DE60200567T2

DE60200567T2 - Speichelvorbereitungskit und Speichelvorbereitungsmethode unter Verwendung desselben

Info

Publication number: DE60200567T2
Application number: DE60200567T
Authority: DE
Inventors: Junichi Itabashi-ku Okada; Yumiko Itabashi-ku Kobayashi
Original assignee: GC Corp; GC Dental Industiral Corp
Current assignee: GC Corp
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: AU2746202A; ATE268475T1; AU783500B2; AU783500C; DE60200567D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vorbehandlungskit für Speichel und ein Vorbehandlungsverfahren für Speichel unter Verwendung des Kits, welche zur Identifikation und Quantifizierung eines Bakteriums verwendet werden, das zu Mutans Streptococci gehört, das eines der kariesfördernden Bakterien im menschlichen Speichel ist, durch das immunochromatographische Verfahren unter Nutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion.
Es ist bekannt, daß das Vorhandensein von Mutans Streptococci in einer menschlichen Mundhöhle eng zusammenhängt mit der Bildung von Zahnkaries. Falls das Vorhandensein oder die Abwesenheit oder die Menge an Mutans Streptococci in der menschlichen Mundhöhle einfach untersucht werden könnte, würde es möglich werden, ein Krankheitsrisiko oder den gegenwärtigen Krankheitszustand zu erfassen. Daher sollte eine extrem große Zahl an Personen möglicherweise solche Vorteile genießen.
In der Vergangenheit ist eine Untersuchung unter Nutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion für die Untersuchung auf Bakterien ausgeführt worden. Beispielsweise ist ein enzymatisches Antikörperverfahren ein Verfahren zur Identifikation und Quantifizierung durch eine Farbentwicklungsdichte unter Verwendung eines Enzyms. Dieses Verfahren erfordert jedoch nicht nur einen speziellen Wäscher und eine komplizierte und genaue Vorgehensweise für den Umgang mit einem Antikörper oder einer Probe, sondern auch einen Inkubator, um eine enzymatische Reaktion zu erreichen. Ferner ist ein Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren ein Verfahren zur Markierung eines Antikörpers mit einem fluoreszierenden Farbstoff, um ein Antigen, das mit dem Antikörper reagiert hat, spezifisch anzufärben. Dieses Verfahren ist jedoch nicht allgemein, weil es ein Fluorenszenzmikroskop als ein Assay-Instrument erfordert.
Aus diesen Gründen ist eine Zahl von Verfahren unter Nutzung einer Antigen-Antikörper-Reaktion einfach vorgeschlagen worden. Beispielsweise sind Assay-Verfahren unter Nutzung von Chromatographie, wie in den US-Patenten mit den Nrn. 5,591,645, 4,855,240, 4,435,504 und 4,980,298, in den Japanischen Patentoffenlegungsschriften mit den Nrn. 145459/1986 und 160388/1994 und so weiter offenbart, ein Verfahren, das überlegen in seiner Einfachheit ist, bei welchem das Vorhandensein oder die Abwesenheit oder die Menge eines Antigens in Erfahrung gebracht werden kann nur durch Einbringen einer gesammelten Körperflüssigkeit in eine Testlösung, die den Antikörper für den Zweck der Identifikation und Quantifizierung enthält, und sein anschließendes Infiltrieren in eine Testvorrichtung. Diese Verfahren werden allgemein ein immunochromatographisches Verfahren genannt. In solchen Verfahren wird ein spezifischer Antikörper, der nur an ein Target-Antigen bindet (dieser Antikörper wird nachfolgend einfach als "spezifischer Antikörper" bezeichnet), in ein Ende einer porösen Membran (ein Porendurchmesser: einige zehn μm) wie Nitrocellulose infiltriert und wird ein anderer spezifischer Antikörper, der ähnlich nur an ein spezifisches Antigen bindet, in einer Streifenform in die Mitte der porösen Membran infiltriert und an der porösen Membran fixiert. Der in ein Ende der porösen Membran infiltrierte spezifische Antikörper wird vorab mit Teilchen aus z. B. kolloidalem Gold gefärbt. Wenn eine Probenlösung in ein Ende der porösen Membran infiltriert wird, an dem der spezifische Antikörper vorhanden ist, wird, sofern ein Antigen, das gegenüber dem spezifischen Antikörper reaktiv ist, in der Probenlösung vorhanden ist, das Antigen mit dem spezifischen Antikörper gekuppelt und wandert in dem Zustand der Bindung der färbenden Teilchen durch die Kapillarwirkung in der porösen Membran zu dem der Seite, in welcher die Probenlösung infiltriert ist, gegenüberliegenden Ende. Während der Wanderung fängt, wenn das Antigen einen Teil passiert, in dem ein anderer spezifischer Antikörper in Streifenform fixiert ist, der spezifische Antikörper auf der porösen Membran das Antigen, wodurch ein streifenartiger Blot auf der porösen Membran erscheint. Daher können das Vorhandensein des Target-Antigens in der Probe und seine Menge erkannt werden.
