)
Verfahren zur Herstellung von radioaktiv markiertem Astemizol nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch: a) Demethylierung von Astemizol der Formel (I) unter Verwendung eines geeigneten Reagens, wie etwa 48%iger wässriger Bromwasserstoffsäure; und
b) Umsetzen der Zwischenverbindung der Formel (II) mit [3H³]-Methyliodid (CT₃I), gegebenenfalls in einem reaktionsträgen Lösungsmittel und in Gegenwart einer Base.
Kit, umfassend: a) eine HERG enthaltende Quelle; b) radioaktiv markiertes Astemizol nach Anspruch 6.
Kit nach Anspruch 8, wobei die HERG enthaltende Quelle ausgewählt ist aus: i) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG mit einer Aminosäuresequenz, die wenigstens 80% Identität mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder ein Fragment davon codiert; ii) einem isolierten und gereinigten Protein, das HERG, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon codiert; iii) Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren; oder iv) Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon exprimieren.
Kit nach Anspruch 8, wobei es sich bei der HERG enthaltenden Quelle um einen isolierten und gereinigten HERG-Polypeptidkanal oder ein Fragment davon, gebunden an einen festen Träger, handelt.
Kit nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem festen Träger um einen einen Fluoreszierer umfassenden festen Träger handelt.
Kit nach Anspruch 8, wobei die HERG enthaltende Quelle aus Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche durch die aus SEQ ID NO: 2 bestehende Aminosäuresequenz codierte HERG-Polypeptidkanäle exprimieren, besteht.
Kit nach Anspruch 12, wobei es sich bei den Zellen um HEK293-Zellen handelt.
Kit nach Anspruch 13, umfassend Mittel zur Entfernung des Überschusses an nichtgebundener markierter Referenzverbindung aus dem Inkubationsgemisch.
Kit nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Trennmittel um eine GF/B-Filtration handelt.
Verwendung eines isolierten und gereinigten Proteins, das HERG, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon codiert, in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung eines isolierten und gereinigten Polynukleotids, das HERG, umfassend die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1, oder ein Fragment davon codiert, in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon exprimieren, in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche den HERG-Polypeptidkanal, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, oder ein Fragment davon exprimieren, in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von Membranpräparationen von Zellen, die auf ihrer Oberfläche durch die aus SEQ ID NO: 2 bestehende Aminosäuresequenz codierte HERG-Polypeptidkanäle exprimieren, in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung von radioaktiv markiertem Astemizol nach Anspruch 6 in einem Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.