Falls eine solche Technologie angewendet werden würde, erschiene es möglich, die Identifikation und Quantifizierung der oben beschriebenen intraoralen Mutans Streptococci vorzunehmen. Jedoch ist tatsächlich so etwas bislang nicht in eine praktische Anwendung umgesetzt worden wegen des Vorhandenseins eines Problems, das unten beschrieben wird. Dieses besteht darin, daß eine Probe, die in dem immunochromatographischen Verfahren verwendet werden kann, in der Lage sein sollte, im Prinzip die poröse Membran durch Kapillarwirkung zu passieren. Weil jedoch ein Hauptbestandteil der Probe, die für die Untersuchung auf intraorale Bakterien wie Mutans Streptococci verwendet wird, Speichel ist, verstopft eine hochviskose Substanz, die Mucin genannt wird und im Speichel vorhanden ist, die Poren der porösen Membran. Auch bewirkt das Mucin die Aggregation von Epithel-gebundenen Zellen, die im Speichel vorhanden sind, welche aus einer oralen Schleimhautoberfläche kommen und daraus abtropfen. Entsprechend verstopft eine solche Substanz die Poren der porösen Membran, so daß Mutans Streptococci die poröse Membran nicht passieren können.
Außerdem besteht zusätzlich zu dem Problem mit Mucin ein Problem, das den Assay von Mutans Streptococci schwierig macht. Dieses besteht darin, daß Mutans Streptococci Bakterien sind, die einen Durchmesser von etwa 1 μm bezogen auf einen einzelnen Körper aufweisen. Da jedoch die Mutans Streptococci Streptokokken sind, sind oft von zehn bis zwanzig oder mehr von ihnen miteinander verkettet, was eine Behinderung der Wanderung in der porösen Membran verursacht. Darüber hinaus generieren die Mutans Streptococci viskoses Glucan aus Saccharose in Lebensmitteln, wodurch sie oft stark miteinander aggregiert werden. Ferner verursacht das Verketten und die Aggregation der Mutans Streptococci nicht nur das Verstopfen der porösen Membran, sondern vermindert auch die Oberflächen der Streptokokken und beeinflußt die Zahl der Antigene, die auf der Oberfläche der Mutans Streptococci vorhanden sind, was zu einer Verminderung der Assaygenauigkeit führt.
Die Erfindung zielt darauf, ein Vorbehandlungskit für Speichel und ein Vorbehandlungsverfahren für Speichel unter Verwendung des Kits zur Identifikation und Quantifizierung eines Mutans Streptococcus, das eines der besonders kariesfördernden Bakterien im menschlichen Speichel ist, durch das immunochromatographische Verfahren bereitzustellen, welches in einem einfachen Verfahren im Speichel vorhandenes Mucin eliminieren und verhindern kann, daß Mutans Streptococci sich verketten und aggregieren.
Um das vorgenannte Ziel zu erreichen haben die Erfinder ausführliche und intensive Untersuchungen vorgenommen. Als ein Ergebnis ist gefunden worden, daß, wenn die Behandlung unter Verwendung einer spezifischen Säure und einer alkalischen Lösung ausgeführt wird, sie im Speichel vorhandenes Mucin und Glucan lösen und auf äußere Membranen von Mutans Streptococci einwirken, wodurch die Aggregation von Mutans Streptococci unterdrückt wird, daß, wenn ferner ein spezifisches grenzflächenaktives Mittel verwendet wird, es in den Mutans Streptococci vorhandene Proteine löslich macht, wodurch ermöglicht wird, daß die Mutans Streptococci glatt eine poröse Membran passieren, und daß, wenn ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich in einem spezifischen pH-Bereich verwendet wird, es möglich ist, mit Leichtigkeit zu bestätigen, ob das System in einem Zustand ist, in dem eine Antigen-Antikörper-Reaktion ausgeführt wird, oder nicht, was zum Erreichen der vorliegenden Erfindung geführt hat.
Genauer ist das erfindungsgemäße Vorbehandlungskit für Speichel dadurch gekennzeichnet, daß es eine wäßrige Lösung, die Natriumhydroxid enthält, eine Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure, und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und/oder ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel umfaßt, wobei das grenzflächenaktive Mittel vorher mit der wäßrigen Lösung und/oder der Pufferlösung gemischt wird oder getrennt von der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung hergestellt wird.
Bevorzugt wird ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 mit der wäßrigen Lösung oder der wäßrigen Lösung mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel und/oder mit der Pufferlösung oder der Pufferlösung mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel gemischt oder wird von der wäßrigen Lösung oder von der mit dem grenzflächenaktiven Mittel zuvor gemischten wäßrigen Lösung und der Pufferlösung oder der zuvor mit dem grenzflächenaktiven Mittel gemischten Pufferlösung getrennt.
Bevorzugt ist das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel als das grenzflächenaktive Mittel ein Mitglied oder eine Mischung von zwei oder mehreren Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykolmonooctylphenylether, n-Octyl-β-D-glucosid, n-Heptyl-β-D-thioglucosid, n-Octyl-β-D-thioglucosid, Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Octylphenoxypolyethoxyethanol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat; ist das amphotere grenzflächenaktive Mittel als das grenzflächenaktive Mittel ein Mitglied oder eine Mischung von zwei Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat und 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-hydroxypropansulfonat; und ist der pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylrot, Azolitmin, p-Nitrophenol, m-Nitrophenol, Bromkresol Purpur, Bromphenol Rot, Chlorphenol Rot, Phenol Rot, Neutral Rot, Bromthymol Blau, Phenolphthalein und Thymolphthalein.
Auch das erfindungsgemäße Vorbehandlungsverfahren für Speichel ist ein Vorbehandlungsverfahren zur Identifikation und Quantifizierung von Mutans Streptococci durch das immunochromatographische Verfahren, welches umfaßt das tropfenweise Zugeben und Mischen einer wäßrigen Lösung enthaltend Natriumhydroxid, einer Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure und eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels und/oder eines amphoteren grenzflächenaktiven Mittels in und mit Speichel in einer zufälligen Reihenfolge oder das tropfenweise Zugeben und Mischen der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung, wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel gemischt worden ist, in und mit Speichel in einer zufälligen Reihenfolge unter Einstellen des pH-Werts auf 5 bis 9. Es ist bevorzugt, ein Gemisch der wäßrigen Lösung und/oder der Pufferlösung, die tropfenweise zuzugeben sind und gemischt werden, oder der wäßrigen Lösung und/oder der Pufferlösung, wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel zuvor gemischt worden ist, und eines pH-Indikators mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 zu verwenden. Es ist auch bevorzugt, daß während der tropfenweise Zugabe der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung in tropfenweiser Zugabe und Mischung der wäßrigen Lösung, der Pufferlösung und des grenzflächenaktiven Mittels oder während der tropfenweisen Zugabe der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung in tropfenweiser Zugabe und Mischung der wäßrigen Lösung und der Pufferlösung, wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel zuvor gemischt worden ist, ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 vor der tropfenweisen Zugabe der wäßrigen Lösung oder der Pufferlösung, die später tropfenweise zugegeben wird, zuvor tropfenweise zugegeben wird.
Die wäßrige Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, welche für das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren gemäß der Erfindung verwendet wird, wirkt auf in äußeren Membranen von Mutans Streptococci im Speichel vorhandenes Mucin und Glucan, wodurch die Aggregation der Mutans Streptococci unterdrückt und erreicht wird, daß die Mutans Streptococci als Antigene in einer porösen Membran leicht wandern. Es ist wichtig, Natriumhydroxid als eine alkalische Lösung zu verwenden. Natriumcarbonat, Dinatriumhydrogenphosphat und dergleichen sind nicht geeignet. Mit anderen Worten ist es unmöglich, die Mutans Streptococci unter Verwendung von anderen wäßrigen alkalischen Lösungen als Natriumhydroxid zu untersuchen. Dies ist so, weil angenommen wird, daß andere wäßrige alkalische Lösungen als Natriumhydroxid möglicherweise ein Hindernis für die Struktur der Antigene von Mutans Streptococci ergeben.
Die Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, welche für das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterdrückt die Kettenbildung des Mutans Streptococcus und bewirkt, daß die Mutans Streptococci als Antigene in der porösen Membran leicht wandern. Es ist wichtig, Weinsäure und/oder Zitronensäure als eine Säure zu verwenden. Andere Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Essigsäure, Milchsäure und Maleinsäure sind nicht geeignet. Auch wenn solche anderen Säuren als Weinsäure und Zitronensäure in Kombination mit Natriumhydroxid verwendet werden, kann eine gewünschte Empfindlichkeit für die Untersuchung nicht erreicht werden. Dies ist so, weil angenommen wird, daß andere Säuren als Weinsäure und Zitronensäure möglicherweise ein Hindernis für die Struktur der Antigene von Mutans Streptococci ergeben. In dem Vorbehandlungskit für Speichel und dem Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, einen Puffer zu verwenden, weil eine Neutralisationsreaktion zwischen dem Natriumhydroxid und der Weinsäure und/oder der Zitronensäure auftritt. Es ist wichtig, daß die die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthaltende wäßrige Lösung Tris(hydroxymethyl)aminomethan als Puffer enthält. Um wirksam eine Pufferwirkung zu erreichen, ist es notwendig, Tris(hydroxymethyl)aminomethan in der Seite der Lösung, die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, zu verwenden. Es ist selbstverständlich, daß Tris(hydroxymethyl)aminomethan gleichzeitig in der Seite der wäßrigen Natriumhydroxidlösung verwendet werden kann. Es ist jedoch zur Zeit bereits bestätigt, daß die Pufferwirkung nicht durch andere Puffer wie eine Kombination von Natriumbicarbonat und Natriumcarbonat oder eine Kombination von Zitronensäure und Natriumcitrat erreicht wird.
Es ist bevorzugt, daß die Konzentrationen von Natriumhydroxid beziehungsweise Weinsäure und/oder Zitronensäure 0,01 N oder mehr betragen. Wenn jede der Konzentrationen von Natriumhydroxid und von Weinsäure und/oder Zitronensäure weniger als 0,01 N ist, besteht nicht nur eine Neigung, daß die Wirkung, die durch jede der Komponenten erbracht werden wird, kaum erreicht wird, sondern ist es auch wahrscheinlich, daß Verstopfen der porösen Membran auftritt. Tatsächlich ist es, je höher die Konzentrationen von Natriumhydroxid und von Weinsäure und/oder Zitronensäure sind, um so vorteilhafter vom Standpunkt der Detektionsempfindlichkeit. Auch ist es im dem erfindungsgemäßen Vorbehandlungskit für Speichel notwendig, daß die wäßrige Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, und die Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, voneinander getrennt sind, weil eine Neutralisationswirkung zwischen ihnen besteht.
Das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C), welches in dem Vorbehandlungskit für Speichel und dem Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bewirkt das Löslichmachen von Proteinen, die auf den Oberflächen der Mutans Streptococci vorhanden sind, und ermöglicht den Mutans Streptococci, glatt die poröse Membran zu passieren. In der Vergangenheit ist gemäß dem immunochromatographischen Verfahren ein ionisches grenzflächenaktives Mittel oft so verwendet worden, daß die Probenlösung oder die Antigenlösung in einer Testapparatur glatt wandern kann. Allerdings ist es aufgrund der experimentellen Ergebnisse erforderlich, daß das grenzflächenaktive Mittel (C), das in dem Vorbehandlungskit für Speichel und dem Vorbehandlungsverfahren für Speichel zur Durchführung der Identifikation und Quantifizierung von Mutans Streptococcus-Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und/oder amphoteres grenzflächenaktives Mittel ist. Wenn ein anionisches grenzflächenaktives Mittel wie Natriumlaurylsulfat und Natriumdodecylbenzolsulfonat oder kationisches grenzflächenaktives Mittel verwendet wird, kann der spezifische Antikörper das Antigen nicht detektieren.
Das grenzflächenaktive Mittel (C), das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht besonders beschränkt, sofern es ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und/oder ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel ist, und jedes derjenigen, die im allgemeinen als ein solubilisierendes Mittel für Membranproteine verwendet werden, können verwendet werden. Allerdings besteht ein Unterschied in der Detektionsempfindlichkeit des Mutans Streptococci-Antigens in Abhängigkeit von der Art des verwendeten nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels und/oder des amphoteren grenzflächenaktiven Mittels. Insbesondere ist es vom Standpunkt der Detektionsempfindlichkeit bevorzugt, daß das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel ein Mitglied oder eine Mischung von zwei oder mehreren Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykolmonooctylphenylether, n-Octyl-β-D-glucosid, n-Heptyl-β-D-thioglucosid und n-Octyl-β-D-thioglucosid, ist und daß das amphotere grenzflächenaktive Mittel irgendein Mitglied oder eine Mischung von zwei Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat) und CHAPSO (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-hydroxypropansulfonat), ist.
Es ist bevorzugt, das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) so zu verwenden, daß die Konzentration des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels und/oder des amphoteren grenzflächenaktiven Mittels (C) in der Speichelprobe nach der Behandlung des Speichels 0,05 bis 90 Gewichts-% beträgt. Wenn die Konzentration des nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels und/oder des amphoteren grenzflächenaktiven Mittels (C) in der Speichelprobe nach der Behandlung des Speichels kleiner als 0,05 Gewichts-% ist, verschwindet die Detektionsempfindlichkeit durch die Antigen-Antikörper-Reaktion, während die Detektionsempfindlichkeit durch die Antigen-Antikörper-Reaktion vermindert wird, wenn sie 90 Gewichts-% übersteigt, und daher sind beide nicht geeignet.
In dem erfindungsgemäßen Vorbehandlungskit für Speichel können das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) getrennt von der wäßrigen Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, und der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, bereitgestellt werden. In diesem Fall kann das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) in einer Form einer wäßrigen Lösung sein. Ferner kann das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) in einem Zustand einer Mischung mit einem oder beiden der wäßrigen Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, und der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, bereitgestellt werden. In diesem Fall muß den Zersetzungseigenschaften durch eine Säure oder eine Base Beachtung geschenkt werden.
Als pH-Indikator (D) mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9, welcher für das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird bevorzugt ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylrot (Übergangsbereich: 4,4 bis 6,2), Azolitmin (Übergangsbereich: 5,0 bis 8,0), p-Nitrophenol (Übergangsbereich: 5,0 bis 7,0), m-Nitrophenol (Übergangsbereich: 6,4 bis 8,8), Bromkresol Purpur (Übergangsbereich: 5,2 bis 6,8), Bromphenol Rot (Übergangsbereich: 5,2 bis 6,8), Chlorphenol Rot (Übergangsbereich: 5,2 bis 6,8), Phenol Rot (Übergangsbereich: 6,4 bis 8,0), Neutral Rot (Übergangsbereich: 6,8 bis 8,0), Bromthymol Blau (Übergangsbereich: 6,0 bis 7,6), Phenolphthalein (Übergangsbereich: 8,0 bis 10,0) und Thymolphthalein (Übergangsbereich: 8,3 bis 10,6), verwendet werden. Der pH-Indikator (D) kann in einer Ausführungsform verwendet werden, in der er mit der wäßrigen Lösung (A) oder der wäßrigen Lösung (A) mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel (C) und/oder der Pufferlösung (B) oder der Pufferlösung (B) mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel (C) gemischt wird. Alternativ kann der pH-Indikator (D) in einer Ausführungsform verwendet werden, in der er von der wäßrigen Lösung (A) oder der wäßrigen Lösung (A) mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel (C) und der Pufferlösung (B) oder der Pufferlösung (B) mit dem zuvor damit gemischten grenzflächenaktiven Mittel (C) getrennt ist. Beiläufig gesagt ist es, weil die Menge des pH-Indikators (D), die zu verwenden ist, sehr klein sein kann, nicht notwendig, irgendeinen Einfluß des pH-Indikators (D) auf die Konzentrationen des Natriumhydroxids in der wäßrigen Lösung (A), der Weinsäure und/oder Zitronensäure in der Pufferlösung (B) und des grenzflächenaktiven Mittels (C) zu berücksichtigen.
Das erfindungsgemäße Vorbehandlungsverfahren für Speichel ist ein Verfahren, welches das tropfenweise Zugeben und Mischen der wäßrigen Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, und des nichtionischen grenzflächenaktive Mittels und/oder des amphoteren grenzflächenaktive Mittels (C) in und mit Speichel in einer zufälligen Reihenfolge umfaßt. Zum Zweck der Vereinfachung dieses Vorbehandlungsverfahrens können das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) vorher zu mindestens einer der wäßrigen Lösung (A), enthaltend Natriumhydroxid, und der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure, zugegeben werden. Auch in diesem Fall können natürlich das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C) zu der wäßrigen Lösung (A), enthaltend Natriumhydroxid, und der Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure, in einer zufälligen Reihenfolge zugegeben werden.
Weil die entsprechenden Komponenten, die wäßrige Lösung (A), die Natriumhydroxid enthält, die Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B), die Weinsäure und/oder Zitronensäure enthält, und das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel und/oder das amphotere grenzflächenaktive Mittel (C), die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, eine voneinander unabhängige Funktion haben, können sie in einer zufälligen Reihenfolge behandelt werden. Die Behandlungen werden jedoch so ausgeführt, daß der Speichel nach den Behandlungen einen pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 5 bis 9 aufweist. Dies ist so, weil die Antigen-Antikörper-Reaktion in diesem pH-Bereich ausgeführt wird und daher, bei Variationen in Abhängigkeit von der Art des spezifischen Antikörpers, der spezifische Antikörper, wenn der pH-Wert außerhalb des oben spezifizierten Bereichs ist, von dem Antigen getrennt wird oder der spezifische Antikörper eine nicht-spezifische Affinität aufweist, was zu einer Verminderung der Verläßlichkeit der Meßergebnisse führt.
Die Speichelprobe, die durch das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt wird, kann der Identifikation und Quantifizierung von Mutans Streptococci durch die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Anwendung des immunochromatiographischen Verfahrens, wie es herkömmlicherweise in der Technik eingesetzt wird, unterzogen werden. Die spezifischen Antikörper können durch überlicherweise eingesetzte Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann einer, der gemäß einem Hybridoma-Herstellungsverfahren durch Zellverschmelzung, wie von Kohler und Milstein (G. Kohler und C. Milstein, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256: 495–497, 1975) vorgeschlagen, erhalten werden, eingesetzt werden. Ferner kann einer, der durch bloßes Immunisieren eines Tieres mit einem Antigen und Reinigen des entstehenden Serums erhalten wird, eingesetzt werden.
Das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung werden mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, aber sie sollten nicht als Beschränkung der vorliegenden Erfindung verstanden werden.
(1) Herstellung der Reagenzien und Testapparaturen
1. Herstellung spezifischer Antikörper
Streptococcus mutans (ATCC25175-Stamm) und Streptococcus sobrinus (ATCC33478-Stamm) als Mutans Streptococci wurden kultiviert, und ihr Wachstum wurde in einer wäßrigen Formaldehydlösung gestoppt. Eine Maus wurde mit diesen Bakteriendispersionen, wie sie waren, immunisiert, und zwei Arten gereinigter Antikörper jedes wie unten beschriebenen Bakteriums wurden gemäß einem Hybridoma-Herstellungsverfahren durch Zellverschmelzung, wie von Kohler und Milstein vorgeschlagen, erhalten.
SM1 Antikörper: Spezifischer Antikörper gegen Streptococcus mutans
SM2 Antikörper: Spezifischer Antikörper gegen Streptococcus mutans
SS1 Antikörper: Spezifischer Antikörper gegen Streptococcus sobrinus
SS2 Antikörper: Spezifischer Antikörper gegen Streptococcus sobrinus
2. Markierung spezifischer Antikörper
Jeder der SM2 und SS2 Antikörper wurde mit kolloidalem Gold mit einer Teilchengröße von 40 nm markiert. Als das kolloidale Gold wurde ein kommerziell erhältliches (hergestellt von British Biocell International) verwendet und mit einer Phosphatpufferlösung mit 1% bovinem Serum-Albumin (ein Handelsname: BSA, hergestellt von Sigma Chemical Company) verdünnt, und 1% eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels (ein Handelsname: Tween 20, hergestellt von Sigma Chemical Company) wurde so dazugegeben, daß die Antikörperkonzentration 0,1 μg/ml betrug. Die jeweils mit kolloidalem Gold markierten Antikörperlösungen wurden eine mit kolloidalem Gold markierte SM2 Antikörperlösung beziehungsweise eine mit kolloidalem Gold markierte SS2 Antikörperlösung genannt.
3. Herstellung einer porösen Membran für die Immunochromatographie
Als eine poröse Membran wurde eine Nitrocellulosemembran (ein Handelsname: SXHF, hergestellt von Nihon Millipore Ltd.) verwendet. Diese Membran wurde zu einem Rechteck von 5 mm × 40 mm geschnitten. Der SM1 Antikörper oder der SS1 Antikörper wurde in einer 50 mM Phosphatpufferlösung, enthaltend 1% bovines Serum-Albumin, auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Die verdünnte Antikörperlösung wurde auf einen zentralen Teil der Nitrocellulosemembran senkrecht zu der longitudinalen Richtung unter Verwendung einer Mikropipette aufgebracht, so daß die Aufbringungsmenge etwa 1 mg/cm betrug. An einem Ende dieser Membran war ein 15 mm-Quadrat Filterpapier mit einem Clip fixiert, um einen Absorber herzustellen. Die so hergestellte Anordnung wurde bei 37°C für 2 Stunden getrocknet und in einem Exsikkator bis kurz vor der Verwendung aufbewahrt.
(2) Testverfahren durch Immunochromatographie

1. Speichel wird von einem Subjekt gesammelt und mit dem Vorbehandlungskit für Speichel behandelt.
2. 100 μl des behandelten Speichels werden zu 25 μl der mit kolliodalem Gold markierten SM2 Antikörperlösung oder der mit kolliodalem Gold markierten SS2 Antikörperlösung hinzugegeben.
3. Ein Ende der porösen Membran für Chromatographie, die den Antikörper, der dem mit kolloidalem Gold markierten Antikörper entspricht, aufgebracht darauf aufweist, in dieser Testlösung, um zu bewirken, daß die Testlösung in die poröse Membran infiltriert, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörperreaktion wird beobachtet.

Beispiel 1
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörperreaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung), und eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt und 5 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (BC-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der A-Lösung und 25 μl der BC-Lösung hinzugegeben, um ein Gemisch zu bilden. Auch wurden zu 100 μl des Speichels nacheinander 25 μl der BC-Lösung und etwa 20 μl der A-Lösung hinzugegeben, um ein Gemisch zu bilden. Jedes der Gemische wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In keiner der Speichelproben nach Mischen wurde Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 2
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung), und eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt und 1 Gewichts-% Polyethylenglykolmonoocytylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxy methyl)aminomethan-Pufferlösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (BC-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der A-Lösung und 15 μl der BC-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Auch wurden zu 100 μl des Speichels nacheinander 15 μl der BC-Lösung und 20 μl der A-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Jede der Mischungen wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In keiner der Speichelproben nach Mischen wurde Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 3
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 5 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (AC-Lösung), und eine 1,5 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt und 5 Gewicht-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (BC-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 15 μl der BC-Lösung und 20 μl der AC-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 4
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 1 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (AC-Lösung), und eine 0,75 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der AC-Lösung und 15 μl der B-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 5
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 1 Gewichts-% n-Octyl-β-D-glucosid (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nichtionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (AC-Lösung), und eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 2,0 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der B-Lösung und 6 μl AC-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 6
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit darauf aufgebrachtem SS1 Antikörper verwendet.
Eine 0,75 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 1 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (AC-Lösung), und eine 0,15 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,05 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 25 μl der B-Lösung und 20 μl der AC-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 7
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung); eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,05 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung); und eine Natriumphosphat-Pufferlösung, die 10 Gewichts-% 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (hergestellt von Sigma Chemical Company) als ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel enthielt, wurde als ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel bestimmt (C-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der A-Lösung, 15 μl der B-Lösung und 10 μl der C-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 8
Unter Verwendung der in Beispiel 7 verwendeten Speichelprobe und des Behandlungskits für Speichel wurden zu 100 μl des Speichels nacheinander 10 μl der C-Lösung, 15 μl der B-Lösung und 20 μl der A-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 9
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung); eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Weinsäure enthielt, wurde als eine Weinsäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung (B-Lösung) bestimmt; und eine Natriumphosphat-Pufferlösung, die 10 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthielt, wurde als ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel bestimmt (C-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der B-Lösung, 10 μl der C-Lösung und 20 μl der A-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde kein Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 10
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Zu einer 0,75 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde 1 Gewichts-% Polyethylenmonooctylphenylehter (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde blau gefärbt durch weiteres Zumischen von Bromthymol Blau als pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9. Diese blaugefärbte Mischung wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die einen pH-Indikator und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (ACD-Lösung). Ferner wurde eine 0,15 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,05 N Zitronensäure enthielt, als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden 20 μl der ACD-Lösung hinzugegeben. Danach wurde die B-Lösung zu der Speichelmischung hinzugegeben und damit gemischt, bis sie sich grün gefärbt hatte. Die entstehende Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde keine Verstopfung der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 11
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 1 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (AC-Lösung), und eine 0,75 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung). Ferner wurde ein pH-Indikator umfassend Methylrot (D-Lösung) als ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 hergestellt.
Zu 100 μl des Speichels wurden 20 μl der B-Lösung hinzugegeben. Danach wurde die D-Lösung dazu tropfenweise hinzugegeben, um die Speichel mischung rot zu färben, und dann wurde die AC-Lösung dazu hinzugegeben und damit gemischt, bis die Mischung sich gelb gefärbt hatte. Die entstehende Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde kein Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 12
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung). Auch wurden zu einer 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, 5 Gewicht-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde durch weiteres Zumischen von Bromthymol Blau als pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 gelb gefärbt. Diese gelbgefärbte Mischung wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die einen pH-Indikator und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (BCD-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden 25 μl der BCD-Lösung hinzugegeben. Danach wurde die A-Lösung zu der Speichelmischung hinzugegeben und damit gemischt, bis sie sich grün gefärbt hatte. Die entstehende Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde kein Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 13
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Zu einer 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurden 5 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde durch weiteres Zumischen von Phenolphthalein als pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 rot gefärbt. Diese rotgefärbte Mischung wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die einen pH-Indikator und ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (ACD-Lösung). Auch wurde eine 1,5 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt und 5 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, bestimmt (BC-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden 20 μl der ACD-Lösung hinzugegeben. Danach wurde die BC-Lösung zu der Speichelmischung hinzugegeben und damit gemischt, bis sie farblos geworden war. Die entstehende Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde kein Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Beispiel 14
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesen Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus sobrinus, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SS1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung bestimmt (A-Lösung); eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,05 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung); und eine Natriumphosphat-Pufferlösung, die 10 Gewichts-% 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (hergestellt von Sigma Chemical Company) als amphoteres grenzflächenaktives Mittel enthielt, wurde als ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel bestimmt (C-Lösung). Ferner wurde ein pH-Indikator umfassend Phenol Rot (D-Lösung) als ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 hergestellt.
Die B-Lösung (20 μl) wurde zu 100 μl des Speichels hinzugegeben, und die D-Lösung wurde weiter tropfenweise dazu hinzugegeben, um die Mischung gelb zu färben. Danach wurden 10 μl der C-Lösung zu der Speichelmischung hinzugegeben und damit gemischt, und die A-Lösung wurde weiter dazu hinzugegeben und damit gemischt, bis die Mischung sich rot gefärbt hatte. Die entstehende Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Speichelprobe nach Mischen wurde kein Verstopfen der porösen Membran beobachtet, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde bestätigt.
Vergleichsbeispiel 1
Unter Verwendung der in Beispiel 1 verwendeten Speichelprobe wurde der Test mit dem immunochromatographischen Verfahren ohne Verwendung des Vorbehandlungskits für Speichel ausgeführt. Als poröse Membran wurde eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet. In der Speichelprobe trat Verstopfen der porösen Membran auf, und das Auftreten der Antikörper-Reaktion wurde nicht bestätigt.
Vergleichsbeispiel 2
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als die poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 0,75 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumhydroxid enthielt und 0,4 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde als eine Natriumhydroxid enthaltende wäßrige Lösung, die ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufweist, bestimmt (AC-Lösung), und eine 1,0 N Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N irgendeiner der Säuren Maleinsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure oder Milchsäure enthielt, wurde als eine Säurelösung bestimmt. Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der AC-Lösung und 25 μl der Säurelösung, die irgendeine der Säuren Maleinsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure oder Milchsäure enthielt, hinzugegeben, gefolgt von Rühren der Mischung. Die entstehenden Mischungen wurden jede mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In den Proben wurde das Auftreten der Antikörper-Reaktion in bezug auf die Behandlung mit jeder der Säuren nicht bestätigt.
Vergleichsbeispiel 3
Speichel (100 μl) wurde in der folgenden Weise behandelt, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Auftretens einer Antikörper-Reaktion zu beobachten. In diesem Fall wurde als Speichel einer mit 2 × 10⁶ (CFU/ml) Bakterien von Streptococcus mutans, gemessen mit einem Fluorometer, im Speichel verwendet. Ferner wurde als poröse Membran eine mit dem darauf aufgebrachten SM1 Antikörper verwendet.
Eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Natriumcarbonat enthielt und 1 Gewichts-% Polyethylenglykolmonooctylphenylether (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein dazu hinzugegebenes nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel aufwies, wurde verwendet (A'C-Lösung), und eine 1,0 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, die 1,0 N Zitronensäure enthielt, wurde als eine Zitronensäure enthaltende Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung bestimmt (B-Lösung).
Zu 100 μl des Speichels wurden nacheinander 20 μl der A'C-Lösung und 15 μl der B-Lösung hinzugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde mit dem immunochromatographischen Verfahren getestet. In der Probe wurde das Auftreten der Antikörper-Reaktion nicht bestätigt.
Wie zuvor im Detail beschrieben worden ist, ist es aus den Beispielen und Vergleichsbeispielen evident, daß das Vorbehandlungskit für Speichel und das Vorbehandlungsverfahren für Speichel gemäß der vorliegenden Erfindung ein Vorbehandlungskit und Vorbehandlungsverfahren zur Identifikation und Quantifizierung von Mutans Streptococci in menschlichem Speichel durch das immunochromatographische Verfahren sind, welche im Speichel vorhandenes Mucin und Glucan lösen und auf äußere Membranen von Mutans Streptococci einwirken können, wodurch die Kettenbildung und Aggregation von Mutans Streptococci unterdrückt und die in Mutans Streptococci vorhandenen Proteine in einem einfachen Verfahren löslich gemacht werden, so daß Mutans Streptococci glatt eine poröse Membran passieren können. Somit ist die vorliegende Erfindung von großem Wert in ihrem Beitrag zum dental-medizinischen Gebiet.

Claims

Vorbehandlungskit für Speichel, umfassend (A) eine wäßrige Lösung, die Natriumhydroxid enthält, (B) eine Tris-(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure, und (C) ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel und/oder ein amphoteres grenzflächenaktives Mittel, wobei das grenzflächenaktive Mittel (C) vorher mit der wäßrigen Lösung (A) und/oder der Pufferlösung (B) gemischt wird oder von der wäßrigen Lösung (A) und der Pufferlösung (B) getrennt ist.
Vorbehandlungskit für Speichel nach Anspruch 1, wobei das nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel als das grenzflächenaktive Mittel (C) ein Mitglied oder ein Gemisch von zwei oder mehreren Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglykolmonooctylphenylether, N-Octyl-β-D-glucosid, N-Heptyl-β-D-thioglucosid, N-Octyl-β-thioglucosid, Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Octylphenoxypolyethoxyethanol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat, ist.
Vorbehandlungskit für Speichel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das amphotere grenzflächenaktive Mittel als das grenzflächenaktive Mittel (C) ein Mitglied oder ein Gemisch von zwei Mitgliedern, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat und 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-hydroxypropansulfonat, ist.
Vorbehandlungskit für Speichel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei (D) ein pH-Indikator mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 mit der wäßrigen Lösung (A) oder der wäßrigen Lösung (A), die mit dem grenzflä chenaktiven Mittel (C) zuvor damit gemischt worden ist, und/oder der Pufferlösung (B) oder der Pufferlösung (B), die mit dem grenzflächenaktiven Mittel (C) zuvor damit gemischt worden ist, gemischt wird oder getrennt von der wäßrigen Lösung (A) oder der wäßrigen Lösung (A), die mit dem grenzflächenaktiven Mittel (C) damit zuvor gemischt worden ist, und der Pufferlösung (B) oder der Pufferlösung (B), die mit dem grenzflächenaktiven Mittel (C) damit zuvor gemischt worden ist, hergestellt wird.
Vorbehandlungskit für Speichel nach Anspruch 4, wobei der pH-Indikator (D) mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Methylrot, Azolitmin, p-Nitrophenol, m-Nitrophenol, Bromkresol Rosa, Bromphenol Rot, Chlorphenol Rot, Phenol Rot, Neutral Rot, Bromthymol Blau, Phenolphthalein und Thymolphthalein.
Vorbehandlungsverfahren für Speichel zur Identifikation und Quantifizierung von Mutans Streptococci durch das immunochromatographische Verfahren, welches das tropfenweise Zugeben und Mischen (A) einer wäßrigen Lösung, enthaltend Natriumhydroxid, (B) einer Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Pufferlösung, enthaltend Weinsäure und/oder Zitronensäure, und (C) eines nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mittels und/oder eines amphoteren grenzflächenaktiven Mittels in und mit Speichel in einer zufälligen Reihenfolge oder das tropfenweise Zugeben und Mischen der wäßrigen Lösung (A) und der Pufferlösung (B), wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel (C) gemischt worden ist, in und mit Speichel in einer zufälligen Reihenfolge unter Einstellung des pH-Wertes auf 5 bis 9 umfaßt.
Vorbehandlungsverfahren für Speichel nach Anspruch 6, wobei ein Gemisch der wäßrigen Lösung (A) und/oder der Pufferlösung (B), tropfenweise zuzugebend und gemischt, oder der wäßrigen Lösung (A) und/oder der Pufferlösung (B), wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel (C) zuvor gemischt worden ist, und des pH-Indikators (D) mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 verwendet wird.
Vorbehandlungsverfahren für Speichel nach Anspruch 6, wobei während des tropfenweisen Zugebens der wäßrigen Lösung (A) und der Pufferlösung (B) in tropfenweiser Zugabe und Mischen der wäßrigen Lösung (A), der Pufferlösung (B) und des grenzflächenaktiven Mittels (C) oder während der tropfenweisen Zugabe der wäßrigen Lösung (A) und der Pufferlösung (B) in tropfenweiser Zugabe und Mischen der wäßrigen Lösung (A) und der Pufferlösung (B), wobei mit mindestens einer davon das grenzflächenaktive Mittel (C) zuvor gemischt worden ist, der pH-Indikator (D) mit einem Farbübergangsbereich von pH 5 bis 9 vor der tropfenweisen Zugabe der wäßrigen Lösung (A) oder der Pufferlösung (B), die später tropfenweise zugegeben wird, zuvor tropfenweise zugegeben wird.